專利名稱：鈉/質(zhì)子反向轉(zhuǎn)運(yùn)載體基因的制作方法
專業(yè)領(lǐng)域本發(fā)明涉及一種從植物中得到的新的Na+/H+反向轉(zhuǎn)運(yùn)載體(antiporter)及其編碼DNA，本發(fā)明還涉及它們的生產(chǎn)方法和用途。
背景技術(shù)：
植物的耐鹽性對(duì)于農(nóng)業(yè)和環(huán)境保護(hù)都很重要。如今，地球上三分之一的土地被認(rèn)為是干旱土地。而且，由于耕地和綠地都在不斷地荒漠化，據(jù)推測(cè)將來(lái)干旱土地的比例還將提高。預(yù)測(cè)表明，2050年時(shí)世界人口將達(dá)到現(xiàn)在的1.5倍，因此所致的需求量上升帶來(lái)嚴(yán)重問(wèn)題，迫切急需開(kāi)發(fā)可在不適于耕種的，特別是干旱的土地上生長(zhǎng)的栽培作物，以及可在上述土地上使用的栽培技術(shù)。在干旱土地上，與農(nóng)業(yè)伴隨的問(wèn)題是鹽的積累。在干旱天氣中，土壤的蒸發(fā)蒸騰作用超過(guò)降水，以及在需要大量排水的土地上持續(xù)的灌溉，均使含有鹽分的地下水位加速上升而在地表沉積，導(dǎo)致大量鹽分積累。從古代的實(shí)例可知，這種情況造成的結(jié)果是一些地方變得不可能進(jìn)行耕種，底格里斯-幼發(fā)拉底文明的結(jié)束就是代表。直到今天，這類問(wèn)題仍在發(fā)生。因此，在干旱以及鹽分積累的土地上進(jìn)行農(nóng)業(yè)革新，來(lái)增強(qiáng)植物的耐鹽性是非常重要的(Toshiaki Tanno(1983)，Kagaku to Seibutsu 21439-445“作物的耐鹽性及其機(jī)制”；Yasutaka Uchiyama(1988)，Kagaku toSeibutsu 26650-659“鹽環(huán)境的農(nóng)業(yè)利用”)。
有兩種與鹽壓力相關(guān)的壓力作用于植物，即滲透壓和離子壓。滲透壓是一種作用方式與脫水作用力相同的壓力。這種壓力是由于植物周圍存在高鹽度環(huán)境，形成了高滲透壓而產(chǎn)生的，其阻止植物吸收水分并同時(shí)使植物失水。眾所周知，植物中存在一種可避免滲透壓的機(jī)制。與這一功能有關(guān)的核心物質(zhì)是一些離子(諸如K+、Na+、Cl-，有機(jī)酸等等)以及稱作相溶性溶質(zhì)的物質(zhì)。這里的術(shù)語(yǔ)“相溶性溶質(zhì)”指諸如糖、脯氨酸(一種氨基酸)、甘氨酸甜菜堿(一種季氨化合物)等物質(zhì)，這些物質(zhì)在細(xì)胞中即使積累到高濃度也不會(huì)干擾合成途徑或抑制酶的活性。植物細(xì)胞積累這些物質(zhì)，這些物質(zhì)反過(guò)來(lái)使植物維持與外界的滲透壓平衡(Manabu Ishitani，Keita Arakawa和Tetsuko Takabe(1990)，植物的化學(xué)調(diào)節(jié).25149-162，“植物耐鹽性的分子機(jī)制”)。
關(guān)于植物避免離子壓力的機(jī)制幾乎沒(méi)有取得什么進(jìn)展。植物細(xì)胞吸收過(guò)量的Na+導(dǎo)致胞內(nèi)酶反應(yīng)被抑制，并最終造成代謝紊亂(ToruMatoh(1997)，植物的化學(xué)調(diào)節(jié).32198-206，“植物的耐鹽機(jī)制”)。因此，很有必要從細(xì)胞中清除掉累積的Na+或者將之隔離入一些細(xì)胞器如液泡中。根據(jù)假設(shè)，Na+/H+反向轉(zhuǎn)運(yùn)載體(鈉/質(zhì)子反向轉(zhuǎn)運(yùn)載體)在此過(guò)程中起核心作用。植物細(xì)胞的Na+/H+反向轉(zhuǎn)運(yùn)載體被認(rèn)為既存在于細(xì)胞膜上也存在于液泡膜上。他們利用由H+泵(H+-ATP酶和H+焦磷酸酶)(即一種運(yùn)輸H+的元件)在生物膜兩邊形成的pH梯度作為能量，將存在于細(xì)胞質(zhì)中的Na+運(yùn)出細(xì)胞或運(yùn)入液泡。再者，根據(jù)假設(shè)，與高濃度鹽接觸的植物不得不在細(xì)胞間保持足夠高的Na+/K+比，通過(guò)Na+/H+反向轉(zhuǎn)運(yùn)載體在液泡內(nèi)積累Na+來(lái)維持胞內(nèi)外的滲透壓平衡。
對(duì)動(dòng)物、酵母、細(xì)菌等生物存在胞質(zhì)膜上的Na+/H+反向轉(zhuǎn)運(yùn)載體進(jìn)行了仔細(xì)檢查。在動(dòng)物細(xì)胞的胞質(zhì)膜上，H+由Na+/H+反向轉(zhuǎn)運(yùn)載體攜帶，通過(guò)利用由Na+/K+-ATP酶形成的膜間Na+濃度梯度，來(lái)維持細(xì)胞中的H+平衡。因此認(rèn)為，反向轉(zhuǎn)運(yùn)載體與胞內(nèi)pH調(diào)節(jié)、細(xì)胞體積的控制以及Na+的胞質(zhì)膜跨膜運(yùn)輸?shù)然顒?dòng)密切相關(guān)(Orlowski，J.和Grinstein，S.(1997)，生物化學(xué)雜志.27222373-22376；Aronson，P.S.(1985)，生理學(xué)年鑒(Ann.Rev.Physiol.)47545-560)。Na+/H+反向轉(zhuǎn)運(yùn)載體存在于動(dòng)物的各種細(xì)胞中，已有六種同工型(NHE1～6)得到報(bào)道(Orlowski，J.和Grinstein，S.(1997)，生物化學(xué)雜志.27222373-22376)。
第一個(gè)從酵母中克隆到的此類基因是來(lái)自于裂殖酵母(粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe))的基因(sod2)，該基因是作為一個(gè)與Na+的運(yùn)輸及耐鹽性相關(guān)的基因被克隆的(Jia，Z.P.，McCullough，N.，Martel，R.，Hemmingsen，S.和Young，PG.(1992)，歐洲分子生物學(xué)組織雜志111631-1640)。另外，從芽殖酵母(釀酒酵母)以及Zygosaccharomyces rouxii中發(fā)現(xiàn)一個(gè)與這個(gè)基因高度相同的基因(分別命名為NHA1和ZSOD2)(Prior，C.等(1996)，F(xiàn)EBS Letter.38789-93；Watanabe，Y.等(1995)，酵母.11829-838)。從大腸桿菌中也分離到了兩個(gè)不同的Na+/H+反向轉(zhuǎn)運(yùn)載體基因(nhaA，nhaB)，都與Na+的運(yùn)輸和耐鹽性緊密相關(guān)(Karpel，R.等(1988)，生物化學(xué)雜志.26310408-10410；Pinner，E.等(1994)，生物化學(xué)雜志.26926274-26279)。關(guān)于植物，已在藻類等中檢測(cè)了此類活性(Katz，A.等(1989)，生物化學(xué)及生物物理學(xué)學(xué)報(bào).9839-14)。
另一方面，植物中僅限于液泡膜上反向載體活性的報(bào)道。迄今已知，液泡膜上的Na+/H+反向轉(zhuǎn)運(yùn)載體與生長(zhǎng)在高鹽度環(huán)境里的鹽生植物的耐鹽性有關(guān)(Matoh，T.等(1989)，植物生理學(xué).89180-183；Hassidim，M.等(1990)，941795-1801；Barkla，B.J.等(1995)，植物生理學(xué).109549-556)，也與耐高鹽的甜土植物如大麥和甜菜等的耐鹽性有關(guān)(Hassidim，M.等(1990)，植物生理學(xué).941795-1801；Blumwald，E.等(1987)，植物生理學(xué).8530-33；Garbarino，J.和DuPont，F(xiàn).M.(1988)，植物生理學(xué).86231-236；Garbarino，J.和DuPont，F(xiàn).M.(1989)，植物生理學(xué).891-4；Staal，M.等(1991)，植物生理學(xué)82179-184)。上述發(fā)現(xiàn)表明，Na+/H+反向轉(zhuǎn)運(yùn)載體與植物的耐鹽性緊密相關(guān)。已有好幾個(gè)關(guān)于液泡膜上Na+/H+反向轉(zhuǎn)運(yùn)載體特征的報(bào)道。反向轉(zhuǎn)運(yùn)載體對(duì)Na+活性的Km值大約為10mM，與哺乳動(dòng)物細(xì)胞膜上的相似(Blumwald，E.等(1987)，植物生理學(xué).8530-33；Garbarino，J.和DuPont，F(xiàn).M.(1988)，植物生理學(xué).86231-236；Orlowski，J.(1993)，生物化學(xué)雜志.26816369-16377)。再者，已知Na+運(yùn)載蛋白的特異性抑制劑氨氯吡嗪脒及其衍生物，可以競(jìng)爭(zhēng)性的方式抑制在植物液泡膜上和哺乳動(dòng)物胞質(zhì)膜上的Na+/H+反向轉(zhuǎn)運(yùn)載體(Blumwald，E.等(1987)，植物生理學(xué).8530-33；Orlowski，J.(1993)，生物化學(xué)雜志.26816369-16377；Tse，C.M.等(1993)，生物化學(xué)雜志.26811917-11924；Fukuda，A.等(1998)，植物細(xì)胞生理學(xué).39196-201)。這些發(fā)現(xiàn)揭示了，植物液泡膜和哺乳動(dòng)物胞質(zhì)膜上的Na+/H+反向轉(zhuǎn)運(yùn)載體之間具有相似特征。如上所述，已有多種關(guān)于植物中的Na+/H+反向轉(zhuǎn)運(yùn)載體活性的報(bào)道，然而，盡管已作了各種各樣的試驗(yàn)，但仍缺乏對(duì)于實(shí)質(zhì)部分也就是基因及其蛋白的分析(Katz，A.等(1989)，生物化學(xué)及生物物理學(xué)報(bào).9839-14；Barkla，B.和Blumwald，E.(1991)，美國(guó)科學(xué)院學(xué)報(bào)Proc.Natl.Acad.Sci.USA.8811177-11181；Katz，A.，Kleyman，T.R.，和Pick，U.(1994)，生物化學(xué).332389-2393)。
最近，從擬南芥屬克隆到了一個(gè)基因，推測(cè)該基因編碼一種與已知Na+/H+反向轉(zhuǎn)運(yùn)載體具有氨基酸序列同源性的蛋白；但是，這一基因的功能還未確定(M.P Apse等(1998)，“第11屆國(guó)際植物膜生物學(xué)討論會(huì)”最后議程和摘要集，Springer；C.P.Darley等(1998)，“第11屆國(guó)際植物膜生物學(xué)討論會(huì)”最后議程和摘要集，Springer)。
從植物中分離得到的Na+/H+反向轉(zhuǎn)運(yùn)載體基因的實(shí)例，僅限于從上述一種雙子葉植物－－擬南芥中分離到的那些。到目前為止，還沒(méi)有從包括諸如具有工業(yè)應(yīng)用價(jià)值的作物水稻、玉米等物種在內(nèi)的單子葉植物綱中分離到此類基因的報(bào)道。
發(fā)明公開(kāi)在所有重要的作物中，水稻是一種耐鹽性較差的作物。150mM的NaCl可將水稻的生長(zhǎng)抑制一半，相比之下，大麥?zhǔn)且环N高度耐鹽的作物，將其生長(zhǎng)抑制到同樣水平所需的NaCl濃度是250mM。Garbarino等曾經(jīng)報(bào)道，通過(guò)在根部液泡中積累Na+來(lái)抑制Na+向莖干的流動(dòng)，可能提高大麥的耐鹽性(Garbarino，J.和DuPont，F(xiàn).M.(1988)，植物生理學(xué).86231-236)。在證實(shí)上述情況的過(guò)程中，發(fā)現(xiàn)經(jīng)過(guò)鹽處理以后，大麥根部液泡膜上的Na+/H+反向轉(zhuǎn)運(yùn)載體活性將提高。還發(fā)現(xiàn)大麥中該活性遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于水稻(Garbarino，J.和DuPont，F(xiàn).M.(1988)，植物生理學(xué).86231-236；Fukuda，A.Yazaki，Y，Ishikawa，T.，Koike，S.和Tanaka，Y.(1998)，植物細(xì)胞生理學(xué).39196-201)。
相反地，在水稻中即使經(jīng)過(guò)鹽的處理，活性也不會(huì)上升(Fukuda，A.Yazaki，Y.，Ishikawa，T.，Koike，S.和Tanaka，Y.(1998)，植物細(xì)胞生理學(xué).39196-201)。此外，已知水稻中Na+從根部向莖干的運(yùn)輸量要比蘆葦(Phragmites)中的高，蘆葦是與水稻同屬禾本科、但比水稻的耐鹽性更強(qiáng)的植物(Matsushita，N.和Matoh，T.(1991)，生理學(xué)和植物(Physiol.Plant)83170-176)。因此，根部液泡膜上Na+/H+反向轉(zhuǎn)運(yùn)載體活性的強(qiáng)度可能與水稻耐鹽性密切相關(guān)。這些報(bào)道表明，通過(guò)提高水稻根部的Na+/H+反向轉(zhuǎn)運(yùn)載體活性，可能會(huì)提高水稻的耐鹽性。因此，就需要分離可能會(huì)提高水稻中Na+/H+反向轉(zhuǎn)運(yùn)載體活性的基因。
這種情況是本發(fā)明的動(dòng)因，本發(fā)明的目標(biāo)之一是提供一種來(lái)自單子葉植物綱，優(yōu)選水稻的Na+/H+反向轉(zhuǎn)運(yùn)載體，其編碼基因，以及它們的生產(chǎn)方法和用途。本發(fā)明提供了所述基因在生產(chǎn)耐鹽植物方面的應(yīng)用，其為本發(fā)明優(yōu)選應(yīng)用。
本發(fā)明人鑒定了一個(gè)水稻花序cDNA克隆，通過(guò)在GeneBank高等植物數(shù)據(jù)庫(kù)中的堿基序列分析，發(fā)現(xiàn)該cDNA克隆與從芽殖酵母的Na+/H+反向轉(zhuǎn)運(yùn)載體(NHX1)基因同源。利用這一序列作為探針，本發(fā)明人最近成功地克隆了該全長(zhǎng)基因，命名為“OsNHXl”，推測(cè)該基因編碼水稻的Na+/H+反向轉(zhuǎn)運(yùn)載體。
分離的OsNHXl的cDNA約為2.3kb，推測(cè)其編碼一個(gè)有535個(gè)氨基酸的蛋白質(zhì)(

圖1)。根據(jù)氨基酸疏水性分析，發(fā)現(xiàn)該蛋白含有12個(gè)跨膜區(qū)域(圖2)。
經(jīng)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，從OsNHXl推測(cè)的氨基酸序列，與NHXl以及哺乳動(dòng)物的Na+/H+反向轉(zhuǎn)運(yùn)載體(NHE)的氨基酸序列具有顯著的一致性(表1)。特別地，在被認(rèn)為是參與離子運(yùn)輸?shù)目缒^(qū)域中發(fā)現(xiàn)了高度一致性(圖3)。
根據(jù)為迄今已報(bào)道的各種Na+/H+反向轉(zhuǎn)運(yùn)載體所作的樹(shù)狀圖(圖4)，可證明這三種蛋白(芽殖酵母的NHXl、哺乳動(dòng)物的NHE6、以及OsNHXl)構(gòu)成了一個(gè)群。由于已有關(guān)于NHXl蛋白在晚期內(nèi)體表達(dá)的報(bào)道(Nass，R.和Rao，R.(1998)，生物化學(xué)雜志.27321054-21060)以及發(fā)現(xiàn)NHE6蛋白也可在細(xì)胞內(nèi)表達(dá)(Numata，M.，Petrecca，K.，Lake，N.和Orlowski J.(1998)，生物化學(xué)雜志.2736951-6959)，因此也可預(yù)期本發(fā)明中的OsNHXl蛋白在細(xì)胞器如液泡中表達(dá)，并且在液泡膜的Na+運(yùn)輸中起重要作用。
再者，本發(fā)明人通過(guò)利用農(nóng)桿菌方法將分離到的OsNHXl基因轉(zhuǎn)入水稻愈傷組織并使之再分化，成功地獲得了轉(zhuǎn)基因植物。
本發(fā)明涉及一種來(lái)自于單子葉植物綱的新的Na+/H+反向轉(zhuǎn)運(yùn)載體以及編碼該反向轉(zhuǎn)運(yùn)載體的DNA，本發(fā)明還涉及生產(chǎn)和使用，尤其是利用該反向轉(zhuǎn)運(yùn)載體生產(chǎn)耐鹽植物的方法。更具體地說(shuō)，本發(fā)明提供了(1)選自下組DNA，該組包括(a)一種DNA，其編碼含SEQ ID NO2所示氨基酸序列的蛋白質(zhì)；(b)一種DNA，其包括SEQ ID NO1所示堿基序列的編碼區(qū)。
(2)一種編碼來(lái)自單子葉植物綱的Na+/H+反向轉(zhuǎn)運(yùn)載體的DNA，其選自
(a)一種DNA，其編碼含SEQ ID NO2所示氨基酸序列的蛋白質(zhì)，所述序列中已取代、刪除、插入和/或添加了一個(gè)或多個(gè)氨基酸；(b)一種DNA，其在嚴(yán)謹(jǐn)條件下可與包含SEQ ID NO1所示堿基序列的DNA雜交；(3)在(2)中的DNA，其中的單子葉植物綱是指屬于禾本科的植物；(4)一種載體，其包含(1)或(2)中的DNA；(5)一種轉(zhuǎn)化細(xì)胞，其含有(1)或(2)中的DNA或含有(4)中的載體；(6)在(5)中的轉(zhuǎn)化細(xì)胞，其中的細(xì)胞是一種植物細(xì)胞；(7)一種由(1)或(2)中的DNA編碼的蛋白質(zhì)；(8)一種生產(chǎn)(7)中蛋白的方法，其包含如下步驟培養(yǎng)(5)中的轉(zhuǎn)化細(xì)胞，以及從該細(xì)胞或其培養(yǎng)物上清中回收表達(dá)的蛋白質(zhì)；(9)一種包含有(6)中轉(zhuǎn)化細(xì)胞的轉(zhuǎn)化植物；(10)在(9)中的轉(zhuǎn)化植物，其中的植物是一種單子葉植物；(11)在(10)中的轉(zhuǎn)化植物，其中的植物是屬于禾本科的植物；(12)在(11)中的轉(zhuǎn)化植物，其中的植物是水稻；(13)一種轉(zhuǎn)化植物，其為(9)～(12)中任一轉(zhuǎn)化植物的后代或克隆；(14)一種用來(lái)培植(9)～(13)中任一轉(zhuǎn)化植物的材料；(15)一種可與(7)中蛋白結(jié)合的抗體；(16)一種可與SEQ ID NO1中所示DNA雜交的核酸分子，且該分子的鏈長(zhǎng)度至少15個(gè)核苷酸。
本發(fā)明提供了一種來(lái)自于單子葉植物綱的新的Na+/H+反向轉(zhuǎn)運(yùn)載體，以及其編碼DNA。由本發(fā)明人從水稻中分離的編碼Na+/H+反向轉(zhuǎn)運(yùn)載體“OsNHXl”的cDNA的堿基序列，被展示在SEQ ID NO1中。由該cDNA編碼的蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO2所示。
“OsNHXl”基因與Na+/H+反向轉(zhuǎn)運(yùn)載體的很多已知氨基酸序列表現(xiàn)出顯著的一致性，尤其在涉及離子運(yùn)輸?shù)奈稽c(diǎn)，可觀察到特別高的一致性。這一發(fā)現(xiàn)意味著“OsNHXl”蛋白在水稻的Na+運(yùn)輸中起著重要的作用。據(jù)推測(cè)，植物的Na+/H+反向轉(zhuǎn)運(yùn)載體參與維持高鹽度壓迫下植物體內(nèi)的滲透壓平衡。因此，預(yù)期“OsNHXl”基因尤其可應(yīng)用于耐鹽栽培品種的生產(chǎn)。
本發(fā)明不僅包括“OsNHXl”蛋白，還包括與其功能等價(jià)的蛋白。本文中“與‘ OsNHXl’蛋白功能等價(jià)的蛋白”是指目標(biāo)蛋白具有Na+/H+反向轉(zhuǎn)運(yùn)載體的功能。Na+/H+反向轉(zhuǎn)運(yùn)載體的活性檢測(cè)如下，如可檢測(cè)因加入Na+而從生物膜囊泡(vesicle)發(fā)射出的H+(其表現(xiàn)為熒光的恢復(fù))，可監(jiān)控H+-ATP酶在不同生物膜囊泡間形成的H+濃度梯度(其表現(xiàn)為丫啶橙熒光的淬滅)(Fukuda，A.，Yazaki，Y.，Ishikawa，T.Koike，S.和Tanaka，Y.(1998)，植物細(xì)胞生理學(xué).39196-201)。
在一個(gè)實(shí)施方案中，與“OsNHXl”功能等價(jià)的蛋白是一種突變蛋白，其已在“OsNHXl”蛋白的氨基酸序列(SEQ ID NO2)中取代、缺失、插入和/或添加了一個(gè)或多個(gè)氨基酸，其保持了與“OsNHXl”蛋白等價(jià)的功能。這類蛋白可按照下面例舉的方法來(lái)制備。如本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的在“OsNHXl”氨基酸中誘導(dǎo)突變的方法。即，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以通過(guò)修飾“OsNHXl”蛋白的氨基酸序列(SEQ ID NO2)，而制備一種與“OsNHXl”功能等價(jià)的修飾蛋白。例如，可用定點(diǎn)誘變方法(Kramer，W.和Fritzx，H.-J.“經(jīng)缺口型雙鏈DNA進(jìn)行寡核苷酸定點(diǎn)誘變”酶學(xué)方法.154350-367，1987)等提高蛋白活性。氨基酸的突變也可自然發(fā)生。本發(fā)明的蛋白包括，在“OsNHXl”蛋白的天然氨基酸序列(SEQ ID NO2)中，取代、缺失、插入或添加一個(gè)或多個(gè)氨基酸并保持了與天然蛋白等價(jià)的功能的人工或天然衍生的蛋白。對(duì)于蛋白中將被改變的氨基酸的部分或數(shù)目沒(méi)有限定，只要修飾后的蛋白保持與天然“OsNHXl”蛋白等價(jià)的功能即可。一般來(lái)講，被修飾的氨基酸在100個(gè)以內(nèi)，優(yōu)選50個(gè)以內(nèi)，更優(yōu)選20個(gè)以內(nèi)，最優(yōu)選5個(gè)以內(nèi)。
在另一實(shí)施方案中，與“OsNHXl”蛋白功能等價(jià)的蛋白，是一種由單子葉植物綱的DNA編碼的蛋白，該DNA可與編碼“OsNHXl”蛋白的DNA(SEQ ID NO1)雜交，該蛋白具有與“OsNHXl”蛋白等價(jià)的功能。這些蛋白可用本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的技術(shù)如雜交技術(shù)(Southem，E.M.分子生物學(xué)雜志，卷.98，503，1975)以及聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)技術(shù)(Saiki，R.K.等.科學(xué)，卷.230，1350-1354，1985；Saiki，R.K.等.科學(xué)，卷.239，487-491，1988)等來(lái)制備。即，本領(lǐng)域技術(shù)人員通?？赏ㄟ^(guò)利用“OsNHXl”基因(SEQID NO1)的堿基序列或其部分作探針，利用可與“OsNHXl”基因堿基序列(SEQ ID NO1)特異性雜交的寡核苷酸作引物，從水稻或其它單子葉植物中分離出與“OsNHXl”基因有高度一致性的DNA，進(jìn)而從該DNA獲得功能與“OsNHXl”蛋白等價(jià)的蛋白。這類來(lái)源于單子葉植物綱，可通過(guò)雜交技術(shù)或PCR技術(shù)獲得的，與“OsNHXl”蛋白具有等價(jià)功能的蛋白質(zhì)，也包括在本發(fā)明的蛋白中。
單子葉植物綱，優(yōu)選屬于禾本科的植物，可以作為通過(guò)雜交技術(shù)和PCR技術(shù)分離基因的來(lái)源植物。例如，屬于禾本科的植物除水稻外，大麥(Hordeumvulgare)，小麥(Triticum aestivum)，玉米(Zea mays)等都可以選擇，但不限于此。
利用上述技術(shù)分離能編碼與“OsNHXl”蛋白功能等價(jià)的蛋白的方法，包括但不僅限于以下例子。例如，用32P等標(biāo)記的探針(例如，包括SEQ IDNO1所示堿基序列或其部分序列的DNA)與單子葉植物綱的cDNA文庫(kù)或基因組文庫(kù)進(jìn)行雜交。用32P標(biāo)記探針進(jìn)行雜交的條件中，溫和條件是25℃(不含甲酰胺)，通常是在42℃下，使用雜交溶液(50％甲酰胺，5X SSPE，2X Denhard’s溶液，0.1％(w/v)SDS以及100μg/ml的鯡魚(yú)精DNA(SambrookJ，F(xiàn)ritsch EF，Maniatis T(1989)，分子克隆實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)(冷泉港實(shí)驗(yàn)室.，冷泉港，紐約)，第二版))。預(yù)雜交進(jìn)行的時(shí)間最少要超過(guò)一個(gè)小時(shí)，而雜交要進(jìn)行24小時(shí)。對(duì)雜交后濾膜的洗滌，溫和條件(低嚴(yán)謹(jǐn)度條件)是在25℃(洗滌溶液2X SSC，0.1％SDS)進(jìn)行，普通條件是在42℃(洗滌溶液2XSSC，0.1％SDS)進(jìn)行，嚴(yán)格條件(高嚴(yán)謹(jǐn)度條件)是在56℃(洗滌溶液0.1XSSC，0.1％SDS)進(jìn)行。
如果按上述方法分離到的DNA編碼的蛋白具有與“OsNHXl”蛋白等價(jià)的功能，該蛋白一般會(huì)表現(xiàn)出與“OsNHXl”蛋白氨基酸序列的高度一致性。本文中術(shù)語(yǔ)“高度一致性”是指一致性高于至少60％，優(yōu)選高于80％，更優(yōu)選高于85％，更加優(yōu)選高于90％。氨基酸序列一致性是通過(guò)，例如GENETYX軟件(軟件開(kāi)發(fā)公司)提供的同源性分析程序來(lái)計(jì)算(Lipman，D.J.和Pearson，W.R.(1985)，科學(xué).227，1435-1441)。
本發(fā)明蛋白可以通過(guò)本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的方法制備為重組蛋白或天然蛋白。重組蛋白可以通過(guò)如下方法來(lái)制備，例如，將編碼本發(fā)明蛋白的DNA插入一個(gè)合適的表達(dá)載體，用此載體轉(zhuǎn)染一種合適的細(xì)胞，然后從轉(zhuǎn)化細(xì)胞中純化這種蛋白，如后文述。另外，天然蛋白可以通過(guò)如下方法來(lái)制備，例如，從表達(dá)本發(fā)明蛋白的細(xì)胞(例如水稻細(xì)胞)制備細(xì)胞提取物，將其上樣于附著有抗體的親和柱，該抗體是通過(guò)用已制備好的重組蛋白或其部分肽段免疫合適的免疫動(dòng)物來(lái)制備的，然后純化結(jié)合在柱上的蛋白。
另外，本發(fā)明提供了編碼上述本發(fā)明蛋白的DNA。本發(fā)明DNA包括基因組DNA、cDNA以及化學(xué)合成的DNA等等，還可以是無(wú)限制的任何DNA，只要該DNA可以編碼本發(fā)明中的一種蛋白。本發(fā)明中包括的“OsNHXl”cDNA的堿基序列示于SEQ ID NO1中。
基因組DNA，及cDNA均可以按照本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的常規(guī)方法來(lái)制備。例如，基因組DNA可以通過(guò)如下方法來(lái)分離，根據(jù)本發(fā)明基因的堿基序列信息設(shè)計(jì)適合的引物進(jìn)行PCR，然后利用所獲擴(kuò)增的DNA片段作為探針篩選基因組文庫(kù)?；蛘?，可按照同樣的方法從cDNA文庫(kù)中分離cDNA。
本發(fā)明中的DNA可以應(yīng)用于，例如，重組蛋白的制備，以及耐鹽型轉(zhuǎn)化植物的產(chǎn)生等。通常，重組蛋白的制備是將編碼本發(fā)明蛋白的DNA插入合適的表達(dá)載體，將該表達(dá)載體轉(zhuǎn)入合適的細(xì)胞，培養(yǎng)所得轉(zhuǎn)化細(xì)胞，然后純化其表達(dá)的蛋白。
重組蛋白可以如下制備將編碼本發(fā)明蛋白的DNA插入載體，通過(guò)已知的基因轉(zhuǎn)移方法，如電穿孔法、磷酸鈣轉(zhuǎn)染法等等將所述載體轉(zhuǎn)入細(xì)胞，如細(xì)菌細(xì)胞(大腸桿菌)、酵母細(xì)胞、昆蟲(chóng)細(xì)胞、哺乳動(dòng)物細(xì)胞等等，然后在細(xì)胞中表達(dá)該重組蛋白。在宿主細(xì)胞中表達(dá)的重組蛋白可用本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的方法純化。例如，可使用諸如大腸桿菌中的pGEX(Pharmacia)載體將所述蛋白表達(dá)為與谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶(GST)的融合蛋白，然后利用谷胱甘肽柱將之純化(Shigeo Ohno和Yoshifumi Nishimura(1997)，“細(xì)胞工程增刊蛋白實(shí)驗(yàn)方案”Shujun-sha)。
此外，利用本發(fā)明DNA制備轉(zhuǎn)化植物，是將編碼本發(fā)明蛋白的DNA插入適合的載體，將該載體轉(zhuǎn)入植物細(xì)胞，繼而使所得轉(zhuǎn)化的植物細(xì)胞再生。根據(jù)物種的不同，植物表達(dá)載體可通過(guò)利用農(nóng)桿菌的方法轉(zhuǎn)入植物細(xì)胞，或直接轉(zhuǎn)入細(xì)胞。利用農(nóng)桿菌的方法有，例如，Nagel等(微生物學(xué)通信.67325(1990))的方法以及Raineri等的轉(zhuǎn)化水稻方法(生物/技術(shù).833-38(1990))。有些方法是先用植物表達(dá)載體(pUC系統(tǒng)等，例如，pCAMBIA載體(Medical Research Council)等)轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌，接著用像葉盤法、愈傷組織法等諸如此類的標(biāo)準(zhǔn)方法將已轉(zhuǎn)化的農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)入植物細(xì)胞。將植物表達(dá)載體直接轉(zhuǎn)入細(xì)胞的方法包括，電穿孔法、粒子槍法、磷酸鈣法、聚乙二醇法等。
對(duì)于本發(fā)明中的載體可轉(zhuǎn)入什么樣的植物細(xì)胞沒(méi)有限制，但優(yōu)選單子葉植物，尤其禾本科植物。除水稻以外，可選玉米等植物作為禾本科的植物。此外，本發(fā)明中的“植物細(xì)胞”包括各種形式的植物細(xì)胞，如懸浮培養(yǎng)細(xì)胞、原生質(zhì)體、葉片的一部分、愈傷組織等等。
可用愈傷組織分化法(Kyozuka，J.和Shimamoto，K.(1991)，植物組織培養(yǎng)手冊(cè).Kluwer Academic Publishers，Bl1-16頁(yè)；Toki，S.(1997)，植物分子生物學(xué).1516-21)、利用原生質(zhì)體的分化方法(Shimamoto，K.等(1989)，自然.338274-276；Kyozuka，J.等(1987)，分子普通遺傳學(xué)206408-413)、以及針對(duì)所用植物的方法等，將已導(dǎo)入載體的轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞再生為轉(zhuǎn)基因植物。
如此產(chǎn)生的轉(zhuǎn)基因植物與野生型植物相比，表現(xiàn)出更高的Na+/H+反向轉(zhuǎn)運(yùn)載體活性，并預(yù)測(cè)其因此將獲得耐鹽性。而且，一旦獲得了本發(fā)明DNA轉(zhuǎn)染的轉(zhuǎn)化植物，就可能通過(guò)有性生殖或無(wú)性生殖從該植物體得到后代。另外，還可以通過(guò)由植物體，及其后代或克隆獲得的繁殖材料(例如，種子、果實(shí)、谷穗、塊莖、結(jié)節(jié)、殘根、愈傷組織、原生質(zhì)體等)大量生產(chǎn)植物。用本發(fā)明DNA轉(zhuǎn)化的植物細(xì)胞、包含有這些細(xì)胞的植物體、該植物的后代和克隆以及從該植物獲得的繁殖材料、其后代和克隆等均包括在本發(fā)明中。
這種比野生型高的Na+/H+反向轉(zhuǎn)運(yùn)載體活性可以通過(guò)Na+/H+反向轉(zhuǎn)運(yùn)載體的高度表達(dá)(量的變化)，或具有更高活性的Na+/H+反向轉(zhuǎn)運(yùn)載體的表達(dá)(質(zhì)的變化)獲得，或是兩者同時(shí)發(fā)生的結(jié)果。
此外，本發(fā)明提供了可以與上述本發(fā)明蛋白結(jié)合的抗體。多克隆抗體和單克隆抗體都包括在本發(fā)明中?？贵w的制備可用本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的方法，如Harlow等的方法(Harlow，E.和Lane，D.(1988)，抗體實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)。冷泉港實(shí)驗(yàn)室，冷泉港，紐約)進(jìn)行。多克隆抗體可通過(guò)將大腸桿菌中合成的融合蛋白或合成肽作為抗原注射家兔，獲得家兔的抗血清，然后經(jīng)親和層析純化其抗血清而獲得。單克隆抗體可通過(guò)將抗原注射至小鼠或大鼠，克隆并制備雜交瘤，然后對(duì)所獲抗體進(jìn)行親和層析而獲得。
此外，本發(fā)明還提供了可與編碼本發(fā)明蛋白的DNA雜交的核酸分子，其鏈長(zhǎng)度至少為15個(gè)核苷酸。這種核酸分子可以，例如，作為探針來(lái)檢測(cè)或分離編碼本發(fā)明蛋白的DNA，以及作為引物擴(kuò)增這類DNA。這種核酸分子優(yōu)選與編碼本發(fā)明蛋白的DNA特異性雜交。這里使用的術(shù)語(yǔ)“特異性雜交”是指，在正常雜交條件下，優(yōu)選在嚴(yán)格雜交條件下，該分子可與編碼本發(fā)明蛋白的DNA雜交，而不能與編碼其它蛋白的DNA雜交。
另外，這種核酸分子可用作反義寡核苷酸、核酶等，抑制本發(fā)明蛋白的表達(dá)。這種反義寡核苷酸的衍生物和修飾形式可以按該反義寡核苷酸本身相同的方式使用。這種反義寡核苷酸不必與組成DNA或mRNA給定區(qū)域的核苷酸完全互補(bǔ)，還可以包括一個(gè)或更多核苷酸錯(cuò)配，只要它能抑制蛋白的表達(dá)?？梢砸种票景l(fā)明蛋白表達(dá)的反義寡核苷酸或核酶可作為分析本發(fā)明蛋白功能的很有用的工具。
附圖簡(jiǎn)述圖1展示水稻Na+/H+反向轉(zhuǎn)運(yùn)載體(OsNHXl)cDNA的堿基序列和預(yù)測(cè)的氨基酸序列。氨基酸序列以單字母符號(hào)來(lái)表示。
圖2展示OsNHXl蛋白的氨基酸疏水圖譜。橫坐標(biāo)表示氨基酸殘基，縱坐標(biāo)表示疏水程度。推測(cè)的跨膜區(qū)域以框起來(lái)的數(shù)字來(lái)表示。
圖3展示OsNHXl和其它Na+/H+反向轉(zhuǎn)運(yùn)載體之間的氨基酸序列比較?？缒^(qū)域(M3～M6)表示在其序列上方。關(guān)于在氨基酸下方的符號(hào)，“*”表示所有的氨基酸都是保守的；“”和“.”表示氨基酸是相似的?！啊贝淼南嗨菩员取?”所代表的更高?？蚱饋?lái)的A代表特異性抑制劑氨氯吡嗪脒的結(jié)合位點(diǎn)，而框起來(lái)的B代表與哺乳動(dòng)物Na+/H+反向轉(zhuǎn)運(yùn)載體具有高度一致性的位點(diǎn)。
圖4展示用Clustal X(Thompson，J.D.等(1994)，核酸研究，224673-4680)(鄰接法(NJ法))對(duì)Na+/H+反向轉(zhuǎn)運(yùn)載體進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)生分析的結(jié)果。
實(shí)施本發(fā)明的最佳模式本發(fā)明用以下實(shí)施例作具體的舉例說(shuō)明。但應(yīng)理解本發(fā)明不限于這些實(shí)施例。
水稻Na+/H+反向轉(zhuǎn)運(yùn)載體基因的克隆對(duì)來(lái)自芽殖酵母并與Na+/H+反向轉(zhuǎn)運(yùn)載體(NHXl)具有一致性的序列從GeneBank的高等植物數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行分析。從水稻圓錐花序的cDNA文庫(kù)中鑒定了一個(gè)cDNA克隆。該克隆預(yù)測(cè)的氨基酸序列與NHXl有37％的一致性。推測(cè)所獲得的cDNA克隆沒(méi)有全長(zhǎng)的堿基序列。因此，利用該cDNA克隆作為探針，用從水稻(Oryza sativa L.cv Nipponbare)籽苗根制備的mRNA構(gòu)建cDNA文庫(kù)，用該cDNA文庫(kù)作為模版，篩選具有全長(zhǎng)插入的cDNA克隆。
將水稻種子吸水過(guò)夜，然后放在懸浮于營(yíng)養(yǎng)液(0.5mM NH4H2PO4，1mMKNO3，0.5mM MgSO4，12.5μM Fe-EDTA，1mM CaCl2，微量營(yíng)養(yǎng)元素)上的棉網(wǎng)上。在如下培養(yǎng)條件下培養(yǎng)7天白天(光強(qiáng)40μmolm-2s-1)30℃下14小時(shí)，夜晚25℃下10小時(shí)，濕度為75％。
從水稻籽苗根制備了Poly(A+)RNA，通過(guò)5～25％的蔗糖密度梯度離心進(jìn)行大小分級(jí)分離。然后，從包含相對(duì)較大的Poly(A+)RNA級(jí)分構(gòu)建了cDNA文庫(kù)(Tanaka，Y.等(1989)，植物生理學(xué).901403-1407)。利用寡聚dT作為引物，通過(guò)Gubler和Hoffman的方法(Gubler，U.和Hoffman，B.J.(1983)，基因.25263-269)，從大小分級(jí)的Poly(A+)RNA合成了雙鏈cDNA。接著利用Asahipack GS710柱(Asahi化學(xué)工業(yè)股份有限公司，東京；2.5x50cm)，通過(guò)高效液相色譜(Tosoh，Tokyo，型號(hào)CCPD)對(duì)樣品進(jìn)行大小分級(jí)分離。將大于2kb的cDNA插入λgtll的EcoRI位點(diǎn)。
將與NHXl有一致性的cDNA克隆作為探針，利用構(gòu)建好的含有cDNA文庫(kù)的λ噬菌體進(jìn)行噬菌斑雜交。從有信號(hào)的噬菌斑中選出有最長(zhǎng)cDNA插入子的載體，通過(guò)將切出的cDNA插入一個(gè)pBluescript(KS+)載體(Stratagene)完成克隆。用所獲克隆作為探針，對(duì)從水稻植物體中提取的RNA進(jìn)行Northern雜交，根據(jù)信號(hào)大小確定所得cDNA克隆為全長(zhǎng)cDNA。其中已插入完整基因(稱之為OsNHXl)的cDNA的所有堿基序列已經(jīng)得到了確定(圖1)。
OsNHXl基因的堿基序列和氨基酸序列分析全長(zhǎng)序列為2330堿基對(duì)，5′非翻譯區(qū)為296個(gè)堿基對(duì)，翻譯區(qū)共1608個(gè)堿基對(duì)，3′非翻譯區(qū)為426個(gè)堿基對(duì)。推測(cè)該基因編碼的蛋白長(zhǎng)度為535個(gè)氨基酸，計(jì)算其分子量為59,070道爾頓。推測(cè)的氨基酸序列中有59％是疏水的，22％是中性氨基酸，還有19％是親水氨基酸。因此，該蛋白看來(lái)像是高度疏水性的。用Kyte和Doolittle的方法(Kyte，J.和Doolittle，R.F.(1982)，分子生物學(xué)雜志.157105-132)進(jìn)行疏水性分析的結(jié)果展示在圖2。通過(guò)利用Tmpred程序的方法(Hofmann，K.和Stoffel，W.(1993)，Biol.Chem.Hoppe-Seyler.374166)發(fā)現(xiàn)了12個(gè)跨膜區(qū)。
發(fā)現(xiàn)從OsNHXl推測(cè)的氨基酸序列與NHXl以及哺乳動(dòng)物Na+/H+反向轉(zhuǎn)運(yùn)載體(NHE)的氨基酸序列有顯著的一致性(表1；表中NHXl來(lái)自酵母[釀酒酵母]，NHE6來(lái)自人，而NHE1～4來(lái)自大鼠。表中數(shù)值用GENETYX(10版)軟件(軟件開(kāi)發(fā)公司)中的同源分析程序(Lipman，D.J.和Pearson，W.R.(1985)，科學(xué).2271435-1441)計(jì)算)。在跨膜區(qū)域觀察到特別高的一致性，該區(qū)域被認(rèn)為參與離子運(yùn)輸(圖3)。OsNHXl氨基酸序列的一部分(SEQ IDNO.2中的83～92殘基)，83LFFIYLLPPI92，在NHXl和NHE中都高度保守，推測(cè)該序列是真核Na+/H+反向轉(zhuǎn)運(yùn)載體的抑制劑氨氯吡嗪脒的結(jié)合位點(diǎn)(Counillon，L.等.(1993)，美國(guó)國(guó)家科學(xué)院學(xué)報(bào).904508-4512)(圖3A)。另外，真核生物Na+/H+反向轉(zhuǎn)運(yùn)載體中的第6和第7跨膜區(qū)高度保守，因此，推測(cè)其在Na+和H+的運(yùn)輸中起重要作用(Orlowski，J.和Grinstejn，S.(1997)，生物化學(xué)雜志.27222373-22376)。OsNHXl氨基酸序列中的第5和第6個(gè)跨膜區(qū)與這些區(qū)域表現(xiàn)出高度的一致性(圖3B)。以上結(jié)果顯示OsNHXl編碼的蛋白具有Na+/H+反向轉(zhuǎn)運(yùn)載體的活性。
表1OsNHXl與其它Na+/H+反向轉(zhuǎn)運(yùn)載體的氨基酸序列一致性(％)OsNHXl NHX1NHE6NHElNHE2NHE3NHE4OsNHXl10029.533.030.129.426.727.7NHXl100 36.128.629.129.332.0NHE6100 31.929.131.828.6NHEl100 48.937.145.5NHE2100 44.766.0NHE3100 44.6NHE4100按照NJ方法，制作了迄今為止已報(bào)道的各種Na+/H+反向轉(zhuǎn)運(yùn)載體的樹(shù)狀圖，這些轉(zhuǎn)運(yùn)載體即哺乳動(dòng)物NHE、芽殖酵母(釀酒酵母)NHXl和NHAl、Sod2(預(yù)測(cè)其在粟酒裂殖酵母的胞質(zhì)膜上表達(dá))、酵母(Zygosaccharomyces rouxii)ZSod3、大腸桿菌NhaA和NhaB、以及OsNHXl(在圖中注為“OsNHXl”)，樹(shù)狀圖揭示出其中三個(gè)，也就是NHXl、NHE6和OsNHXl構(gòu)成一個(gè)群(圖4)。已有報(bào)道表明NHXl蛋白在晚期內(nèi)體中表達(dá)(Nass，R.和Rao，R.(1998)，生物化學(xué)雜志.27321054-21060)，NHE6蛋白也在細(xì)胞內(nèi)表達(dá)(Numata，M.，Petrecca，K.，Lake，N.和Orlowski，J.(1998)，生物化學(xué)雜志.2736951-6959)。因此，預(yù)測(cè)OsNHXl蛋白是在細(xì)胞器如液泡等內(nèi)表達(dá)，并且在這些細(xì)胞器的Na+運(yùn)輸中起重要作用。
表達(dá)水稻Na+/H+反向轉(zhuǎn)運(yùn)載體基因的轉(zhuǎn)化水稻的產(chǎn)生用KpnI和NotI切出插入在pBluescript KS+(STRATAGENE)的BamHI位點(diǎn)的OsNHXI。然后，將OsNHXl插入pMSHl(需高度表達(dá)時(shí))以及pMSH2(需抑制表達(dá)時(shí))中花椰菜花葉病毒35S啟動(dòng)子下游，這兩種載體均來(lái)自Ti質(zhì)粒，且轉(zhuǎn)有卡那霉素抗性基因和潮霉素抗性基因(pMSH1Kawasaki，T.等(1999)，美國(guó)國(guó)家科學(xué)院學(xué)報(bào).9610922-10926；pMSH2多克隆位點(diǎn)的方向與pMSH1的相反)。利用構(gòu)建好的載體，通過(guò)根癌農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化水稻愈傷組織。愈傷組織從種子誘導(dǎo)，以農(nóng)桿菌感染后，利用潮霉素完成篩選。篩選出的愈傷組織經(jīng)過(guò)分化來(lái)獲得轉(zhuǎn)化植物。轉(zhuǎn)化和分化基本上按照Toki的方法(Toki，S.(1997)，植物分子生物學(xué).15，16-21)來(lái)進(jìn)行。
工業(yè)應(yīng)用性根據(jù)本發(fā)明可以預(yù)期，分離的Na+/H+反向轉(zhuǎn)運(yùn)載體基因能夠通過(guò)其在植物中的表達(dá)而賦予植物耐鹽性。因此，通過(guò)將該基因轉(zhuǎn)入諸如水稻等有用作物，由于耐鹽性的提高，可以使這些作物在如干旱等土地上抵御鹽的危害，從而可能有助于，如作物產(chǎn)量的提高。
權(quán)利要求
1.一種選自下組的DNA，該組包括(a)一種DNA，其編碼含SEQ ID NO2所示氨基酸序列的蛋白質(zhì)；(b)一種DNA，其包括SEQ ID NO1所示堿基序列的編碼區(qū)。
2.一種編碼來(lái)自單子葉植物綱的Na+/H+反向轉(zhuǎn)運(yùn)載體的DNA，該DNA選自(a)一種DNA，其編碼含SEQ ID NO2所示氨基酸序列的蛋白質(zhì)，所述序列中已取代、刪除、插入和/或添加了一個(gè)或多個(gè)氨基酸；(b)一種DNA，其在嚴(yán)謹(jǐn)條件下可與包含SEQ ID NO1所示堿基序列的DNA雜交。
3.權(quán)利要求2的DNA，其中的單子葉植物綱是屬于禾本科的植物。
4.一種載體，其包含權(quán)利要求1或2中的DNA。
5.一種轉(zhuǎn)化細(xì)胞，其含有權(quán)利要求1或2中的DNA或含有 4中的載體。
6.權(quán)利要求5中的轉(zhuǎn)化細(xì)胞，所述細(xì)胞是植物細(xì)胞。
7.一種蛋白，該蛋白由權(quán)利要求1或2中的DNA編碼。
8.一種生產(chǎn)權(quán)利要求7中蛋白的方法，其包含如下步驟培養(yǎng)權(quán)利要求5中的轉(zhuǎn)化細(xì)胞，以及從該細(xì)胞或其培養(yǎng)物上清中回收所表達(dá)的蛋白質(zhì)。
9.一種轉(zhuǎn)化植物，其包含權(quán)利要求6中的轉(zhuǎn)化細(xì)胞。
10.權(quán)利要求9中的轉(zhuǎn)化植物，所述植物是單子葉植物。
11.權(quán)利要求10中的轉(zhuǎn)化植物，所述植物是屬于禾本科的植物。
12.權(quán)利要求11中的轉(zhuǎn)化植物，所述植物是水稻。
13.一種轉(zhuǎn)化植物，該植物是權(quán)利要求9～12中任一項(xiàng)的轉(zhuǎn)化植物的后代或克隆。
14.一種用來(lái)培植權(quán)利要求9～13中任一項(xiàng)的轉(zhuǎn)化植物的材料。
15.一種可與權(quán)利要求7中蛋白結(jié)合的抗體。
16.一種核酸分子，其可與SE ID NO1所示DNA雜交，且該分子的鏈長(zhǎng)度為至少15個(gè)核苷酸。
全文摘要
本發(fā)明成功地克隆了水稻Na
文檔編號(hào)C12N15/82GK1342203SQ99816068
公開(kāi)日2002年3月27日 申請(qǐng)日期1999年12月22日 優(yōu)先權(quán)日1998年12月22日
發(fā)明者福田篤德, 田中喜之 申請(qǐng)人:獨(dú)立行政法人農(nóng)業(yè)生物資源研究所