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      用二氫唑酮功能化載體進(jìn)行完整細(xì)胞的選擇的制作方法

      文檔序號(hào):560533閱讀:272來源:國(guó)知局
      專利名稱:用二氫唑酮功能化載體進(jìn)行完整細(xì)胞的選擇的制作方法
      技術(shù)領(lǐng)域
      本發(fā)明涉及使用二氫唑酮功能化載體進(jìn)行細(xì)胞選擇。
      背景技術(shù)
      分子和細(xì)胞生物學(xué)、免疫學(xué)和遺傳學(xué)領(lǐng)域的知識(shí)迅速發(fā)展,導(dǎo)致需要對(duì)許多類型組織中各種高度特異性細(xì)胞亞群細(xì)胞的鑒定與特性分析。例如,在重要的組織如大腦、胰腺的胰島細(xì)胞和肝臟中鑒定到稀有的干細(xì)胞,使人們思考有一天許多患病組織可能通過細(xì)胞移植再生出健康組織進(jìn)行治療(Beardsley,ScentificAmerican,June 1998,pp.11-12)。實(shí)際上,這些療法已經(jīng)在癌癥治療領(lǐng)域中使用。摧毀癌組織所需的高劑量化療或放療常常也破壞病人的骨髓,影響病人的整個(gè)免疫系統(tǒng)。將預(yù)先從骨髓或外圍血中分離出來的造血干細(xì)胞移植到病人身上,重建病人的骨髓及免疫系統(tǒng)的細(xì)胞(Donahue等人,Blood,1996,87,pp.1644-1653),可使病人獲救。還認(rèn)為純化的干細(xì)胞或者其他特異性細(xì)胞群對(duì)于發(fā)展各種免疫療法(例如AIDS療法)和基因治療是重要的。
      對(duì)于干細(xì)胞的研究和實(shí)際臨床應(yīng)用以及相關(guān)的領(lǐng)域,日益需要有效的分離和純化各種細(xì)胞群的方法。這些年來,已采用了許多細(xì)胞分離/純化方法。這些分離技術(shù)取決于待分離細(xì)胞群的不同的生物學(xué)和生物化學(xué)、物理或免疫學(xué)特性(Esser,《細(xì)胞分離方法和應(yīng)用》,D.Recktenwald和Radbruch編輯,Marcel Dekker,NY,NY,1997,pp.1-14)?;诿庖哂H和力的分離方法已顯示在提供相對(duì)純的特異性細(xì)胞制品上具有相當(dāng)好的前景。美國(guó)專利No.5,035,994(Civin)描述了一種連接有單克隆抗體的固相載體的使用,該單克隆抗體能與人類多能淋巴造血干細(xì)胞上的抗原特異性結(jié)合而從骨髓或血液細(xì)胞的懸浮液分離所述干細(xì)胞。Pope等人(Bioconiugate Chem.,1993,4,pp.166-171)描述了活化的玻璃和纖維素固相載體的雙功能硅烷試劑的使用。將山羊抗小鼠抗體與激活的載體共價(jià)連接,用此衍生的載體選擇性去除外周血樣品中的CD34+或CD4+單個(gè)核細(xì)胞。美國(guó)專利No.5,215,927(Berenson等人)描述了使用親和素-生物素識(shí)別系統(tǒng)的細(xì)胞免疫選擇法。雖然提到的這些方法和本領(lǐng)域中的其他方法可用于所選定細(xì)胞群的選擇和純化,但仍需要提供能提高干細(xì)胞群純度和產(chǎn)量的新的方法和材料。
      已報(bào)道二氫唑酮功能化載體對(duì)生物學(xué)活性材料的固定相當(dāng)有用。例如,美國(guó)專利No.5,403,902(Heilmann等人)描述了能與生物大分子(如蛋白質(zhì)、抗體、酶)交聯(lián)的顆粒狀或珠狀材料的制備。這些材料可用于如親和層析法純化蛋白質(zhì)。美國(guó)專利No.5,262,484、No.5,292,514、No.5,451,453、No.5,486,358和No.5,510,421都描述了其他的二氫唑酮功能化載體和材料以及它們的用途。在所有的這些文獻(xiàn)中,沒有一篇描述或提出二氫唑酮功能化載體可用于完整細(xì)胞的純化或選擇。
      PCT專利出版物WO93/04576(Kim等人)描述了用二氫唑酮功能化載體從非蛋白質(zhì)原料中分離蛋白質(zhì)材料的能力。這可能對(duì)生物學(xué)材料的分離和純化有用。當(dāng)二氫唑酮功能化載體與蛋白質(zhì)和非蛋白質(zhì)材料的混合物接觸時(shí),蛋白質(zhì)材料與該載體反應(yīng)并交聯(lián),而非蛋白質(zhì)材料(如核酸)不與該載體反應(yīng),但殘留在溶液中。該出版物沒有描述該載體從天然生物液體中分離完整細(xì)胞的能力,但確實(shí)公開了從交聯(lián)有蛋白質(zhì)材料的二氫唑酮功能化載體中分離后的非蛋白質(zhì)材料保留了進(jìn)一步處理所需的生物學(xué)活性。
      PCT專利出版物WO94/22918(Velander等人)描述了一種以分配配體方式對(duì)多孔載體進(jìn)行衍生化處理的方法。該出版物中公開的例子確定了單克隆抗體和蛋白質(zhì)的共價(jià)交聯(lián)可用于進(jìn)一步生物學(xué)分離。
      美國(guó)專利No.5,200,471(Coleman等人)描述了一種將配體共價(jià)聯(lián)接到二氫唑酮功能化載體上的方法(尤其是一種增加共價(jià)聯(lián)接配體質(zhì)量的方法),該方法可保留高特異性結(jié)合生物學(xué)活性。
      美國(guó)專利No.5,561,097(Gleason等人)描述了一種以能夠控制配體的密度和分布的方式將小分子配體共價(jià)聯(lián)接到二氫唑酮功能化載體上的方法。該方法可用于層析載體的制備。
      發(fā)明概述存在對(duì)選擇或純化完整細(xì)胞的新材料和方法的需要。二氫唑酮功能化載體材料,先前知道其可用于制備蛋白質(zhì)純化的層析載體或制備諸如蛋白質(zhì)、酶等共價(jià)聯(lián)接配體,現(xiàn)在發(fā)現(xiàn)它還可作為制備完整細(xì)胞選擇和純化用載體的起始原料。
      簡(jiǎn)單講,一方面,本發(fā)明提供一種選擇細(xì)胞的方法,該方法包括以下步驟(a)提供二氫唑酮功能化載體,(b)用一種對(duì)所需類型的完整細(xì)胞有生物學(xué)活性的物質(zhì)衍生化該二氫唑酮功能化載體,其中該物質(zhì)與二氫唑酮功能化載體共價(jià)聯(lián)接,(c)使(b)的產(chǎn)物與含有完整細(xì)胞的混合物接觸,(d)讓混合物中的完整細(xì)胞與偶聯(lián)的生物活性物質(zhì)反應(yīng)并結(jié)合,(e)從載體上去除混合物的剩余物,(f)可任選地從聯(lián)接的生物活性物質(zhì)上洗脫結(jié)合的細(xì)胞,得到純化的完整細(xì)胞收集物。
      “載體”指任何是或能被制成具有二氫唑酮功能的物品。用于本發(fā)明的可接受的載體在本發(fā)明范圍內(nèi)可以作廣泛的改變。載體可以是多孔性或非多孔性,這取決于最終的優(yōu)選用途。載體可以是連續(xù)性的也可以是非連續(xù)性的,這取決于最終需要的用途。載體可用各種各樣的材料制成,包括用陶磁、玻璃、金屬或聚合材料或這些材料組合制成的載體。載體可具有柔韌性也可無柔韌性,這取決于最終需要的用途。
      “二氫唑酮功能化”是指在載體的內(nèi)或/和外表面上有二氫唑酮功能基團(tuán)。因而,這些反應(yīng)性載體具有如下式結(jié)構(gòu)的二氫唑酮功能基團(tuán) 其中,R1和R2分別可能是1到14個(gè)碳原子的烷基、3到14個(gè)碳原子的環(huán)烷基、具有5到12個(gè)成環(huán)原子的芳基、具有6到26個(gè)碳原子和0到3個(gè)S、N和非過氧化物氧雜原子的芳烴基,或者R1和R2與和它們連接的碳一起能形成含有4到12個(gè)成環(huán)原子的碳環(huán),n是整數(shù)0或1。
      “共價(jià)聯(lián)接”指通過共價(jià)鍵化學(xué)聯(lián)接。
      “生物活性物質(zhì)”指共價(jià)聯(lián)接并固定在二氫唑酮功能化載體上的物質(zhì),這種物質(zhì)可用于選擇性或特異性地與某目標(biāo)全細(xì)胞群相互作用。
      “完整細(xì)胞”是指具有生物學(xué)活性的植物或動(dòng)物細(xì)胞,這些細(xì)胞在與其他的生物材料分離的過程中保持其完整的結(jié)構(gòu),使用具有生物活性物質(zhì)共價(jià)聯(lián)接的二氫唑酮功能化載體使這些植物或動(dòng)物細(xì)胞與其他的生物材料相分離后,仍能保持細(xì)胞的生物學(xué)活性。用于制備細(xì)胞選擇載體的二氫唑酮功能化載體,包括珠狀或顆粒狀載體(如美國(guó)專利No.5,403,902公開的)、多孔性載體(如美國(guó)專利No.5,344,701和PCT專利出版物WO93/06925公開的)、膜載體(如美國(guó)專利No.5,510,421公開的)、從如美國(guó)專利No.5,408,002公開的方法中制得的混合物和制品、底物(如美國(guó)專利No.5,292,514公開的)和從美國(guó)專利No.5,013,795和No.5,262,484公開的技術(shù)中制得的移植共聚物和制品。
      經(jīng)共價(jià)聯(lián)接后用于衍生化二氫唑酮功能化載體的生物活性物質(zhì)可能直接與待選擇的特異性(完整)細(xì)胞群相互作用。這些物質(zhì)的非限制性的例子包括直接針對(duì)待選擇細(xì)胞表面上的特異性細(xì)胞表面標(biāo)記(或抗原,Ag)的抗體(Ab)?;蛘?,該生物活性物質(zhì)可通過另一種中間性生物活性物質(zhì)與選定的細(xì)胞群反應(yīng)。
      本發(fā)明的一個(gè)特征是容易制備用于細(xì)胞選擇的載體。
      本發(fā)明的另一個(gè)特征是可用于制備二氫唑酮功能化載體的方法的多用途性和多樣性,這類載體能經(jīng)修飾而用于細(xì)胞的選擇。
      本發(fā)明的另一個(gè)特征是可容易地控制細(xì)胞選擇載體的表面特征而最大程度減少或防止載體與非目標(biāo)(完整)細(xì)胞發(fā)生非特異性反應(yīng)。
      本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)點(diǎn)是與使用常規(guī)載體相比,本發(fā)明載體能夠以較高的純度分離目標(biāo)細(xì)胞群。常規(guī)載體包括本文發(fā)明背景部分提到的、利用其他的化學(xué)物質(zhì)而不是二氫唑酮的那些載體。
      本發(fā)明的另一個(gè)優(yōu)點(diǎn)是與使用常規(guī)載體相比,使用本發(fā)明載體能以更高產(chǎn)量分離目標(biāo)細(xì)胞群并保持其生物學(xué)活性。
      另外的特征和優(yōu)點(diǎn)將在以下的本發(fā)明實(shí)施例中公開。
      本發(fā)明的實(shí)施方式二氫唑酮功能化載體二氫唑酮功能化載體可以是含有至少一個(gè)二氫唑酮基團(tuán)的任何化合物和材料,此二氫唑酮基團(tuán)可與生物活性物質(zhì)發(fā)生共價(jià)反應(yīng)而被衍生。這些二氫唑酮功能化載體是本領(lǐng)域熟知的。二氫唑酮功能化載體優(yōu)選固體不溶解性材料,其中“不溶解”指此載體在進(jìn)行細(xì)胞選擇的培養(yǎng)基中不溶解,在該載體表面含有二氫唑酮基團(tuán),其易與用于細(xì)胞選擇的生物活性物質(zhì)發(fā)生反應(yīng)。
      二氫唑酮功能化載體的非限制性例子包括珠狀、顆粒狀、膜狀、編織和非編織的網(wǎng)狀和固體塑料制品,在這些載體表面含有二氫唑酮基團(tuán)。這類二氫唑酮功能化載體在前面提到的美國(guó)專利中已被各自公開,所有的載體都屬于MinnesotaMining and Manufacturing公司(3M)(St.Paul,Minnesota,美國(guó))。
      更具體說,珠狀和顆粒狀二氫唑酮功能化載體在美國(guó)專利No.5,403,902(Heilmann等人)中已有廣泛的描述。這些載體可通過反相懸浮聚合法以及分散聚合法從2-鏈烯基二氫唑酮單體或可任選的由共聚單體和交聯(lián)劑制備。
      在美國(guó)專利No.5,344,701(Gagnon等人)中描述了多孔性二氫唑酮功能化載體(如膜和非編織材料的載體)。采用高能量輻射法將二氫唑酮單體或任選的共聚單體移植聚合到預(yù)先存在的載體表面而制得這些載體。或者,將二氫唑酮單體、交聯(lián)劑或共聚單體包被到預(yù)先存在的載體表面上,然后使其聚合產(chǎn)生二氫唑酮功能化載體。
      在PCT專利出版物WO93/06925(Rasmussen等人)中還描述了其他多孔性二氫唑酮功能化載體,其中是將二氫唑酮功能化顆粒摻入到一個(gè)連續(xù)的多孔性基質(zhì)(如纖維化的聚四氟乙烯膜或非編織網(wǎng))中而制得。
      在美國(guó)專利No.5,510,421(Dennison等人)中描述了用溶劑相倒置技術(shù)制備二氫唑酮功能化載體。
      在美國(guó)專利No.5,013,795、No.5,262,484和No.5,408,002(都是Coleman等人)中描述了熱塑性的二氫唑酮功能化移植共聚物和共聚混合物。這些組合物用于制備二氫唑酮功能化模具塑料制品如微量滴定孔和微量滴定板、有蓋培養(yǎng)皿、制管、體植入管、試驗(yàn)試管、離心試管、斷路器、小玻璃管等等,這些組合物也可用作制備本發(fā)明完整細(xì)胞選擇用的載體的底物。
      本發(fā)明中所用的其他二氫唑酮功能化底物是那些在美國(guó)專利No.5,292,514(Capecchi等人)中公開的底物。生物活性物質(zhì)用于本發(fā)明的生物活性物質(zhì)可與目標(biāo)細(xì)胞直接地或間接相互作用,例如通過一種或多種其他生物活性物質(zhì)的中介。能與目標(biāo)細(xì)胞直接相互作用的生物活性物質(zhì)包括但不限于針對(duì)該完整細(xì)胞表面抗原的抗體、凝集素和其他已知能與細(xì)胞表面反應(yīng)的蛋白質(zhì)。各種各樣的特異性完整細(xì)胞表面抗原已得到鑒別,這些抗原通常指CD抗原(《細(xì)胞分離方法與應(yīng)用》,D.Recktenwald和Radbruch編輯,MarcelDekker,NY,NY,1997,pp.297-319)。制備這些抗原的抗體在本領(lǐng)域技術(shù)人員的能力中。實(shí)際上,許多這樣的抗體目前已能從商業(yè)途徑(如R&amp;D Systems,Minneapolis,MN.和Boehringer Mannheim公司,Indianapolis,IN.)得到。將這些抗體共價(jià)聯(lián)接于二氫唑酮功能化載體上,生產(chǎn)出通過抗體-抗原結(jié)合反應(yīng)而能夠直接與目標(biāo)細(xì)胞反應(yīng)并進(jìn)行選擇的載體。
      其他的固定在二氫唑酮功能化載體上的生物活性物質(zhì)可間接與目標(biāo)細(xì)胞發(fā)生相互作用。例如,在本發(fā)明范圍內(nèi)使用一種中間性生物活性物質(zhì),該中間物質(zhì)具有最低限度的雙功能性,比如,它顯示有特異性識(shí)別目標(biāo)細(xì)胞群或與其相互作用的功能,還有與聯(lián)接于二氫唑酮功能化載體上的生物活性物質(zhì)相互作用和結(jié)合的第二種功能。這種中間物質(zhì)的一個(gè)例子是,偶聯(lián)于能特異性地與固定在載體上的第二抗體相互反應(yīng)的抗原的抗細(xì)胞表面抗原的抗體。另一例子是偶聯(lián)于生物素的抗CD34+抗體(用于本發(fā)明的優(yōu)選中間物質(zhì))。完整細(xì)胞的選擇可通過抗體部分與目標(biāo)細(xì)胞的相互作用以及通過生物素與固定在載體上的親和素相互作用而實(shí)現(xiàn)。將載體衍生化的方法在二氫唑酮功能化載體上固定生物活性物質(zhì)的方法是本領(lǐng)域熟知的,在上面提到的專利參考文獻(xiàn)中也有詳細(xì)描述。在美國(guó)專利No.5,200,471(Coleman等人)和PCT專利出版物WO94/22918(Velander等人)中特別講到了改進(jìn)蛋白質(zhì)和抗體的固定條件。另外,在美國(guó)專利No.5,561,097(Cleason等人)中描述了控制偶聯(lián)于二氫唑酮功能化載體的配體密度的技術(shù)。本發(fā)明的用途固定條件的多用途性和簡(jiǎn)單性,以及各種可用來制備二氫唑酮功能化載體的技術(shù)使得細(xì)胞選擇載體的制備和優(yōu)化到了一個(gè)前所未知的程度。例如,一旦從已鑒定的細(xì)胞混合物中分離得到所需的目標(biāo)細(xì)胞(如骨髓或外周血),就可鑒定出具有最小非特異性結(jié)合混合物中目標(biāo)細(xì)胞的基本聚合物載體。這保證了選出來的細(xì)胞的高純度。接著采用上述專利參考文獻(xiàn)公開的各種技術(shù)將二氫唑酮基團(tuán)摻入基本聚合物載體中,以提供將生物活性物質(zhì)共價(jià)聯(lián)接到載體上所需的活躍化學(xué)性質(zhì)。最后,可將一種適當(dāng)?shù)纳锘钚晕镔|(zhì)固定到該載體上,得到完整細(xì)胞的選擇載體。根據(jù)生物活性物質(zhì)的特性和目標(biāo)細(xì)胞的特性,本領(lǐng)域技術(shù)人員不難優(yōu)化二氫唑酮功能基團(tuán)的數(shù)量和摻入的生物活性物質(zhì)的數(shù)量,以在常規(guī)實(shí)驗(yàn)中產(chǎn)生最好的細(xì)胞選擇。另外,由于二氫唑酮偶聯(lián)的獨(dú)一無二的化學(xué)特性,在固定過程中,可對(duì)最終的細(xì)胞選擇載體的表面特性進(jìn)行操縱,以進(jìn)一步優(yōu)化所述載體的完整細(xì)胞選擇性能。在許多例子中可制備出與用常規(guī)載體獲得的細(xì)胞相比,具有所選細(xì)胞群純度和分離產(chǎn)量提高的細(xì)胞選擇載體,所述常規(guī)載體使用聚丙烯酰胺或聚苯乙烯聚合物或常規(guī)結(jié)合化合物(如用溴化氰或碳二亞胺交聯(lián))。下面實(shí)施例說明了本發(fā)明的其他優(yōu)點(diǎn),但在這些例子中提到的具體材料及其數(shù)量以及其他條件和細(xì)節(jié)不應(yīng)被認(rèn)為是對(duì)本發(fā)明的不適當(dāng)限制。
      實(shí)施例試驗(yàn)方法完整細(xì)胞的選擇/純化在下面的實(shí)施例中按照制造者的說明用CeprateTMLC親和素柱試劑盒(CellPro,Tnc.,Bothell,WA)進(jìn)行了完整細(xì)胞與顆粒載體相反應(yīng)的評(píng)估。用抗-人CD34生物素化的單克隆抗體(小鼠)來選擇CD34+完整細(xì)胞獲得成功。
      親和素偶聯(lián)的密度利用生物素-p-硝基苯酯試劑評(píng)估了親和素偶聯(lián)于二氫唑酮載體上的密度,Hermanson等人描述了其測(cè)定方案(AmericanBiotechnology Laboratory,September 1994,pp.86-88)。實(shí)施例1.與Ficoll緩沖層非特異性結(jié)合的評(píng)估按照美國(guó)專利No.5,403,902,采用反相懸浮聚合法制備了交聯(lián)的載體,其中用到參考文獻(xiàn)實(shí)例24E的聚合性穩(wěn)定劑。用亞甲基二丙烯酸胺(MBA)作為交聯(lián)劑,二甲基丙烯酸胺(DMAm)、丙烯酸胺(Am)、乙烯基二甲基二氫唑酮(VDM)或N-丙烯酸基-2-甲基丙胺酸(鈉鹽,AMA)用作共聚用單體。這些顆粒載體中的小顆粒被淘選掉,然后裝在Ceprate LC柱中以評(píng)估。將最少50×106個(gè)從新鮮全血中得到的白細(xì)胞層的完整細(xì)胞過每一個(gè)柱。收集流過柱的部分。用熒光激活細(xì)胞分選儀(FACS)測(cè)定淋巴細(xì)胞和單核細(xì)胞的細(xì)胞數(shù),并與開始樣品的細(xì)胞數(shù)比較。表1列出了所評(píng)估的載體、細(xì)胞回收和對(duì)商品試劑盒提供的聯(lián)接親和素的聚丙烯酰胺載體的非特異性結(jié)合的鑒定。
      討論該例子表明一些單體組合物顯示對(duì)淋巴細(xì)胞的非特異性結(jié)合特性低,這對(duì)于設(shè)計(jì)用于干細(xì)胞的選擇/純化的載體是一種重要的特性。單核細(xì)胞的回收比較差不必?fù)?dān)心,實(shí)際上,這可能是優(yōu)于商品化載體的一個(gè)優(yōu)點(diǎn),因?yàn)閱蝹€(gè)核細(xì)胞群包括T細(xì)胞,而T細(xì)胞介導(dǎo)細(xì)胞免疫力,但人們需要在例如多能的干細(xì)胞的制備中最大程度減少介導(dǎo)細(xì)胞免疫力的細(xì)胞。另外需要關(guān)注樣品1e/1f和1g/1h。VDM(水解的)和AMA具有相同的化學(xué)式,因而,都被用不同的方法摻入到得到的聚合體對(duì)中。例如,1e中,聚合物用上面引用的美國(guó)專利No.5,403,902的步驟II制得,在該步驟中,共聚化VDM單體,然后水解得到的載體,產(chǎn)生此試驗(yàn)樣品。另一方面,樣品1f由AMA的共聚合而成,是VDM的合成前體。這樣,制備聚合體的方法可能影響到聚合體與生物種類的相互反應(yīng),即使它可能具有相同的化學(xué)式。實(shí)施例2.對(duì)流動(dòng)的外周血非特異性結(jié)合的評(píng)估實(shí)施例1中作用效果最好的載體(包括1f載體),除了過柱用的是流動(dòng)的外周血外(在加入此柱前在該血中加入了抗CD34+抗體),其余的如實(shí)施例1進(jìn)行了評(píng)估。結(jié)果列于表2。
      該實(shí)例也說明找到與現(xiàn)有技術(shù)相比具有相等的或較低的非特異性結(jié)合的聚合體骨架是有可能的。實(shí)施例3.二氫唑酮/二甲基丙烯酸胺載體按照美國(guó)專利No.5,403,902中的步驟II,用反相懸浮聚合法從MBA、VDM和DMAm制備了顆粒載體。在這些實(shí)驗(yàn)中,單體總重20g。MBA單體和DMAm單體溶于30ml甲醇和70ml水的混合液中。溶解后加入過硫酸鈉0.5克,并使其溶解。然后將該溶液在氮?dú)庀录尤氲胶蠽DM、甲苯(132ml)、庚烷(243ml)和預(yù)平衡的穩(wěn)定劑(0.33g)的35℃不停攪拌的溶液中。持續(xù)通入氮?dú)?分鐘,然后加入四甲基乙烯二胺(TMEDA,0.5ml)啟動(dòng)聚合作用。聚合作用持續(xù)2小時(shí),過濾得到產(chǎn)物。用丙酮洗滌,用甲醇做液相淘選去除直徑100微米以下的顆粒,真空干燥至質(zhì)量不變。親和素交聯(lián)用0.1M碳酸鈉/1.4M硫酸鈉緩沖液(pH9.5)配的親和素溶液(1mg/ml)將親和素聯(lián)接到載體上。聯(lián)接后,用pH9.0、0.2M甘氨酸消除過剩的二氫唑酮功能活性。每種載體一式二份用于CD34+細(xì)胞選擇以進(jìn)行評(píng)估。每一個(gè)載體(2.0ml)Ceprate LC柱從新鮮骨髓樣品中回收到總數(shù)2.0×108的細(xì)胞。表3列出載體組合物、所選出的目標(biāo)細(xì)胞數(shù)目和得率%(兩組試驗(yàn)的平均)。
      實(shí)施例4.二氫唑酮/丙烯酸胺載體如實(shí)施例3將二甲基丙烯酸胺換成丙烯酸胺,其余相同,制得本實(shí)施例的載體。評(píng)估方法和實(shí)施例3一樣。結(jié)果列在表4中,所示得率%是相對(duì)于CD34+全細(xì)胞對(duì)照的得率。
      討論實(shí)施例3和實(shí)施例4說明,優(yōu)良的細(xì)胞選擇可用基于二氫唑酮載體分離得到。實(shí)施例5.親和素的密度研究制備了一個(gè)與例3b相似的20∶20∶60MBA/VDM/DMAm載體。為了提供親和素交聯(lián)密度范圍,以不同親和素濃度過柱。載體評(píng)估方法和實(shí)施例3一樣。結(jié)果如表5所示,其中報(bào)告的得率%以商品化對(duì)照載體。
      這些數(shù)據(jù),以及實(shí)施例4的數(shù)據(jù),表明由二氫唑酮功能顆粒制成的載體的性能比得上常規(guī)載體,但親和素密度低得多。
      該實(shí)施例產(chǎn)生了許多令人驚訝的結(jié)果(1)發(fā)現(xiàn)在沒有硫酸鹽的情況下,交聯(lián)的親和素密度比有硫酸鹽時(shí)高得多,這一結(jié)果用上述按方法II制得的載體也得到驗(yàn)證。這也和目前的技術(shù)形成鮮明的對(duì)比,目前的技術(shù)表明,硫酸鹽的存在能增加蛋白與二氫唑酮功能化載體的交聯(lián)效率(美國(guó)專利No.5,200,471,Coleman等人)。(2)盡管用相同的化學(xué)組合物,方法I載體比方法II的珠狀載體顯示出更高的得率%(見例4)。(3)方法I的珠狀載體相與對(duì)照載體相比還有異常高的純度。(4)二氫唑酮功能化載體最佳性能出現(xiàn)在250微米珠子時(shí)比對(duì)照載體的顆粒小得多。
      或者,可按照美國(guó)專利No.5,510,421制備二氫唑酮功能膜載體,用一種適當(dāng)?shù)目贵w將其衍生化,可以用交叉流動(dòng)過濾的方式進(jìn)行細(xì)胞選擇。實(shí)施例11.使用二氫唑酮功能珠狀載體檢測(cè)人血細(xì)胞血型將市售的A型和B型血選擇性抗血清與蛋白A-衍生化二氫唑酮珠(根據(jù)美國(guó)專利No.5,200,471中例4制備)在PBS溶液中,以5mg的血清IgG對(duì)1ml充填珠的比例一起孵育,在環(huán)境溫度下振搖15分鐘。用PBS多次漂洗和離心去除未結(jié)合蛋白。以10倍體積PBS稀釋人血樣品。將200μL的稀釋血樣各與大約50μL的抗血清-蛋白A-氫唑酮珠在環(huán)境溫度下輕微攪拌培育15分鐘。讓珠子沉降幾分鐘,然后將該上清液的濁度與用免疫前血清培育的蛋白A珠的對(duì)照比較。對(duì)照樣品是混濁的,因?yàn)檠?xì)胞不和珠子一起沉降于試管底部。含有與抗血清相同血型細(xì)胞的試管是清澈的,或者與對(duì)照相比濁度大大降低。實(shí)施例12.通過特異性抗體的直接固定檢測(cè)人血血型將抗人血型抗原的抗體或抗其他細(xì)胞表面標(biāo)記的抗體直接固定在二氫唑酮功能化載體上并用于血型檢測(cè)(如實(shí)施例11所述)或純化全細(xì)胞的特別組分。為了去除特異性結(jié)合的全細(xì)胞,用等滲緩沖液淋洗幾次,洗掉未結(jié)合的細(xì)胞后,將特異性抗原與珠子-抗體-全細(xì)胞懸液共同培育。例如,為了釋放A型血液中所選定的細(xì)胞,將該懸液稀釋至大約每ml懸液(含有1mg/ml或更高濃度的所需抗原)含0.1ml珠。又如,用以α-N-乙酰半乳糖胺為末端的短多糖洗脫A型血陽(yáng)性的細(xì)胞。其他的抗原要求對(duì)表達(dá)在被捕獲的細(xì)胞表面上的標(biāo)記具有特異性。實(shí)施例13.用直接固定的完整細(xì)胞選擇與其結(jié)合的特異性細(xì)胞憑借與抗原遞呈細(xì)胞或巨噬細(xì)胞的結(jié)合能力,可將帶有細(xì)胞表面標(biāo)記CD-28的活化T淋巴細(xì)胞從淋巴細(xì)胞群中(如從全血樣品中得到的白細(xì)胞層)純化出來。在基本上無伯胺的等滲緩沖液中將大約一百萬個(gè)完整細(xì)胞與1-2ml珠共培育(輕微攪拌15分鐘),可使純化的抗原遞呈細(xì)胞直接固定到二氫唑酮功能化載體上。通過沉淀懸浮液、去除上清液和幾次淋洗去除未結(jié)合的細(xì)胞。將1ml固定的抗原遞呈細(xì)胞制品與大約10ml、已用PBS稀釋到500,000個(gè)全細(xì)胞/ml的白細(xì)胞層制品一起培育,輕微震搖30分鐘。使載體沉降,去除上清液,然后用5倍體積的PBS洗滌兩次。邊讓PBS流過珠子漿液邊輕輕攪拌(如使用Ceprete裝置),取得純化的T全細(xì)胞。
      本發(fā)明并不限于上面所提到的實(shí)施例。以下是我們的權(quán)利要求。
      權(quán)利要求
      1.一種選擇細(xì)胞的方法,它包括以下步驟(a)提供一種二氫唑酮功能化載體;(b)用一種與所需類型的完整細(xì)胞有生物學(xué)活性的物質(zhì)衍生化該二氫唑酮功能化載體,其中該物質(zhì)與二氫唑酮功能化載體共價(jià)聯(lián)接;(c)使(b)的產(chǎn)物與含有該完整細(xì)胞的混合物接觸;(d)讓混合物中的該完整細(xì)胞與聯(lián)接的生物活性物質(zhì)相互作用并結(jié)合;(e)從載體中去除該混合物的剩余物;(f)可任選地從聯(lián)接的生物活性物質(zhì)上洗脫結(jié)合的細(xì)胞,得到純化的該完整細(xì)胞的收集物。
      2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法,其中,二氫唑酮功能化載體選自珠、顆粒、膜、混合物品、移植共聚物、編織網(wǎng)、非編織網(wǎng)、具有含二氫唑酮基團(tuán)的表面的固體塑料物品及它們的組合;其中生物活性物質(zhì)選自抗體、凝集素、蛋白質(zhì)、抗原、親和素及它們的組合。
      3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的方法,其中,生物活性物質(zhì)可直接與該完整細(xì)胞相互作用,或者通過另一種對(duì)該完整細(xì)胞和二氫唑酮功能化載體二者具有雙重功能的生物學(xué)中間活性物質(zhì),與該完整細(xì)胞間接發(fā)生相互作用。
      4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法,其中,二氫唑酮功能化載體是由選自懸浮聚合法或分散聚合法的方法所制得;二氫唑酮功能化載體由2-鏈烯基二氫唑酮單體和可任意的共聚單體和交聯(lián)劑制得。
      5.根據(jù)權(quán)利要求2-4任一項(xiàng)所述的方法,其中,固體塑料物是微量滴定孔、微量滴定板、有蓋培養(yǎng)皿、藥用試管、試驗(yàn)試管、離心試管、燒杯、小玻璃管或體植入管。
      6.根據(jù)權(quán)利要求1-5任一項(xiàng)所述的方法,其中可任選的步驟(f)被用于該完整細(xì)胞的進(jìn)一步生物學(xué)處理。
      7.根據(jù)權(quán)利要求1-6任一項(xiàng)所述的方法,其中所述混合物選自骨髓或外周血。
      8.用權(quán)利要求1-7的任一的方法產(chǎn)生的一種純化的完整細(xì)胞群。
      9.一種相互作用的載體,它包括(a)二氫唑酮功能化載體;(b)聯(lián)接于此載體的生物活性物質(zhì);(c)與所述物質(zhì)相互作用的一種完整細(xì)胞。
      10.根據(jù)權(quán)利要求9的載體,其中,二氫唑酮功能化載體選自珠、顆粒、膜、混合物品、移植的共聚物、編織網(wǎng)、非編織網(wǎng)、具有含二氫唑酮基團(tuán)的表面的固體塑料物品及它們的組合;其中生物活性物質(zhì)選自抗體、凝集素、蛋白質(zhì)、抗原、親和素及它們的組合。
      11.根據(jù)權(quán)利要求10所述的載體,其中生物活性物質(zhì)通過另一種對(duì)該完整細(xì)胞和二氫唑酮功能化載體二者具有雙重功能的生物學(xué)活性中間物質(zhì),與該完整細(xì)胞發(fā)生間接的相互作用。
      12.根據(jù)權(quán)利要求9或10所述的載體,其中,固體塑料物品選自微量滴定孔、微量滴定板、有蓋培養(yǎng)皿、藥用試管、試驗(yàn)試管、離心試管、燒杯、小玻璃管或體植入管。
      13.根據(jù)權(quán)利要求9-12任一項(xiàng)所述的載體,其中,在與生物活性物質(zhì)共價(jià)聯(lián)接之前的二氫唑酮功能化載體具有至少一個(gè)下式所述的二氫唑酮功能性基團(tuán) 其中,R1和R2分別可能是1到14個(gè)碳原子的烷基、3到14個(gè)碳原子的環(huán)烷基、具有5到12個(gè)成環(huán)原子的芳基、具有6到26個(gè)碳原子和0到3個(gè)S、N和非過氧化物氧雜原子的芳烴基,或者R1和R2與和它們連接的碳一起能形成含有4到12個(gè)成環(huán)原子的碳環(huán),n是整數(shù)0或1。
      全文摘要
      本文公開了一種選擇細(xì)胞的方法。該方法采用了一種二氫唑酮功能化載體,該載體經(jīng)衍生化共價(jià)交聯(lián)了能與所需類型完整細(xì)胞起生物學(xué)反應(yīng)的物質(zhì)。該方法能使混合物中的完整細(xì)胞與交聯(lián)于載體上的生物活性物質(zhì)相互作用并結(jié)合,從載體上除去混合物的剩余物后,可任選的從交聯(lián)的生物活性物質(zhì)上洗脫結(jié)合的完整細(xì)胞,得到該完整細(xì)胞的純化收集物。
      文檔編號(hào)C12N1/00GK1334923SQ99815950
      公開日2002年2月6日 申請(qǐng)日期1999年4月30日 優(yōu)先權(quán)日1999年2月1日
      發(fā)明者J·K·拉斯馬森, P·L·科爾曼 申請(qǐng)人:3M創(chuàng)新有限公司
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