專利名稱：基因和蛋白質(zhì),及它們的用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及細(xì)菌基因和蛋白質(zhì)的鑒定和它們的用途。特別是，涉及其在免疫治療和藥物篩選中的用途發(fā)明背景B群鏈球菌(Streptococcus)(GBS)，也稱為無乳鏈球菌(Streptococcusagalactiae)，是多種病癥的病原體。特別是，GBS引起；早發(fā)性新生兒感染這種感染通常始于子宮中，并在嬰幼兒中引起嚴(yán)重的敗血癥和肺炎，如果未治療則其是致命的，且即使治療其也與10-20％的死亡率有關(guān)。
遲發(fā)性新生兒感染這種感染在出生之后不久直到大約3月齡的一段時(shí)間內(nèi)出現(xiàn)。它引起敗血癥，在90％的病例中并發(fā)有腦膜炎。也發(fā)生其它的灶性感染，包括骨髓炎，膿毒性關(guān)節(jié)炎，膿腫和眼內(nèi)炎。
成人感染看來這些愈加普遍，頻繁地發(fā)生在剛生產(chǎn)嬰兒的婦女，年長者和無免疫應(yīng)答的人中。他們的特征在于敗血癥和灶性感染，包括骨髓炎，膿毒性關(guān)節(jié)炎，膿腫和眼內(nèi)炎。
尿道感染GBS是尿道感染的一個(gè)原因，且在懷孕期間約占所有感染的10％。
獸醫(yī)感染GBS在母牛中引起慢性乳腺炎。這又導(dǎo)致牛奶產(chǎn)量減少，并因此消減了相當(dāng)大的經(jīng)濟(jì)價(jià)值可以用抗生素治療GBS感染。然而，免疫接種是優(yōu)選的。因此希望研制一種能夠用于治療有效的疫苗中的免疫原。
發(fā)明概述本發(fā)明是基于GBS中一系列基因的鑒定，并與生物體相關(guān)，其產(chǎn)物可以位于生物體的外表面并因此可以作為免疫-治療的靶使用。
根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)方面，肽是由可從B群連球菌中獲得的包括任一被鑒定為pho1-13，pho3-21，pho2-15，pho3-18，pho3-22，pho3-3，pho3-17，pho2-2，pho1-5，pho3-1，pho3-23，pho3-50，pho1-14，pho2-10，pho3-14，pho3-24和pho3-29的基因的操縱子或其同源物或其功能性片段編碼的。這種肽適宜于治療用途，例如，當(dāng)分離時(shí)。
此處使用術(shù)語“功能性片段”以定義保留完整基因或肽活性的基因或肽的一部分。例如，肽的功能性片段可以作為抗原決定因素使用，其在疫苗或抗體的生產(chǎn)中是有益的。
基因片段可以用于編碼活性肽?；蛘撸蚱慰赡茉诨蛑委熤杏杏?，在體內(nèi)靶定野生型基因以發(fā)揮治療作用。
本發(fā)明的肽可以包含此處被鑒定為SEQ ID NOS。2，4，6，8，10，11，13，15，17，19，21，23，25，27，29，31，33和35的任一氨基酸序列，或其功能性片段。
由于細(xì)胞外或細(xì)胞表面定位，對于抗GBS的治療有效的疫苗的生產(chǎn)，本發(fā)明的肽可能是適宜的候選物。術(shù)語“治療有效”的意思是包括疫苗的預(yù)防作用。例如，疫苗可以包含用于感染治療的本發(fā)明的肽，或用于其表達(dá)的工具?？梢栽趹言兄盎驊言羞^程中將疫苗給予女性以保護(hù)母親和新生兒免受GBS感染。
根據(jù)本發(fā)明的另一方面，肽或基因可以用于篩選潛在的抗微生物藥物或用于毒性的檢出。
本發(fā)明又一方面是此處鑒定的任一產(chǎn)品用于與B群鏈球菌菌株感染相關(guān)病癥的治療或預(yù)防的用途。
雖然已經(jīng)描述了蛋白質(zhì)在患者治療中的用途，認(rèn)為本發(fā)明產(chǎn)品的獸醫(yī)用途也在本發(fā)明的范圍之內(nèi)。特別是，肽或疫苗可以用于慢性乳腺炎，特別是在母牛中的治療。
發(fā)明描述本發(fā)明是根據(jù)B群鏈球菌菌株M732描述的。然而，所有的GBS菌株和許多其它的細(xì)菌菌株可能包括具有與M732肽同源的氨基酸序列的相關(guān)肽或蛋白質(zhì)?？赡馨ㄟ@樣的肽的生物體包括，但不限于，肺炎鏈球菌(Streptococcus pneumoniae)，釀膿鏈球菌(Streptococcus pyogenes)，豬鏈球菌(Streptococcussuis)，米氏鏈球菌(Streptococcus milleri)，C群和G群鏈球菌和腸球菌。每種這些生物體的疫苗均可以按照描述GBS的相同方式來研制。
優(yōu)選地，對于疫苗生產(chǎn)有益的肽具有大于40％的與此處鑒定的肽的序列相似性。更優(yōu)選，肽具有大于60％的序列相似性。最優(yōu)選，肽具有遠(yuǎn)大于80％的序列相似性，例如，95％相似性。
只要表征了本發(fā)明的基因，使用基因序列在其它微生物體中確立同源物是可能的。也可能確定是否其它微生物體具有相似的外表面產(chǎn)物?？梢酝ㄟ^在現(xiàn)有的數(shù)據(jù)庫，例如EMBL或Genbank中檢索來建立序列同源物。
可以通過本領(lǐng)域已知的方法來純化和分離本發(fā)明的肽或蛋白質(zhì)。特別是，只要鑒定了基因序列，使用重組技術(shù)在適宜的宿主中表達(dá)基因序列將是可能的?？梢澡b定活性片段和同源物，且其在治療中是有益的。例如，肽或它們的活性片段可以在疫苗中作為抗原決定簇使用，以引起免疫應(yīng)答。它們也可以在抗體的制備中使用以用于被動(dòng)免疫或診斷應(yīng)用，適宜的抗體包括單克隆抗體，或其片段，包括單鏈fv片段?？贵w的制備方法對于本領(lǐng)域的那些技術(shù)人員是顯而易見的。
基于減毒微生物體的疫苗的制備對于本領(lǐng)域的那些技術(shù)人員是已知的。按照治療中所用的，所需要的或所期望的，可以用適宜的載體或輔劑，例如明礬配制疫苗組合物，以提供對B群鏈球菌或其它有關(guān)微生物體的有效免疫接種。疫苗制劑的制備對于技術(shù)人員來說將是顯而易見的。
更通常地，并為本領(lǐng)域的那些技術(shù)人員所熟知的，為了治療的用途，可以選擇本發(fā)明活性組分適宜的量，適宜的載體或賦形劑，和給藥途徑?？梢愿鶕?jù)已知的標(biāo)準(zhǔn)，如所治療病癥的性質(zhì)/嚴(yán)重性，患者的類型或健康狀況等，來選擇或確定這些因素。
如下鑒定本發(fā)明的產(chǎn)品使用質(zhì)粒載體pFW-phoA1，pFW-phoA2和pFW-phoA3(Podbielski，A等人，1996?；?Gene))177137-147)制備GBS(M732菌株)染色體DNA的部分基因庫。這些質(zhì)粒具有組成性大觀霉素腺苷?；D(zhuǎn)移酶抗生素抗性標(biāo)記，其賦予高水平的大觀霉素抵抗力并因此而容易選擇。此外，對于堿性磷酸酶，這些載體包含截短的(無前導(dǎo)序列的(1eaderless))大腸桿菌phoA基因。與上游符合讀框BamI限制酶位點(diǎn)相比較，這三個(gè)載體僅僅就無前導(dǎo)序列phoA基因是否存在于讀框其中這方面不同。因?yàn)榇私囟痰拇竽c桿菌phoA基因缺乏適當(dāng)?shù)那皩?dǎo)序列以輸出此酶穿過細(xì)菌膜，所以當(dāng)質(zhì)粒在大腸桿菌phoA突變體(例如DH5α菌株)中繁殖時(shí)，細(xì)胞外的堿性磷酸酶活性是缺乏的。產(chǎn)色的堿性磷酸酶底物，XP(5-溴-4-氯-3-吲哚-磷酸酯)，不進(jìn)入完整的細(xì)菌細(xì)胞中，因此僅僅可以檢測到被輸出的或結(jié)合于表面的堿性磷酸酶活性。當(dāng)被輸出或結(jié)合于表面的堿性磷酸酶活性存在時(shí)，產(chǎn)色XP被切割以產(chǎn)生藍(lán)色色素，且可以通過它們的藍(lán)顏色鑒定相應(yīng)的細(xì)菌菌落。
用BamHI完全消化質(zhì)粒DNA并使用蝦堿性磷酸酶去磷酸化。用Sau3AI部分地消化GBS基因組DNA，在蔗糖梯度上按大小進(jìn)行分級分離，將大?。?kb的片段連接到所制備的pFW-phoA載體上。將大腸桿菌菌株DH5α選作克隆宿主，因?yàn)樗鄙俟δ苄詐hoA基因。在包含100μg/ml大觀霉素和40μg/ml產(chǎn)色XP底物的Luria瓊脂上選擇重組質(zhì)粒。包含帶GBS插入DNA的質(zhì)粒大腸桿菌轉(zhuǎn)化子是通過菌落的藍(lán)顏色鑒定的，所述插入DNA互補(bǔ)了無前導(dǎo)序列phoA基因的輸出信號序列。以這種方式篩選了包含GBS插入DNA的大約30000不同的重組質(zhì)粒，互補(bǔ)無前導(dǎo)序列phoA的83個(gè)重組質(zhì)粒用于進(jìn)一步研究。
從這些實(shí)驗(yàn)中選擇多種克隆，每種均包含這樣的質(zhì)粒，該質(zhì)粒包含互補(bǔ)無前導(dǎo)序列phoA的基因(或其一部分)。
一旦在每種克隆中鑒定了基因，那么如下得到完整長度的基因序列是可能的。
為了基因組DNA測序，使用已經(jīng)鑒定和測序的基因片段設(shè)計(jì)寡核苷酸引物。設(shè)計(jì)這些引物以便從得到的序列中以“向外的”方向上測序。一旦讀取，檢查所得到的序列以了解是否已經(jīng)到達(dá)基因的5’和3’端。這些特征的存在是通過檢查同源物序列，以及對于5’端，Shine-Dalgarno共有序列在先的AUG起始密碼子(或公認(rèn)的相等物)的存在，和對于3’端，翻譯終止(停止)密碼子的存在鑒定的。
一旦完整長度基因得以鑒定，為了完整長度的產(chǎn)品的擴(kuò)增而設(shè)計(jì)引物。所使用的引物包括限制酶識(shí)別位點(diǎn)(NcoI位于5’端且Eco0109I位于3’端)以讓后來的產(chǎn)品克隆入所用的乳球菌(Lactococcal)表達(dá)系統(tǒng)。
使用引物進(jìn)PCR，且將產(chǎn)品克隆入pCR2.1克隆載體(in Vitrogen)。在克隆片段的存在確證之后，使用限制酶NcoI和Eco0109I切斷DNA。
片段插入其中的載體是一修飾的pNZ8048版本(Kuipers，0.P.等人，(1998)生物技術(shù)雜志(J.Biotech))6415-21)。此載體帶有乳球菌復(fù)制起點(diǎn)，氯霉素抗性標(biāo)記，可誘導(dǎo)的乳鏈菌肽啟動(dòng)子和一種多克隆位點(diǎn)其被用兩個(gè)10X His標(biāo)簽對多克隆位點(diǎn)的替換而改變所述標(biāo)簽，最5′端側(cè)翼為NcoI位點(diǎn)，中間用多克隆位點(diǎn)分開(包括Eco0109I位點(diǎn))，終止密碼子在3’端。
插入有關(guān)基因，以便10X His標(biāo)簽位于相對于編碼區(qū)的3’位。重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化進(jìn)乳酸乳球菌(L.lactis)(菌株NZ9000-Kuipers，O.P.等人，(1998)同上)之后，準(zhǔn)備400ml液體培養(yǎng)物，通過將乳鏈菌肽加入到培養(yǎng)物中，誘導(dǎo)蛋白質(zhì)的翻譯。培養(yǎng)2小時(shí)之后，收獲細(xì)胞并通過玻珠打漿(bead beating)裂解細(xì)胞。通過離心純化最終的細(xì)胞裂解物，然后將其通入金屬親和柱(Talon Clonetech)。在用咪唑洗脫結(jié)合蛋白之前，反復(fù)洗滌柱子。
為了鑒定包含His標(biāo)簽的重組蛋白級分，用SDS-PAGE，Western印跡分析并用抗His抗體探測源自每一級分的等分試樣。
然后將所得到的重組蛋白用于免疫新西蘭白兔。免疫之前收獲免疫前血清。加強(qiáng)免疫之后，處死白兔并收集血清。此血清用于蛋白質(zhì)印跡，ELISA和動(dòng)物保護(hù)模型中。
使用從動(dòng)物研究中獲得的血清，進(jìn)行免疫吸附的研究。
B群鏈球菌在20ml Todd Hewitt肉湯(THB)中培養(yǎng)8小時(shí)，在5ml PBS中收獲和重懸浮。50μl的等分試樣用于在96孔板(Nunc Immuno-Sorb)中包被孔。在4℃過夜以使細(xì)菌吸附于板上。用PBS洗滌板兩次，然后在37℃時(shí)，在PBS中用3％BSA封閉1小時(shí)。再洗滌板。在PBS中產(chǎn)生血清的連續(xù)10倍的稀釋液，并將50μl的這些稀釋液加入到板的孔中，雙份。覆蓋板并在37℃時(shí)培養(yǎng)1小時(shí)。洗滌該板，將50μl 1∶5000濃度的抗兔堿性磷酸酶綴合次級抗體加入到每個(gè)孔中。37℃培養(yǎng)1小時(shí)后，再洗滌該板。將50μ1底物(PNPP)加入到每個(gè)孔中，在讀取405nm處的吸收值之前，讓反應(yīng)進(jìn)行30分鐘。
也進(jìn)行動(dòng)物保護(hù)的研究以測試在經(jīng)免疫的兔上的保護(hù)效果。
GBS M732在THB沖培養(yǎng)直到達(dá)到對數(shù)中期階段—大約5個(gè)小時(shí)。在計(jì)數(shù)室中計(jì)數(shù)細(xì)胞，稀釋得到濃度為2×107個(gè)細(xì)菌/ml的免疫前血清或測試血清。將50μl經(jīng)由腹膜內(nèi)途徑注射進(jìn)0-1日齡的小鼠中。觀察到小鼠的存活超過48小時(shí)。
下列實(shí)施例舉例說明本發(fā)明。
實(shí)施例1第一個(gè)克隆包含在此處被鑒定為SEQ ID NO.1的基因序列，和被鑒定為SEQID NO.2的氨基酸序列，并被分類為pho1-13。
進(jìn)行pho1-13的氨基酸序列比較。
可以在釀膿鏈球菌，肺炎鏈球菌，唾液鏈球菌(S.salivarius)，大腸桿菌，小腸結(jié)腸炎耶爾森氏菌(Yersinia enterocolitica)，Aquifex aeolicus，幽門螺桿菌(Helicobacter pylori)和流感嗜血桿菌(Haemophilus influenzae)中鑒定GBS pho1-13基因產(chǎn)物的同源物。釀膿鏈球菌和肺炎鏈球菌的同源物是從基因組序列數(shù)據(jù)中鑒定的，且關(guān)于基因或基因產(chǎn)物的鑒定，沒有注釋是可利用的。在所有其它的情況中，上述同源物可以被鑒定為依賴于ATP的Clp蛋白酶蛋白裂解亞基。在ATP和鎂存在情況下，Clp蛋白酶的催化活性導(dǎo)致蛋白質(zhì)水解為小肽(Giffard，P.M.等人1993.普通微生物學(xué)雜志(J.Gen.Microbiol.)139913-920)。此外，已經(jīng)證明了Clp蛋白酶的ClpP成分被誘導(dǎo)為熱激反應(yīng)的一部分(Kroh，H.E.和L.D.Simon.1990.細(xì)菌學(xué)雜志(J.Bacteriol).1726026-6034)且可能此亞基或完全的蛋白裂解結(jié)構(gòu)域與細(xì)菌的表面結(jié)合。
按照上面描述的進(jìn)行免疫研究，得到下列結(jié)果。
治療 沒有動(dòng)物 沒有動(dòng)物存活時(shí)間(小時(shí))24 48PBS 10 70免疫前 37 13 0經(jīng)免疫的 38 17 9實(shí)施例2選擇第二個(gè)包括稱為pho1-14質(zhì)粒的克隆。此質(zhì)粒包括互補(bǔ)無前導(dǎo)序列phoA的基因(或其一部分)。核苷酸和推定的氨基酸序列分別作為SEQ ID NOS.3和4列出。
進(jìn)行pho1-14的氨基酸序列比較。
可以在釀膿鏈球菌，糞腸球菌(Enterococcus faecalis)和肺炎鏈球菌中鑒定GBS pho1-14基因產(chǎn)物的同源物。這些同源物是從基因組序列數(shù)據(jù)中鑒定的，且關(guān)于基因或基因產(chǎn)物的鑒定，沒有注釋是可利用的。另外，也可以從弗氏志賀氏菌(Shigella flexneri)(SpaR)和假結(jié)核耶爾森氏菌(Yersinia pseudotuberculosis)(YscT)中鑒定兩種可能的同源物。這后兩種同源物是相關(guān)蛋白質(zhì)，認(rèn)為其在細(xì)菌的膜上錨定(Bergman，T1994.細(xì)菌學(xué)雜志1762619-2626)。在弗氏志賀氏菌中，已經(jīng)證明了spaR基因產(chǎn)物對于上皮細(xì)胞的入侵是重要的(Sasakawa，C.et al.1993.細(xì)菌學(xué)雜志1752334-2346)。此外，spaR基因產(chǎn)物對于侵入質(zhì)?？乖谋砻娉蔬f來說，也是需要的。在假結(jié)核耶爾森氏菌中，類似的蛋白質(zhì)是Yop分泌系統(tǒng)的組成部分，且對于生物體中的毒性也是重要的。
實(shí)施例3選擇第三個(gè)包括稱為pho1-5質(zhì)粒的克隆。此質(zhì)粒包括互補(bǔ)無前導(dǎo)序列phoA的基因(或其一部分)。核苷酸和推定的氨基酸序列分別作為SEQ ID NOS.5和6列出。
進(jìn)行pho1-5的氨基酸序列比較。
僅可以在釀膿鏈球菌，肉葡萄球菌(Staphylococcus carnosus)(sceA)中鑒定出GBS pho1-5基因產(chǎn)物的同源物。釀膿鏈球菌同源物是從基因組序列數(shù)據(jù)中鑒定的，且關(guān)于基因或基因產(chǎn)物的鑒定，沒有注釋是可利用的。此外，在源自肉葡萄球菌的sceA基因產(chǎn)物上，幾乎沒有信息是可以利用的。SceA基因產(chǎn)物表現(xiàn)出某些與源自加氏乳桿菌(Lactobacillus gasseri)的促集聚蛋白質(zhì)相似的序列。基于sceA基因產(chǎn)物的分析，此分子包含充分保守的信號序列且其被很顯然地分泌或與細(xì)菌細(xì)胞的表面結(jié)合。
實(shí)施例4選擇又一個(gè)包括稱為pho3-3質(zhì)粒的克隆。此質(zhì)粒包括補(bǔ)充無前導(dǎo)序列phoA的基因(或其一部分)。核苷酸和推定的氨基酸序列分別作為SEQ ID NOS.7和8列出。
進(jìn)行pho3-3的氨基酸序列比較。
可以在變異鏈球菌(Streptococcus mutans)(rmiC)，(cpsM)肺炎鏈球菌和釀膿鏈球菌中鑒定GBS pho3-3基因產(chǎn)物的同源物。釀膿鏈球菌同源物是從基因組序列數(shù)據(jù)中鑒定的，且關(guān)于基因或基因產(chǎn)物的鑒定，沒有注釋是可利用的。在肺炎鏈球菌中，同源物可以被鑒定為dTDP-4-酮-6-去氧葡萄糖-3，5-差向異構(gòu)酶。在其它兩種情況下，上面的同源物可以被鑒定為dTDP-4-酮-L-鼠李糖還原酶(rmlC)。在變異鏈球菌中，編碼此酶基因的rmlC是rml基因座的一部分。rml基因座包括三種基因，其顯示出與參與dTDP-鼠李糖(變異鏈球菌多糖膠囊中鼠李糖成分的直接前體)的生物合成中的酶顯著的相似性(Tsukioka，Y.等人。1997.細(xì)菌學(xué)雜志.1773-83)。在肺炎鏈球菌中鑒定類似的基因座(coffey等人，1998，分子微生物學(xué)，1773-83)。幾乎所有的鏈球菌在它們與多糖有關(guān)的細(xì)胞壁中特征性地具有鼠李糖(Schleifer，K.H.和R.Kilper-Balz.1987.系統(tǒng)應(yīng)用微生物(Syst.Appl.Microbiol).10∶1-19)，且在鏈球菌中，很可能dTDP-4-酮-L鼠李糖還原酶與外表面結(jié)合。
實(shí)施例5選擇又一個(gè)包括稱為pho2-10質(zhì)粒的克隆。此質(zhì)粒包括互補(bǔ)無前導(dǎo)序列phoA的基因(或其一部分)。
核苷酸序列分別作為SEQ ID NO.9列出。由此，鑒定了上游的和下游的編碼區(qū)，推定的氨基酸序列作為SEQ ID NOS.10和11列出。
進(jìn)行pho2-10的氨基酸序列比較。
可以在釀膿鏈球菌，糞腸球菌，Debaryomyces occidentalis(hatI)和大腸桿菌(trkD)中鑒定GBS pho2-10基因產(chǎn)物的同源物。釀膿鏈球菌和大腸桿菌同源物是從基因組序列數(shù)據(jù)中鑒定的，且關(guān)于基因或基因產(chǎn)物的鑒定，沒有注釋是可利用的。在酵母菌D.occidentalis中，hak1基因是源自大腸桿菌的trkD基因的同源物(Banuelos，M.A.等人。1995.EMBO J.143012-3027)。大腸桿菌的trkD基因是kup鉀攝取系統(tǒng)的一部分。此處鑒定的特定同源物是kup系統(tǒng)鉀攝取蛋白。在大腸桿菌中，kup系統(tǒng)是一種組成型鉀攝取系統(tǒng)。Kup系統(tǒng)鉀攝取蛋白包含高度疏水的N-端，預(yù)測其至少12次跨越膜。Kup不與其他已知的膜蛋白序列同源。沒有ATP結(jié)合的跡象，并提示通過化學(xué)滲透的梯度來推動(dòng)系統(tǒng)(Schleyer，M.&E.P.Bakker，1993.細(xì)菌學(xué)雜志.1756925-6931)。
實(shí)施例6選擇又一個(gè)包括稱為pho2-15質(zhì)粒的克隆。此質(zhì)粒包括互補(bǔ)無前導(dǎo)序列phoA的基因(或其一部分)。基因的核苷酸和推定氨基酸序列分別作為SEQ ID NOS.12和13列出。
進(jìn)行pho2-15的氨基酸序列比較。
可以在釀膿鏈球菌，肺炎鏈球菌，糞腸球菌和大腸桿菌(gat C和SgcC)中鑒定GBS pho2-15基因產(chǎn)物的同源物。釀膿鏈球菌，肺炎鏈球菌和糞腸球菌同源物是從基因組序列數(shù)據(jù)中鑒定的，且關(guān)于基因或基因產(chǎn)物的鑒定，沒有注釋是可利用的。在大腸桿菌中，gatC和sgcC基因產(chǎn)物可以被鑒定為磷酸烯醇丙酮酸依賴的糖磷酸轉(zhuǎn)移酶系統(tǒng)(PTS)(一種重要的碳水化合物活性-運(yùn)送系統(tǒng))的IIC成分。在PTS系統(tǒng)中，IIC成分一般參與細(xì)胞外碳水化合物的結(jié)合，并與IID成分形成一復(fù)合體以組成膜通道(Nobelmann，B.和J.W.Lengeler.1995.生物化學(xué)和生物物理學(xué)學(xué)報(bào)(Biochin.Biophys.Acta)126269-72)。
實(shí)施例7選擇又一個(gè)包括稱為pho2-2質(zhì)粒的克隆。此質(zhì)粒包括互補(bǔ)無前導(dǎo)序列phoA的基因(或其一部分)。基因的核苷酸和推定氨基酸序列分別作為SEQ ID NOS.14和15列出。
進(jìn)行pho2-2的氨基酸序列比較。
可以在糞腸球菌，大腸桿菌(malK和afuC)，枯草芽孢桿菌(glh0)，流感嗜血桿菌(yebM和potA)，釀膿鏈球菌，肺炎鏈球菌，和鼠傷寒沙門氏菌(Salmonella typhimurium)(malK)中鑒定GBS pho2-2基因產(chǎn)物的同源物。糞腸球菌，釀膿鏈球菌和肺炎鏈球菌同源物是從基因組序列數(shù)據(jù)中鑒定的，且關(guān)于基因或基因產(chǎn)物的鑒定，沒有注釋是可利用的。在所有其它的情況中，同源物代表了ATP-結(jié)合轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，其是ABC型轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的一部分。ABC型轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的許多成分是結(jié)合于膜或細(xì)胞表面，這些系統(tǒng)參與在大分子從細(xì)胞外環(huán)境向細(xì)胞內(nèi)隔室的轉(zhuǎn)運(yùn)。
實(shí)施例8選擇又一個(gè)包括稱為pho3-14質(zhì)粒的克降。此質(zhì)粒包括互補(bǔ)無前導(dǎo)序列phoA的基因(或其一部分)。基因的核苷酸和推定的氨基酸序列分別作為SEQ ID NOS.16和17列出。
進(jìn)行pho3-14的氨基酸序列比較。且沒有同源物能夠在任何公開數(shù)據(jù)庫中被鑒定。GBSpho3-14基因產(chǎn)物的一個(gè)同源物可以在釀膿鏈球菌中鑒定，但是這個(gè)同源物是從基因組序列數(shù)據(jù)中鑒定的，且關(guān)于基因或基因產(chǎn)物的鑒定，沒有注釋是可利用的。使用此釀膿鏈球菌同源物來檢索公開的數(shù)據(jù)庫，沒有得到更多的信息。既然pho3-14產(chǎn)品互補(bǔ)了無前導(dǎo)序列phoA基因，可以推斷此蛋白質(zhì)(或其一部分)將最可能位于細(xì)胞外。
實(shí)施例9選擇又一個(gè)包括稱為pho3-17質(zhì)粒的克隆。此質(zhì)粒包括互補(bǔ)無前導(dǎo)序列phoA的基因(或其一部分)?；虻暮塑账岷屯贫ò被嵝蛄蟹謩e作為SEQ ID NOS.18和19列出。
進(jìn)行pho3-17的氨基酸序列比較。
可以在變異鏈球菌和乳酸乳球菌中鑒定GBS Pho3-17基因產(chǎn)物的同源物，具有與N-乙酰基胞壁質(zhì)酶的相似性。也注意到與未鑒定的基因即源自枯草芽孢桿菌的yubE的相似性。
N-乙?；谫|(zhì)酶是一種參與細(xì)胞分裂中的自溶素。使用這種有限的信息連同pho3-17互補(bǔ)無前導(dǎo)序列phoA基因的事實(shí)，可以推斷出pho3-17產(chǎn)物將最可能位于細(xì)胞外。
實(shí)施例10選擇又一個(gè)包括稱為pho3-18質(zhì)粒的克隆。此質(zhì)粒包括互補(bǔ)無前導(dǎo)序列phoA的基因(或其一部分)?；虻暮塑账岷屯贫ò被嵝蛄蟹謩e作為SEQ ID NOS.20和21列出。
進(jìn)行pho3-18的氨基酸序列比較。
可以在釀膿鏈球菌和肺炎鏈球菌中鑒定GBS Pho3-18基因產(chǎn)物的同源物。這些同源物是從基因組序列數(shù)據(jù)中鑒定的，且關(guān)于基因或基因產(chǎn)物的鑒定，沒有注釋是可利用的。使用這些釀膿鏈球菌和肺炎鏈球菌同源物檢索公開的數(shù)據(jù)庫，其表現(xiàn)出某些與外表面和跨越膜蛋白的相似性。既然ORF3-18產(chǎn)物互補(bǔ)了無前導(dǎo)序列phoA基因，可以推斷出此蛋白質(zhì)(或其一部分)將最可能位于細(xì)胞外。
實(shí)施例11選擇又一個(gè)包括稱為pho3-1質(zhì)粒的克隆。此質(zhì)粒包括互補(bǔ)無前導(dǎo)序列phoA的基因(或其一部分)?；虻暮塑账岷屯贫ò被嵝蛄蟹謩e作為SEQ ID NOS.22和23列出。
進(jìn)行pho3-1的氨基酸序列比較。
可以在釀膿鏈球菌，肺炎鏈球菌，枯草芽孢桿菌(yutD)和糞腸球菌中鑒定GBS Pho3-1基因產(chǎn)物的同源物。釀膿鏈球菌，肺炎鏈球菌和糞腸球菌同源物是從基因組序列數(shù)據(jù)中鑒定的，且關(guān)于基因或基因產(chǎn)物的鑒定，沒有注釋是可利用的。在枯草芽孢桿菌中，yutD基因產(chǎn)物的功能是未知的。然而可以注意到，yutD基因位于枯草芽孢桿菌染色體中含有參與細(xì)胞壁合成的基因的區(qū)域中。此DNA序列互補(bǔ)了無前導(dǎo)序列的phoA基因的事實(shí)暗示此基因產(chǎn)物位于細(xì)胞外。
實(shí)施例12選擇又一個(gè)包括稱為pho3-21質(zhì)粒的克隆。此質(zhì)粒包括互補(bǔ)無前導(dǎo)序列phoA的基因(或其一部分)?；虻暮塑账岷屯贫ò被嵝蛄蟹謩e作為SEQ ID NOS.24和25列出。
進(jìn)行pho3-21的氨基酸序列比較。
可以在釀膿鏈球菌，肺炎鏈球菌，發(fā)酵乳桿菌(Lactobacillus fermentum)(bspA)和路氏乳桿菌(Lactobacillus reuteri)(cnb)中鑒定GBS Pho3-21基因產(chǎn)物的同源物。釀膿鏈球菌，肺炎鏈球菌同源物是從基因組序列數(shù)據(jù)中鑒定的，且關(guān)于基因或基因產(chǎn)物的鑒定，沒有注釋是可利用的。在發(fā)酵乳桿菌中，bspA基因產(chǎn)物已經(jīng)被鑒定為基本(basic)細(xì)胞表面-定位的蛋白質(zhì)，其具有某些與細(xì)菌溶質(zhì)-結(jié)合蛋白質(zhì)第III家族相似的序列(Turner，M.S.等人.1997.細(xì)菌學(xué)雜志.1793310-3316)。在路氏乳桿菌中，cnb基因產(chǎn)物已經(jīng)被鑒定為膠原結(jié)合蛋白，其具有某些與細(xì)菌ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白溶質(zhì)結(jié)合組分相似的序列(Roos，S.等人1996.FEMS Microbiol.Lett.14433-38)。
實(shí)施例13選擇又一個(gè)包括稱為pho3-22質(zhì)粒的克隆。此質(zhì)粒包括互補(bǔ)無前導(dǎo)序列phoA的基因(或其一部分)?；虻暮塑账岷屯贫ò被嵝蛄蟹謩e作為SEQ ID NOS.26和27列出。
進(jìn)行pho3-22的氨基酸序列比較。
可以在糞腸球菌，似馬鏈球菌(Streoticiccys eqyusunukus)(lppC)，熒光假單胞菌(Pseudomonas fluorescens)(oprI)和嗜熱鏈球菌(orfl42)中鑒定GBS Pho3-22基因產(chǎn)物的同源物。糞腸球菌同源物是從基因組序列數(shù)據(jù)中鑒定的，且關(guān)于基因或基因產(chǎn)物的鑒定，沒有注釋是可利用的。在似馬鏈球菌中，lppC基因產(chǎn)物已經(jīng)被鑒定為脂蛋白，其與源自流感嗜血桿菌的E(P4)外膜蛋白質(zhì)同源(Gase，K.等人1997醫(yī)學(xué)微生物免疫學(xué)(Med.Microbiol.Immunol).18663-73)。同樣地，熒光假單胞菌oprI基因編碼一重要的外膜脂蛋白(Cornelis，P.等人。1989.分子微生物學(xué)3421-428)。在嗜熱鏈球菌中，orf142產(chǎn)物已經(jīng)推定地被鑒定為暴露于細(xì)胞表面的脂蛋白，其充當(dāng)噬菌體kTP-J34和Sfi21的受體(Neve，H.等人。1998.病毒學(xué)(Virology)24161-72)。ORF3-22產(chǎn)品顯示出了與上面同源物較好的相似性，特別是在N-端。這很可能是無前導(dǎo)序列的phoA基因之互補(bǔ)所需要的區(qū)域。并因此作為前導(dǎo)序列。
實(shí)施例14
選擇又一個(gè)包括稱為pho3-23質(zhì)粒的克隆。此質(zhì)粒包括互補(bǔ)無前導(dǎo)序列phoA的基因(或其一部分)?；虻暮塑账岷屯贫ò被嵝蛄蟹謩e作為SEQ ID NOS.28和29列出。
進(jìn)行pho3-23的氨基酸序列對照。
可以在釀膿鏈球菌，肺炎鏈球菌，糞腸球菌和變異鏈球菌(perM)中鑒定GBSpho3-23基因產(chǎn)物的同源物。釀膿鏈球菌，肺炎鏈球菌和糞腸球菌同源物是從基因組序列數(shù)據(jù)中鑒定的，且關(guān)于基因或基因產(chǎn)物的鑒定，沒有注釋是可利用的。在變異鏈球菌中，perM基因產(chǎn)物已經(jīng)被假定地鑒定為通透酶，但是關(guān)于此蛋白質(zhì)的功能沒有其它信息是可利用的?？紤]到pho3-23編碼區(qū)域互補(bǔ)無前導(dǎo)序列phoA基因，可以推斷pho3-17基因產(chǎn)物將最可能位于細(xì)胞外。
實(shí)施例15選擇又一個(gè)包括稱為pho3-24質(zhì)粒的克隆。此質(zhì)粒包括互補(bǔ)無前導(dǎo)序列phoA的基因(或其一部分)?；虻暮塑账岷屯贫ò被嵝蛄蟹謩e作為SEQ ID NOS.30和31列出。
進(jìn)行pho3-24的氨基酸序列比較。
可以在變異鏈球菌(dltB)，肺炎鏈球菌，釀膿鏈球菌，糞腸球菌，干酪乳桿菌(Lactobaillus casei)(dltB)和枯草芽孢桿菌(dltB)中鑒定GBS pho3-24基因產(chǎn)物的同源物。肺炎鏈球菌，釀膿鏈球菌和糞腸球菌同源物是從基因組序列數(shù)據(jù)中鑒定的，且關(guān)于基因或基因產(chǎn)物的鑒定。沒有注釋是可利用的。在變異鏈球菌，干酪乳桿菌和枯草芽孢桿菌中，dltB基因產(chǎn)物已經(jīng)被鑒定為基本膜蛋白，其參與穿過細(xì)胞膜的活性D-丙氨酸的轉(zhuǎn)運(yùn)中。dltB基因產(chǎn)物參與D-丙氨酰-脂磷壁酸質(zhì)的生物合成(Heaton，M.P.和F.C.Neuhaus.1992.細(xì)菌學(xué)雜志1744707-4717)。在干酪乳桿菌和枯草芽孢桿菌中，認(rèn)為dltB基因產(chǎn)物包含至少9個(gè)膜跨越結(jié)構(gòu)域，顯示蛋白質(zhì)或其一部分暴露于細(xì)胞的外面。
實(shí)施例16選擇又一個(gè)包含稱為pho3-29質(zhì)粒的克隆。此質(zhì)粒包括互補(bǔ)無前導(dǎo)序列phoA的基因(或其一部分)?；虻暮塑账岷屯贫ò被嵝蛄蟹謩e作為SEQ ID NOS.32和33列出。
進(jìn)行pho3-29的氨基酸序列比較。
可以布氏疏螺旋體(Borrelia burgdorferi)(p23或ospC)，短芽孢桿菌(Bacillus brevis)(owp)和綠膿假單胞菌(Pseudomonas aeruginosa)(oprI)中鑒定GBS pho3-29基因產(chǎn)物的同源物。雖然這些同源物彼此并不相關(guān)，它們?nèi)看碇匾耐獗砻娴鞍?。在布氏疏螺旋體中，ospC基因產(chǎn)物已經(jīng)被鑒定為23-kDa蛋白，它是這種細(xì)菌表面上的免疫顯性抗原(Padula，S.J.等人。1993感染與免疫(Infect.Immun).615097-5105)。源自短芽孢桿菌的owp基因產(chǎn)物是包括在表面層晶格中的兩種主要細(xì)胞壁蛋白中的一種(Tsuboi，A.1988.細(xì)菌學(xué)雜志170935-945)。最后，源自綠膿假單胞菌的oprI基因編碼重要的外膜脂蛋白前體(Saint-Onge，A.等人1992普通微生物學(xué)雜志(J.Gen.Microbiol).138733-741)。
實(shí)施例17選擇又一個(gè)包含稱為pho3-50質(zhì)粒的克隆。此質(zhì)粒包括互補(bǔ)無前導(dǎo)序列phoA的基因(或其一部分)?；虻暮塑账岷屯贫ò被嵝蛄蟹謩e作為SEQ ID NOS.34和35列出。
進(jìn)行pho3-50的氨基酸序列比較。
可以在鏈球菌(penA，pbp2B，pbpB2)，布氏疏螺旋體(pbp2)，糞腸球菌(pbpC)，金黃色葡萄球菌(Stephylococcus aureus)(pbpA)，麻風(fēng)分枝桿菌(Mycobacterium leprae)(pbpC)和幽門螺桿菌(pbp2)中鑒定GBS Pho3-50基因產(chǎn)物的同源物。在所有的情況中，上面的同源物可以被鑒定為青霉素結(jié)合蛋白(PBP)。編碼青霉素結(jié)合蛋白的基因通常位于與細(xì)胞壁合成相關(guān)的一簇基因中(Pucci，M.J.等人.1997.細(xì)菌學(xué)雜志1795632-5635)。此外，PBP到細(xì)菌的細(xì)胞壁中，某些或全部蛋白質(zhì)暴露于外部細(xì)菌表面的一般整合。
序列表<110>Microscience Limited<120>基因和蛋白質(zhì)，及其用途<130>REP05973WO<140><141><160>35<170>PatentIn Ver.2.1<210>1<211>587<212>DNA<213>B群鏈球菌<220><221>CDS<222>(1)..(582)<400>1atg atc cca gta gta atc gaa caa aca agt cgt ggt gaa cgt tct tat48Met Ile Pro Val Val Ile Glu Gln Thr Ser Arg Gly Glu Arg Ser Tyr1 5 10 15gat att tac tca cgt ctt tta aaa gat cgt att att atg ttg aca ggc96Asp Ile Tyr Ser Arg Leu Leu Lys Asp Arg Ile Ile Met Leu Thr Gly20 25 30caa gtt gag gat aat atg gcc aat agt atc att gca cag tta ttg ttt144Gln Val Glu Asp Asn Met Ala Asn Ser Ile Ile Ala Gln Leu Leu Phe35 40 45ctc gat gca caa gat aat aca aag gat att tac ctt tat gtc aat aca192Leu Asp Ala Gln Asp Asn Thr Lys Asp Ile Tyr Leu Tyr Val Asn Thr50 55 60cca ggt ggt tca gta tcg gct gga ctt gct att gtg gac acc atg aac240Pro Gly Gly Ser Val Ser Ala Gly Leu Ala Ile Val Asp Thr Met Asn65 70 75 80ttc att aaa tcg gac gta cag acg att gtt atg ggg atg gct gct tcg288Phe Ile Lys Ser Asp Val Gln Thr Ile Val Met Gly Met Ala Ala Ser85 90 95atg gga acc att att gct tca agt ggt gct aaa gga aaa cgt ttt atg336Met Gly Thr Ile Ile Ala Ser Ser Gly Ala Lys Gly Lys Arg Phe Met100 105 110tta ccg aat gca gaa tat atg atc cac caa cca atg ggc gga aca ggc384Leu Pro Asn Ala Glu Tyr Met Ile His Gln Pro Met Gly Gly Thr Gly115 120 125gga ggt aca cag caa tct gat atg gct atc gct gct gag cat ctt tta432Gly Gly Thr Gln Gln Ser Asp Met Ala Ile Ala Ala Glu His Leu Leu130 135 140aaa acg cgt cat act tta gaa aaa atc tta gct gat aat tct ggt caa480Lys Thr Arg His Thr Leu Glu Lys Ile Leu Ala Asp Asn Ser Gly Gln145 150 155 160tct att gaa aaa gtc cat gat gat gca gag cgt gat cgt tgg atg agt528Ser Ile Glu Lys Val His Asp Asp Ala Glu Arg Asp Arg Trp Met Ser165 170 175gct caa gaa aca ctt gat tat ggc ttt att gat gaa atc atg gct aat576Ala Gln Glu Thr Leu Asp Tyr Gly Phe Ile Asp Glu Ile Met Ala Asn180 185 190aat gaa taagg 587Asn Glu<210>2<211>194<212>PRT<213>B群鏈球菌<400>2Met Ile Pro Val Val Ile Glu Gln Thr Ser Arg Gly Glu Arg Ser Tyr1 5 10 15Asp Ile Tyr Ser Arg Leu Leu Lys Asp Arg Ile Ile Met Leu Thr Gly20 25 30Gln Val Glu Asp Asn Met Ala Asn Ser Ile Ile Ala Gln Leu Leu Phe35 40 45Leu Asp Ala Gln Asp Asn Thr Lys Asp Ile Tyr Leu Tyr Val Asn Thr50 55 60Pro Gly Gly Ser Val Ser Ala Gly Leu Ala Ile Val Asp Thr Met Asn65 70 75 80Phe Ile Lys Ser Asp Val Gln Thr Ile Val Met Gly Met Ala Ala Ser85 90 95Met Gly Thr Ile Ile Ala Ser Ser Gly Ala Lys Gly Lys Arg Phe Met100 105 110Leu Pro Asn Ala Glu Tyr Met Ile His Gln Pro Met Gly Gly Thr Gly115 120 125Gly Gly Thr Gln Gln Ser Asp Met Ala Ile Ala Ala Glu His Leu Leu130 135 140Lys Thr Arg His Thr Leu Glu Lys Ile Leu Ala Asp Asn Ser Gly Gln145 150 155 160Ser Ile Glu Lys Val His Asp Asp Ala Glu Arg Asp Arg Trp Met Ser165 170 175Ala Gln Glu Thr Leu Asp Tyr Gly Phe Ile Asp Glu Ile Met Ala Asn180 185 190Asn Glu<210>3<211>218<212>DNA<213>B群鏈球菌<220><221>CDS<222>(1)..(216)<400> 3atc aga gca tat tct ggt cct ctt tcg gtt ttc ctg cca cgt ttt aaa48Ile Arg Ala Tyr Ser Gly Pro Leu Ser Val Phe Leu Pro Arg Phe Lys1 5 10 15gct tgt gat ara ata gtc aat gtg agg agg act atc atg tta ttt aag96Ala Cys Asp Ile Ile Val Asn Va1 Arg Arg Thr Ile Met Leu Phe Lys20 25 30gaa aaa att cct gga cta ata tta tgc ttt att att gct ata cca tct144Glu Lys Ile Pro Gly Leu Ile Leu Cys Phe Ile Ile Ala Ile Pro Ser
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1.一種由可從B群鏈球菌中獲得的包括此處被鑒定為phol-13，pho3-21，pho2-15，pho3-18，pho3-22，pho3-3，pho3-17，pho2-2，pho1-5，pho3-1，pho3-23，pho3-50，pho1-14，pho2-10，pho3-14，pho3-24和ho3-29的基因中任一個(gè)的操縱子或其同源物或其功能性片段編碼的肽。
2.權(quán)利要求1的肽，包含在此處被鑒定為SEQ ID NOS.2，4，6，8，10，11，13，15，17，19，21，23，25，27，29，31，33和35的任一氨基酸序列。
3.用于治療用途的權(quán)利要求1或權(quán)利要求2的肽。
4.一種編碼用于治療用途的權(quán)利要求1或權(quán)利要求2的肽的多核苷酸。
5.一種表述權(quán)利要求1或權(quán)利要求2的肽的轉(zhuǎn)化宿主。
6.一種疫苗，包含權(quán)利要求1或權(quán)利要求2的肽，或用于其表達(dá)的工具。
7.權(quán)利要求1-5中任何一項(xiàng)的產(chǎn)品用于篩選潛在藥物或用于毒性檢出的用。
8.權(quán)利要求1-5中任何一項(xiàng)的產(chǎn)品在制備用于治療或預(yù)防與細(xì)菌感染相關(guān)的病癥的藥物中的用途。
9.權(quán)利要求8的用途，其中的感染是B群鏈球菌感染。
10.權(quán)利要求8或權(quán)利要求9的用途，其中的感染是灶性感染。
11.權(quán)利要求8或權(quán)利要求9的用途，其中的感染是尿道感染。
12.針對權(quán)利要求1或權(quán)利要求2的肽所產(chǎn)生的抗體。
全文摘要
根據(jù)本發(fā)明,在B群鏈球菌中鑒定一系列基因,其產(chǎn)物可能與生物體的外表面結(jié)合。該基因或其功能性片段在制備治療制劑,例如使患者對微生物感染產(chǎn)生免疫的疫苗中可能是有益的。
文檔編號C12Q1/37GK1331745SQ99814780
公開日2002年1月16日 申請日期1999年12月22日 優(yōu)先權(quán)日1998年12月22日
發(fā)明者M·J·G·休斯, J·D·桑坦格羅, J·D·萊恩, P·埃弗里斯特, R·斯?fàn)柕侣? J·C·穆爾, R·K·威爾遜, R·J·多布森, G·杜根 申請人:微科學(xué)有限公司