專利名稱：分離病毒顆粒的方法
技術(shù)領域：
本發(fā)明涉及一種對病毒顆粒進行純化和定量的新方法。更具體地，本發(fā)明涉及一種通過離子交換色譜純化和定量腺病毒的方法。本發(fā)明還涉及一種鑒定不同血清型腺病毒的方法。
基因治療現(xiàn)今取得了顯著的進步，自從1990年的第一次試驗以來在人體中正進行著各種各樣的臨床研究。在當前使用的基因轉(zhuǎn)移方法中，病毒載體是特別令人鼓舞的，其中腺病毒處于首要地位。
基因治療中腺病毒載體的發(fā)展必需借助于兩種技術(shù)(這是現(xiàn)今限制病毒原種生產(chǎn)之所在)第一種是在來自所用病毒構(gòu)建和擴增步驟的樣品中定量測定病毒顆粒的高選擇性高敏感性的快速方法，這一點對病毒原種生產(chǎn)方法的優(yōu)化特別重要；第二種是純化病毒顆粒的易于推廣至工業(yè)規(guī)模的簡單、可靠、可重復的方法。
腺病毒臨床用料的生產(chǎn)仍是一種冗長的過程，因為有許多轉(zhuǎn)染和擴增的步驟，其產(chǎn)率未經(jīng)優(yōu)化。重組腺病毒一般是通過將病毒DNA引入包衣化細胞系中，然后培養(yǎng)2-3天(腺病毒的動力學周期為24-36小時)后機械或化學溶胞而制得?；蛘甙戳硪环椒ǎ瑢⑴囵B(yǎng)進行更長時間(8-12天)，在經(jīng)包衣化細胞自溶自動釋放后直接在上清中收集病毒(WO98/00524)。
要形成病毒原種一般需要2-7個擴增周期。對病毒原種生產(chǎn)方法優(yōu)化的重要限制在于病毒顆粒的滴定方法。實際上，生物學方法是相對敏感和精確的方法，但實施起來時間特別長(根據(jù)所用的測定方法不同需4-15天，即測定轉(zhuǎn)基因活性(tdu)還是要獲得噬菌斑(pfu)。已開發(fā)了更快捷的分析方法，但若不預純化在溶胞物、粗細胞提取物或培養(yǎng)物上清中滴定病毒顆粒時，其精確性和靈敏度不夠。這就是為什么要以大概估計的感染復數(shù)(MOI)進行連續(xù)的擴增循環(huán)。由此得出，擴增步驟可重復性差，甚至往往比優(yōu)化的方法所需的時間更長和/或步驟更多。腺病毒溶液的快速、精確滴定方法可以在每一步調(diào)節(jié)感染復數(shù)，以優(yōu)化腺病毒原種的總體生產(chǎn)方法。
病毒顆粒的定量方法應滿足幾個條件。首先，它應該足夠靈敏，以保證測定稀釋樣品或低滴度(一般＜1×109病毒顆粒/ml(pv/ml))樣品中的病毒顆粒，而無需求助于預富集步驟。病毒顆粒的測定應能在溶胞物或粗樣本中直接進行，而無需純化或預處理步驟。另外，該方法應具有高選擇性，以克服溶胞液或細胞粗提物中存在的眾多化合物的可能干擾，這些化合物的比例可依培養(yǎng)條件而變化。
文獻中已報道了基于陰離子交換色譜的定量分析方法(Huygue等，人類基因治療(Human Gene Ther.61403-1416，1995；P.W.Shabram等，人類基因治療8453-465，1997)。該方法的檢測限為約1×108pv/ml，其適用于純化病毒樣品的滴定。但在溶胞液或細胞粗提物中進行分析時該方法的靈敏降低。在這種樣品中的檢測限估計為2-5×109pv/ml，該方法不能在很稀的未純化的樣品中定量測定腺病毒顆粒，如在病毒轉(zhuǎn)染和擴增步驟時被感染細胞的溶胞液中，其腺病毒滴度典型地為約1×108pv/ml到1×109pv/ml。另外，該方法也不能在獲自某些無動物蛋白之生產(chǎn)培養(yǎng)基的樣品中定量測定腺病毒顆粒。實際上，在培養(yǎng)結(jié)束時這種培養(yǎng)基中含有糖、氨基酸、維生素或酚紅等類型的化合物，其中有些可能干擾腺病毒顆粒的定量測定，并導致大大高估樣品的滴度。最后，Shabram等報道的色譜方法需要用廣譜活性的核酸酶(Benzonase)預處理樣品，以消除干擾顆粒檢測和測定的核酸。
關(guān)于腺病毒的制備性分離方法，從許多年前就開始使用色譜法純化腺病毒顆粒[Haruna，I.，Yaosi，H.，Kono，R.和Watanabe，I.，病毒學(Virology)(1961)13，264-267；Klemperer，H.G.和Pereira，H.G.，病毒學(1959)9，536-545；Philipson，L.，病毒學(1960)10，459-465]。近年來又報道了大規(guī)模純化重組腺病毒的方法(國際專利申請WO96/27677、WO97/08298、WO98/00524、WO98/22588)。
專利申請WO98/00524特別公開了使用強陰離子交換樹脂Source 15Q的純化方法，其在一個色譜步驟中可以獲得純度至少與經(jīng)氯化銫梯度超速離心純化的樣品相當?shù)南俨《局破?。該純度很高，達到了人體臨床研究要求的標準(WHO生物標準化專家委員會第49號報告，WHO技術(shù)報告系列，日內(nèi)瓦世界衛(wèi)生組織，待出版)。
但是，當待純化樣品的病毒滴定小(例如腺病毒產(chǎn)量低時，或當對從早期擴增步驟所獲原種進行純化時)，或當病毒生產(chǎn)培養(yǎng)基導致有與腺病毒共洗脫的成分時(例如無胎牛血清的培養(yǎng)基的情況)，以前報道的色譜技術(shù)的有限效力既不能從這種起始材料定量、也不能從此一步純化腺病毒顆粒。
因此，問題在于要擁有這樣的對粗樣品病毒顆粒的滴定方法，它要同時快速、靈敏和有高選擇性。問題還在于要擁有一種可靠的可重復的純化方法，它能夠從同樣的粗樣品優(yōu)選一步獲得藥物質(zhì)量的病毒制品。
現(xiàn)發(fā)現(xiàn)(這也構(gòu)成本發(fā)明的主題)，某些色譜載體出人意料地對于分離病毒顆粒、特別是腺病毒顆粒具有特別優(yōu)異的性質(zhì)。這些性質(zhì)使得能夠以很高的靈敏度和選擇性從粗樣品滴定和/或純化病毒顆粒，而無需預處理。這些載體的使用另外出人意料地提供了一種色譜分離和鑒別不同血清型腺病毒或在尾絲或六鄰體上修飾的腺病毒的快速簡便的分析方法。
本發(fā)明涉及一種從生物介質(zhì)中分離病毒顆粒的方法，其特征在于包含至少一個在含基質(zhì)和離子交換基團的載體上進行的色譜步驟，所述基團通過一種柔性臂接枝在所述基質(zhì)上。
所述基質(zhì)可以選自瓊脂糖、葡聚糖、丙烯酰胺、二氧化硅、聚[苯乙烯-二乙烯苯]，為單一物質(zhì)或混合物。優(yōu)選地，基質(zhì)由瓊脂糖構(gòu)成，更優(yōu)選由約6％交聯(lián)的瓊脂糖構(gòu)成。
已開發(fā)了由其上接枝官能化離子交換柔性臂的交聯(lián)瓊脂糖小珠構(gòu)成的載體，用于生物分子的工業(yè)化制備性色譜。這些載體是特別設計用于從簡單凈化之粗混合物(即去除其懸浮的固體成分)捕獲生物分子的步驟。它們的性能已在以下方面得以優(yōu)化載體上結(jié)合溶質(zhì)的容量很大，高液體線性流速下反壓很小，成本低，以及對再生所用洗滌劑的化學耐性很強。
有利地，所述柔性臂是親水性質(zhì)的，并由合成或天然聚合物構(gòu)成。在合成聚合物中，可以提到由聚乙烯醇單體組成的聚合物，聚丙烯酰胺、聚甲基丙烯酰胺或聚乙烯醚。作為天然來源的聚合物，特別可以提到選自淀粉、纖維素、葡聚糖和瓊脂糖的天然多糖聚合物。優(yōu)選所述柔性臂的聚合度為約30個單體單元，更優(yōu)選該柔性臂為平均分子量為約5000Da的葡聚糖。
優(yōu)選地，該柔性臂通過接枝能與陰離子分子作用的基因而功能化。最廣義地講，該基因由胺構(gòu)成，可以是叔胺或季銨。在本發(fā)明中，使用強陰離子交換劑特別有利。因此，本發(fā)明優(yōu)選使用由季銨功能化的如上所述的色譜載體。
作為特別優(yōu)選用于實施本發(fā)明的載體，可提及Q SepharoseXL(Amersham Pharmacia Biotech)。在專利申請WO98/39467的實施例中提到了這種載體的使用。純化的腺病毒通過用聚乙二醇(PEG)處理而被修飾。反應后，在Q SepharoseXL柱上通過，分離修飾的腺病毒、未修飾的腺病毒和PEG。因此這是一種化學反應的起始物和終產(chǎn)物間的分離。本領域技術(shù)人員不能預期該柱能夠用于從含各種污染物(宿主DNA、RNA、蛋白、脂類、脂蛋白、內(nèi)毒素等)的復雜生物介質(zhì)(如包衣化細胞的溶胞物)成功分離腺病毒。閱讀該文件后也看不出，Q SepharoseXL能夠用于制備性目的，因為已知在注入大量產(chǎn)物時大部分載體喪失其效力。
具有基質(zhì)組成、顆粒大小分布、孔隙率、柔性臂的化學性質(zhì)、接枝密度方面相似特征的其他強陰離子交換載體也可用于腺病毒顆粒的制備性和分析性分離。有利地，所述基質(zhì)由6％交聯(lián)的瓊脂糖構(gòu)成，它用柔性臂接枝，柔性臂由葡聚糖組成并用強陰離子交換基團功能化。該載體具有優(yōu)選約40-200μm的粒度；與粒度相關(guān)的“約”字指所述值位于相對標示值+/-20％誤差范圍內(nèi)。優(yōu)選該誤差在+/-10％之內(nèi)，更優(yōu)選該誤差在標示值的+/-5％之內(nèi)。
特別優(yōu)選地，粒度在45-165μm之間，以90μm為中心。
同樣有利的是，所述基質(zhì)的分散性為95％顆粒的直徑在顆粒平均直徑的0.1-10倍之間，優(yōu)選在顆粒平均直徑的0.3-3倍之間。
在下文實施例中使用的Q SepharoseXL非窮舉性地說明了可用于本發(fā)明之載體的性能。
Q SepharoseXL的珠粒大小分布為45-165μm，以90μm為中心。珠粒大小和分布的這些特征使該載體成為制備型的色譜交換劑。色譜理論和實踐都提示，這種載體對于分離在離子交換相互作用方面具有相似色譜行為的成分效力非常有限。同樣，這種載體產(chǎn)生分辨差的寬色譜峰，特別是因為構(gòu)成載體的珠粒太大、分布太寬。這些預料的色譜特征在諸如蛋白質(zhì)的一般性生物分子中得到了驗證，它們以分離性差的幾個寬峰形式被洗脫(見Data File Pharmacia Biotech No.18-1123-82)。相反，完全出人意外的是，腺病毒顆粒從此類載體以極精細的很對稱的峰形式被洗脫。與蛋白質(zhì)如白蛋白比較，以理論塔板的當量高度(HEPT)或單位柱長的理論塔板數(shù)(N/m)測定的Q SepharoseXL填充柱的效率，對腺病毒的(N/m35000)比對諸如牛血清白蛋白之類蛋白的(N/m600)高50-100倍。例如見圖1。因此，當在優(yōu)化色譜條件下實施時，這類凝膠、特別是凝膠Q SepharoseXL會對腺病毒給出分離生物分子一般推薦之載體無法匹敵的精細色譜峰。在分離生物分子的推薦載體中，可提及聚苯乙烯二乙烯苯型基質(zhì)的載體(例如樹脂Source 15Q和Source 30Q，或樹脂Poros HQ、Poros DE2或Poros D)。還可以提及甲基丙烯酸酯乙二醇共聚物型基質(zhì)的載體，例如樹脂Toyopearl DEAE、QAE和Super Q，或離子交換功能團位于接枝在基質(zhì)上的聚丙烯酰胺型線性聚合物鏈上的Fractogel TMAE、TMAE HiCap、DMAE或DEAE型樹脂。
本發(fā)明所用載體對分離腺病毒顆粒的效率導致檢測這些顆粒的靈敏度很高。當在分析型色譜柱中使用這些載體時，病毒顆粒出人意料的色譜行為使得腺病毒定量的檢測限定低于現(xiàn)有技術(shù)所述方法的檢測限。該檢測限至少低10倍，在粗細胞溶胞物類樣品中可達到1×108pv/ml水平的檢測限，對于純化的病毒樣品可達到1×107pv/ml水平的檢測限。
此類載體還保證相對于待分析樣品中所存在污染物如蛋白質(zhì)和核酸的很高的選擇性。蛋白質(zhì)呈現(xiàn)很寬的峰，并遠在病毒峰之前被洗脫。核酸以遠高于病毒洗脫所需濃度的鹽水濃度從柱中洗脫。該特征與以前報道的色譜方法(Huygue等，人類基因治療，61403-1416，1995)很不相同，它得以克服這類化合物對病毒峰的干擾。最后，甚至在待分析樣品中含有與病毒顆粒共洗脫成分時，病毒峰很特異的形式也易于鑒別并進行其定量。
因此，本發(fā)明中所用的載體在分析含大量蛋白質(zhì)和核酸的樣品中之腺病毒時，能以高精確度很容易地鑒別和定量腺病毒峰。也可以從獲自各種各樣病毒生產(chǎn)培養(yǎng)基、缺乏動物來源成分之介質(zhì)的樣品進行病毒顆粒的定量分析及純化，所述動物來源成分例如為白蛋白，它可以來自牛、人或其他來源(圖2)。同樣重要的是證明本發(fā)明所述方法適用于分析未采用核酸酶預處理的含核酸的樣品，并不影響該方法的靈敏度和選擇性。
因此，本發(fā)明的另一主題涉及該類載體，特別是Q SepharoseXL從生物介質(zhì)中制備性分離或純化病毒顆粒的應用。這樣的方法還可以選擇包含在另一載體上的預色譜步驟，例如專利申請WO98/00524的方法中所用的那些載體，尤其是樹脂Source 15Q。這種預色譜步驟在一些特別的情形中可能是有利的，例如生物介質(zhì)中存在太多量的污染物時。
本發(fā)明的另一主題涉及該類載體、尤其是Q SepharoseXL在生物介質(zhì)中定量分析或滴定病毒顆粒的應用。
從中進行病毒純化或滴定的生物介質(zhì)可以是病毒包衣化生產(chǎn)細胞的上清液或包衣化細胞的溶胞物，或所述病毒的預純化溶液。當從包衣化生產(chǎn)細胞上清液或溶胞物進行病毒顆粒的制備性分離或純化時，進行預超濾步驟可能是有利的，優(yōu)選在截斷閾值300-500kDa的膜上進行切線超濾。
本發(fā)明的純化方法可以從稀釋或/和污染物高富集的儲液、在完全符合工業(yè)化要求和治療分子生產(chǎn)方面法規(guī)的條件下，一步獲得純度方面高質(zhì)量的病毒制品，且顆粒的收率高(約75-80％)。
本發(fā)明的另一主題涉及一種腺病毒定量方法，其特征在于在QSepharoseXL型載體上色譜分離病毒顆粒，通過測定色譜級分的吸光度確定腺病毒的量。本發(fā)明方法使得可以更容易更精確地跟蹤生產(chǎn)的動力學過程，即無需預處理直接對上清液的均勻樣品測定，這使得病毒顆粒原種的生產(chǎn)工藝更具有可重復性、可得到更好的控制。
本發(fā)明還有一個主題是Q SepharoseXL型色譜載體在鑒別不同血清型腺病毒中的應用。實際上，令人驚奇地發(fā)現(xiàn)，通過測定保留時間和色譜峰260nm和280nm吸光度之比，該類載體可以直接從病毒生產(chǎn)介質(zhì)的樣品簡單迅速地分離和鑒別大量不同血清型的腺病毒。
關(guān)于色譜載體在本發(fā)明中的應用，通過對色譜柱進行鹽梯度的洗脫或者進行等梯度洗脫(即鹽濃度恒定)可進行各種分析和制備目的的病毒顆粒分離。
對于制備性方法，色譜載體可用于常規(guī)色譜柱中或適于高效色譜系統(tǒng)的柱中(例如使用載體Q SepharoseXL)，或用于所謂“流化床”或膨脹系統(tǒng)中(例如使用載體StreamlineQ XL)。色譜柱的大小根據(jù)起始材料中存在的病毒量確定。
待純化的病毒樣品可以施于緩沖液中的載體上，所述緩沖液的電導率使病毒不能保留在載體上，而核酸被固定。有利地，調(diào)節(jié)電導率至45mS/cm。因而這種特別的實施方式可以通過簡單地濾過載體QSepharoseXL來分離病毒和污染病毒樣品的來自宿主細胞的核酸。
本發(fā)明描述的測定和純化以及不同血清型鑒定的方法可以適用于不同類型的病毒，尤其是腺病毒，無論是野生病毒或帶有目的轉(zhuǎn)基因的重組病毒。
除了上述特征外，本發(fā)明還包括源自以下實施例的其他特征和優(yōu)點，這些實施例是說明性質(zhì)的而非限制性的。


圖1純化腺病毒和白蛋白在Q SepharoseXL上的洗脫圖。
圖2無血清培養(yǎng)基上所獲病毒培養(yǎng)物上清液在Q SepharoseXL上的洗脫圖。
圖3一種純化的腺病毒制品在Q SepharoseXL上的洗脫圖(注射2×1010pv)。
圖4一種純化的腺病毒制品在Q SepharoseFast Flow上的洗脫圖(注射2×1010pv)。
圖5一種純化腺病毒制品在Q SepharoseXL和Q SepharoseFastFlow上洗脫圖的比較。
圖6一種純化腺病毒制品在Q SepharoseHP上的洗脫圖。
材料和方法1.腺病毒和復制缺陷重組腺病毒的生產(chǎn)腺病毒是約36千堿基長的線性雙鏈DNA病毒。它們的基因組中特別含有每個末端的一個反向重復序列(ITR)、包衣化序列(Psi)、早期基因和晚期基因。主要的早期基因包含在E1、E2、E3和E4區(qū)中。其中包含于E1區(qū)中的基因尤其為病毒繁殖所必需的。主要的晚期基因包含在L1-L5區(qū)中。已對腺病毒Ad5的基因組完全測序，并可在數(shù)據(jù)庫中得到(特別見Genebank M73260)。同樣，對其他腺病毒基因組的部分、甚至全部(Ad2、Ad7、Ad12等)也已測序。
為了用于基因治療，已制備了包含各種治療基因的衍生自腺病毒的不同載體。每種這些構(gòu)建體中，腺病毒均被修飾得不能在感染細胞中復制。因此，現(xiàn)有技術(shù)中描述的構(gòu)建體是缺失病毒復制必需的E1區(qū)的腺病毒，在缺失處插入了外源DNA序列(Levrero等，基因(Gene)101(1991)195；Gosh-Choudhury等，基因，50(1986)161)。另外，為了改善載體的性質(zhì)，已提出在腺病毒基因組中制造另外的缺失或修飾。例如，在ts125突變體中引入了熱敏感性點突變，使得72kDa的DNA結(jié)合蛋白(DBP)失活(Van der Vliet等，1975)。另一些載體含有另一腺病毒復制和/或繁殖必需區(qū)(E4區(qū))中的缺失。E4區(qū)實際上參與晚期基因表達的調(diào)控、晚期核RNA的穩(wěn)定性、宿主細胞蛋白表達的消除和病毒DNA復制的效率。E1和E4區(qū)缺失的腺病毒載體因此具有很低的病毒基因轉(zhuǎn)錄和表達基底噪音。這種載體已在例如專利申請WO94/28152、WO95/02697、WO96/22378中報道。另外，帶有IVa2基因修飾的載體也已有報道(WO96/10088)。
文獻中報道的重組腺病毒是從各種血清型腺病毒產(chǎn)生的。實際上存在腺病毒的不同血清型，其結(jié)構(gòu)和特性稍有差別，但具有相似的基因組織結(jié)構(gòu)。更具體地講，這些重組腺病毒可以是人源的或動物來源的。關(guān)于人源腺病毒，可優(yōu)選提及歸于C組的那些，尤其是2型(Ad2)，5型(Ad5)腺病毒；B組的7型腺病毒(Ad7)；或A組的12型腺病毒(Ad12)。在動物來源的不同腺病毒中，可優(yōu)選提及狗來源的腺病毒，尤其是腺病毒CAV2的所有株[例如manhattan株或A26/61株(ATCC VR-800)]。尤其在專利申請WO94/26914(引入本文作為參考)中描述了動物來源的其他腺病毒。
在本發(fā)明的一個優(yōu)選實施方案中，重組腺病毒是C組人腺病毒，更優(yōu)選，是腺病毒Ad2或Ad5。
已報道過多種生產(chǎn)重組腺病毒的方法(C.Chartier等，病毒學雜志(J.Virol.)704805-4810，1996；WO96/25506；J.Crouzet等，美國科學院院刊(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)，941414-1419，1997；J-C.He等，美國科學院院刊，952509-2514，1998)。這些方法可以在大腸桿菌中構(gòu)建帶有目的腺病毒基因組的質(zhì)粒，這些質(zhì)粒隨后用限制酶消化以切出質(zhì)粒的腺病毒基因組。然后腺病毒基因組轉(zhuǎn)染在包衣化細胞系中，然后擴增。
重組腺病毒一般通過將病毒DNA引入包衣化細胞系中，隨后約2-3天后(腺病毒的動力學周期為24-36小時)溶解細胞來生產(chǎn)，在另一方案中，培養(yǎng)持續(xù)到8-12天，通過包衣細胞的自溶病毒顆粒自動釋放到培養(yǎng)基中。
以下實施例中所用病毒是含有大腸桿菌lacZ標志基因的腺病毒(AV10CMV.lacZ)。這些腺病毒衍生自Ad5血清型并具有如下結(jié)構(gòu)-包括例如386(HinfI位點)至3446位核苷酸(Sau 3a位點)的E1區(qū)中的缺失。
-插入在所述缺失處的CMV啟動子控制下的lacZ基因的表達盒。
-E3區(qū)的缺失。
文獻中已報道了這些病毒的構(gòu)建(WO94/25073，WO95/14102，WO96/25506，J.Crouzet等，美國科學院院刊941414-1419，1997)。應理解，任何其他構(gòu)建體均可用于本發(fā)明的方法，尤其是帶有其他外源基因和/或其他缺失(例如E1/E4或E1/E2)的病毒。
以前已報道過細胞轉(zhuǎn)染、腺病毒擴增和滴定的技術(shù)(F.L.Graham等，分子生物學(Molecular Biotechnology)3207-220，1995；Crouzet等，美國科學院報刊，941414-1419，1997；WO96/25506)。
按P.Yeh等(病毒學雜志，70559-565，1996)所述實施病毒AV1.0CMV.lacZ所含lacZ基因編碼的β-半乳糖苷酶活性tdu的測定技術(shù)。
-腺病毒AV1.0CMV.lacZ的生產(chǎn)從生產(chǎn)細胞系培養(yǎng)物收集病毒是按以下方法進行的涉及一系列凍-融循環(huán)的常規(guī)方法，或在1％Tween-20存在下化學裂解，或按WO98/00524中所述持續(xù)培養(yǎng)到自溶。
培養(yǎng)基可依據(jù)所用反式補充細胞系或所用的量而變化。這些培養(yǎng)基可以是MEM，DMEM等，其中加或不加胎牛血清并含有不同濃度的無機鹽、糖、氨基酸、維生素、HEPES或酚紅。
反式補充E1區(qū)的細胞如293細胞或PER.C6細胞以培養(yǎng)皿中60-80％的匯合度用從帶目的腺病毒基因組之質(zhì)粒消化獲得的病毒DNA轉(zhuǎn)染。培養(yǎng)持續(xù)8-15天，通過顯微鏡觀察細胞變圓、折射變強而與培養(yǎng)支持物的粘附越來越弱來判斷收獲時機。然后通過3-6個連續(xù)的解凍循環(huán)(-70℃乙醇干冰，37℃水溶)從核中釋放病毒。如此獲得的病毒再以給定的10-500病毒顆粒/細胞之間的感染復數(shù)(MOI)感染反式補充細胞，持續(xù)培養(yǎng)40-72小時后如前所述獲得擴增的病毒。
根據(jù)專利申請WO98/00524中所述另一方案，不在感染后40-72小時收集細胞，而延長培養(yǎng)至8-12天，以獲得細胞的完全溶解，而無需進行凍融循環(huán)。病毒自動釋放到上清液中。通過孔隙度遞減的濾膜(10μm/1.0μm/0.8-0.2μm)過濾凈化上清液。然后凈化的上清液通過截斷閾為300kDa的螺旋形膜切線超濾而被濃縮。濃縮倍數(shù)為約20-100倍。根據(jù)另一方案，凈化的上清液直接用于通過Q SepharoseXL柱色譜純化腺病毒顆粒。
-腺病毒制品的分析以前已報道了(WO98/00524)用于測定所獲病毒制品質(zhì)量的各種分析技術(shù)(SDS-PAGE，Western印跡分析，Resource 15Q柱上的IE-HPLC等)。
2.利用色譜載體Q SepharoseXL的分析方法從感染的包衣細胞培養(yǎng)物檢測、鑒別及定量腺病毒顆粒的操作條件按如下實施。
在一個HR5/5型柱(Amersham-Pharmacia Biotech)中裝填約1ml QSepharoseXL(45-165μm；Amersham-Pharmacia Biotech)制備色譜柱。將該柱裝在Waters 626型HPLC系統(tǒng)上，該系統(tǒng)裝有在200-300nm吸光度范圍操作的996二極管陣列紫外/可見檢測系統(tǒng)。該陰離子交換柱用于分離和定量測定病毒顆粒。
在每次分析前，將柱子在20mM Tris/HCl，pH7.5中以1.5ml/分鐘的流速于30℃平衡。將含有病毒顆粒的待分析樣品注射到該柱上。為了獲得最大分辨率，注射顆粒的量應小于或等于2×1012顆粒/ml載體。注射的體積對各成分的分離沒有敏感的影響，至少小于或等于50ml/ml凝膠的體積是如此。注射后，用5倍體積的相同緩沖液洗柱子，用20mM Tris/HCl，pH7.5緩沖液中的0-1M NaCl線性梯度在30倍柱體積內(nèi)洗脫結(jié)合在柱子上的成分。在梯度結(jié)束時，用2倍柱體積的0.5N氫氧化鈉洗柱子，然后再平衡用于以下的分析。
用經(jīng)CsCl梯度或經(jīng)色譜純化的腺病毒顆粒制品建立了260nm處的標準曲線。按1×1010顆粒/260nm吸光度單位的轉(zhuǎn)換倍數(shù)，通過其在0.1％SDS溶液中的260nm吸光度預先滴定了該標準制品的病毒顆粒。
在這些條件下，腺病毒在約18分鐘的保留時間處被洗脫，并具有1.30±0.02的260nm與280nm吸光度之比(見圖3)。Millennium Waters色譜信號獲取和處理工作站的“suitability”軟件在每次分析后自動確定峰的N/m值(以半高度計算)和不對稱性(以10％高度計算)。腺病毒峰的N/m值典型為35000±3000，峰的不對稱因子為1.05±0.05。
3.用陽離子交換色譜純化腺病毒的制備性方法從293或PER.C6包衣細胞(WO97/00326)的培養(yǎng)物純化腺病毒。如前所述產(chǎn)生病毒并在自溶后在上清液中回收。然后，在臨純化前通過0.45μm的膜(HT Tuffryn或聚砜)過濾。若無相反說明，純化步驟與上文所述病毒顆粒分析型分離使用的步驟相同，但使用不同的洗脫梯度。用0.25-1M NaCl梯度在30倍柱體積內(nèi)洗脫。以每ml色譜載體1×1012顆粒的容量計，按待純化的病毒的量調(diào)節(jié)柱的體積。同樣，洗脫劑的線性流速設定在300cm/h。
實施例實施例1Q SepharoseXL型載體與載體Q SepharoseFast Flow的比較本實施例說明Q SepharoseXL型載體相對于載體Q SepharoseFast Flow的特異性特性。
這兩種載體由相同基質(zhì)結(jié)構(gòu)(6％交聯(lián)的瓊脂糖)和相同粒度分布(45-165μm)的小珠組成。它們的區(qū)別在于，Q SepharoseXL有帶有Q型離子交換基團的葡聚糖柔性臂，而Q SepharoseFF中同樣的Q型基團直接固定在瓊脂糖基質(zhì)上。
將一純化的腺病毒制品(2×1010pv)注射在一個Q SepharoseXL柱(1ml載體)上，并用如材料和方法第2段中所述NaCl梯度洗脫。洗脫曲線示于圖3中。在同樣的條件下，在載體Q SepharoseFast Flow(FF)裝填的相似柱子上進行相同的分析。洗脫曲線示于圖4中。色譜性能的比較示于下表中。
表1載體Q SepharoseXL和Q SepharoseFF色譜性能的比較

如圖3和4中所示，在兩種情況下病毒的保留時間相似(對于QSepharoseXL t＝18分鐘，對于Q SepharoseFF，t＝20分鐘)，但載體Q SepharoseXL的效率大大高于載體Q SepharoseFF。
同樣，在這兩種載體上對含2×109病毒顆粒的細胞粗提物的分析(圖5)表明，只有載體Q SepharoseXL給出了確定的可定量的病毒峰。而樣品中存在的蛋白質(zhì)在所研究的兩種載體上以相同的效率分離(圖5)。
這些結(jié)果表明，存在攜離子交換基團的柔性臂是該類載體的必需要素。這些柔性臂的存在對Q SepharoseXL分離腺病毒的有利色譜性能有重要貢獻。
實施例2Q SepharoseXL型載體與載體Q SepharoseHP的比較本實施例證明Q SepharoseXL型載體相對于Q SepharoseHP的特異性特征。
這兩種載體由相同基質(zhì)結(jié)構(gòu)的小珠組成(6％交聯(lián)的瓊脂糖)。載體QSepharoseXL具有以90μm為中心的從45到165μm的珠粒大小分布。載體Q SepharoseHP的粒度為34±10μm。載體Q SepharoseHP的粒度比載體Q SepharoseXL的更細且分散性小得多。因此載體QSepharoseHP應具有比Q SepharoseXL好得多的色譜性能。
將一純化的腺病毒制品(2×1010pv)注射到一個Q SepharoseXL柱上(1ml載體)，并用材料和方法部分第2段中所述NaCl梯度洗脫。洗脫曲線示于圖3中。在相同條件下，在載體Q SepharoseHP填充的相似柱子上進行相同的分析。用載體Q SepharoseHP獲得的洗脫曲線示于圖6中。
圖6中所示結(jié)果表明，載體Q SepharoseHP的效率(N/m，15000)明顯低于載體Q SepharoseXL。另外，載體Q SepharoseHP上的病毒峰有一個明顯的拖后(不對稱性，1.6)，而載體Q SepharoseXL上該峰是嚴格對稱的。
出人意料地，盡管其粒度更細、其粒度分布更少分散，載體QSepharoseHP不能達到載體Q SepharoseXL分離病毒顆粒的性能。而它對于分離蛋白質(zhì)的性能要好得多，如供應商(Amersham-PharmaciaBiotech)所示，這也在我們的牛白蛋白分離試驗的試驗條件下得到了證實(下表)。
表2.載體Q SepharoseXL和Q SepharoseHP的色譜性能比較

這些結(jié)果證實，攜強陰離子交換基團之柔性臂的存在是該類載體分離病毒顆粒之色譜性能的必需要素。這些結(jié)果還表明在載體選擇條件中要考慮的另一重要參數(shù)是粒度，尤其是大小分散度。
實施例3Q SepharoseXL型載體與載體FractogelTMAE(S)和Source 15Q的比較。
本實施例證明Q SepharoseXL型載體相對于載體FractogelTMAE(S)和載體Source 15Q的特異性特性。
這三種載體由不同結(jié)構(gòu)和組成的小珠組成。Q SepharoseXL由6％交聯(lián)的瓊脂糖構(gòu)成。載體FractogelTMAE是一種交聯(lián)的聚甲基丙烯酸酯樹脂，載體Source 15Q由聚苯乙烯-二乙烯苯型樹脂小珠構(gòu)成。載體FractogelTMAE(S)(20-40μm)和Source 15Q(15μm)的粒度遠小于載體Q SepharoseXL的(45-165μm)，且更少分散。另外，三種載體都帶有強離子交換基團。這些基團位于FractogelTMAE(S)和QSepharoseXL的基質(zhì)上固定的柔性臂上，而Source 15Q中的交換基團直接接枝在基質(zhì)上。
將一種純化的腺病毒制品(2×1010pv)注射到一個Q SepharoseXL柱(1ml載體)上，并用材料和方法部分第2段中所述NaCl梯度洗脫。洗脫曲線示于圖3中。在相同條件下，在一載體Source 15Q裝填的相似柱上進行相同的分析，在載體FractogelTMAE(S)裝填的柱上進行另一分析。
出人意料地，盡管粒度要細得多，但載體FractogelTMAE(S)達不到載體Q SepharoseXL分離腺病毒的性能。而它對分離蛋白質(zhì)的性能要好得多。同樣，雖然其粒度很細且粒度分布近于單一分布，載體Source15Q也不能達到載體Q SepharoseXL分離腺病毒的性能。
表3載體Source 15Q、Q SepharoseXL和FractogelTMAE(S)色譜性能的比較

這些結(jié)果顯示，攜交換基團之柔性臂的存在不是負責載體QSepharoseXL分離腺病毒之特異色譜性能的唯一因素。這些臂的化學組成、其接枝密度、接枝柔性臂之基質(zhì)的性能和孔隙率也是可能影響載體分離病毒顆粒之色譜性能的參數(shù)。
實施例4不同血清型野生腺病毒顆粒的檢測和定量本實施例說明基于使用Q SepharoseXL型色譜載體的不同血清型野生腺病毒顆粒的檢測和鑒別方法。
通過感染培養(yǎng)于DMEM培養(yǎng)基的A549細胞生產(chǎn)不同野生型腺病毒，并在將細胞凍融3個循環(huán)后收集。然后在分析前通過一Acrodisc膜(HTTuffryn型0.45μm；GelmanSciences)過濾病毒制品。
然后按材料和方法部分第2段中所述步驟色譜分析這些不同制品。但在本實施例中，用體積稍大于1ml的柱(約1.35ml)進行分析，這解釋了為什么腺病毒5的保留時間(25.3分鐘)長于材料和方法部分所述參考保留時間(18分鐘)。
表4不同野生型腺病毒的色譜特征

本實施例表明，不同的腺病毒不但具有依血清型而變化的保留時間，而且具有血清型各自特有的260nm/280nm吸光度比值。這兩個標準(其可在同一個色譜分析中同時測定)的組合構(gòu)成了快速可靠地鑒別色譜制品中腺病毒血清型的方法。
研究了病毒在柱上的保留時間和7、3、4、5和2型腺病毒尾絲和六鄰體特征之間的相關(guān)性，所述腺病毒的序列已發(fā)布(1998，病毒學雜志(1998)72 p.7909和Arch.Virol(1997)142，p.1307)。從尾絲頭的序列一致性數(shù)據(jù)沒有發(fā)現(xiàn)任何相關(guān)性，甚至從尾絲柄中β片層重復的數(shù)目差中也沒有發(fā)現(xiàn)相關(guān)性(見下表)。但令人驚異地，發(fā)現(xiàn)了病毒保留時間和六鄰體序列一致性之間的相關(guān)性(見下表)。這種相關(guān)性與六鄰體在pH7下的總電荷完全一致；這種相關(guān)性表明六鄰體在pH7下電荷的提高相應于病毒在柱上的保留增加。根據(jù)六鄰體暴露的L1部分pH7下的電荷不同可能存在細微的差別，如用3型腺病毒所獲數(shù)據(jù)所顯示的。
表5病毒的保留時間與六鄰體序列一致性之間的相關(guān)性

實施例5在病毒原種生產(chǎn)步驟中重組腺病毒顆粒的檢測和定量本實施例說明Q SepharoseXL型載體在檢測和定量用不同包衣細胞系(293或PER.C6細胞)轉(zhuǎn)染和擴增步驟中產(chǎn)生的重組腺病毒顆粒AV1.0CMV.lacZ的應用。
該極快速的分析方法從培養(yǎng)上清開始在幾分鐘內(nèi)提供每步所得腺病毒溶液的滴度。該快速靈敏的方法可用于優(yōu)化下步的擴增條件，該步驟從而可以在確定和有控制的MOI條件下進行。
試驗了該方法對293或PER.C6細胞轉(zhuǎn)染和擴增步驟中AV1.0CMV.lacZ重組腺病毒生產(chǎn)的控制。
用PacI消化的質(zhì)粒pXL2822(Crouzet等，美國科學院院刊，941414-1419，1997)轉(zhuǎn)染293細胞后產(chǎn)生腺病毒AV1.0CMV.lacZ，然后以確定的感染復數(shù)(MOI)分別感染293或PER.C6細胞。起始的轉(zhuǎn)染用質(zhì)粒消化獲得的5-10微克病毒DNA進行。
表7感染性顆粒濃度(pfu)和具有轉(zhuǎn)基因活性之顆粒(tdu)之間的關(guān)系

實施例6在IGRP2細胞中轉(zhuǎn)染和擴增步驟中所獲重組腺病毒顆粒的檢測和定量本實施例說明Q SepharoseXL型載體在檢測和定量在IGRP2細胞中轉(zhuǎn)染和擴增步驟中所獲重組腺病毒顆粒AV3.0CMV.lacZ中的應用。
在用PacI消化的質(zhì)粒pXL3005轉(zhuǎn)染包衣細胞IGRP2后產(chǎn)生腺病毒AV3.0CMV.lacZ(質(zhì)粒pXL3005通過用CMV啟動替換RSV啟動子衍生自Crouzet等，美國科學院院刊，341414-1419，1997中所述質(zhì)粒pXL2811)，然后以確定的感染復數(shù)感染IGRP2細胞(WO96/22378)。對于細胞溶解，通過細胞的3個凍融循環(huán)收獲病毒。然后在分析前通過0.45μm的Acrodisc膜(HT Tuffryn型)過濾這些病毒制品。
然后按材料和方法中所述色譜分析各種病毒制品。結(jié)果示于下表中。
表8病毒原種生產(chǎn)中所獲重組腺病毒顆粒AV3.0CMV.lacZ的檢測和定量

通過具有轉(zhuǎn)基因活性顆粒的濃度(3.2×108tdu/ml)確定所獲病毒顆?？倲?shù)。pv/tdu之比43與實施例5中所得pv/tdu比值43和55相當，從而得以將病毒顆粒的物理測定值1.39×1010pv/ml與轉(zhuǎn)導單位的生物測定值3.2×108tdu/ml相關(guān)聯(lián)。
實施例7通過樹脂Q SepharoseXL上的色譜純化病毒起始材料為生產(chǎn)病毒的包衣細胞凍融后獲得的培養(yǎng)物溶胞液或細胞自溶后獲得的上清液。
在本實施例報道的試驗中，在5.8ml Q SepharoseXL柱上注射153ml含4.9×1012顆粒的AV1.0CMV.lacZ病毒感染的PER.C6細胞培養(yǎng)物自溶液。如材料和方法部分第2段對病毒分析性分離所述，進行柱平衡和用0.25-1M NaCl梯度以300cm/h的流速在30柱體積內(nèi)洗脫病毒。收集病毒峰(7.1ml)，然后用如上文所述的各種技術(shù)分析(EI-HPLC，SDS-PAGE)。對所收集的級分在Resource Q(1ml)柱上以下述色譜系統(tǒng)進行高效液相色譜分析將10ml如上所述色譜純化的級分注射到在含0.5mM MgCl2之緩沖液Tris/HCl 100mM pH8.0(緩沖液B)中平衡的Resource Q15柱(1ml凝膠，Pharmacia)上。用5ml緩沖液B洗滌后，吸附的成分用30ml NaCl(0-1M)在緩沖液B中的線性梯度以1ml/分的流速洗脫。在260hm處測檢被洗脫的成分。在Q SepharoseXL柱上純化步驟后，所收集的級分有≥99％的病毒顆粒純度(260nm處紫外檢測)。病毒顆粒的純化收率為82％。
該HPLC分析還顯示，起始溶胞液中殘存的牛血白蛋白在制備性色譜過程中被完全消除。
色譜純化的腺病毒級分的電泳分析在聚丙烯酰胺凝膠(4-20％)上在變性條件(SDS)下進行。然后用硝酸銀顯示蛋白條帶。該分析顯示色譜獲得的腺病毒制品具有至少等同于超速離心常規(guī)獲得制品的純度，它不顯示額外的蛋白條帶，這種蛋白帶表明制品中有非腺病毒的蛋白污染。
色譜所得腺病毒制品具有1.30±0.05的A260nm/A280nm吸光度之比。該值與超速離心所獲最好制品的值相同，顯示該制品沒有污染的蛋白和污染的核酸。
病毒滴定顯示確實存在感染性病毒顆粒，pv/pfu比很滿意(見下表)，純化的病毒顆粒具有所期望的有效感染活性。
表9在Q SepharoseXL載體上純化腺病毒AV1.0CMV.lacZ

因此，本實施例中描述的方法可以直接從包衣細胞溶胞液而無需待純化材料的預處理(如超濾或核酸酶處理)純化腺病毒顆粒，而不影響其感染能力。
權(quán)利要求
1.從生物介質(zhì)中分離病毒顆粒的方法，其特征在于包含至少一個在含基質(zhì)、離子交換基團的載體上進行的色譜步驟，所述基團通過一柔性臂接枝在所述基質(zhì)上。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其特征在于所述基質(zhì)選自瓊脂糖、葡聚糖、丙烯酰胺、二氧化硅、聚[苯乙烯-二乙烯苯]、或其混合物。
3.根據(jù)權(quán)利要求2的方法，其特征在于所述基質(zhì)由交聯(lián)的瓊脂糖、優(yōu)選6％交聯(lián)的瓊脂糖構(gòu)成。
4.根據(jù)權(quán)利要求1-3之一的方法，其特征在于所述基質(zhì)的粒度在約40-200μm之間。
5.根據(jù)權(quán)利要求4的方法，其特征在于所述基質(zhì)的粒度以90μm為中心在45-165μm之間。
6.根據(jù)權(quán)利要求4或5的方法，其特征在于所述基質(zhì)的分散度為95％的顆粒直徑在顆粒平均直徑的0.1-10倍，優(yōu)選為顆粒平均直徑的0.3-3倍之間。
7.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其特征在于所述柔性臂是一種由天然或合成聚合物組成的親水臂。
8.根據(jù)權(quán)利要求7的方法，其特征在于所述柔性臂是選自聚乙烯醇、聚丙烯酰胺、聚甲基丙烯酰胺或聚乙烯醚的合成聚合物。
9.根據(jù)權(quán)利要求7的方法，其特征在于所述柔性臂是選自淀粉、纖維素、葡聚糖和瓊脂糖的多糖性質(zhì)的天然聚合物。
10.根據(jù)權(quán)利要求8或9的方法，其特征在于所述柔性臂的聚合度為約30個單體單元。
11.根據(jù)權(quán)利要求10的方法，其特征在于所述柔性臂是平均分子量為約5000Da的葡聚糖。
12.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其特征在于所述離子交換基團是一種強陰離子交換基團。
13.根據(jù)權(quán)利要求12的方法，其特征在于所述強陰離子交換基團是一種季銨。
14.根據(jù)權(quán)利要求7-13之一或權(quán)利要求5的方法，其特征在于所述色譜在Q SepharoseXL型載體上進行。
15.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其特征在于所述生物介質(zhì)是生產(chǎn)所述病毒之包衣細胞的上清液。
16.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其特征在于所述生物介質(zhì)是生產(chǎn)所述病毒之包衣細胞的溶胞產(chǎn)物。
17.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其特征在于所述生物介質(zhì)是所述病毒的一種預純化溶液。
18.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其特征在于包含預超濾步驟。
19.根據(jù)權(quán)利要求18的方法，其特征在于所述超濾是在截斷閾值為300-500kDa的膜上的切線超濾。
20.Q SepharoseXL型色譜載體分析性和/或制備性分離病毒顆粒的應用。
21.根據(jù)權(quán)利要求20的應用，其特征在于所述病毒顆粒為腺病毒。
22.Q SepharoseXL型色譜載體鑒別不同血清型腺病毒的應用。
23.Q SepharoseXL型色譜載體滴定腺病毒的應用。
24.定量測定腺病毒的方法，其特征在于在Q SepharoseXL型載體上色譜分離病毒顆粒，通過色譜級分的吸光度測定腺病毒的量。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種純化和定量測定病毒顆粒的新方法。更具體地講,本發(fā)明涉及一種通過離子交換色譜純化和定量腺病毒的方法。本發(fā)明還涉及一種鑒別不同血清型腺病毒的方法。
文檔編號C12N5/02GK1332796SQ99815158
公開日2002年1月23日 申請日期1999年12月30日 優(yōu)先權(quán)日1998年12月31日
發(fā)明者F·布朗赫, A·巴伯特, B·卡米隆 申請人:阿文蒂斯藥物股份有限公司