專利名稱：硫氧還蛋白和谷物加工的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及用于谷物加工特別是玉米濕磨和大豆加工，以增強蛋白質(zhì)和淀粉回收的新方法，以及用于這種方法的新轉(zhuǎn)基因植物。
硫氧還蛋白(TRX)和硫氧還蛋白還原酶(TR)是利用NADPH還原蛋白質(zhì)中二硫鍵的酶。蛋白質(zhì)二硫鍵在谷物加工效率和從谷物加工中回收產(chǎn)物的質(zhì)量等方面起重要作用。開發(fā)去除或降低谷物中蛋白質(zhì)二硫鍵的量的有效方法將大大增加加工效率。另外，牲畜飼料中的谷物性能還受到分子內(nèi)及分子間二硫鍵的影響谷物可消化性、營養(yǎng)可得性和抗營養(yǎng)因子(如，蛋白酶、淀粉酶抑制劑等)的中和通過降低二硫鍵的程度均可增加。
轉(zhuǎn)基因硫氧還蛋白和/或硫氧還蛋白還原酶在玉米及大豆中的表達，以及硫氧還蛋白在谷物加工(如濕磨)中的用途有新穎性，且提供了另一種在工業(yè)加工過程中降低種子蛋白質(zhì)中二硫鍵的方法。本發(fā)明因此提供了帶有改變的儲存蛋白質(zhì)質(zhì)量的谷物，以及在工業(yè)加工或動物消化過程中(以下均稱為“加工”)加工性能質(zhì)量上不同于正常谷物的谷物。
硫氧還蛋白和/或硫氧還蛋白還原酶的遞送方法避免了在加工中形成用于添加的硫氧還蛋白和/或硫氧還蛋白還原酶的外部來源需要。通過谷物提供硫氧還蛋白和/或硫氧還蛋白還原酶的第二個優(yōu)點是在加工之前或作為額外的加工步驟，不必物理性破壞種子的完整性以使酶與種子的儲存或基質(zhì)蛋白質(zhì)接觸。
提供了在谷物加工中利用硫氧還蛋白的三種模式1)在種子發(fā)育過程中表達和作用以改變收獲的谷物之組成和質(zhì)量；2)在種子發(fā)育過程中表達(但無活性)以改變經(jīng)加工時的產(chǎn)物質(zhì)量；3)谷物中硫氧還蛋白和/或硫氧還蛋白還原酶的產(chǎn)生用于在加工過程中通過添加改變其他谷物產(chǎn)品的質(zhì)量。
本發(fā)明因此提供了一種在谷物制粉方法中增加淀粉和蛋白質(zhì)分離效率的方法，包括在補加的硫氧還蛋白和/或硫氧還蛋白還原酶存在下于高溫中浸漬谷物，和分離谷物中的蛋白質(zhì)和淀粉成分的步驟。
一種如上述的方法，其中谷物包括來自轉(zhuǎn)基因植物的谷物，其中轉(zhuǎn)基因表達硫氧還蛋白和/或硫氧還蛋白還原酶，特別是熱穩(wěn)定的硫氧還蛋白和/或硫氧還蛋白還原酶。
一種如上述的方法，其中植物選自雙子葉植物或單子葉植物，特別是來自谷類，尤其特別是來自玉米(Zea mays)和大豆。
本發(fā)明還提供了轉(zhuǎn)基因植物。
特別是，本發(fā)明提供了一種包含編碼硫氧還蛋白和/或硫氧還蛋白還原酶的異源DNA序列的植物，所述DNA序列穩(wěn)定地整合入植物的核或質(zhì)體DNA。
一種如上述的植物，其中硫氧還蛋白和/或硫氧還蛋白還原酶是熱穩(wěn)定的。
一種如上述的植物，其中硫氧還蛋白和/或硫氧還蛋白還原酶選自SEQID NO1，SEQ ID NO2，SEQ ID NO3，SEQ ID NO4，SEQ IDNO5，SEQ ID NO6和SEQ ID NO7。
一種如上述的植物，其中植物選自玉米和大豆。
本發(fā)明還提供了一種植物可表達的表達盒，其含有與在植物中有功能的啟動子和終止子序列有效連接的硫氧還蛋白和/或硫氧還蛋白還原酶編碼區(qū)。
一種如上述的植物可表達的表達盒，其中硫氧還蛋白和/或硫氧還蛋白還原酶是熱穩(wěn)定的。
一種如上述的植物可表達的表達盒，其中硫氧還蛋白和/或硫氧還蛋白還原酶選自SEQ ID NO1，SEQ ID NO2，SEQ ID NO3，SEQ IDNO4，SEQ ID NO5，SEQ ID NO6和SEQ ID NO7。
本發(fā)明還提供了一種制備包含高水平的硫氧還蛋白和/或硫氧還蛋白還原酶的谷物的方法，包括用如上述的表達盒轉(zhuǎn)化植物。
一種制備包含高水平的硫氧還蛋白和/或硫氧還蛋白還原酶的谷物的方法，包括給含有異源表達盒的第一種植物用來自含有異源表達盒的第二種植物的花粉授粉，其中所述第一種植物的表達盒中含有反式激活蛋白調(diào)節(jié)的啟動子，其調(diào)節(jié)且與編碼硫氧還蛋白和/或硫氧還蛋白還原酶的DNA序列有效連接，第二種植物的表達盒中含有與編碼反式激活蛋白的DNA序列有效連接的啟動子，所述反式激活蛋白能調(diào)節(jié)該反式激活蛋白調(diào)節(jié)的啟動子，該方法中還包含從如此授粉的植物中回收谷物。
此外，本發(fā)明提供了根據(jù)本發(fā)明的植物或植物材料作為動物飼料的用途。
此處所述的本發(fā)明適用于所有谷物作物，特別是玉米、大豆、小麥和大麥，更特別的是玉米和大豆，尤其是玉米。轉(zhuǎn)基因硫氧還蛋白和/或硫氧還蛋白還原酶在谷物中的表達是改變待谷物加工的原料(種子)質(zhì)量，改變來自谷物加工的原料質(zhì)量，在加工中最大化特定種子成分產(chǎn)量(提高效率)，改變加工方法以及從制粉物流中產(chǎn)生種子來源的級分或成分之新用途的方法。濕磨法濕磨法是一種分離谷物(更常見地為谷類，例如玉米)的淀粉、蛋白質(zhì)和油成分的方法。此處其與僅簡單地將谷物研磨成粉的干磨法不同。濕磨法中第一步通常是浸漬，其中谷物在小心控制的條件下浸泡于水中，以軟化谷粒，且促進成分的分離。含油的胚漂浮在水性溶液的表面，且被移出，通過加水、脫水、研磨、篩選、離心和洗滌的方法，將淀粉與蛋白質(zhì)分離并被純化。難點在于將淀粉顆粒從構(gòu)成谷物胚乳的蛋白質(zhì)及細胞壁之復雜基質(zhì)中松開。據(jù)信，這種困難的一個原因是分子內(nèi)或分子間二硫鍵的存在，其使蛋白質(zhì)不易溶解，且對蛋白酶不敏感，抑制淀粉顆粒從谷物中的蛋白質(zhì)基質(zhì)中釋放。目前，用于減少這些鍵的主要方法使將谷物在二氧化硫存在下浸漬，但是這種方法成本高，有害環(huán)境且不甚有效。
一些突變賦予了玉米谷粒胚乳的蛋白質(zhì)基質(zhì)有益的作用(粉狀和不透明)，但破壞了谷粒完整性。轉(zhuǎn)基因硫氧還蛋白表達提供了一些這樣的優(yōu)點，而不產(chǎn)生與這類突變相關(guān)的谷粒完整性問題。
硫氧還蛋白的收獲后或加工依賴性活性具有同樣的有益作用。例如，在一個實施方案中，硫氧還蛋白酶被導向細胞區(qū)室中并在其中累積。在種子物理破壞后發(fā)生蛋白質(zhì)還原。在另一個實施方案中，經(jīng)過浸漬休眠的胚乳硫氧還蛋白被活化。在一個優(yōu)選實施方案中，本發(fā)明提供了一種表達熱穩(wěn)定的轉(zhuǎn)基因硫氧還蛋白和硫氧還蛋白還原酶的植物，如來自高嗜熱生物的硫氧還蛋白和硫氧還蛋白還原酶，例如除非在高溫下(如，高于50℃)否則無明顯活性的硫氧還蛋白和硫氧還蛋白還原酶。在一個實施方案中，在胚乳中熱穩(wěn)定的硫氧還蛋白和硫氧還蛋白還原酶與通過其他熱穩(wěn)定酶的表達之糖化作用協(xié)同。飼料應用轉(zhuǎn)基因硫氧還蛋白和/或硫氧還蛋白還原酶在谷物中的表達也可用于改善尤其是動物飼料中與可消化性相關(guān)的谷物特性。飼料蛋白質(zhì)對蛋白酶的敏感性是時間及蛋白質(zhì)構(gòu)型的函數(shù)。谷粒破碎作為蒸汽制片(steamflaking)常常用于飼料配制中。這些方法均設(shè)計用于有益于谷粒的可消化性。在動物胃中更易破壞其完整性的松軟谷粒是期望的。蛋白質(zhì)間構(gòu)象的約束和交聯(lián)是蛋白酶敏感性的主要決定因素。由增加的硫氧還蛋白表達修飾這些鍵可有助于消化。玉米干磨法/粗玉米粉在制粒生產(chǎn)和粗玉米粉生產(chǎn)中蛋白質(zhì)含量和質(zhì)量是重要的決定因素。二硫鍵的減少改變了玉米粉的性質(zhì)，使得其適于用做小麥替代品，尤其是由高蛋白質(zhì)白玉米變種制備的玉米粉。大豆破碎半數(shù)以上的美國大豆作物被破碎或研磨，所得低脂大豆粉或脫脂大豆粉(或粗粒)中的蛋白質(zhì)質(zhì)量對于隨后的加工非常重要。大豆加工物流的蛋白質(zhì)產(chǎn)量及質(zhì)量經(jīng)濟上十分重要，且主要取決于蛋白質(zhì)構(gòu)象。通過在水溶性蛋白質(zhì)級分中增加轉(zhuǎn)基因硫氧還蛋白和/或硫氧還蛋白還原酶的表達增加硫氧還蛋白活性增加了蛋白質(zhì)溶解性，由此增加蛋白質(zhì)產(chǎn)量。在堿性條件下通過脫脂大豆粉的水性提取促進回收。通過轉(zhuǎn)基因硫氧還蛋白和/或硫氧還蛋白還原酶的表達增加硫氧還蛋白活性，還降低了對有效提取所需的pH，由此降低了加入的氫氧化鈣或氫氧化鈉，并且減少了隨后用于酸沉淀加入的酸，實現(xiàn)了無堿性破壞的蛋白質(zhì)有效回收，降低了水的消耗及加工工廠的廢物排放(含有主要的生物耗氧量)。
蛋白質(zhì)的氧化還原狀況影響大豆蛋白質(zhì)提供的功能性，如溶解性、水吸收、粘度、凝聚/粘附、膠凝和彈性。通過如上述增加硫氧還蛋白活性增強了在大豆蛋白質(zhì)濃縮物生產(chǎn)和大豆蛋白質(zhì)分離物蛋白酶水解過程中的纖維去除。類似地，如上關(guān)于玉米所述，通過轉(zhuǎn)基因硫氧還蛋白和/或硫氧還蛋白還原酶的表達增加硫氧還蛋白活性，提高了動物飼料中酶活化大豆粉的功能性，大豆粗粉級分蒸汽制粉級分的可溶性。
盡管優(yōu)選靶定于細胞區(qū)室中的且為熱穩(wěn)定的轉(zhuǎn)基因硫氧還蛋白和/或硫氧還蛋白還原酶，如上述，提供了在種子發(fā)育過程中以及加工過程中蛋白質(zhì)修飾的方法，以避免遇到對作為種子發(fā)育過程中硫氧還蛋白活性的結(jié)果之儲存蛋白質(zhì)積累的明顯不利作用。另外，作為加工酶可加入硫氧還蛋白，因為(與玉米濕磨法相反)直到谷物完整性被破壞之前(破碎和油提取)不需要破壞二硫鍵。用于異源表達的硫氧還蛋白和硫氧還蛋白還原酶的選擇硫氧還蛋白，硫氧還蛋白還原酶和蛋白質(zhì)二硫鍵異構(gòu)酶(PDI)基因見于真核生物、真細菌以及古細菌，包括嗜高溫生物，如詹氏甲烷球菌(Methanococcus iannaschii)和閃爍古生球菌(Archaeoglobusfulgidus)。特定基因的選擇部分取決于預期的目的。為了本發(fā)明的方法，優(yōu)選的硫氧還蛋白具有以下特性1.熱穩(wěn)定性來自嗜高溫生物的硫氧還蛋白和相關(guān)蛋白質(zhì)在高溫下(＞50℃)發(fā)現(xiàn)有增加的穩(wěn)定性，且在室溫下相對地低活性。從嗜高溫生物例如從古細菌(如，詹氏甲烷球菌和閃爍古生球菌)或其他嗜高溫生物中表達TRX和/或TR，優(yōu)選地用于在種子發(fā)育過程中表達，使得直到谷物被浸漬時或在高溫下加工時硫氧還蛋白活性才明顯增加。大多數(shù)谷物加工方法包括或適于高溫步驟。因此優(yōu)選熱穩(wěn)定的硫氧還蛋白和硫氧還蛋白還原酶。熱穩(wěn)定的是指，在高溫下酶優(yōu)勢活化，例如，高于40℃，最優(yōu)選高于50℃，例如對于濕磨法為45-60℃，甚至更高，如45-95℃。2.底物敏感性也可通過選擇優(yōu)先作用于某些蛋白質(zhì)(如基質(zhì)中的結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì))且對關(guān)鍵的代謝酶有低活性的硫氧還蛋白，降低種子發(fā)育過程中的不期望的作用。多種TRX顯示與在氧化還原控制下的酶的不同的反應性。因此，能選擇主要作用于期望的靶標，最小化過量表達的副作用。
合適的熱穩(wěn)定的硫氧還蛋白和硫氧還蛋白還原酶包括如下來自詹氏甲烷球菌的硫氧還蛋白序列(SEQ ID NO1；gi|1591029)MSKVKIELFTSPMCPHCPAAKRVVEEVANEMPDAVEVEYINVMENPQKAMEYGIMAVPTIVINGDVEFIGAPTKEALVEAIKKRL來自閃爍古生球菌的硫氧還蛋白序列(SEQ ID NO2；gi|2649903)(trx-1)MPMVRKAAFYAIAVISGVLAAVVGNALYHNFNSDLGAQAKIYFFYSDSCPHCREVKPYVEEFAKTHNLTWCNVAEMDANCSKIAQEFGIKYVPTLVIMDEEAHVFVGSDEVRTAIEGMK來自閃爍古生球菌的硫氧還蛋白序列(SEQ ID NO3；gi|2649838)(trx-2)MVFTSKYCPYCRAFEKVVERLMGELNGTVEFEVVDVDEKRELAEKYEVLMLPTLVLADGDEVLGGFMGFADYKTAREAILEQISAFLKPDYKN來自閃爍古生球菌的硫氧還蛋白序列(SEQ ID NO4；gi|2649295)(trx-3)MDELELIRQKKLKEMMQKMSGEEKARKVLDSPVKLNSSNFDETLKNNENVVVDFWAEWCMPCKMIAPVIEELAKEYAGKVVFGKLNTDENPTIAARYGISAIPTLIFFKKGKPVDQLVGAMPKSELKRWVQRNL來自閃爍古生球菌的硫氧還蛋白序列(SEQ ID NO5；gi|2648389)(trx-4)MERLNSERFREVIQSDKLVVVDFYADWCMPCRYISPILEKLSKEYNGEVEFYKLNVDENQDVAFEYGIASIPTVLFFRNGKVVGGFIGAMPESAVRAEIEKALGA來自詹氏甲烷球菌的硫氧還蛋白(trxB)序列(SEQ ID NO6gi|1592167)MIHDTIIIGAGP GGLTAGIYAMRGKLNALCIE KENAGGRIAEAGIVENYPGFEEIRGYELAEKFKNHAEKFKLPIIYDEVIKIETKERPFKVITKNSEYLTKTIVIATGTKPKKLGLNEDKFIGRGISYCTMCDAFFYLNKEVIVIGRDTPAIMSAINLKDIAKKVIVITDKSELKAAESIMLDKLKEANNVEIIYNAKPLEIVGEERAEGVKISVNGKEEIIKADGIFISLGHVPNTEFLKDSGIELDKKGFIKTDENCRTNIDGIYAVGDVRGGVMQVAKAVGDGCVAMANIIKYLQKL來自閃爍古生球菌的硫氧還蛋白序列(SEQ ID NO7；gi|2649006)(trxB)MYDVAIIGGGPAGLTAALYSARYGLKTVFFETVDPVSQLSLAAKIENYPGFEGSGMELLEKMKEQAVKAGAEWKLEKVERVERNGETFTVIAEGGEYEAKAIIVATGGKHKEAGIEGESAFIGRGVSYCATCDGNFFRGKKVIVYGSGKEAIEDAIYLHDIGCEVTIVSRTPSFRAEKALVEEVEKRGIPVHYSTTIRKIIGSGKVEKVVAYNREKKEEFEIEADGIFVAIGMRPATDVVAELGVERDSMGYIKVDKEQRTNVEGVFAAGDCCDNPLKQVVTACGDGAVAAYSAYKYLTS。
編碼用于本發(fā)明的蛋白質(zhì)之基因優(yōu)選地通過利用植物優(yōu)選的密碼子反編譯而設(shè)計，以增加G-C含量和去除有害序列，如下詳述。蛋白質(zhì)的活性可通過DNA重排或其他方法增強，如下述。因此，本發(fā)明包含來自這些蛋白質(zhì)的蛋白質(zhì)，尤其是與保留了硫氧還蛋白或硫氧還蛋白還原酶活性的蛋白質(zhì)基本上相似的蛋白質(zhì)。
為了在種子中構(gòu)建硫氧還蛋白表達用于在谷物發(fā)育中的活性，優(yōu)選指導TRX和TR的種子特異性表達的啟動子，其靶向于儲存物，使得酶對儲存蛋白質(zhì)有期望的作用，這在一些應用中是期望的。但是，在本發(fā)明中，通常期望在種子中構(gòu)建硫氧還蛋白和/或硫氧還蛋白還原酶的表達，用于在谷物形成過程中的累積且無活性。利用了數(shù)種策略，以產(chǎn)生表達轉(zhuǎn)基因硫氧還蛋白和/或硫氧還蛋白還原酶而對正常種子發(fā)育無明顯損害的種子。如(i)使活性硫氧還蛋白或硫氧還蛋白還原酶區(qū)室化，使得其不與靶蛋白質(zhì)明顯相互作用，例如通過導向于造粉體或在造粉體中表達。采用質(zhì)體靶向序列指導在造粉體中的積累?；蛘?，利用分泌信號將硫氧還蛋白和/或硫氧還蛋白還原酶導向于細胞壁的胞外位置中?；蜃罱K，在單子葉植物中，利用在種子發(fā)育過程中于細胞類型(如糊粉)中表達將硫氧還蛋白和/或硫氧還蛋白還原酶與胚乳中其余的儲存成分分隔。
(ii)從嗜熱生物中構(gòu)建硫氧還蛋白和/或硫氧還蛋白還原酶的表達。在發(fā)育過程中在室溫下(在田間最高為38-39℃)沒有或幾乎沒有活性的酶不太會引起問題。因此優(yōu)選地，酶主要在高溫下有活性，例如，高于40℃，對于濕磨法最優(yōu)選地為45-60℃，甚至更高，例如，45-90℃。
(iii)將硫氧還蛋白和/或硫氧還蛋白還原酶置于誘導型啟動子控制之下，例如化學誘導型啟動子，創(chuàng)傷誘導型啟動子或反式激活蛋白-調(diào)節(jié)的啟動子，其經(jīng)表達反式激活蛋白的植物授粉后被活化。
(iv)利用具有對于特定硫氧還蛋白還原酶有特異性需求的硫氧還蛋白，使得硫氧還蛋白或硫氧還蛋白還原酶的活性分別通過適當?shù)牧蜓踹€蛋白或硫氧還蛋白還原酶的獲得而被適當?shù)恼{(diào)節(jié)。例如，在不同植物中表達硫氧還蛋白和硫氧還蛋白還原酶，使活性組合僅在經(jīng)表達互補性(complimentary)酶的植物授粉后的種子中可得?；蛘?，將硫氧還蛋白或硫氧還蛋白還原酶局限于細胞中，例如在質(zhì)體、液泡或質(zhì)外體中，如上述，使得直到谷物被加工時才可得。谷物加工方法本發(fā)明因此提供了一種利用硫氧還蛋白和/或硫氧還蛋白還原酶增強淀粉從蛋白質(zhì)基質(zhì)中分離的新方法。在第一個實施方案中，發(fā)現(xiàn)硫氧還蛋白在多種種子加工應用中有用，包括濕磨法、干磨法、油料種子加工、大豆加工、小麥加工和面粉/生面團質(zhì)量，最優(yōu)選地是谷物，尤其是玉米的濕磨。
因此，本發(fā)明提供了一種方法·以改進濕磨效率或增加制粉產(chǎn)量，·以增加淀粉和蛋白質(zhì)的分離效率，·以增加從谷物中的淀粉和可溶性蛋白質(zhì)的產(chǎn)量，或·以增加蛋白質(zhì)在水中或其他溶劑中的溶解性，該方法包括在補加有硫氧還蛋白和/或硫氧還蛋白還原酶的存在下浸漬谷物，且分離谷物中的淀粉和蛋白質(zhì)成分。
一般地，浸漬在制粉前進行，但可在其后進行，在提取工藝方法中可能有一次以上的制粉或浸漬步驟，在浸漬過程中或浸漬后的過程中增加從種子中的蛋白質(zhì)產(chǎn)量。優(yōu)選地，通過在由其上收獲谷物的植物中表達轉(zhuǎn)基因可提供補充性的硫氧還蛋白和/或硫氧還蛋白還原酶。
本發(fā)明進一步提供·硫氧還蛋白或硫氧還蛋白還原酶在一種方法中的用途，所述方法用于在例如上述任一方法中改善制粉效率或增加淀粉或蛋白質(zhì)的制粉產(chǎn)量·浸漬水，其中包含由有效量的硫氧還蛋白和/或硫氧還蛋白還原酶以促進谷物中淀粉與蛋白質(zhì)分離·谷物，其已經(jīng)接觸有效量的硫氧還蛋白以促進淀粉與蛋白質(zhì)的分離；和·淀粉或蛋白質(zhì)，其已經(jīng)通過上述方法被生產(chǎn)。
可通過向浸漬水中補加硫氧還蛋白還原酶和/或NADPH，增強上述方法中硫氧還蛋白的活性。通常存在于浸漬水中用于濕磨法的其他成分也可存在，如產(chǎn)生乳酸的細菌。優(yōu)選地，浸漬在約52℃溫度下進行22-50小時，因此期望在這些條件下硫氧還蛋白穩(wěn)定。谷物可以是雙子葉植物種子，例如，油料種子，如大豆、向日葵或canola，優(yōu)選為大豆；或者谷物可以是單子葉植物種子，例如玉米、小麥、燕麥、大麥、黑麥或稻，最優(yōu)選玉米。
硫氧還蛋白可以是帶有硫醇基的任一蛋白質(zhì)，其可被可逆地氧化形成二硫鍵，且在硫氧還蛋白還原酶存在下被NADPH還原。優(yōu)選地，硫氧還蛋白衍生于嗜熱生物，如上所述。用于本發(fā)明的硫氧還蛋白和/或硫氧還蛋白還原酶在一種經(jīng)工程化的微生物中(如酵母或曲霉屬(Aspergillus))穩(wěn)定地產(chǎn)生，或者在經(jīng)工程化的能進行極高表達的植物(如在大麥)中表達，例如在糖化過程中有活性的啟動子(如高pIα淀粉酶啟動子或其他赤霉素依賴性啟動子)控制下。然后將硫氧還蛋白(呈分泌的或提取的形式或與生產(chǎn)生物或其部分相結(jié)合)加入浸漬水中。
作為添加硫氧還蛋白于浸漬水中的替代方法或補充，可在待制粉的種子中直接表達酶。優(yōu)選地，在谷物成熟或受控工藝過程中表達酶。
因此，在另一個實施方案中，本發(fā)明提供一種在轉(zhuǎn)基因生物(如植物，例如谷物類，如大麥或玉米；或微生物中，例如酵母或曲霉屬)中以工業(yè)規(guī)模生產(chǎn)硫氧還蛋白的方法，例如，這樣一種方法，包括培養(yǎng)帶有表達硫氧還蛋白嵌合基因的轉(zhuǎn)基因生物，且任選地分離或提取硫氧還蛋白的步驟。
一種利用轉(zhuǎn)基因植物的方法，所述轉(zhuǎn)基因植物在種子成熟或萌發(fā)階段產(chǎn)生增加量的硫氧還蛋白，使得在種子發(fā)育過程中或在浸漬工藝中通過內(nèi)源性合成的硫氧還蛋白影響該種子中的蛋白質(zhì)的質(zhì)量，由此消除或降低在制粉前用外源性化學劑或酶處理的需要。
一種制備轉(zhuǎn)基因植物的方法，所述轉(zhuǎn)基因植物在種子成熟或萌發(fā)階段產(chǎn)生增加量的硫氧還蛋白，使得在種子發(fā)育過程中或在浸漬工藝中通過內(nèi)源性合成的硫氧還蛋白影響該種子中的蛋白質(zhì)的質(zhì)量，由此消除或降低在制粉前用外源性化學劑或酶處理的需要。
一種用于將谷物制粉的方法，其利用含有硫氧還蛋白的轉(zhuǎn)基因種子，得到高淀粉及可溶性蛋白質(zhì)的產(chǎn)量。硫氧還蛋白和硫氧還蛋白還原酶在轉(zhuǎn)基因植物中的表達本發(fā)明還包含一種轉(zhuǎn)基因生物，所述生物在其基因組中具有一種嵌合表達盒，所述表達盒包含一種在啟動子可操縱地控制下編碼熱穩(wěn)定的硫氧還蛋白或硫氧還蛋白還原酶的編碼區(qū)。
優(yōu)選地，轉(zhuǎn)基因生物是一種植物，其以該種植物中非天然存在的形式表達硫氧還蛋白和/或硫氧還蛋白還原酶，或其以該種植物非天然存在的高水平表達硫氧還蛋白。優(yōu)選地，在種子發(fā)育過程中在種子中表達硫氧還蛋白，且因此優(yōu)選在種子特異性啟動子的控制下。任選地，硫氧還蛋白的表達置于可誘導的或反式激活蛋白調(diào)節(jié)的啟動子的控制下，使得期望時，通過化學誘導或與反式激活蛋白雜交可活化表達。通過與液泡靶向序列融合將硫氧還蛋白適當?shù)匕卸ㄓ谥参锏囊号葜小?br> 在本發(fā)明中，將硫氧還蛋白序列與在植物中有活性的啟動子融合，且轉(zhuǎn)化入核基因組或質(zhì)體基因組。啟動子優(yōu)選為種子特異性的啟動子，如γ-玉米醇溶蛋白啟動子。啟動子可另外為化學誘導的啟動子，如煙草PR-la啟動子，或可以是化學誘導的反式激活蛋白調(diào)節(jié)的啟動子，其中反式激活蛋白在化學誘導的啟動子控制下；但是，有些情況中，組成型啟動子如CaMV 35S或Gelvin啟動子也可使用。帶有化學誘導的啟動子，轉(zhuǎn)化入植物的硫氧還蛋白基因的表達可在適當?shù)臅r機通過葉面施用化學誘導劑激活。
或者，硫氧還蛋白編碼序列在反式激活蛋白調(diào)節(jié)的啟動子控制下，且通過將用該序列轉(zhuǎn)化的植物與表達反式激活蛋白的第二種植物雜交，可實現(xiàn)表達。在本方法的優(yōu)選形式中，含有硫氧還蛋白編碼序列的第一種植物是種子親代，且為雄性不育的，而表達反式激活蛋白的第二種植物是授粉者。在種子中硫氧還蛋白的表達是通過將第一種植物與第二種植物間作，例如使得第一種植物被第二種授粉，且通過用由第二種親代之反式激活蛋白基因表達的反式激活蛋白激活反式激活蛋白調(diào)節(jié)的啟動子，在第一種植物的種子中表達硫氧還蛋白。
本發(fā)明因此提供了一種在例如硫氧還蛋白和/或硫氧還蛋白非天然表達的植物中表達硫氧還蛋白和/或硫氧還蛋白的植物，例如，一種含有編碼硫氧還蛋白的異源DNA序列的植物，所述DNA序列穩(wěn)定地整合入其核或質(zhì)體DNA，優(yōu)選地在一種可誘導型啟動子控制下，例如，化學可誘導的啟動子，例如與誘導型啟動子有效連接，或者在反式激活蛋白調(diào)節(jié)的啟動子控制下，其中，相應的反式激活蛋白在誘導型啟動子控制下，或在第二種植物中表達，使得通過與第二種植物雜交，可激活啟動子；其中硫氧還蛋白或硫氧還蛋白還原酶優(yōu)選為熱穩(wěn)定的；這種植物也包括其種子，其中種子任選地經(jīng)處理(如primed或包衣)和/或被包裝，例如，置于具有使用說明的袋中，包括從中收獲的種子，例如用于上述的制粉方法中。
本發(fā)明的轉(zhuǎn)基因植物可任選地包含用于增強硫氧還蛋白還原酶和/或NADPH產(chǎn)生的基因。
本發(fā)明還提供一種生產(chǎn)硫氧還蛋白的方法，包括培養(yǎng)如上述的硫氧還蛋白表達植物一種生產(chǎn)淀粉核和/或蛋白質(zhì)的方法，包括從如上述收獲的種子中提取淀粉或蛋白質(zhì)；及一種濕磨法，包括如上述浸漬表達硫氧還蛋白的植物之種子，且從中提取淀粉和/或蛋白質(zhì)。
本發(fā)明還提供了·一種植物表達盒，其包含編碼硫氧還蛋白或硫氧還蛋白還原酶的區(qū)域，優(yōu)選地硫氧還蛋白來自嗜熱生物，例如來自，例如如上述來自詹氏甲烷球菌或閃爍古生球菌，其中編碼區(qū)優(yōu)選地經(jīng)優(yōu)化以含有植物偏好的密碼子，所述編碼區(qū)與在植物中有功能的啟動子和終止序列連接，其中啟動子優(yōu)選為種子特異性啟動子或誘導型啟動子，例如化學誘導型啟動子或反式激活蛋白調(diào)節(jié)的啟動子，其由核反式激活蛋白調(diào)節(jié)(例如，當反式激活蛋白是T7 RNA聚合酶時為T7啟動子，其表達任選地在誘導型啟動子控制下)。
·一種載體，其含有這種植物中可表達的表達盒；·一種用這種載體轉(zhuǎn)化的植物；或·一種轉(zhuǎn)基因植物，在其基因組例如其核或質(zhì)體基因組中包含這種植物可表達的表達盒。
本發(fā)明還包含一種生產(chǎn)含有高水平硫氧還蛋白或硫氧還蛋白還原酶的谷物的方法，包括包括給含有異源表達盒的第一種植物用含有異源表達盒的第二種植物授粉，其中所述第一種植物中的表達盒含有反式激活蛋白調(diào)節(jié)的啟動子，其調(diào)節(jié)且與編碼硫氧還蛋白和/或硫氧還蛋白還原酶的DNA序列有效連接，第二種植物中的表達盒含有與編碼反式激活蛋白的DNA序列有效連接的啟動子，所述反式激活蛋白能調(diào)節(jié)該反式激活蛋白調(diào)節(jié)的啟動子；該方法還包含從如此授粉的植物中回收谷物。定義為確保說明書及權(quán)利要求書的清楚及一致的理解，提供如下定義在此使用的“表達盒”意思是能在植物細胞中引導基因表達的DNA序列，包括有效地與目的編碼區(qū)連接的啟動子，此編碼區(qū)有效地與終止區(qū)連接。編碼區(qū)通常編碼目的蛋白但也可編碼目的功能性RNA，例如在有義或反義方向抑制了特定基因(如反義RNA)的表達的反義RNA或非翻譯RNA?；蚩梢允乔逗系模馑际腔虻闹辽僖环N成分對于基因的至少另一種成分是異源的?；蛞部墒翘烊话l(fā)生的，但已以重組形式獲得，可用于植物的基因轉(zhuǎn)化。然而一般而言表達盒對于宿主是異源的，即表達盒的特定DNA序列不在宿主細胞中天然發(fā)生，并且必須通過轉(zhuǎn)化事件被引入宿主細胞或宿主細胞的祖先。
“核表達盒”是整合入宿主核DNA的表達盒。
“質(zhì)體表達盒”是整合入宿主質(zhì)體DNA的表達盒。在此描述的質(zhì)體表達盒可任選地包含一個多順反子操縱子，此操縱子包括位于單個啟動子(如反式激活蛋白介導的啟動子)的控制之下的兩個或更多的目的順反子編碼序列，例如，其中一個目的編碼序列編碼抑制clpP或其它質(zhì)體蛋白酶表達的反義mRNA，以此增強其它編碼序列或目的序列表達的蛋白質(zhì)的積累。
在此使用的“異源的”意思是“不同于天然來源的”。例如，如果用從其它生物尤其是從另一個種的生物衍生的基因轉(zhuǎn)化植物，該基因?qū)τ谠撝参锸钱愒吹模⑶覍τ谠撝参锏臄y帶該基因的后代也是異源的。
“同質(zhì)體的”指一種植物、植物組織或植物細胞其中所有的質(zhì)體遺傳學上是相同的。當質(zhì)體未被轉(zhuǎn)化、突變或其它的基因改變時，這在植物中是正常狀態(tài)。在不同的組織或發(fā)育的不同階段，質(zhì)體可有不同的形式，如葉綠體、前質(zhì)體、黃化質(zhì)體、造粉體、色質(zhì)體等等。
“可誘導的啟動子”是僅當植物接觸某些特定的外部刺激物時才起始轉(zhuǎn)錄的啟動子，這不同于組成型啟動子或?qū)μ囟ńM織或器官或發(fā)育階段特異的啟動子。對于本發(fā)明特別優(yōu)選的是化學誘導型啟動子和創(chuàng)傷誘導型啟動子?；瘜W誘導型啟動子包括植物衍生的啟動子，如系統(tǒng)獲得的耐受途徑中的啟動子，例如PR啟動子，如PR-1、PR-2、PR-3、PR-4和PR-5啟動子，尤其是煙草PR-1a啟動子和擬南芥(Arabidopsis)PR-1啟動子，當植物接觸BTH和相關(guān)化學物時它們起始轉(zhuǎn)錄。見美國專利5，614，395，在此引入作為參考，以及WO98/03536，在此引入作為參考?；瘜W誘導型的啟動子也包括受體介導的系統(tǒng)，如由其它生物衍生來的系統(tǒng)，如類固醇依賴的基因表達、銅依賴的基因表達、四環(huán)素依賴的基因表達，以及尤其是應用保幼生長激素及其拮抗劑介導的果蠅(Drisophila)USP受體的表達系統(tǒng)，這在PCT/EP96/04224中有描述，在此引入作為參考，以及聯(lián)合使用受體的系統(tǒng)，如PCT/EP96/00686中描述的，在此引入作為參考。創(chuàng)傷誘導型啟動子包括蛋白酶抑制劑的啟動子，如馬鈴薯的蛋白酶抑制劑II啟動子，及其它參與創(chuàng)傷應答途徑的植物衍生的啟動子，如多酚氧化酶、LAP和TD的啟動子?？偟囊奀.Gatz，“基因表達的化學控制”，植物生理植物分子生物學年報，(Annu.Rev.Plant Physiol.PlantMol.Biol.)(1997)4889-108，其內(nèi)容在此引入作為參考。反式激活蛋白調(diào)節(jié)的啟動子在下面詳述，并且可通過將一種植物與表達反式激活蛋白的第二種植物雜交而誘導，所述植物含有在反式激活蛋白調(diào)節(jié)的啟動子控制下的硫氧還蛋白基因。
“分離的DNA分子”是由于人工參與使核苷酸序列與其天然環(huán)境相分離而存在，且因此非天然產(chǎn)物。分離的核苷酸序列可以純的形式存在或存在于非天然環(huán)境中，如轉(zhuǎn)基因宿主細胞中。
“蛋白質(zhì)”如此處所述為由相應核苷酸序列編碼的完整蛋白質(zhì)，或由相應核苷酸序列的一部分編碼的蛋白質(zhì)的一部分。
“分離的蛋白質(zhì)”是由分離的核苷酸序列編碼的蛋白質(zhì)，因而非天然產(chǎn)物。分離的蛋白質(zhì)可以純的形式存在或存在于非天然環(huán)境，如轉(zhuǎn)基因宿主細胞，其中在等基因轉(zhuǎn)基因宿主細胞中蛋白質(zhì)正常下不表達，或以不同形式或不同的量表達。
“植物”是指任一植物，或在任一發(fā)育階段中的植物部分，是特別旨在涵蓋被粉碎、破壞或處死的植物和植物材料，以及存活的植物，植物切條、細胞或組織培養(yǎng)物及種子。
DNA改組DNA改組是指在DNA分子中導入(優(yōu)選隨機導入)突變或重排，或在兩個或列多DNA分子間產(chǎn)生(優(yōu)選隨機產(chǎn)生)DNA序列交換的方法。DNA改組所獲得的DNA分子是至少來源于一個模板DNA分子的非天然存在的改組DNA分子。相對模板DNA編碼的酶而言，改組DNA分子編碼修飾的酶，而且優(yōu)選具有改變的生物學活性。
最廣義地來說，當在此對于核苷酸序列使用時，術(shù)語“基本上類似”意思是一種對應于參照核苷酸序列的核苷酸序列，其中相應的序列編碼一種與參照核苷酸序列編碼的多肽有基本上相同的結(jié)構(gòu)和功能的多肽，例如，只發(fā)生不影響多肽功能的氨基酸改變。希望地，基本上相似的核苷酸序列編碼參照核苷酸序列編碼的多肽?；旧项愃频暮塑账嵝蛄信c參照核苷酸序列之間同一性的百分數(shù)希望地為至少80％，更希望地為至少85％，優(yōu)選地至少90％。使用Smith-Waterman序列對比算法進行序列對比(見，例如，Waterman，M.S.《計算生物學介紹圖譜、序列與基因組》。Chapman&Hall.倫敦1995.ISBN 0-412-99391-0，或http//www-hto.usc.edu/software/seqaln/indes.html)。localS程序1.16版使用下列參數(shù)區(qū)配1，罰錯配0.33，開放罰區(qū)間(open-gap)2，擴展罰區(qū)間(extended-gap)2。
與參照核苷酸序列“基本上類似的”核苷酸序列在下列條件下可與參照核苷酸序列雜交7％十二烷基硫酸鈉(SDS)、0.5M NaPO4、1mMEDTA，50℃，用2×SSC、0.1％SDSD在50℃下洗滌，更希望的是7％十二烷基硫酸鈉(SDS)、0.5M NaPO4、1mM EDTA，50℃，用1×SSC、0.1％SDSD在50℃下洗滌，更希望的是7％十二烷基硫酸鈉(SDS)、0.5MNaPO4、1mM EDTA，50℃，用0.5×SSC、0.1％SDSD在50℃下洗滌，優(yōu)選的是7％十二烷基硫酸鈉(SDS)、0.5M NaPO4、1mM EDTA，50℃，用0.1×SSC、0.1％SDSD在50℃下洗滌，更優(yōu)選的是7％十二烷基硫酸鈉(SDS)、0.5M NaPO4、1mM EDTA，50℃，用0.1×SSC、0.1％SDSD在65℃下洗滌。
當在此對于蛋白質(zhì)使用時，術(shù)語“基本上類似”意思是一種對應于參照蛋白質(zhì)的蛋白質(zhì)，其中該蛋白質(zhì)與參照蛋白質(zhì)有基本上相同的結(jié)構(gòu)和功能，例如，只發(fā)生不影響多肽功能的氨基酸變化。當用于蛋白質(zhì)或氨基酸序列時，基本上類似的與參照蛋白質(zhì)或氨基酸序列之間的同一性百分數(shù)希望地至少為80％。更希望地85％，優(yōu)選地至少90％，更優(yōu)選地至少95％，再更優(yōu)選地至少90％。
“反式激活蛋白”是一種蛋白質(zhì)，通過其本身或與一種或多種其它蛋白質(zhì)的聯(lián)合，能導致位于相應反式激活蛋白介導的啟動子控制下的編碼區(qū)轉(zhuǎn)錄。反式激活蛋白系統(tǒng)的實例包括噬菌體T7基因10啟動子，其轉(zhuǎn)錄的激活依賴于特異的RNA聚合酶如噬菌體T7 RNA聚合酶。反式激活蛋白一般是RNA聚合酶或DNA結(jié)合蛋白，它能與特定的啟動子相互作用以起始轉(zhuǎn)錄，方法是直接激活該啟動子或滅活阻遏基因，如抑制阻遏蛋白的表達或積累。DNA結(jié)合蛋白可以是包含一個與適當轉(zhuǎn)錄激活蛋白結(jié)構(gòu)域連接的結(jié)合區(qū)(如GAL4結(jié)合區(qū))的嵌合蛋白。某些反式激活蛋白系統(tǒng)可具有多重反式激活蛋白，例如對于啟動子識別、DNA結(jié)合、或轉(zhuǎn)錄激活不僅需要聚合酶而且需要特定亞單位(sigma因子)的啟動子。反式激活蛋白優(yōu)選地對于植物是異源的.微生物基因的修飾以優(yōu)化在植物中的核表達如果希望，本申請中描述的克隆硫氧還蛋白基因可被修飾以用于在轉(zhuǎn)基因植物宿主中表達。例如，衍生自微生物來源的基因在植物中的轉(zhuǎn)基因表達，需要對這些基因加以修飾以實現(xiàn)并且優(yōu)化其在植物中的表達。特別是，編碼分隔的酶但其在天然微生物中被同一轉(zhuǎn)錄物編碼的細菌開放閱讀框，其在植物中在分隔的轉(zhuǎn)錄物上可被最好地表達。為達到這一點，個別分離每個微生物開放閱讀框(ORF)，并在提供了開放閱讀框5′末端的植物啟動子序列和開放閱讀框3′末端的植物轉(zhuǎn)錄終止子的表達盒內(nèi)克隆。分離的開放閱讀框序列優(yōu)選地包括起始ATG密碼子和終止STOP密碼子，但可包括除起始ATG和STOP密碼子之外的其它序列。另外，開放閱讀框可被截短，但仍保留需要的活性；對特別長的開放閱讀框，保留活性的截短形式可優(yōu)選地用于在轉(zhuǎn)基因生物中表達。
“植物啟動子”和“植物轉(zhuǎn)錄終止子”意思是在植物細胞內(nèi)有作用的啟動子和轉(zhuǎn)錄終止子。這包括可從非植物來源如病毒(一個例子包括花椰菜花葉病毒或農(nóng)桿菌Ti/Ri質(zhì)粒的章魚堿合酶基因)衍生的啟動子和轉(zhuǎn)錄終止子。
在某些情況中，開放閱讀框編碼序列和相鄰序列的修飾是不需要的，在這些情況中，足以分離包含目的開放閱讀框的片段并將其插入植物啟動子的下游。然而優(yōu)選的，應盡可能少地留有或去除連接于ATG上游和STOP密碼子下游的相鄰微生物序列。實際中，這種結(jié)構(gòu)依賴于限制位點的可用性。
其它情況中，衍生自微生物來源基因的表達可引起表達中的問題。這些問題在本領(lǐng)域中已經(jīng)很好地表征，對特定來源如芽孢桿菌(Bacillus)衍生的基因尤為常見。這些基因的修飾可用本領(lǐng)域中眾所周知的技術(shù)進行。以下問題是可能遇到的典型情況1.密碼子使用植物中優(yōu)選的密碼子使用不同于特定微生物中優(yōu)選的密碼子使用。對比克隆的微生物開放閱讀框內(nèi)的密碼子使用與植物基因中的使用(尤其是靶植物的基因)，將能鑒定開放閱讀框內(nèi)應優(yōu)選地改變的密碼子。一般植物進化趨向于單子葉植物的第三個堿基位置是核苷酸C和G的強烈偏好性，而雙子葉植物在此位置經(jīng)常使用核苷酸A或T。通過修飾基因以引入對特定靶轉(zhuǎn)基因物種優(yōu)選的密碼子使用，可以克服許多以下描述的GC/AT含量和非常規(guī)剪接的問題。2.GC/AT含量植物基因一般具有多于35％的GC含量。富含A和T核苷酸的開放閱讀框序列在植物中能引起一些問題。首先，ATTTA的基元被認為導致信息的去穩(wěn)定作用，并在許多短壽mRNA的3′末端被發(fā)現(xiàn)。其次，認為信息內(nèi)不恰當?shù)奈恢锰幘巯佘账峄盘朅ATAAA的出現(xiàn)引起轉(zhuǎn)錄的提前截短。另外，單子葉植物可識別富含AT的序列作為剪接位點(見下)。3.與起始甲硫氨酸相鄰的序列植物不同于微生物之處在于它們的信息沒有確定的核糖體結(jié)合位點。更確切地，據(jù)信核糖體附著于信息的5′末端，并且掃描第一個可得到的ATG，在此開始翻譯。然而，據(jù)信與ATG相鄰的一定核苷酸有偏好性，并且可通過在ATG處包含真核共有翻譯起始子增強微生物基因的表達。Ciontech(1993/1994目錄，210頁)建議序列GTCGACCATGGTC(SEQ IDNo8)作為在植物中表達大腸桿菌uidA基因的共有翻譯起始子。另外，Joshi(NAR 156643-6653(1987))對比了許多與ATG相鄰的植物序列，建議共有序列TAAACAATGGCT(SEQ ID No9)。在植物中表達微生物開放閱讀框中遇到困難的情況下，在起始ATG處包含這些序列之一可改善翻譯。在這些情況中，共有序列的最后三個核苷酸可能不適合包含在由于第二個AA殘基的修飾引起的修飾過的序列中。與起始甲硫氨酸相鄰的優(yōu)選的序列在不同的植物種之間可以不同。對位于GenBank數(shù)據(jù)庫中的14個玉米基因的調(diào)查提供了以下結(jié)果14個玉米基因中起始ATG之前的位點-10 -9 -8 -7 -6 -5 -4 -3 -2 -1C3846256010 7T3034321110A2314323723G6360654615
可對希望的待引入硫氧還蛋白基因的植物物種進行這種分析，并且修飾與ATG相鄰的序列以引入優(yōu)選的核苷酸。4.非正常剪接位點的去除從非植物來源克隆的基因和未對在植物中表達進行優(yōu)化的基因也可能包含植物中識別為5′或3′剪接位點的基元，并被切割，因此產(chǎn)生截短的或缺失的信息。這些位點的去除可應用申請WO97/02352中描述的技術(shù)，在此引入作為參考。
編碼序列和相鄰序列的修飾技術(shù)為本領(lǐng)域周知。假使微生物開放閱讀框的起始表達很低并且認為適合進行對上述序列的修飾，可根據(jù)本領(lǐng)域中眾所周知的方法完成合成基因的構(gòu)建。例如，描述于發(fā)表的專利公開EP0 385 962(Monsanto)，EP 0 359 472(Lubrizol)和WO93/07278(Ciba-Geigy)。在大多數(shù)例子中，優(yōu)選地應用瞬時測定方案(在本領(lǐng)域中眾所周知)測定基因構(gòu)建體在轉(zhuǎn)移至轉(zhuǎn)基因植物之前的表達。
質(zhì)體轉(zhuǎn)化的主要優(yōu)點是質(zhì)體普遍能表達基本無修飾的細菌基因。不需要如上描述的密碼子適應性改造等，并且質(zhì)體能表達在單個啟動子控制下的多個開放閱讀框架。植物轉(zhuǎn)化載體和選擇性標記的構(gòu)建多種轉(zhuǎn)化載體可用于植物轉(zhuǎn)化，本發(fā)明的基因可用于與這些載體中的任一個連接。所用載體的選擇取決于優(yōu)選轉(zhuǎn)化技術(shù)和用于轉(zhuǎn)化的目標物種。對某些靶物種，可優(yōu)選不同的抗生素或除草劑篩選。通常用于轉(zhuǎn)化的選擇性標記包括nptII基因，其賦予對卡那霉素和相關(guān)抗生素的抗性(Viera&Messing，基因19259-268，(1982)；Bevan等，自然，304184-187(1983))，bar基因，其賦予對除草劑膦絲菌素的抗性(White等，核酸研究181062(1990)，Spencer等，應用遺傳學理論(Theor.Appl.Genet.)79625-631(1990))，hpt基因，其賦予對抗生素潮霉素的抗性(Blochinger&Dggelmam，分子細胞生物學42929-2931)，dhfr基因，其賦予對氨甲蝶呤的抗性(Bourouis等，EMBOJ.2(7)1099-1104(1983))，以及甘露糖-6-磷酸異構(gòu)酶基因，其賦予代謝甘露糖的能力，如US 5767378所述。構(gòu)建植物表達盒的要求準備在轉(zhuǎn)基因植物中表達的基因序列首先裝配于位于合適的啟動子之后并位于合適的轉(zhuǎn)錄終止子上游的表達盒中。這些表達盒然后可被容易地轉(zhuǎn)移至上述的植物轉(zhuǎn)化載體中。
1.啟動子選擇在表達盒中使用的啟動子的選擇將決定轉(zhuǎn)基因植物中轉(zhuǎn)基因的空間和時間表達模式。選擇的啟動子將在特定的細胞型(如葉表皮細胞、葉肉細胞、根皮細胞)或在特定組織或器官(如根、葉或花)中表達轉(zhuǎn)基因，此選擇將反映硫氧還蛋白生物合成的希望的定位。本發(fā)明中，優(yōu)選種子特異性啟動子。另外，所選的啟動子可在光誘導的或其它瞬時調(diào)節(jié)啟動子之下驅(qū)動基因的表達。進一步的選擇是所選的啟動子可被外部刺激物，如應用特異的化學誘導劑或創(chuàng)傷誘導。這將提供僅當希望時才誘導硫氧還蛋白轉(zhuǎn)錄的可能性。
2.轉(zhuǎn)錄終止子多種轉(zhuǎn)錄終止子均可在表達盒中使用。它們負責轉(zhuǎn)基因和其正確的聚腺苷酸化之外的轉(zhuǎn)錄終止。合適的和已知在植物中起作用的轉(zhuǎn)錄終止子包括CaMV 35S終止子、tml終止子、胭脂氨酸合酶終止子、豌豆rbcS E9終止子。這些可用于單子葉植物和雙子葉植物。
3.增強或調(diào)節(jié)表達的序列已發(fā)現(xiàn)許多序列能增強轉(zhuǎn)錄單位內(nèi)的基因表達，這些序列可與本發(fā)明的基因結(jié)合使用以增強其在轉(zhuǎn)基因植物中的表達。
已發(fā)現(xiàn)多種內(nèi)含子序列能增強表達，尤其在單子葉植物細胞中。例如，發(fā)現(xiàn)當引入玉米細胞時，玉米Adhl基因的內(nèi)含子顯著增強位于同源啟動子之下的野生型基因的表達。發(fā)現(xiàn)內(nèi)含子1特別有效，且增強在與氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶基因的融合構(gòu)建體中的表達(Callis等人，基因發(fā)育(GenesDevelep)11183-1200(1987))。在相同的實驗系統(tǒng)中，玉米bronzel基因的內(nèi)含子在增強表達上具有相似的效果。內(nèi)含子序列已被常規(guī)引入植物轉(zhuǎn)化載體，一般在非翻譯前導序列中。
已知一定數(shù)量的由病毒衍生的非翻譯前導序列也可增強表達，且其在雙子葉植物細胞中尤其有效。特別是，煙草花葉病毒(TMV，“Ω-序列”)、玉米萎黃病斑點病毒(MCMV)和苜?；ㄈ~病毒(AMV)的前導序列在增強表達上已證明有效(如Gallie等人，核酸研究158693-8711(1987)；Skuzeski等人，植物分子生物學1565-79(1990))。
4.細胞內(nèi)基因產(chǎn)物的定向已知植物中存在定向基因產(chǎn)物的多種機制，也已表征了控制這些機制作用的序列的一些細節(jié)。氨基末端序列負責定向于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、質(zhì)外體以及從糊粉細胞的胞外分泌(Koehler和Ho，植物細胞2769-783(1990))。另外，氨基端序列聯(lián)合羧基端序列負責基因產(chǎn)物的液泡導向(Shinshi等人，植物分子生物學14357-368(1990))。通過將以上描述的合適的定向序列與目的轉(zhuǎn)基因序列融合，可能引導轉(zhuǎn)基因產(chǎn)物至任何細胞器或細胞區(qū)室。所選的信號序列應該包含已知的切割位點，構(gòu)建的融合體應考慮切割所需的切割位點之后的任何氨基酸。在某些情況中，可通過在切割位點與轉(zhuǎn)基因ATG之間添加少量的氨基酸或替換轉(zhuǎn)基因序列內(nèi)的某些氨基酸來滿足這一需要。
以上描述的細胞定向的機制不僅可與其同源啟動子結(jié)合使用，而且可與異源啟動子結(jié)合使用，從而實現(xiàn)啟動子轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)下的特異的細胞定向目的，此啟動子具有與衍生定向信號的啟動子不同的表達模式。表達盒構(gòu)建的實施例本發(fā)明包括任何在植物中可表達的啟動子調(diào)節(jié)之下的硫氧還蛋白基因的表達，而不論啟動子的來源如何。
此外本發(fā)明包括任何植物可表達的啟動子與任何硫氧還蛋白基因表達所需要或選擇的其它序列的聯(lián)合使用。這些序列包括但不限于，轉(zhuǎn)錄終止子、增強表達的外部序列(如內(nèi)含子[如Adh內(nèi)含子1]、病毒序列[如TMV-Ω])、以及意在將基因產(chǎn)物定向于特定細胞器和細胞區(qū)室的序列。
可使用多種化學調(diào)節(jié)劑以誘導在根據(jù)本發(fā)明轉(zhuǎn)化的植物中表達硫氧還蛋白或硫氧還蛋白還原酶編碼序列。在本公開內(nèi)容的上下文中，“化學調(diào)節(jié)劑”包括已知在植物中是PR-1a啟動子的誘導物的化學試劑(述于US 5，614，395)，或其相關(guān)的衍生物。用于本發(fā)明的化學可誘導硫氧還蛋白基因的一組優(yōu)選的調(diào)節(jié)劑基于苯并-1，2，3-噻二唑(BTH)結(jié)構(gòu)，包括但不限于以下類型的化合物苯并-1，2，3-噻二唑羧酸、苯并-1，2，3-噻二唑硫代羧酸、氰苯并-1，2，3-噻二唑、苯并-1，2，3-羧酸胺、苯并-1，2，3-噻二唑羧酸酰肼、苯并-1，2，3-噻二唑-7-羧酸、苯并-1，2，3-噻二唑-7-硫代羧酸、7-氰苯-1，2，3-噻二唑、苯并-1，2，3-噻二唑-7-羧酸胺、苯并-1，2，3-噻二唑-7-羧酸酰肼、苯并-1，2，3-噻二唑羧酸烷基酯，其中烷基包含一至六個碳原子、苯并-1，2，3-噻二唑-7-羧酸甲酯、苯并-1，2，3-噻二唑-7-羧酸正丙基酯、苯并-1，2，3-噻二唑-7-羧酸芐基酯、苯并-1，2，3-噻二唑-7-羧酸仲丁基酰肼，及其合適的衍生物。其它化學誘導型物包括，例如，苯甲酸、水楊酸(SA)、聚丙烯酸及其取代的衍生物；合適的取代基包括低級烷基、低級烷氧基、低級硫代烷基和鹵素。用于本發(fā)明的化學可誘導DNA序列的另一組調(diào)節(jié)劑基于吡啶羧酸結(jié)構(gòu)，如異煙酸結(jié)構(gòu)，優(yōu)選地是鹵代異煙酸結(jié)構(gòu)。優(yōu)選的是二氯異煙酸及其衍生物，如低級烷基酯。此類化合物的合適的調(diào)節(jié)劑是如，2，6-二氯異煙酸(INA)及其低級烷基酯，尤其是甲酯。
組成型表達肌動蛋白啟動子已知肌動蛋白的幾個同工型在大多數(shù)細胞型中表達，因此肌動蛋白啟動子是用作組成型啟動子適當選擇。尤其是，稻ActI基因的啟動子已被克隆和表征(McElroy等人，植物細胞2163-171(1990))。發(fā)現(xiàn)此啟動子的1.3kb片段包含水稻原生質(zhì)體中表達所需的所有調(diào)節(jié)元件。此外，已構(gòu)建了許多基于Actl啟動子特異地用于單子葉植物的表達載體(McElroy等人，分子基因遺傳學(Mol.Gen.Genet.)231150-160(1991))。它們引入了Actl-內(nèi)含子1、Adhl 5′側(cè)翼序列和(玉米醇脫氫酶基因的)Adhl-內(nèi)含子1和CaMV35S啟動子的序列。顯示最高表達的載體是35S和Actl內(nèi)含子或Actl 5′側(cè)翼序列和Actl內(nèi)含予的融合體。(GUS告基因的)起始ATG附近序列的優(yōu)化也增強表達。McElroy等人(分子基因遺傳學231150-160(1991))描述的啟動子表達盒可被方便地修飾以用于硫氧還蛋白基因的表達，并且尤其適用于單子葉植物宿主中。例如，包含該片段的啟動子可從McElroy結(jié)構(gòu)中去除，用來替換pCGN1761ENX中的雙35S啟動子，然后該載體可用于特異基因序列的插入。然后可將構(gòu)建的融合基因轉(zhuǎn)移至合適的轉(zhuǎn)化載體。在單獨的報道中，也發(fā)現(xiàn)帶有第一個內(nèi)含子的水稻Actl啟動子引導了在培養(yǎng)的大麥細胞中的高表達(Chibbar等人，植物細胞報道(Plant CellRep.)12506-509(1993))。
組成型表達遍在蛋白啟動子遍在蛋白是已知在許多細胞型中積累的另一種基因產(chǎn)物，它的啟動子已從幾個物種克隆，在轉(zhuǎn)基因植物中使用(如向日葵-Binet等人，植物科學7987-94(1991)，玉米-Christensen等人，植物分子生物學12619-632(1989))。玉米遍在蛋白已在轉(zhuǎn)基因單子葉系統(tǒng)中加以研究，并且其序列和為單子葉植物轉(zhuǎn)化構(gòu)建的載體公開于專利公開文本EP 0 342 926中。進一步，Taylor等人(植物細胞報道12491-495(1993))描述了一種載體(pAHC25)，它包含玉米遍在蛋白啟動子和第一個內(nèi)含子，以及經(jīng)微粒轟擊引入時其在許多單子葉植物細胞懸液中的高活性。遍在蛋白啟動子適于在轉(zhuǎn)基因植物尤其是單子葉植物中表達硫氧還蛋白基因。合適的載體是pAHC25的衍生物或本申請中描述的通過引入合適的遍在蛋白啟動子和/或內(nèi)含子序列被修飾的任何轉(zhuǎn)化載體。
根特異的表達本發(fā)明的表達硫氧還蛋白和硫氧還蛋白還原酶的另一個模式是根表達，例如，從根作物如甜菜和馬鈴著中增加提取淀粉和糖。一種合適的根啟動子由de Framond所描述(FEBS 290103-106(1991))，也在公開的專利申請EP 0 452 269中描述。此啟動子被轉(zhuǎn)移至合適的載體如pCGN1761ENX，以用于插入硫氧還蛋白或硫氧還蛋白還原酶基因及隨后將完整的啟動子-基因-終止子盒轉(zhuǎn)移至目的轉(zhuǎn)化載體。
創(chuàng)傷誘導型啟動子創(chuàng)傷誘導型啟動子也適用于硫氧還蛋白基因的表達。許多這種啟動子已被描述(如Xu等人，植物分子生物學22573-588(1993)，Logemann等人，植物細胞1151-158(1989)，Rohrmeier和Lehle，植物分子生物學22783-792(1993)，F(xiàn)irek等人，植物分子生物學22129-142(1993)，Warner等人，植物雜志(Plant J.)3191-201(1993))，并且均都適用于本發(fā)明。Logemann等人描述了雙子葉馬鈴薯Wunl基因的5′上游序列。Xu等人顯示雙子葉植物馬鈴薯的創(chuàng)傷誘導型啟動子(pin2)在單子葉植物水稻中有活性。進一步，Rohrmeier和Lehle描述了創(chuàng)傷誘導型的且可用于使用標準技術(shù)分離同源啟動子的玉米Wipl cDNA的克隆。相似地，F(xiàn)irek等人和Warner等人描述了單子葉植物藥用蘆筍(Asparagus officinalis)的創(chuàng)傷誘導型基因，它在局部創(chuàng)傷和病原體侵入部位表達。使用本領(lǐng)域眾所周知的克隆技術(shù)，可將這些啟動子轉(zhuǎn)移至合適的載體，與本發(fā)明的硫氧還蛋白基因融合，并用來在植物創(chuàng)傷部位表達這些基因。
葉綠體定向的表達Chen和Jagend開放閱讀框(生物化學雜志(J.Biol.Chem.)2682363-2367(1993))已描述了成功應用葉綠體轉(zhuǎn)運肽來輸入異源轉(zhuǎn)基因。所使用的肽是煙草Nicotiana plumbaginifolia的rbcS基因的轉(zhuǎn)運肽(Poulsen等人，分子基因遺傳學205193-200(1986))。使用限制酶DraI和SphI，或Tsp509I和SphI，編碼此轉(zhuǎn)運肽的DNA序列可被從質(zhì)粒prbcS-8B上切下并經(jīng)操作以與如上描述的任何結(jié)構(gòu)一起使用。DraI-SphI片段從相對于起始rbcS ATG的-58延伸至，并且包括，緊接輸入切割位點之后的成熟肽的第一個氨基酸(也是甲硫氨酸)，而Tsp509I-SphI片段從相對于起始rbcS ATG的-8延伸至，并且包括，成熟肽的第一個氨基酸。因此，可將這些片段適當?shù)夭迦肴魏嗡x的表達盒的多接頭，產(chǎn)生與所選啟動子(如35S，PR-1a、肌動蛋白、遍在蛋白等)的非翻譯前導序列融合的轉(zhuǎn)錄融合基因，而能使硫氧還蛋白或硫氧還蛋白還原酶基因插入轉(zhuǎn)運肽下游的正確的融合基因。雙子葉植物的轉(zhuǎn)化用于雙子葉植物的轉(zhuǎn)化技術(shù)在本領(lǐng)域中眾所周知，包括基于農(nóng)桿菌的技術(shù)和不需要農(nóng)桿菌的技術(shù)。非農(nóng)桿菌的技術(shù)包括原生質(zhì)體或細胞直接攝取外源遺傳物質(zhì)。這可通過PEG或電穿孔介導的攝取、粒子轟擊介導的運輸、或顯微注射來完成。這些技術(shù)的實例描述于Paszkowski等人，歐洲分子生物學會雜志EMBO J 32717-2722(1984)，Potrykus等人，分子基因遺傳學199169-177(1985)，Reich等人，生物技術(shù)41001-1004(1986)，以及Klein等人，自然32770-73(1987)。在每個例子中，應用本領(lǐng)域中已知的標準技術(shù)將轉(zhuǎn)化的細胞再生為整個植物。
以其高轉(zhuǎn)化效率和對許多不同種的廣泛應用，農(nóng)桿菌介導的轉(zhuǎn)化是用于轉(zhuǎn)化雙子葉植物的優(yōu)選的技術(shù)。用農(nóng)桿菌常規(guī)轉(zhuǎn)化的許多作物品種包括煙草、西紅柿、向日葵、棉花、油籽油菜、葡萄、馬鈴薯、大豆、苜蓿和白楊(EP 0 317 511(棉花)，EP 0 249 432(西紅柿)，WO87/07299(Brassica)，US 4，795，855(白楊))。農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化一般包括將攜帶目的外源DNA的二元載體(如pCIB200或pCIB2001)轉(zhuǎn)移至合適的農(nóng)桿菌菌株，這依賴于在共生Ti質(zhì)粒上或染色體上由宿主農(nóng)桿菌菌株攜帶的vir基因的完整性(如用于pCIB200和pCIB2001的CIB542株(Uknes等人，植物細胞5159-169(1993))。重組二元載體向農(nóng)桿菌的轉(zhuǎn)移通過三親本交配方法完成，使用攜帶重組二元載體的大腸桿菌、攜帶質(zhì)粒如pRK2013并能將重組二元載體轉(zhuǎn)移至靶農(nóng)桿菌株的輔助大腸桿菌菌株。另外，可通過DNA轉(zhuǎn)化將重組二元載體轉(zhuǎn)移至農(nóng)桿菌(Hofgen和Willmitzer，核酸研究169877(1988))。
通過重組農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化靶植物種通常包括農(nóng)桿菌與植物外植體的共培育，且依照在本領(lǐng)域眾所周知的方案。轉(zhuǎn)化的組織在帶有在二元質(zhì)粒T-DNA邊界之間存在的抗生素或除草劑抗性標記的選擇培養(yǎng)基上再生。也可利用粒子轟擊(biolistics)進行雙子葉植物轉(zhuǎn)化。對于大豆轉(zhuǎn)化優(yōu)選的方法見US 5024944。單子葉植物的轉(zhuǎn)化大多數(shù)單子葉植物種類的轉(zhuǎn)化現(xiàn)也已成為常規(guī)。優(yōu)選的技術(shù)包括使用PEG或電穿孔技術(shù)直接將基因轉(zhuǎn)移至原生質(zhì)體，以及使用粒子轟擊轉(zhuǎn)移至愈傷組織。可用單種DNA或多種DNA(即共轉(zhuǎn)化)進行轉(zhuǎn)化，這些方法都適用于本發(fā)明。共轉(zhuǎn)化的優(yōu)點是避免了復雜的載體構(gòu)建，以及產(chǎn)生具有目的基因和選擇性標記的非連鎖基因座的轉(zhuǎn)基因植物，如果希望能在隨后的子代中去除選擇性標記的話。然而，使用共轉(zhuǎn)化的一個缺點是分開的DNA種類整合入基因組的頻率低于100％(Schocher等人，生物技術(shù)41093-1096(1986))。
專利申請EP 0 292 435([1280/1281]，Ciba-Geigy)、EP 0 392 225(CibaGeigy)和WO 93/07278(Ciba-Geigy)描述了從玉米的一個優(yōu)良近交系制備愈傷組織和原生質(zhì)體、使用PEG或電穿孔轉(zhuǎn)化原生質(zhì)體、以及從轉(zhuǎn)化的原生質(zhì)體再生玉米植物的技術(shù)。Gordon-Kamm等人(植物細胞2603-618(1990))和Fromm等人(生物技術(shù)8833-839(1990))發(fā)表了使用粒子轟擊轉(zhuǎn)化A188-衍生的玉米株系的技術(shù)。此外，申請WO 93/07278(Ciba-Geigy)和Koziel等人(生物技術(shù)11194-200(1993))描述了經(jīng)粒子轟擊轉(zhuǎn)化玉米的優(yōu)良近交系的技術(shù)。此技術(shù)使用1.5-2.5mm長的未成熟的玉米胚，它是傳粉后14-15天從玉米穗上切下的，并且使用PDS-1000He Biolistics裝置用于轟擊。
進行水稻的轉(zhuǎn)化也可使用應用原生質(zhì)體和粒子轟擊的直接基因轉(zhuǎn)移技術(shù)。用于Japonica-型和lndica-型的原生質(zhì)體介導的轉(zhuǎn)化已有描述(Zhang等人，植物細胞報道7379-384(1988)；Shimamoto等人，自然338274-277(1989)；Datta等人，生物技術(shù)8736-740(1990))。使用粒子轟擊均可常規(guī)轉(zhuǎn)化這兩個類型(Christou等人，生物技術(shù)9957-962(1991))。
專利申請EP 0 332 581(Ciba-Geigy)描述了Pooideae原生質(zhì)體的產(chǎn)生、轉(zhuǎn)化和再生的技術(shù)。這些技術(shù)允許鴨茅屬(Dactylis)和小麥的轉(zhuǎn)化。而且，Vasil等人(生物技術(shù)10667-674(1992))描述了應用粒子轟擊轉(zhuǎn)入C型長期可再生愈傷組織細胞的小麥轉(zhuǎn)化，Vasil等人(生物技術(shù)111553-1558(1993))和Weeks等人(植物生理1021077-1084(1993))也描述了應用粒子轟擊未成熟胚和未成熟胚衍生的愈傷組織的小麥轉(zhuǎn)化。然而，一個優(yōu)選的用于小麥轉(zhuǎn)化的技術(shù)，包括通過粒子轟擊未成熟胚轉(zhuǎn)化小麥，并包括基因輸運前的高蔗糖或高麥芽糖步驟。轟擊前，任何數(shù)量的胚(長0.75-1mm)置于含3％蔗糖和3mg/12，4-D的MS培養(yǎng)基上(Murashiga和Skoog，Physiologia Plantarum 15473-497(1962))，用于可在暗處進行的體細胞胚的誘導。在選定的轟擊日，從誘導培養(yǎng)基上移出胚，將其置于滲壓劑上(即以希望的濃度一般是15％，添加了蔗糖或麥芽糖的誘導培養(yǎng)基)。將胚質(zhì)壁分離2-3小時，然后轟擊。一般是每個靶平板二十個胚，盡管不是關(guān)鍵的。用標準方法沉淀合適的攜帶基因的質(zhì)粒(如pCIB3064或pSG35)于微米尺寸的金粒子上。每個胚平板用DuPont Biolistics氦裝置轟擊且用約1000psi的爆發(fā)壓力，使用標準的80目的篩子。轟擊后，將胚放回暗處回復約24小時(仍在滲壓劑上)。24小時后，從滲壓劑中移出胚，將其放回誘導培養(yǎng)基，在再生之前放置約一個月。大約一個月后，將含發(fā)育的胚發(fā)生愈傷組織的胚外植體轉(zhuǎn)移至再生培養(yǎng)基(MS+1mg/lNAA，5mg/lGA)，它另外包含適當?shù)倪x擇試劑(在pCIB3064的情況中是10mg/lbasta，在pSOG35的情況中是2mg/l氨甲喋呤)。約一個月后，將發(fā)育的苗轉(zhuǎn)移至更大的被稱為“GA7”無菌容器中，它含有半強度的MS、2％蔗糖和相同濃度的選擇試劑。專利申請WO94/13822描述了小麥轉(zhuǎn)化的方法，在此引入作為參考。質(zhì)體轉(zhuǎn)化質(zhì)體轉(zhuǎn)化技術(shù)在美國專利5,451,513、5,545,817和5,545,818中有廣泛的描述，它們都由此明確地全面引入作為參考；在PCT申請WO95/16783號中有描述，由此全面引入作為參考；并在McBride等人(1994)美國國家科學院學報917301-7305中有描述，也在此全面引入作為參考。葉綠體轉(zhuǎn)化的基本技術(shù)包括將側(cè)翼為選擇性標記的克隆的質(zhì)體DNA區(qū)與目的基因一起引入合適的靶組織，如使用biolistics或原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化(如氯化鈣或PEG介導的轉(zhuǎn)化)。1到1.5kb的側(cè)翼區(qū)，稱為定向序列，方便了與質(zhì)體基因組的同源重組，并且因此允許質(zhì)體基因組特定區(qū)的替換或修飾。最初，葉綠體16S rRNA和賦予壯觀霉素和/或鏈霉素的抗性的rps12基因中的點突變被用作轉(zhuǎn)化的選擇性標記(Svab，乙，Hajdukiewicz，P.，和Maliga，P.(1990)美國國家科學院學報878526-8530，在此引入作為參考；Staub，J.M.和Maliga，P.(1992)植物細胞4，39-45，在此引入作為參考)。這導致了穩(wěn)定的同胞質(zhì)轉(zhuǎn)化體，其頻率是每100次轟擊靶葉大約產(chǎn)生一個轉(zhuǎn)化體。這些標記間克隆位點的存在允許用于引入外源基因質(zhì)體定向載體的產(chǎn)生(Staub，J.M.和Maliga，P.(1993)歐洲分子生物學會雜志12，601-606，在此引入作為參考)。獲得轉(zhuǎn)化頻率的實質(zhì)增加的方法是將隱性rRNA或r-蛋白抗生素抗性基因替換為顯性選擇標記，編碼壯觀霉素解毒酶氨基糖苷-3′-腺苷轉(zhuǎn)移酶的細菌aadA基因(Svab，Z.和Maliga，P.(1993)美國國家科學院學報90，913-917，在此引入作為參考)。以前，這個標記已成功用于綠藻Chlamydomonas reinhardtii衣藻質(zhì)體基因組的高頻率轉(zhuǎn)化(Goldschmidt-Clermont，M.(1991)核酸研究19，4083-4089，在此引入作為參考)。用于質(zhì)體轉(zhuǎn)化的其它選擇性標記在本領(lǐng)域中已知，并包括于本發(fā)明的范圍中。一般，轉(zhuǎn)化后需要大約15-20個細胞分裂周期來達到同質(zhì)體狀態(tài)。
通過同源重組，將基因插入每個植物細胞存在的環(huán)形質(zhì)體基因組的所有幾千個拷貝中的質(zhì)體表達，利用優(yōu)于核表達的基因的許多拷貝數(shù)使表達水平能輕易超過總可溶植物蛋白的10％。然而，這種高表達水平可造成潛在的存活問題，尤其是在植物生長和發(fā)育早期。表達對轉(zhuǎn)基因植物的生存高度有害的生物活性酶或某些蛋白質(zhì)也造成相似的問題，因為如果組成型地表達可能使其無法成功引入植物基因組。因此，一個方面，本發(fā)明把化學誘導型的煙草PR-1a啟動子(US 5,614,395引入作為參考)控制下在核基因組中葉綠體定向噬菌體T7 RNA聚合酶的表達與T7基因10啟動子/終止子序列調(diào)節(jié)的葉綠體報告轉(zhuǎn)基因結(jié)合在一起。例如，當對于母體遺傳的編碼β-葡糖醛酸酶(GUS)報告基因的uidA基因同胞質(zhì)的質(zhì)體轉(zhuǎn)化體被在細胞核中表達T7聚合酶的株系傳粉時，獲得攜帶兩個轉(zhuǎn)基因構(gòu)建體但不表達GUS蛋白的F1植物。僅在對葉使用PR-1a誘導化合物苯并(1，2，3)噻二唑-7-硫代羧酸S-甲酯(BTH)以后，才在這些植物的質(zhì)體中引發(fā)大量酶活化的GUS的合成。序列表中的序列的簡要描述SEQ ID NO1來自詹氏甲烷球菌的硫氧還蛋白之蛋白質(zhì)序列。
SEQ ID NO2來自閃爍古生球菌(trx-1)的硫氧還蛋白之蛋白質(zhì)序列。
SEQ ID NO3來自閃爍古生球菌(trx-2)的硫氧還蛋白之蛋白質(zhì)序列。
SEQ ID NO4來自閃爍古生球菌(trx-3)的硫氧還蛋白之蛋白質(zhì)序列。
SEQ ID NO5來自閃爍古生球菌(trx-4)的硫氧還蛋白之蛋白質(zhì)序列。
SEQ ID NO6來自詹氏甲烷球菌(trxB)的硫氧還蛋白之蛋白質(zhì)序列。
SEQ ID NO7來自閃爍古生球菌(trxB)的硫氧還蛋白之蛋白質(zhì)序列。
SEQ ID NO8 Clontech序列SEQ ID NO9 Joshi序列此處利用的標準重組DNA及分子克隆技術(shù)為本領(lǐng)域周知，例如，Sambrook等人，(1989)分子克隆，和Ausubel等人，(1994)當代分子生物學方法。實施例1用熱穩(wěn)定的硫氧還蛋白轉(zhuǎn)化玉米表達來自詹氏甲烷球菌的熱穩(wěn)定的硫氧還蛋白基因具有如下序列MSKVKIELFTSPMCPHCPAAKRVVEEVANEMPDAVEVEYINVMENPQKAMEYGIMAVPTIVINGDVEFIGAPTKEALVEAIKKRL(SEQ ID NO1)
其是通過利用如美國專利5625136所述的玉米偏好密碼子在種子特異性γ-玉米醇溶蛋白啟動子控制下，且利用摻入在質(zhì)粒pGIGUP的T-DNA邊界之間的表達盒制備。該質(zhì)粒的T-DNA邊界含有由遍在蛋白質(zhì)啟動子驅(qū)動的植物可表達的bar基因以提供對膦絲菌素的抗性(Christensen等人，植物分子生物學雜志，18875-689，1992)。其還含有在編碼序列N-末端密碼子中的帶有內(nèi)含子的GUS基因β-葡糖醛酸酶，所述編碼序列由來自章魚氨酸及甘露氨酸合酶基因的嵌合啟動子(SMAS)驅(qū)動(在帶有甘露氨酸合酶基因結(jié)構(gòu)域的活性序列上游的章魚氨酸啟動子的三聚體，Ni等人，植物雜志，7661-676，1995)。該內(nèi)含子-GUS基因在植物細胞中表達GUS活性，但是在農(nóng)桿菌(Agrobacterium)中不表達。另外，將來自詹氏甲烷球菌的熱穩(wěn)定的硫氧還蛋白克隆入質(zhì)粒pNOV117，其含有由玉米遍在蛋白質(zhì)啟動子驅(qū)動的植物可表達的pmi基因，用于在甘露糖上篩選(Christensen等人，1992，Joersbo等人，1998)。
在這些實驗中利用了根瘤農(nóng)桿菌(A.Tumefaciens)LBA4404(pAL4404，pSB1)。pAIA404是一種卸甲(disarmed)輔助質(zhì)粒。pSB1是一種寬宿主范圍的質(zhì)粒，其含有與pGIGUP和pNOV117同源的區(qū)域，和一個來自pTiBo542的侵入?yún)^(qū)的15.2kb KpnI片段(Ishida等人，1996；根瘤農(nóng)桿菌介導的玉米的高效轉(zhuǎn)化(Zea mays L.)，自然雜志生物技術(shù)分冊，14，745-750)。利用電穿孔將質(zhì)粒pGIGUP或pNOV117導入LBA4404(pAL4404，pSB1)，得到pGIGUP或pNOV117和pSB1的共整合。pNOV117的T-DNA含有由遍在蛋白質(zhì)啟動子驅(qū)動的甘露糖-6-磷酸異構(gòu)酶基因(提供代謝甘露糖的能力)和上述的硫氧還蛋白基因。
農(nóng)桿菌在補加了50mg/l壯觀霉素和10mg/l四環(huán)素的YP培養(yǎng)基上生長3天(5g/l酵母提取物，10g/l蛋白胨，5g/lNaCl，15g/l瓊脂，pH6.8)。用接種環(huán)收集細菌，并以密度范圍109至5109個細胞/ml懸浮于N6液體培養(yǎng)基中。也可從YP培養(yǎng)基的過夜培養(yǎng)物中收集農(nóng)桿菌細胞，并懸浮于N6液體培養(yǎng)基中。對于1升培養(yǎng)基，加入4g粉狀N6鹽(Sigma，St.Louis，MO)，30g蔗糖，100mg肌醇，2mg甘氨酸，1mg硫胺素，0.5mg pyrodoxine HCL，0.5mg煙酸，2mg 2，4-D(來自母液[1mg/mL]，在稀KOH中溶解2，4-D制得)。用lMKOH調(diào)節(jié)至pH6.0，加入3gGelrite，蒸汽滅菌。
自花授粉后約10-14天獲得未成熟的玉米胚。將未成熟的合子胚以每板約25個未成熟胚的量分配到不同板中，板中含有能誘導和支持生胚愈傷組織形成的培養(yǎng)基。
將未成熟的胚接與含包括一種選擇性標記物基因之Ti質(zhì)粒的農(nóng)桿菌種入板上，或接種入液體中。在接種農(nóng)桿菌之前或接種后立即將未成熟胚鋪板于含有硝酸銀(10mg/l)的愈傷組織初始培養(yǎng)基中。每板上約放置25個未成熟胚。接種后16-72小時，將未成熟胚轉(zhuǎn)移到含有硝酸銀和頭孢氨噻的愈傷組織初始培養(yǎng)基中。如下進行轉(zhuǎn)化細胞的篩選利用甘露糖體外選擇轉(zhuǎn)化細胞。篩選可應用低至1g/L，在接種后2-20天并維持總共2-12周。如此獲得的生胚愈傷組織在有或沒有甘露糖存在下于標準再生培養(yǎng)基上再生。所有植物均用氯酚紅(CR)測試對甘露糖的耐受。該試驗利用了pH敏感指示劑染料顯示在甘露糖存在下生長的細胞。生長的細胞在培養(yǎng)基中產(chǎn)生pH改變，其將指示劑氯酚紅(CR)由紅變黃。表達對甘露糖耐受的植物在此試驗中可方便地鑒別。CR試驗陽性的植物通過PCR鑒定甘露糖基因的存在與否。對于PCR試驗陽性的植物利用Southern印跡分析。分析再生植物中硫氧還蛋白的表達。所述植物發(fā)育正常。在小規(guī)模濕磨法加工中分析鑒定了來自高表達植物的子代植物玉米谷物，與沒有硫氧還蛋白轉(zhuǎn)基因的相同基因型的玉米相比，測量了淀粉可提取性。表達硫氧還蛋白基因的玉米顯示了比同種型非轉(zhuǎn)化玉米明顯較高的濕磨法加工之淀粉可得性。實施例2用熱穩(wěn)定的硫氧還蛋白及硫氧還蛋白還原酶轉(zhuǎn)化玉米利用實施例1中所述的步驟，將玉米用如上述來自M.jannaschii的硫氧還蛋白和硫氧還蛋白還原酶共轉(zhuǎn)化。兩個基因均在種子特異性的γ玉米醇溶蛋白啟動子控制下。兩個基因相連且位于pGIGUP或pNOV117的左和右邊界之間，以增強兩個基因作為單一插入片段摻入植物基因組中的可能性。
鑒定再生的植物是否表達硫氧還蛋白和硫氧還蛋白還原酶。所述植物發(fā)育正常。在小規(guī)模濕磨法加工中分析鑒定了來自高表達植物的子代植物玉米谷物，與沒有硫氧還蛋白轉(zhuǎn)基因的相同基因型的玉米相比，測量了淀粉可提取性。表達硫氧還蛋白基因的玉米顯示了比同種型非轉(zhuǎn)化玉米明顯較高的濕磨法加工之淀粉可得性。
序列表<110>Novartis AG<120>硫氧還蛋白及谷物加工<130>S-30758/A<140>09/213.208<141>1998年12月17日<160>9<170>PatentIn Ver.2.2<210>1<211>85<212>PRT<213>詹氏甲烷球菌<400>1Met Ser Lys Val Lys Ile Glu Leu Phe Thr Ser Pro Met Cys Pro His1 5 10 15Cys Pro Ala Ala Lys Arg Val Val Glu Glu Val Ala Asn Glu Met Pro20 25 30Asp Ala Val Glu Val Glu Tyr Ile Asn Val Met Glu Asn Pro Gln Lys35 40 45Ala Met Glu Tyr Gly Ile Met Ala Val Pro Thr Ile Val Ile Asn Gly50 55 60Asp Val Glu Phe Ile Gly Ala Pro Thr Lys Glu Ala Leu Val Glu Ala65 70 75 80Ile Lys Lys Arg Leu85<210>2<211>119<212>PRT<213>閃爍古生球菌<400>2Met Pro Met Val Arg Lys Ala Ala Phe Tyr Ala Ile Ala Val Ile Ser1 5 10 15Gly Val Leu Ala Ala Val Val Gly Asn Ala Leu Tyr His Asn Phe Asn20 25 30Ser Asp Leu Gly Ala Gln Ala Lys Ile Tyr Phe Phe Tyr Ser Asp Ser35 40 45Cys Pro His Cys Arg Glu Val Lys Pro Tyr Val Glu Glu Phe Ala Lys50 55 60Thr His Asn Leu Thr Trp Cys Asn Val Ala Glu Met Asp Ala Asn Cys65 70 75 80Ser Lys Ile Ala Gln Glu Phe Gly Ile Lys Tyr Val Pro Thr Leu Val85 90 95Ile Met Asp Glu Glu Ala His Val Phe Val Gly Ser Asp Glu Val Arg100 105 110Thr Ala Ile Glu Gly Met Lys115<210>3<211>93<212>PRT<213>閃爍古生球菌<400>3Met Val Phe Thr Ser Lys Tyr Cys Pro Tyr Cys Arg Ala Phe Glu Lys1 5 10 15Val Val Glu Arg Leu Met Gly Glu Leu Asn Gly Thr Val Glu Phe Glu20 25 30Val Val Asp Val Asp Glu Lys Arg Glu Leu Ala Glu Lys Tyr Glu Val35 40 45Leu Met Leu Pro Thr Leu Val Leu Ala Asp Gly Asp Glu Val Leu Gly50 55 60Gly Phe Met Gly Phe Ala Asp Tyr Lys Thr Ala Arg Glu Ala Ile Leu65 70 75 80Glu Gln Ile Set Ala Phe Leu Lys Pro Asp Tyr Lys Asn85 90<210>4<211>134<212>PRT<213>閃爍古生球菌<400>4Met Asp Glu Leu Glu Leu IleArg Gln Lys Lys Leu Lys Glu Met Met1 5 10 15Gln Lys Met Ser Gly Glu Glu Lys Ala Arg Lys Val Leu Asp Ser Pro20 25 30Val Lys Leu Asn Ser Ser Asn Phe Asp Glu Thr Leu Lys Asn Asn Glu35 40 45Asn Val Val Val Asp Phe Trp Ala Glu Trp Cys Met Pro Cys Lys Met50 55 60Ile Ala Pro Val Ile Glu Glu Leu Ala Lys Glu Tyr Ala Gly Lys Val65 70 75 80Val Phe Gly Lys Leu Asn Thr Asp Glu Asn Pro Thr Ile Ala Ala Arg85 90 95Tyr Gly Ile Ser Ala Ile Pro Thr Leu Ile Phe Phe Lys Lys Gly Lys100 105 110Pro Val Asp Gln Leu Val Gly Ala Met Pro Lys Ser Glu Leu Lys Arg115 120 125Trp Val Gln Arg Asn Leu130<210>5<211>105<212>PRT<213>閃爍古生球菌<400>5Met Glu Arg Leu Asn Ser Glu Arg Phe Arg Glu Val Ile Gln Ser Asp1 5 10 15Lys Leu Val Val Val Asp Phe Tyr Ala Asp Trp Cys Met Pro Cys Arg20 25 30Tyr Ile Ser Pro Ile Leu Glu Lys Leu Ser Lys Glu Tyr Asn Gly Glu35 40 45Val Glu Phe Tyr Lys Leu Asn Val Asp Glu Asn Gln Asp Val Ala Phe50 55 60Glu Tyr Gly Ile Ala Ser Ile Pro Thr Val Leu Phe Phe Arg Asn Gly65 70 75 80Lys Val Val Gly Gly Phe Ile Gly Ala Met Pro Glu Ser Ala Val Arg85 90 95Ala Glu Ile Glu Lys Ala Leu Gly Ala100 105<210>6<211>301<212>PRT<213>詹氏甲烷球菌<400>6Met Ile His Asp Ihr Ile Ile Ile Gly Ala Gly Pro Gly Gly Leu Thr1 5 10 15Ala Gly Ile Tyr Ala Met Arg Gly Lys Leu Asn Ala Leu Cys Ile Glu20 25 30Lys Glu Asn Ala Gly Gly Arg Ile Ala Glu Ala Gly Ile Val Glu Asn35 40 45Tyr Pro Gly Phe Glu Glu Ile Arg Gly Tyr Glu Leu Ala Glu Lys Phe50 55 60Lys Asn His Ala Glu Lys Phe Lys Leu Pro Ile Ile Tyr Asp Glu Val65 70 75 80Ile Lys Ile Glu Thr Lys Glu Arg Pro Phe Lys Val Ile Thr Lys Asn85 90 95Ser Glu Tyr Leu Thr Lys Thr Ile Val Ile Ala Thr Gly Thr Lys Pro100 105 110Lys Lys Leu Gly Leu Asn Glu Asp Lys Phe Ile Gly Arg Gly Ile Ser115 120 125Tyr Cys Thr Met Cys Asp Ala Phe Phe Tyr Leu Asn Lys Glu Val Ile130 135 140Val Ile Gly Arg Asp Thr Pro Ala Ile Met Ser Ala Ile Asn Leu Lys145 150 155 160Asp Ile Ala Lys Lys Val Ile Val Ile Thr Asp Lys Ser Glu Leu Lys165 170 175Ala Ala Glu Ser Ile Met Leu Asp Lys Leu Lys Glu Ala Asn Asn Val180 185 190Glu Ile Ile Tyr Asn Ala Lys Pro Leu Glu Ile Val Gly Glu Glu Arg195 200 205Ala Glu Gly Val Lys Ile Ser Val Asn Gly Lys Glu Glu Ile Ile Lys210 215 220Ala Asp Gly Ile Phe Ile Ser Leu Gly His Val Pro Asn Thr Glu Phe225 230 235 240Leu Lys Asp Ser Gly Ile Glu Leu Asp Lys Lys Gly Phe Ile Lys Thr245 250 255Asp Glu Asn Cys Arg Thr Asn Ile Asp Gly Ile Tyr Ala Val Gly Asp260 265 270Val Arg Gly Gly Val Met Gln Val Ala Lys Ala Val Gly Asp Gly Cys275 280 285Val Ala Met Ala Asn Ile Ile Lys Tyr Leu Gln Lys Leu290 295 300<210>7<211>300<212>PRT<213>閃爍古生球菌<400>7Met Tyr Asp Val Ala Ile Ile Gly Gly Gly Pro Ala Gly Leu Thr Ala1 5 10 15Ala Leu Tyr Ser Ala Arg Tyr Gly Leu Lys Thr Val Phe Phe Glu Thr20 25 30Val Asp Pro Val Ser Gln Leu Ser Leu Ala Ala Lys Ile Glu Asn Tyr35 40 45Pro Gly Phe Glu Gly Ser Gly Met Glu Leu Leu Glu Lys Met Lys Glu50 55 60Gln Ala Val Lys Ala Gly Ala Glu Trp Lys Leu Glu Lys Val Glu Arg65 70 75 80Val Glu Arg Asn Gly Glu Thr Phe Thr Val Ile Ala Glu Gly Gly Glu85 90 95Tyr Glu Ala Lys Ala Ile Ile Val Ala Thr Gly Gly Lys His Lys Glu100 105 110Ala Gly Ile Glu Gly Glu Ser Ala Phe Ile Gly Arg Gly Val Ser Tyr115 120 125Cys Ala Thr Cys Asp Gly Asn Phe Phe Arg Gly Lys Lys Val Ile Val130 135 140Tyr Gly Ser Gly Lys Glu Ala Ile Glu Asp Ala Ile Tyr Leu His Asp145 150 155 160Ile Gly Cys Glu Val Thr Ile Val Ser Arg Thr Pro Ser Phe Arg Ala165 170 175Glu Lys Ala Leu Val Glu Glu Val Glu Lys Arg Gly Ile Pro Val His180 185 190Tyr Ser Thr Thr Ile Arg Lys Ile Ile Gly Ser Gly Lys Val Glu Lys195 200 205Val Val Ala Tyr Asn Arg Glu Lys Lys Glu Glu Phe Glu Ile Glu Ala210 215 220Asp Gly Ile Phe Val Ala Ile Gly Met Arg Pro Ala Thr Asp Val Val225 230 235 240Ala Glu Leu Gly Val Glu Arg Asp Ser Met Gly Tyr Ile Lys Val Asp245 250 255Lys Glu Gln Arg Thr Asn Val Glu Gly Val Phe Ala Ala Gly Asp Cys260 265 270Cys Asp Asn Pro Leu Lys Gln Val Val Thr Ala Cys Gly Asp Gly Ala275 280 285Val Ala Ala Tyr Ser Ala Tyr Lys Tyr Leu Thr Ser290 295 300<210>8<211>13<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列描述寡核苷酸<400>8gtcgaccatg gtc 13<210>9<211>12<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列描述寡核苷酸<400>9taaacaatgg ct1權(quán)利要求
1.一種在谷物制粉方法中增加淀粉和蛋白質(zhì)分離效率的方法，包括在補加的硫氧還蛋白和/或硫氧還蛋白還原酶存在下于高溫中浸漬谷物，以及分離谷物的蛋白質(zhì)和淀粉成分的步驟。
2.權(quán)利要求1的方法，其中谷物包括來自轉(zhuǎn)基因植物的谷物，其中轉(zhuǎn)基因表達硫氧還蛋白和/或硫氧還蛋白還原酶。
3.權(quán)利要求2的方法，其中植物選自玉米(Zea mays)和大豆。
4.一種包含編碼硫氧還蛋白和/或硫氧還蛋白還原酶的異源DNA序列的植物，所述DNA序列穩(wěn)定地整合入植物的核或質(zhì)體DNA。
5.權(quán)利要求4的植物，其中硫氧還蛋白和/或硫氧還蛋白還原酶是熱穩(wěn)定的。
6.權(quán)利要求5的植物，其中硫氧還蛋白和/或硫氧還蛋白還原酶選自SEQ ID NO1，SEQ ID NO2，SEQ ID NO3，SEQ ID NO4，SEQID NO5，SEQ ID NO6和SEQ ID NO7。
7.權(quán)利要求4-6中任一項的植物，其中植物選自玉米和大豆。
8.一種植物可表達的表達盒，其含有與在植物中有功能的啟動子和終止子序列有效連接的硫氧還蛋白和/或硫氧還蛋白還原酶編碼區(qū)。
9.權(quán)利要求8的植物可表達的表達盒，其中硫氧還蛋白和/或硫氧還蛋白還原酶是熱穩(wěn)定的。
10.權(quán)利要求9的植物可表達的表達盒，其中硫氧還蛋白和/或硫氧還蛋白還原酶選自SEQ ID NO1，SEQ ID NO2，SEQ ID NO3，SEQ ID NO4，SEQ ID NO5，SEQ ID NO6和SEQ ID NO7。
11.一種制備包含高水平的硫氧還蛋白和/或硫氧還蛋白還原酶的谷物的方法，包括用權(quán)利要求8-10中的表達盒轉(zhuǎn)化植物。
12.一種制備包含高水平的硫氧還蛋白和/或硫氧還蛋白還原酶的谷物的方法，包括給含有異源表達盒的第一種植物用含有異源表達盒的來自第二種植物的花粉授粉，其中所述第一種植物中的表達盒含有反式激活蛋白調(diào)節(jié)的啟動子，其調(diào)節(jié)且與編碼硫氧還蛋白和/或硫氧還蛋白還原酶的DNA序列有效連接，第二種植物中的表達盒含有與編碼反式激活蛋白的DNA序列有效連接的啟動子，所述反式激活蛋白能調(diào)節(jié)該反式激活蛋白調(diào)節(jié)的啟動子；該方法還包含從如此授粉的植物中回收谷物。
13.根據(jù)權(quán)利要求4-7中任一項的植物或植物材料作為動物飼料的用途。
全文摘要
本發(fā)明提供了加工谷物,特別是玉米和大豆的新方法,其利用硫氧還蛋白和/或硫氧還蛋白還原酶以增強淀粉和蛋白質(zhì)的可提取性和回收。本發(fā)明還提供了表達熱穩(wěn)定的硫氧還蛋白和/或硫氧還蛋白還原酶的轉(zhuǎn)基因植物。
文檔編號C12N9/02GK1330720SQ99814535
公開日2002年1月9日 申請日期1999年12月15日 優(yōu)先權(quán)日1998年12月17日
發(fā)明者M·B·拉納漢 申請人:辛根塔參與股份公司