專利名稱：蛋白質(zhì)的制作方法
背景技術(shù)：
本發(fā)明涉及蛋白質(zhì)。
具體地講，本發(fā)明涉及存在于小麥面粉中的內(nèi)源性內(nèi)切-β-1，4-木聚糖酶抑制劑的分離和鑒定，及其對不同木聚糖酶的影響。本發(fā)明還涉及通過用所述抑制劑進行篩選所鑒定的木聚糖酶，并涉及由此而鑒定的新型木聚糖酶。
背景技術(shù)：
木聚糖酶被用于面包烘烤業(yè)已有若干年時間。
就此而言，已知小麥面粉含有源于胚乳細胞壁的阿糖基木聚糖。面粉中阿糖基木聚糖含量因為面粉的來源而不同-例如，參見Rouau等，谷類科學(xué)雜志(1994)19，259-272含有戊聚糖的酶制劑對面粉的面包生產(chǎn)質(zhì)量的影響與戊聚糖特性的改變相關(guān)；Fincher和Stone，(1986)谷類技術(shù)進展，8卷(Why Pomeranz著)AACC，StPaul，明尼蘇達，207-295；和Meuser和Suckow(1986)，烘烤化學(xué)和物理學(xué)(J.M.V.Blanchard，P J Frasier和T Gillard著)皇家化學(xué)協(xié)會，倫敦，42-61。通常，阿糖基木聚糖的含量可以在2-5％((w/w)以面粉的干重為基礎(chǔ))范圍內(nèi)波動。
據(jù)Fincher和Stone(1986)報導(dǎo)，胚乳細胞壁中的70％的多糖是阿糖基木聚糖。阿糖基木聚糖的一個特征是它能與水結(jié)合。阿糖基木聚糖的一部分是水不溶性的戊聚糖(WIP)，并且部分是水溶性的戊聚糖(WSP)。實驗結(jié)果業(yè)已證實了高分子量(HMW)水溶性聚合物的WIP的降解，與面包體積之間的相關(guān)性。
在生產(chǎn)烘烤食品期間，已知使用適當劑量的木聚糖酶可以得到更穩(wěn)定的面團系統(tǒng)(它通常包括鹽、面粉、酵母和水)以及更好地發(fā)起的面包體積。
在這一方面，用于增加面包體積的好的木聚糖酶應(yīng)當能溶解WIP，以便提高面團液體的粘性，而不會將WSP進一步降解成木糖寡聚體。據(jù)信WIP降解成低分子量(LMW)WSP會損害面團的性質(zhì)并會產(chǎn)生粘性(Rouau等和McCleary(1986)國際生物大分子雜志，8，349-354)。
US-A-5306633披露了一種獲自枯草芽孢桿菌菌株的木聚糖酶。很顯然，這種木聚糖酶能改善含有這種酶的面包和烘烤食品的均勻性并增加其體積。
業(yè)已分離了源于枯草芽孢桿菌的另一種木聚糖酶并進行了測序。參見Paice，M.G.，Bourbonnais，R.，Desrochers，M.，Jurasek，L.和Yaguchi，M.源于枯草芽孢桿菌的木聚糖酶基因核苷酸序列以及與短小芽孢桿菌基因的比較。Arch.Microbiol.144，201-206(1986))。
現(xiàn)在，有時候會考慮到這樣的問題，細菌木聚糖酶有可能產(chǎn)生很粘的面團。因此，人們通常預(yù)期枯草芽孢桿菌的木聚糖酶-如US-A-5306633中的木聚糖酶-能產(chǎn)生非常粘的面團。
能夠產(chǎn)生粘性的現(xiàn)有的酶必須以小心控制的量使用，以便其粘性對操作性的負面影響不會達到損害有效的商業(yè)操作的程度。不過，小心控制劑量的必要性，阻止了在生產(chǎn)面團之前將木聚糖酶直接添加到面粉中。因此，對于現(xiàn)有系統(tǒng)來說，有必要在生產(chǎn)面團期間以高度受控制的方式添加木聚糖酶。
迄今為止，真菌木聚糖酶-直通常被用于食品烘烤。例如，J Maat等(木聚糖和木聚糖酶，J Visser等著，349-360，木聚糖酶及其在面包烘烤中的應(yīng)用)披露了由黑曲霉(Aspergillus Nigervar.awarmor)菌株產(chǎn)生的β-1，4-木聚糖酶。根據(jù)該作者的介紹，所述真菌木聚糖酶能有效增加面包的比體積，而不會對面團的操作能力產(chǎn)生負面的副作用(面團的粘性)，正如用源于其他真菌或源于細菌的木聚糖酶所能觀察到的結(jié)果那樣。
W Debyser等(美國釀酒協(xié)會雜志55(4，153-156，1997，在糖化期間用小麥全粉佐劑溶解阿糖基木聚糖并抑制大麥麥芽糖木聚糖裂解系統(tǒng)小麥中新型酶抑制劑的證據(jù))認為，小麥中可能存在木聚糖酶抑制劑。沒有分離到由W Debyser等所披露的抑制劑。另外，WDebyser等也沒有披露所述抑制劑是內(nèi)源性的或者是微生物的。另外，不存在有關(guān)該抑制劑的化學(xué)資料。
最近，X Rouau和A Surget也披露了木聚糖酶抑制劑在小麥面粉中的存在(谷類科學(xué)雜志28，(1998)63-70，戊聚糖酶抑制劑在小麥面粉中存在的證據(jù))。與Debyser等相似，X Rouau和A Surget認為，他們證實了一種不耐熱的化合物在小麥面粉的可溶性部分中的存在，它限制了所添加的戊聚糖酶的作用。同樣與Debyser等相似，上述作者沒有分離到一種抑制劑，并且不能夠得出所述抑制劑是內(nèi)源性的或是來源于微生物的結(jié)論。類似地，也不存在該抑制劑的化學(xué)資料。
因此，現(xiàn)有技術(shù)中一個公知的問題是，如何用不存在負面的操作特性的面團制備烘烤食品。更具體的問題是，如何提供一種非粘性的面團-即一種不會粘到會導(dǎo)致操作和加工問題的面團。
本發(fā)明試圖提供上述問題的解決方案。
本發(fā)明概述本發(fā)明的有關(guān)方面在權(quán)利要求書和以下說明中提供。
簡單地講，本發(fā)明的某些方面涉及1.內(nèi)源性內(nèi)切-β-1，4-木聚糖酶抑制劑-包括編碼它的核苷酸序列及其氨基酸序列，及其變體、同系物或片段。
2.測定β-1，4-木聚糖酶抑制劑對不同木聚糖酶的作用的測定方法。
3.測定面團中不同木聚糖酶的作用的測定方法。
4.測定葡聚糖酶對含有木聚糖酶的不同面團的作用的測定方法。
5.新型木聚糖酶-包括編碼它的核苷酸序列及其氨基酸序列，及其變體、同系物或片段。
6.木聚糖酶的新用途。
7.用木聚糖酶制備的食品。
其他方面涉及本發(fā)明的氨基酸序列和/或本發(fā)明的核苷酸序列，包括含有或能夠表達本發(fā)明序列的結(jié)構(gòu)；含有或能夠表達本發(fā)明序列的載體；含有或能夠表達本發(fā)明序列的質(zhì)粒；含有或能夠表達本發(fā)明序列的組織；含有或能夠表達本發(fā)明序列的器官；含有或能夠表達本發(fā)明序列的轉(zhuǎn)化宿主；含有或能夠表達本發(fā)明序列的轉(zhuǎn)化生物。本發(fā)明還包括表達所述序列的方法，如在微生物中表達；包括轉(zhuǎn)化所述序列的方法。
本發(fā)明與WO-A-98/49278的內(nèi)容的不同之處特別在于，所述PCT專利申請包括有關(guān)其所披露的蛋白質(zhì)抑制劑的很少的序列信息。
下面將在適當?shù)牟糠謽祟}下面對本發(fā)明的有關(guān)方面進行說明。為方便起見，本發(fā)明有關(guān)方面的一般性應(yīng)用說明可以參考題為“一般定義”和“一般介紹”部分。不過，在每一部分下面的說明并不一定局限于每一個特定的部分。一般定義本文所使用的“小麥面粉”一詞是磨的很細的小麥粉的同義詞。不過，該名詞優(yōu)選表示獲自小麥本身的面粉而不是獲自其他谷物。因此，除非另有說明，本文所提到的“小麥面粉”優(yōu)選表示小麥面粉本身，并表示存在于一種介質(zhì)，如面團中的小麥面粉。
本文所使用的術(shù)語“木聚糖酶”具有其普通含義-例如，特別是一種能夠催化可能存在于小麥中的阿糖基木聚糖解聚的酶(例如，一種特別能夠催化可能存在于小麥中的WIP溶解，并催化WSP解聚的酶)。
用于測定內(nèi)切-β-1，4木聚糖酶活性的測定方法隨后提供。為方便起見，該測定方法被稱為“木聚糖酶測定”。
本發(fā)明所涉及的術(shù)語“核苷酸序列”包括基因組DNA、cDNA、重組DNA(即使用重組DNA技術(shù)制備的DNA)、合成DNA、和RNA-及其組合。
術(shù)語“核苷酸序列”優(yōu)選表示DNA。
本發(fā)明的核苷酸序列可以是單鏈的或雙鏈的。
本發(fā)明的核苷酸序列上可以包括合成的或修飾過的核苷酸。有多種不同類型的對寡核苷酸的修飾為本領(lǐng)域所公知。其中，包括甲基膦酸酯和硫代磷酸酯主鏈，在分子的3’和/或5’末端添加丫啶或多賴氨酸鏈。對本發(fā)明來說，可以這樣理解，本文所披露的核苷酸序列可以通過本領(lǐng)域現(xiàn)有的任一種方法修飾。進行所述修飾可以是為了提高本發(fā)明核苷酸序列的體內(nèi)活性或存活周期。
與本發(fā)明核苷酸序列和本發(fā)明氨基酸相關(guān)的術(shù)語“變體”或“同系物”是所述序列的等位變體的同義詞。
具體地講，本文所使用的術(shù)語“同源性”可能與術(shù)語“相同性”等同。在這里，與本發(fā)明核苷酸序列和本發(fā)明氨基酸相關(guān)的序列同源性可以通過將任一種或多種序列與其他序列進行簡單的“肉眼”比較(即嚴格比較)來測定，以便了解其他序列與所述序列是否至少具有75％的相同性。相對序列同源性(即序列相同性)也可以通過商業(yè)化的計算機程序測定，該程序能計算兩種或多種序列之間的百分同源性。所述計算機程序的一個典型例子是CLUSTAL。
因此，同源性比較可以用肉眼完成。不過，更常見的是，這種同源性比較是借助于很容易獲得的序列比較程序完成的。所述商業(yè)化計算機程序可以計算兩種或兩種以上序列之間的百分同源性。
可以在連續(xù)的序列上計算百分同源性，即將一種序列與另一種序列進行排比，并將一種序列上的每一個氨基酸與另一個序列上的相應(yīng)的氨基酸進行直接比較，每次比較一個殘基，這被稱為“無缺口”排比。通常，所述無缺口排比只能用于較短數(shù)量的殘基(例如，低于50個連續(xù)氨基酸)。
盡管這是一種十分簡單、并且可靠的方法，但它的不足之處在于，例如，在一對相同的序列上，一個插入或缺失將會導(dǎo)致隨后的氨基酸殘基被排出排比之外，因此，在進行總體排比時，很有可能導(dǎo)致百分同源性的大規(guī)模降低。因此，大多數(shù)序列比較方法被設(shè)計成能產(chǎn)生兼顧到可能的插入和缺失的最佳排比，而不會過分地破壞總的同源性等級。這一目的是通過在序列排比中插入“缺口”以便增加局部同源性而實現(xiàn)的。
不過，這些更復(fù)雜的方法為出現(xiàn)在所述排比中的每一個缺口規(guī)定了“缺口限度”，以便對于相同數(shù)量的相同氨基酸來說，一種序列排比具有盡可能少的缺口-表示在兩種比較的序列之間具有較高的相關(guān)性-可以比具有多個缺口獲得更高的得分。通常使用“Affine缺口代價”，它讓缺口的存在承擔(dān)較高的代價，而讓該缺口中每一個后續(xù)殘基承擔(dān)較小的份額。這是最常用的缺口評分系統(tǒng)。高缺口份額理所當然地會產(chǎn)生具有較少缺口的優(yōu)化排比。大多數(shù)排比程序可以對缺口份額進行改變。不過，在將所述軟件用于序列比較時優(yōu)選使用預(yù)設(shè)值。例如，在使用GCG Wisconsin Bestfit包(見下文)時，氨基酸序列的預(yù)設(shè)缺口額度為-一個缺口12和-每一個延長4。
因此，計算最大百分同源性首先產(chǎn)生考慮到缺口額度的最佳排比。用于進行所述排比的合適的計算機程序是GCG WisconsinBestfit包(Wisconsin大學(xué)，美國；Devereux等，1984，核酸研究12387)?？梢赃M行序列比較的其他軟件的例子包括，但不限于BLAST包(參見Ausubel等，1999，同上-第18章)，F(xiàn)ASTA(Atschul，1990，分子生物學(xué)雜志，403-410)和比較工具的GENEWORKS組件。BLAST和FASTA可用于脫機和聯(lián)機檢索(參見Ausubel等，1999，同上，7-58至7-60頁)。不過，優(yōu)選使用GCG Bestfit程序。
盡管最終的百分同源性可以以相同性形式衡量，所述排比過程本身通常不是基于有或無的成對比較。相反，通常使用一定程度的相似性得分基質(zhì)，它根據(jù)化學(xué)相似性或進化距離為每一個成對的比較評分。常用的所述基質(zhì)的例子是BLOSUM62基質(zhì)-程序BLAST組件的預(yù)設(shè)基質(zhì)。GCG Wisconsin程序通常使用公開的預(yù)設(shè)值或定制的符號比較表(如果提供了的話)(進一步的細節(jié)參見用戶手冊)。對于GCG包來說，優(yōu)選使用公開的預(yù)設(shè)值，而對于其他軟件來說，使用諸如BLOSUM62的預(yù)設(shè)基質(zhì)。
一旦所述軟件產(chǎn)生了最佳比較，就有可能計算出百分同源性，優(yōu)選百分序列相同性。所述軟件通常是作為序列比較的一部分實現(xiàn)這一目的的，并產(chǎn)生多種結(jié)果。
序列比較是使用由http//www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST提供的簡單的BLAST檢索程序使用預(yù)設(shè)的參數(shù)進行的。
本發(fā)明還包括互補于本文所提供序列的核苷酸序列，或其任何衍生物、片段或衍生物。如果所述序列互補于其一個片段，則該序列可以用一種探針鑒定其他生物中的相似的編碼序列等。
本發(fā)明還包括能夠與本文所提供序列雜交的核苷酸序列、或其任何衍生物、片段或衍生物。
本發(fā)明還包括能夠與互補于本發(fā)明所提供序列的序列雜交的核苷酸序列、或其任何衍生物、片段或衍生物。
術(shù)語“互補”還包括能夠與所述編碼序列的核苷酸序列雜交的核苷酸序列。
術(shù)語“變體”還包括互補于能夠與本文所述提供的核苷酸序列雜交的序列的序列。
術(shù)語“變體”優(yōu)選包括互補于能夠在嚴格條件下(例如，65℃和0.1XSSC{1XSSC＝0.15M NaCl，0.015檸檬酸鈉，pH7.0})與本發(fā)明所提供的核苷酸序列雜交的序列的序列。
本發(fā)明還涉及能夠與本發(fā)明核苷酸序列雜交的核苷酸序列(包括本文所提供序列的互補序列)。
本發(fā)明還涉及互補于能夠與本發(fā)明核苷酸序列(包括本文所提供序列的互補序列)雜交的序列的核苷酸序列。
本文所使用的術(shù)語“雜交”包括“一股核酸鏈通過堿基配對與互補鏈結(jié)合的過程”(Coombs J(1994)生物技術(shù)詞典Stockton出版社，紐約)，以及在聚合酶鏈式反應(yīng)技術(shù)中所進行的擴增過程，如Dieffenbach CW和GS Dveksler所述(1995，PCR引物，實驗室手冊，冷泉港出版社，Olainview NY)。
本發(fā)明的范圍還包括能夠在中等到最高嚴格性條件下與本文所提供的核苷酸序列雜交的多核苷酸序列。雜交條件基于核酸結(jié)合復(fù)合體的解鏈溫度(Tm)，如Berger和Kimmel所述(1987，分子克隆技術(shù)指南，酶學(xué)方法，152卷，學(xué)術(shù)出版社，San Diego CA)，并給予特定的“嚴格性”，如下文所述。
最高嚴格性通常出現(xiàn)在大約Tm-5℃(低于探針Tm5℃)；高嚴格性出現(xiàn)在低于Tm大約5℃-10℃；中等嚴格性出現(xiàn)在低于Tm大約10℃-大約20℃；而低嚴格性出現(xiàn)在低于Tm大約20-25℃。正如本領(lǐng)域技術(shù)人員所了解的，最高嚴格性雜交可用于鑒定或檢測相同的多核苷酸序列，而中等(或低)嚴格性雜交可用于鑒定或檢測相似的或相關(guān)的多核苷酸序列。
在一個優(yōu)選方面，本發(fā)明包括能夠在嚴格條件(例如，65℃和0.1XSSC)下與本發(fā)明的核苷酸序列雜交的核苷酸序列。內(nèi)源內(nèi)切-β-1，4-木聚糖酶抑制劑一方面，本發(fā)明提供了一種獲自小麥面粉的內(nèi)源內(nèi)切-β-1，4-木聚糖酶抑制劑。
在我們的研究中，我們業(yè)已發(fā)現(xiàn)這種抑制劑是一種二肽，分子量為大約40kDa(通過SDS或MS測定)，并且其pI為大約8-大約9.5。
在本發(fā)明的一個方面，所述抑制劑為分離形式和/或大體上純化的形式。在本文中，術(shù)語“分離的”表示所述抑制劑不是處在其天然環(huán)境中。
迄今為止所進行的序列分析業(yè)已證實，所述抑制劑具有序列13、序列14、序列15、序列16、序列17、序列18和/或序列19所示的至少一種或多種序列。
因此，本發(fā)明包括一種內(nèi)切-β-1，4-木聚糖酶抑制劑，它包括序列13、序列14、序列15、序列16、序列17、序列18和/或序列19所示序列的至少一種或多種，或其變體、同系物或其片段。
與本發(fā)明抑制劑相關(guān)的術(shù)語“變體”、“同系物”或“片段”包括對所述序列進行一個(或多個)氨基酸的取代、改變、修飾、置換、缺失或添加的任一種，前提是所得到的氨基酸序列具有木聚糖酶抑制作用，優(yōu)選至少具有與至少包括序列13、序列14、序列15、序列16、序列17、序列18和/或序列19所示的一種或多種序列相同的活性。具體地講，術(shù)語“同系物”包括結(jié)構(gòu)和/或功能方面的同源性，其前提是所得到的抑制劑具有木聚糖酶抑制作用，優(yōu)選至少具有與至少包括序列13、序列14、序列1 5、序列16、序列17、序列18和/或序列19所示的至少一種或多種序列相同的活性。就序列同源性而言(即序列相似性或序列相同性)，優(yōu)選與序列表所示序列具有至少75％，更優(yōu)選至少80％，更優(yōu)選至少85％，更優(yōu)選至少90％的同源性，更優(yōu)選與所附序列表所示序列具有至少95％，更優(yōu)選至少98％的同源性。
本發(fā)明抑制劑的變體的一種推測性例子具有序列1和序列2所示序列中的至少一種或多種。
本發(fā)明的抑制劑方面因為多種原因是有利的。
舉例來說，通過了解內(nèi)源內(nèi)切-β-1，4-木聚糖酶抑制劑的化學(xué)性質(zhì)，工作者可以測定該抑制劑在諸如小麥面粉中的含量。為方便起見，我們將該方法稱作“抑制劑含量測定方法”。
所述抑制劑含量測定方法使得工作者能夠篩選用于添加到小麥面粉中的一種或多種合適的木聚糖酶和/或篩選用于添加到小麥面粉中的合適量的一種或多種木聚糖酶。
因此，本發(fā)明提供了一種方法，包括(a)測定小麥面粉中抑制劑的含量或類型；(b)篩選適于添加到小麥面粉中的木聚糖酶和/或篩選適于添加到小麥面粉中的木聚糖酶的用量；和(c)將合適的木聚糖酶和/或合適量的木聚糖酶添加到小麥面粉中。
本發(fā)明還提供了一種方法，包括(a)測定小麥面粉中抑制劑的含量或類型；(b)篩選適于添加到小麥面粉中的木聚糖酶和/或篩選適于添加到小麥面粉中的木聚糖酶的用量；和(c)將合適的木聚糖酶抑制劑和/或合適量的木聚糖酶抑制劑添加到小麥面粉中。
本發(fā)明還提供了一種方法，包括(a)測定小麥面粉中抑制劑的含量或類型；(b)篩選適于添加到小麥面粉中的木聚糖酶和/或篩選適于添加到小麥面粉中的木聚糖酶的用量；和(c)將合適的木聚糖酶和合適的木聚糖酶抑制劑和/或合適量的木聚糖酶抑制劑添加到小麥面粉中。
抑制劑含量的檢測可以用標準化學(xué)技術(shù)，如通過分析固態(tài)NMR光譜分析測定。抑制劑的含量甚至可以通過使用已知能受到該抑制劑的負面影響的木聚糖酶測定。在后一種情況下，可以采取小麥面粉的樣品并將它添加到已知量的所述木聚糖酶中。在特定的時間點上可以測定木聚糖酶的活性，所得到的活性可能與小麥面粉中抑制劑的量相關(guān)。
因此，本發(fā)明還包括使用木聚糖酶及其抑制劑的組合來校正和/或測定小麥面粉樣品中抑制劑的含量。
可將所述抑制劑的抗體用于篩選小麥面粉樣品，以便證實本發(fā)明抑制劑的存在。所述抗體甚至可用于從小麥面粉樣品中分離一定數(shù)量的抑制劑。用于測定β-1，4-木聚糖酶抑制劑對不同木聚糖酶的作用的測定方法本發(fā)明的抑制劑具有另一種重要用途。
就此而言，所述抑制劑可用于測定/篩選，以便鑒定受該抑制劑影響的木聚糖酶。
例如，在某些場合下，可能需要篩選具有低耐受性-即不能耐受-所述抑制劑的木聚糖酶。
在一個方面，所述抑制劑可用于測定/篩選具有一般(中等)耐受性-即合理的耐受-所述抑制劑的木聚糖酶。
在一個方面，所述抑制劑可用于測定/篩選，以便鑒定對所述抑制劑具有高的耐受性的木聚糖酶。
用于測定本發(fā)明抑制劑的抑制程度的合適的方法將在下文提供。為方面起見，我們將稱該方法為“抑制劑測定方法“。
因此，本發(fā)明提供了一種用于測定木聚糖酶對木聚糖酶抑制劑的耐受程度的方法，其中，該方法包括(a)讓感興趣的木聚糖酶與所述抑制劑接觸；和(b)測定該抑制劑是否能抑制所述感興趣的木聚糖酶的活性。為方便起見，我們將該方法稱為“抑制劑測定方法“。
在本文中，術(shù)語“耐受“表示木聚糖酶的活性沒有受到所述抑制劑的全面抑制。換句話說，所述抑制劑可用于測定/篩選，以便鑒定不受該抑制劑的負面影響的木聚糖酶。
因此，與木聚糖酶和木聚糖酶抑制劑相關(guān)的術(shù)語“耐受程度“是所述木聚糖酶抑制劑對木聚糖酶活性的非抑制作用的程度的同義詞。因此，對所述木聚糖抑制劑具有高度耐受性的木聚糖酶是與所述木聚糖酶抑制劑對木聚糖酶的高度的非抑制作用同類的。
本發(fā)明還包括一種方法，包括以下步驟(a)實施所述抑制劑測定方法；(b)鑒定對所述抑制劑具有高(或中或低)度耐受性的一種或多種木聚糖酶；和(c)制備一定量的所述一種或多種鑒定的木聚糖酶。
然后可以將合適的鑒定的木聚糖酶用于制備食品，特別是用來生產(chǎn)烘烤食品的面團。
另外，通過鑒定對所述抑制劑具有一定程度耐受性的木聚糖酶(即不會像其他木聚糖酶那樣受到抑制的木聚糖酶)，可以將較少的所鑒定的木聚糖酶添加到一種介質(zhì)中，以便隨后使用。所述木聚糖酶的最終用途可以包括食品制備、蛋白質(zhì)和淀粉生產(chǎn)、造紙和紙漿加工等的任一種或多種。
因此，本發(fā)明還包括一種方法，包括以下步驟(a)實施所述抑制劑測定方法；(b)鑒定對所述抑制劑具有高(或中或低)度耐受性的一種或多種木聚糖酶；和(c)制備含有所述鑒定的木聚糖酶的一種或多種的面團。
在進行與本發(fā)明相關(guān)的實驗的過程中，我們驚奇地發(fā)現(xiàn)，細菌木聚糖酶能夠耐受所述抑制劑，就是說其活性沒有被完全破壞。在某些情況下，所述木聚糖酶表現(xiàn)出非常理想的對所述抑制劑的耐受性。測定面團中不同木聚糖酶作用的測定方法當用所述抑制劑測定方法鑒定的某些合適的細菌木聚糖酶存在于一種面團混合物中時，我們驚奇地發(fā)現(xiàn)，該面團混合物不像含有真菌木聚糖酶的面團混合物那樣粘。從現(xiàn)有技術(shù)角度考慮，以上結(jié)果完全是出人意料的。
因此，本發(fā)明提供了另外一種用于鑒定適用于制備烘烤食品的細菌木聚糖酶或其變體的方法，該方法包括(a)將感興趣的細菌木聚糖酶摻入面團混合物中；和(b)測定所得面團混合物的粘性；以便所述細菌木聚糖酶或其變體適用于制備烘烤食品，如果所得到的面團混合物的粘性低于含有真菌木聚糖酶的類似面團混合物的粘性的話。為方便起見，我們將該方法稱為“粘性測定方法”。
因此，本發(fā)明還提供了一種方法，包括以下步驟(a)實施所述粘性測定方法；(b)鑒定適用于制備烘烤食品的一種或多種木聚糖酶；(c)制備一定量的所述一種或多種鑒定的木聚糖酶。
適用于測定面團粘性的方法將在下面提供。為方便起見，我們將該方法稱為“粘性方法”。根據(jù)本發(fā)明，不如含有真菌木聚糖酶的面團粘的含有本發(fā)明木聚糖酶的面團，有時可以被稱為“非粘性面團”。
如果一種細菌木聚糖酶具有有利的特征-就是說它不會產(chǎn)生像含有真菌木聚糖酶的面團那樣粘的面團-那么該木聚糖酶可被用于制備食品，如被用于制備烘烤食品的面團。
因此，本發(fā)明還提供了一種方法，包括以下步驟(a)實施所述粘性測定方法；(b)鑒定適用于制備烘烤食品的一種或多種木聚糖酶；和(c)制備含有所述一種或多種鑒定的木聚糖酶的面團。用于測定葡聚糖酶對有可能含有木聚糖酶的面團的面團的特性的影響的測定方法在進行與本發(fā)明相關(guān)的實驗的過程中，我們還發(fā)現(xiàn)一定量的葡聚糖酶的存在對木聚糖酶具有負面影響。
因此，在一方面，在木聚糖酶制劑-如用于制備或提取木聚糖酶的介質(zhì)中沒有有害含量的葡聚糖酶是有利的。另外，在某些方面，在用于制備食品的介質(zhì)中沒有有害含量的葡聚糖酶是有利的，所述介質(zhì)含有木聚糖酶。在本文中，術(shù)語“有害含量”表示存在一定量的葡聚糖酶，因而使得木聚糖酶的優(yōu)點被葡聚糖酶的負面影響所掩蓋。
因此，本發(fā)明提供了另一種用于鑒定適用于制備烘烤食品的木聚糖酶組合物(如木聚糖酶制劑)或制備木聚糖酶的介質(zhì)或添加了木聚糖酶的介質(zhì)的測定方法，該方法包括(a)提供一種含有感興趣的木聚糖酶的組合物或用于制備木聚糖酶的介質(zhì)或被添加了木聚糖酶的介質(zhì)；和(b)測定所述組合物或介質(zhì)中活性葡聚糖酶的存在；這樣，如果在所述組合物或介質(zhì)中存在至多為低水平的活性葡聚糖酶的話，該組合物或介質(zhì)適用于制備烘烤食品。為方便起見，我們將該方法稱為“葡聚糖酶測定方法”。
本發(fā)明還提供了一種方法，包括以下步驟(a)實施葡聚糖酶測定方法；(b)鑒定適用于制備烘烤食品的一種或多種組合物或介質(zhì)；(c)制備一定量的所述一種或多種鑒定的組合物或介質(zhì)。
適用于測定葡聚糖酶活性的方法將在下面提供。為方便起見，我們將該方法稱為“葡聚糖酶方法”。
如果所述組合物或介質(zhì)表現(xiàn)出有利特征-就是說與木聚糖酶相關(guān)的有利效果沒有因為有害量的葡聚糖酶的存在而受到完全掩蓋-那么，該組合物或介質(zhì)就可用于制備食品，優(yōu)選被用于生產(chǎn)面包制品的面團。
因此，本發(fā)明還包括一種方法，包括以下步驟(a)實施葡聚糖酶測定方法；(b)鑒定適用于制備烘烤食品的一種或多種鑒定的組合物或介質(zhì)；(c)制備含有所述一種或多種鑒定的組合物或介質(zhì)的面團。
因此，本發(fā)明包括木聚糖酶制劑，其中，所述木聚糖酶制劑基本上不含葡聚糖酶。
就此而言，所述木聚糖酶制劑可以從一種原始制劑中制備，該原始制劑中有可能存在的所有葡聚糖酶至少基本上被除去或者甚至其中的葡聚糖酶活性受到抑制或消除。用于達到這一目的的技術(shù)可以包括使用能夠識別并結(jié)合葡聚糖酶的抗體，在這樣做的時候，使得葡聚糖酶的活性失活?；蛘?，可以將葡聚糖酶的專一性抗體結(jié)合在一種支持物上，以便當所述原始制劑通過所述結(jié)合的抗體時能夠?qū)⑵暇厶敲笍钠渲谐ィ瑥亩纬梢环N基本上不含葡聚糖酶的木聚糖酶制劑。在另一種實施方案中，甚至是在其他的實施方案中，所述木聚糖酶制劑可以從具有極低或沒有葡聚糖酶活性的宿主生物中制備。就此而言，可以使存在于該宿主生物中的葡聚糖酶的活性失活。在另一方面，可以使所述葡聚糖酶基因的表達沉默或剔除。用于實現(xiàn)這一目的的技術(shù)可以包括使用葡聚糖酶編碼序列的反義序列。在另一種實施方案中，使用沒有或至多具有很低葡聚糖酶表達的宿主生物。Ki測定在某些場合下，測定木聚糖酶的Ki值(我們稱之為“Ki測定”)可能是有用的。就此而言，我們業(yè)已發(fā)現(xiàn)，在某些場合下Ki值有時表示木聚糖酶對某些用途的合適度。對Ki值的了解本身可能是有用的。組合測定本發(fā)明還包括本發(fā)明測定的適當組合。
就此而言，本發(fā)明包括一種組合方法，包括以下步驟的兩個或兩個以上構(gòu)成抑制劑含量測定方法的步驟；構(gòu)成抑制劑測定方法的步驟；構(gòu)成粘性測定方法的步驟；構(gòu)成葡聚糖酶測定方法的步驟；構(gòu)成Ki測定的步驟。在所述組合方法，所述步驟可以任何順序出現(xiàn)，并且不一定同時或連續(xù)出現(xiàn)。新型木聚糖酶如上文所述，本發(fā)明提供了一種用于鑒定可用于制備食品，特別是用于制備面包制品的面團的木聚糖酶的合適的測定方法。
就此而言，我們業(yè)已鑒定了三種適用于制備食品，特別是適用于制備烘烤食品的面團的新型木聚糖酶。
因此，本發(fā)明還包括含有序列7、序列9或序列11所示任一種氨基酸序列或其變體、同系物或片段的氨基酸序列。
與本發(fā)明木聚糖酶相關(guān)的術(shù)語“變體”、“同系物”、或“片段”可以包括對該序列進行的一個(或多個)氨基酸的取代、改變、修飾、置換、缺失或添加，其前提是所得到的氨基酸序列具有木聚糖酶活性，優(yōu)選至少具有與含有序列7、序列9、或序列11所示氨基酸序列的任一種的序列相同的活性。
具體地講，術(shù)語“同系物”包括結(jié)構(gòu)和/或功能方面的同源性，所得到的蛋白具有木聚糖酶活性，優(yōu)選至少具有與含有序列7、序列9、或序列11所示氨基酸序列的任一種的序列相同的活性。就序列同源性(即序列相似性或序列相同性)而言，與所附序列表所示序列的同源性優(yōu)選至少為75％，更優(yōu)選至少85％，更優(yōu)選至少90％。與所附序列表中所示序列的同源性優(yōu)選至少為95％，更優(yōu)選至少98％。
所述木聚糖酶優(yōu)選包括序列7或序列11所示序列，或其變體、同系物或片段。
本發(fā)明還包括編碼本發(fā)明氨基酸序列的核苷酸序列。
本發(fā)明的核苷酸序列優(yōu)選選自
(a)含有序列8、序列10或序列12所示核苷酸序列的任一種或其變體、同系物或片段的核苷酸序列；(b)序列8、序列10或序列12所示核苷酸序列的任一種或其互補物；(c)能夠與序列8、序列10或序列12所示核苷酸序列的任一種或其片段雜交的核苷酸序列；和(d)能夠與序列8、序列10或序列12所示核苷酸序列的任一種或其片段的互補物雜交的核苷酸序列；和(e)由于遺傳密碼的簡并性作為(a)、(b)、(c)或(d)所定義的核苷酸的簡并物的核苷酸序列。
與本發(fā)明核苷酸序列相關(guān)的術(shù)語“變體”、“同系物”或“片段”包括在該序列上取代、改變、修飾、置換、缺失或添加一個(或多個)核酸的任一種，只要所得到的核苷酸序列所編碼的氨基酸序列具有木聚糖活性即可，優(yōu)選至少具有包括序列7、序列9或序列11所示任一種氨基酸序列的相同活性。具體地講，術(shù)語“同系物”包括結(jié)構(gòu)和/或功能方面的同源性，只要所得到的表達蛋白具有木聚糖活性即可，優(yōu)選至少具有序列7、序列9或序列11所示任一種氨基酸序列的相同活性。就序列同源性(即序列相似性或序列相同性)而言，與所附序列表中序列8、序列10或序列12所示序列的同源性優(yōu)選至少為75％，更優(yōu)選至少85％，更優(yōu)選至少90％。與所附序列表中所示序列的同源性更優(yōu)選至少為95％，更優(yōu)選至少為98％。
本發(fā)明的核苷酸序列優(yōu)選包括序列8或序列12所示的序列或其變體、同系物或其片段。木聚糖酶的新型用途如上文所述，本發(fā)明還提供了一種用于鑒定木聚糖酶的合適的測定方法，所述木聚糖酶可被用于制備非粘性面團(如本文所定義的)，以便用于制備烘烤食品。
就此而言，我們業(yè)已鑒定了某些木聚糖酶，包括已知的和新型的細菌木聚糖酶，這些酶適用于制備食品，特別是用于制備烘烤食品的面團。
因此，本發(fā)明包括非粘性面團(如本文所定義的)，該面團含有能通過本發(fā)明測定方法鑒定的木聚糖酶。所述木聚糖酶優(yōu)選具有序列3、5、7、9、11中任一種所示的氨基酸序列，或其衍生物或同系物。更具體地講，所述木聚糖酶具有序列5、7、9、11中任一種所示的氨基酸序列，或其變體、衍生物或同系物。
與現(xiàn)有系統(tǒng)相反，本發(fā)明提供了在生產(chǎn)面團之前將木聚糖酶直接添加到面粉中的可能性。因此，可以將面粉/木聚糖酶混合物的批料供應(yīng)給面團生產(chǎn)者。另外，所述面團生產(chǎn)者不需要劑量設(shè)備就能獲得便于操作的面團。用木聚糖酶制備的食品本發(fā)明提供了一種鑒定適用于食品生產(chǎn)的木聚糖酶的方法。典型的食品(也包括動物飼料)包括乳制品、肉制品、禽制品、魚制品和烘烤制品。
所述食品優(yōu)選為烘烤食品。包括在本發(fā)明范圍之內(nèi)的典型的烘烤制品包括面包-如方面包、面包圈、小甜面包、意大利面包等-椒鹽卷餅、玉米薄餅、蛋糕、曲奇餅、餅干、薄脆餅干等。一般介紹在以下說明中所提到的“本發(fā)明的核苷酸序列”和“本發(fā)明的氨基酸序列”分別指本發(fā)明所提供的任一種或多種核苷酸序列和本發(fā)明所提供的任一種或多種氨基酸序列。氨基酸序列/多肽序列術(shù)語“本發(fā)明的氨基酸序列”是術(shù)語“本發(fā)明的多肽序列”的同義詞。在這里，所述氨基酸序列可以是木聚糖酶或木聚糖酶抑制劑的氨基酸序列。
本發(fā)明的多肽還包括本發(fā)明氨基酸序列及其變體的片段。合適片段的大小至少為5個，例如，至少10個、12個、15個或20個氨基酸。
還可以對本發(fā)明的多肽進行修飾，以便包括取代、缺失或插入，包括保守性取代在內(nèi)的一種或多種(例如，至少2、3、5或10個)。
可以按下表進行保守性取代，表中表示的是保守性取代，其中，第2欄同一個方框中的氨基酸，優(yōu)選第3欄同一行中的氨基酸可以彼此取代

本發(fā)明的多肽可以為大體上分離的形式。應(yīng)當理解的是，所述多肽可以與載體或稀釋劑混合，所述載體或稀釋劑不會影響該多肽的預(yù)期用途，并仍然被視為大體上分離的。本發(fā)明的多肽還可以為大體上純化的形式。在這種情況下它通常是指這樣的多肽制劑其中，有90％以上，例如，95、98％或99％的多肽是本發(fā)明的多肽?？梢詫Ρ景l(fā)明的多肽進行修飾，例如，通過添加組氨酸殘基以便有利于其純化，或通過添加信號序列以便促進其從細胞中分離，如下文所述。
本發(fā)明的多肽可以通過合成方法(例如，Geysen等所述，1996)或重組方法生產(chǎn)，如下文所述。
合適的宿主細胞-如酵母、真菌和植物宿主細胞-的使用可以在需要的時候進行如下翻譯后修飾(例如，肉豆蔻酸化、糖基化、截短、lapidation和酪氨酸、絲氨酸或蘇氨酸磷酸化)，以便賦予本發(fā)明重組表達產(chǎn)物最佳的生物學(xué)活性。核苷酸序列/多核苷酸序列術(shù)語“本發(fā)明的核苷酸序列”與術(shù)語“本發(fā)明的多核苷酸序列“同義。
本發(fā)明的多核苷酸包括編碼本發(fā)明多肽的核苷酸序列。應(yīng)當理解的是，由于遺傳密碼的簡并性，有多種不同的多核苷酸編碼一種特定的氨基酸序列。
通過了解本文所提供的氨基酸序列，可以設(shè)計出編碼本發(fā)明多肽的部分和完整長度的核酸序列，如cDNA和/或基因組克隆。例如，可以用簡并PCR獲得本發(fā)明的多核苷酸，所述PCR使用針對編碼本發(fā)明氨基酸序列的目標序列而設(shè)計的引物。所述引物通常包括多個簡并位點。不過，為了降低簡并性，應(yīng)當選擇編碼含有諸如甲硫氨酸的氨基酸的本發(fā)明所提供的氨基酸序列的片段的序列，它僅由一個三聯(lián)體編碼。另外，序列的選擇要考慮其核酸被用作PCR生產(chǎn)的模板DNA的生物中的密碼子使用。PCR所使用的嚴格條件低于克隆序列所使用的條件，具有針對已知序列的單一序列(非簡并)引物。
通過PCR獲得的編碼本發(fā)明多肽片段的核酸序列可用于通過雜交文庫篩選技術(shù)獲得較大的序列。例如，可以用放射性原子標記PCR克隆，并用于從其他物種中篩選cDNA或基因組文庫，優(yōu)選從其他植物物種或真菌物種中篩選。雜交條件通常為中等至高等嚴格性的條件(例如，0.03M氯化鈉和0.03M檸檬酸鈉，大約50℃-大約60℃)。
編碼所述氨基酸序列的全部或部分的簡并性核酸探針還可被用于從其他物種中檢測cDNA和/或基因組文庫，優(yōu)選從其他植物物種或真菌物種中檢測。不過，首先優(yōu)選實施PCR技術(shù)，以便獲得用于進一步篩選過程的單一序列。
用上文所述技術(shù)所獲得的本發(fā)明的多核苷酸序列，可被用于通過上文所述的技術(shù)獲得其他的同源序列和變體。還可對其進行修飾，以便用于在多種宿主細胞系統(tǒng)中表達本發(fā)明的多肽，例如，優(yōu)化表達所述多核苷酸序列的特定宿主細胞中的密碼子偏倚性。為了引入限制酶識別位點，或者改變由該多核苷酸所編碼的多肽的特性或功能，可能需要進行其他序列改變。
本發(fā)明的多核苷酸可用于生產(chǎn)一種引物，例如，PCR引物、可變擴增反應(yīng)的引物、探針，例如，通過常規(guī)方法用放射性或非放射性標記物標記過的探針，或者可以將所述多核苷酸克隆到載體中。所述引物、探針和其他片段的長度至少為15，優(yōu)選至少20，例如，至少25、30或40個核苷酸，它們?nèi)匀话ㄔ诒疚乃褂玫男g(shù)語本發(fā)明多核苷酸的范圍內(nèi)。
本發(fā)明的多核苷酸或引物可以攜帶一種顯像標記，合適的標記包括放射性同位素，如32P或35S，酶標記、或其他蛋白標記，如生物素。所述標記可以添加到本發(fā)明的多核苷酸或引物中，并可以用本身已知的技術(shù)檢測。
本發(fā)明的多核苷酸，如DNA多核苷酸和引物可以通過重組、合成、或本領(lǐng)域技術(shù)人員所知的任何方法生產(chǎn)。還可以用標準技術(shù)對其進行克隆。
一般，引物是通過合成方法生產(chǎn)的，包括逐步生產(chǎn)所需要的核酸序列，每次生產(chǎn)一個核苷酸。用于實現(xiàn)這一目的的、使用自動化技術(shù)的技術(shù)在本領(lǐng)域中很容易獲得。
較長的多核苷酸通常是用重組方法生產(chǎn)的，例如，使用PCR(聚合酶鏈式反應(yīng))克隆技術(shù)。該方法包括制備針對需要克隆的內(nèi)切-β-1，4木聚糖酶抑制劑基因的一個片段的引物對(例如，大約15-30個核苷酸)，讓所述引物與從真菌、植物或原核細胞中獲得的mRNA或cDNA接觸，在能夠發(fā)生所需要片段擴增的條件下進行聚合酶鏈式反應(yīng)，分離擴增的片段(例如，通過在瓊脂糖凝膠上純化反應(yīng)混合物)，以及回收擴增的DNA。所述引物可以被設(shè)計成含有合適的限制酶識別位點，以便擴增的DNA可以擴增到合適的克隆載體上。調(diào)控序列優(yōu)選將本發(fā)明的多核苷酸可操作地連接到一種調(diào)控序列上，該序列能夠進行編碼序列的表達，如由所選擇的宿主細胞表達。舉例來說，本發(fā)明包括含有可操作地連接在所述調(diào)控序列上的本發(fā)明多核苷酸的載體，即該載體是表達載體。
術(shù)語“可操作地連接”是指并列連接，其中，所述成分的連接關(guān)系使得它們能夠以其預(yù)期的方式起作用。“可操作地連接”與編碼序列上的調(diào)控序列是以這種方式連接的，該編碼序列的表達是在與調(diào)控序列兼容的條件下實現(xiàn)的。
術(shù)語“調(diào)控序列”包括啟動子和增強子，以及其他表達調(diào)控信號。
術(shù)語“啟動子”使用的是本領(lǐng)域的普通含義，例如，RNA聚合酶結(jié)合位點。
還可以通過篩選異源調(diào)控區(qū)，例如，啟動子、分泌前導(dǎo)和終止區(qū)實現(xiàn)編碼本發(fā)明多肽的多核苷酸的增強表達，所述調(diào)控區(qū)起著增強表達的作用，并且，如果需要還可以增強從選擇的表達宿主中分泌感興趣的蛋白的水平和/或提供對本發(fā)明多肽表達的誘導(dǎo)型控制。
本發(fā)明的核苷酸序列優(yōu)選可操作地與一個啟動子連接。
除了編碼本發(fā)明多肽的基因所固有的啟動子之外，還可以用其他啟動子指導(dǎo)本發(fā)明多肽的表達。還可以篩選啟動子的效率，以便指導(dǎo)本發(fā)明多肽在希望的表達宿主中表達。
在另一種實施方案中，可以篩選一種組成型啟動子，以便指導(dǎo)本發(fā)明需要的多肽的表達。所述表達結(jié)構(gòu)可以提供其他優(yōu)點，因為它避免了在含有誘導(dǎo)底物的培養(yǎng)基上培養(yǎng)表達宿主的必要性。
優(yōu)選用于真菌表達宿主中的強組成型和/或誘導(dǎo)型啟動子的例子是可以從編碼木聚糖酶(xlnA)，植酸酶，ATP合成酶、亞基9(oliC)，磷酸三糖異構(gòu)酶(tpi)，醇脫氫酶(AdhA)，α淀粉酶(amy)，淀粉葡糖苷酶(AG-來自glaA基因)，乙酰胺酶(amdS)和甘油醛-3-磷酸脫氫酶(gpd)啟動子的真菌基因中獲得的啟動子。
強酵母啟動子的例子是可以從編碼醇脫氫酶、乳酸酶、3-磷酸甘油酸激酶和磷酸三糖異構(gòu)酶的基因中獲得的啟動子。
強細菌啟動子的例子是α-淀粉酶和SP02啟動子，以及來自胞外蛋白酶基因的啟動子。
還可以將雜合啟動子用于改善所述表達結(jié)構(gòu)的誘導(dǎo)型調(diào)控。
所述啟動子還可以包括能確?；蛱岣咴诤线m宿主中表達的特征。例如，所述特征可以是諸如Pribnow框或TATA框的保守區(qū)。所述啟動子甚至可以含有能影響(如維持、增強、減弱)本發(fā)明核苷酸序列表達水平的其他序列。例如，合適的其他序列包括Sh1-內(nèi)含子或ADH內(nèi)含子。其他序列包括誘導(dǎo)因子-如溫度、化合物、光照或脅迫誘導(dǎo)因子。另外，可以存在能增強轉(zhuǎn)錄或翻譯的合適因子。上述因子的一個例子TMV5’信號序列(參見Sleat基因217 217-225；和Dawson植物分子生物學(xué)23 97)。分泌通常，希望本發(fā)明的多肽能從表達宿主中分泌到培養(yǎng)基中，這樣，更有利于從培養(yǎng)基中回收本發(fā)明的多肽。根據(jù)本發(fā)明，分泌前導(dǎo)序列可以根據(jù)需要的表達載體進行選擇。對于本發(fā)明來說還可以使用雜合的信號序列。
異源分泌前導(dǎo)序列的典型例子是源于真菌淀粉葡糖苷酶(AG)基因(glaA-18和24個氨基酸的形式，例如，來自曲霉屬)、α因子基因(酵母，例如，酵母屬和克魯維酵母屬)或α淀粉酶基因(芽孢桿菌屬)的分泌前導(dǎo)序列。結(jié)構(gòu)術(shù)語“結(jié)構(gòu)”-是諸如“接合體”、“框”和“雜合體”的術(shù)語的同義詞-包括直接或間接與啟動子連接的本發(fā)明的核苷酸序列。間接連接的例子是提供一個合適的間隔基團，如內(nèi)含子序列，如Sh1-內(nèi)含子或ADH內(nèi)含子，使其介于本發(fā)明的啟動子和核苷酸序列之間。與本發(fā)明相關(guān)的術(shù)語“融合”的情況也是如此，它包括直接或間接連接。在每一種情況下，該術(shù)語不包括編碼正常情況下與野生型基因啟動子結(jié)合的核苷酸序列的天然組合，并且它是處在其天然環(huán)境中。
所述結(jié)構(gòu)甚至還可以包括或表達一種標記，該標記可用于從在轉(zhuǎn)入了該結(jié)構(gòu)的諸如細菌，優(yōu)選芽孢桿菌屬，如枯草芽孢桿菌或植物，如馬鈴薯、甜菜等的生物中篩選該基因結(jié)構(gòu)?？梢允褂酶鞣N現(xiàn)有的標記，如編碼甘露糖-6-磷酸異構(gòu)酶(特別是植物的)的標記，或能產(chǎn)生抗生素抗性的標記-例如，針對G418潮霉素、博來霉素、卡那霉素和慶大霉素的抗性。
本發(fā)明的結(jié)構(gòu)優(yōu)選至少包括可操作地連接在一個啟動子上的本發(fā)明的核苷酸序列。載體術(shù)語“載體”包括表達載體和轉(zhuǎn)化載體，以及穿梭載體。
術(shù)語“表達載體”表示一種能進行體內(nèi)或體外表達的結(jié)構(gòu)。
術(shù)語“轉(zhuǎn)化載體”表示一種能夠從一種實體轉(zhuǎn)移到另一種實體-它可以是相同的物種或不同的物種中的結(jié)構(gòu)。如果所述結(jié)構(gòu)能夠從一個物種轉(zhuǎn)移到另一個物種-如從大腸桿菌質(zhì)粒轉(zhuǎn)移到細菌中，優(yōu)選轉(zhuǎn)移到芽孢桿菌屬中，該轉(zhuǎn)化載體有時被稱為穿梭載體。它甚至可以是能夠從大腸桿菌質(zhì)粒轉(zhuǎn)移到農(nóng)桿菌屬再轉(zhuǎn)移到植物中的結(jié)構(gòu)。
如下文所述，本發(fā)明的載體可以轉(zhuǎn)入合適的宿主細胞，以便實現(xiàn)本發(fā)明多肽的表達。因此，本發(fā)明的另一方面提供了一種用于制備本發(fā)明多肽的方法，該方法包括在能表達所述載體的編碼所述多肽的編碼序列的條件下，用表達載體轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染過的宿主細胞，以及回收表達的多肽。
例如，所述載體可以是具有一個復(fù)制起點、并選擇性地具有一個用于表達所述多核苷酸的啟動子，以及選擇性地具有一個所述啟動子的調(diào)控子的質(zhì)粒、病毒或噬菌體載體。
本發(fā)明的載體可以包括一個或多個選擇標記基因。用于工業(yè)微生物的最合適的篩選系統(tǒng)是不需要在宿主生物中突變的一類篩選標記構(gòu)成的。真菌篩選標記的例子是編碼乙酰胺(amdS)、ATP合成酶、亞基9(oliC)、乳清苷-5’磷酸-脫羧酶(pvrA)、腐草霉素和benomyl抗性(benA)的基因。非真菌篩選標記的例子是細菌G418抗性基因(它還可用于酵母，而不是真菌中)，氨芐青霉素抗性基因(大腸桿菌)，新霉素抗性基因(芽孢桿菌屬)和大腸桿菌uidA基因，編碼β-葡糖醛酸酶(GUS)。
載體可以體外使用，例如用于生產(chǎn)RNA，或用于轉(zhuǎn)染或轉(zhuǎn)化所述細胞。
因此，本發(fā)明的多核苷酸可以整合到重組載體(通常為復(fù)制型載體)上，例如，克隆或表達載體。所述載體可用于在兼容的宿主細胞中復(fù)制所述核酸。因此，在另一種實施方案中，本發(fā)明提供了一種通過以下方式制備本發(fā)明多核苷酸的方法將本發(fā)明的多核苷酸導(dǎo)入一種復(fù)制型載體，將所述載體導(dǎo)入兼容的宿主細胞，并在能復(fù)制該載體的條件下生長所述宿主細胞。可以從所述宿主細胞中回收所述載體。合適的宿主細胞在下文結(jié)合表達載體介紹。組織本文所使用的術(shù)語“組織”包括組織本身和器官。宿主細胞與本發(fā)明相關(guān)的術(shù)語“宿主細胞”包括能夠含有編碼本發(fā)明重組蛋白和/或由它所獲得的產(chǎn)物的核苷酸序列的所有細胞，其中，一個啟動子使得本發(fā)明的核苷酸序列能在宿主細胞中表達。
因此，本發(fā)明的另一種實施方案提供了用本發(fā)明多核苷酸轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染過的宿主細胞。所述多核苷酸優(yōu)選攜帶在用于復(fù)制和表達所述多核苷酸的載體上。應(yīng)當選擇與所述載體兼容的細胞，并且，舉例來說可以是原核(例如，細菌)、真菌、酵母或植物細胞。
革蘭氏陰性細菌大腸桿菌被廣泛用作異源基因表達的宿主。不過，大量的異源蛋白傾向于積累在所述細胞里面。隨后要從大量的大腸桿菌細胞內(nèi)部蛋白中純化所需要的蛋白有時可能是困難的。
與大腸桿菌相反，來自芽孢桿菌屬的細菌非常適合作為異源宿主，因為它具有將蛋白分泌到培養(yǎng)基中的能力。適于作為宿主的其他細菌是來自鏈霉素或假單胞菌屬的宿主。
根據(jù)編碼本發(fā)明多肽的多核苷酸的性質(zhì)和/或?qū)M一步加工表達蛋白的需要，諸如酵母或真菌的真核宿主可能是優(yōu)選的。一般，酵母細胞優(yōu)于真菌細胞，因為它更有利于操作。不過，某些蛋白要么很少從酵母細胞中分泌，要么在某些情況下不能正確加工(例如，在酵母中高糖基化)。在這種情況下，應(yīng)當選擇真菌宿主生物。
本發(fā)明范圍內(nèi)的優(yōu)選表達宿主的例子是真菌，如曲霉菌(如，在EP-A-0184438和EP-A-0284603中所披露的)和木霉菌；細菌，如芽孢桿菌(如在EP-A-0134048和EP-A-0253455所披露的)，鏈霉菌和假單胞菌；以及酵母，如克魯維酵母(如EP-A0096430和EP-A-00301670中所披露的)和酵母菌。
典型的表達宿主可選自黑曲霉、塔賓黑曲霉、泡盛黑曲霉、棘孢曲霉、構(gòu)巢曲霉、米曲霉、Trichoderma reesei、枯草芽孢桿菌、地衣型芽孢桿菌、解淀粉芽孢桿菌、乳酸克魯維酵母和釀酒酵母。生物與本發(fā)明相關(guān)的術(shù)語“生物”包括可以含有編碼本發(fā)明的重組蛋白和/或由它所獲得的產(chǎn)物的核苷酸序列的所有生物，其中，一個啟動子使得本發(fā)明的核苷酸序列能夠在所述生物中表達。對于本發(fā)明的木聚糖酶抑制劑方面來說，優(yōu)選的生物可以包括真菌、酵母或植物。對于本發(fā)明的木聚糖酶方面來說，優(yōu)選的生物可以是細菌，優(yōu)選芽孢桿菌屬、更優(yōu)選枯草芽孢桿菌。
與本發(fā)明相關(guān)的術(shù)語“轉(zhuǎn)基因生物”包括含有編碼本發(fā)明的重組蛋白和/或由它所獲得的產(chǎn)物的核苷酸序列的所有生物，其中，所述啟動子能夠在所述生物內(nèi)表達本發(fā)明的核苷酸序列。所述核苷酸序列優(yōu)選整合到該生物的基因組中。
術(shù)語“轉(zhuǎn)基因生物”不包括存在于其天然環(huán)境中的本發(fā)明的天然核苷酸編碼序列，在這種情況下，它受同樣也處在天然環(huán)境中的天然啟動子的控制。另外，本發(fā)明不包括本發(fā)明的天然蛋白，在這種情況下，它處于其天然環(huán)境中，并且它是由同樣處在其天然環(huán)境中的天然核苷酸序列表達的，并且該核苷酸序列是由同樣處在其天然環(huán)境中的天然啟動子控制的。
因此，本發(fā)明的轉(zhuǎn)基因生物包括編碼本發(fā)明氨基酸序列的核苷酸序列，本發(fā)明結(jié)構(gòu)(包括其組合)、本發(fā)明載體、本發(fā)明質(zhì)粒、本發(fā)明細胞、本發(fā)明組織或其產(chǎn)物的任一種或其組合。所述轉(zhuǎn)化細胞或生物能夠制備可接受數(shù)量的理想化合物，這些化合物可以從所述細胞或生物中方便地回收。宿主細胞/宿主生物的轉(zhuǎn)化如上文所述，宿主生物可以是原核生物或真核生物。合適原核宿主的例子包括大腸桿菌和枯草芽孢桿菌?，F(xiàn)有技術(shù)對原核宿主轉(zhuǎn)化的介紹相當充分，例如，Sambrook等(分子克隆實驗室手冊，第2版，1989，冷泉港實驗室出版社)和Ausubel等，當代分子生物學(xué)方法(1995)，John Wiley&Sons公司。
如果使用原核宿主，可能需要在轉(zhuǎn)化之前對核苷酸序列進行適當?shù)男揎?如除去內(nèi)含子。
如上文所述，優(yōu)選的宿主生物是芽孢桿菌屬，如枯草芽孢桿菌。
在另一種實施方案中，所述轉(zhuǎn)基因生物可以是酵母。就此而言，酵母還可以被廣泛用作異源基因表達的載體。釀酒酵母具有很長的工業(yè)應(yīng)用歷史，包括其作為異源基因表達的用途。Goodey等(1987，酵母生物技術(shù)，D R Berry等著，401-429頁，Allen和Unwin，倫敦)和King等(1989，酵母分子和細胞生物學(xué)，E F Walton和G TYarronton著，107-133頁，Blackie，Glasgow)業(yè)已對異源基因在釀酒酵母中的表達做過綜述。
由于若干種原因，釀酒酵母很適合于異源基因表達。首先，它不是人類的病原體，并且它不能夠產(chǎn)生某些內(nèi)毒素。其次，它在幾個世紀的各種目的的商業(yè)利用中，具有很長的安全使用歷史。這導(dǎo)致了普遍的公眾認可。第三，對這種生物進行的深入的商業(yè)應(yīng)用和研究導(dǎo)致了對釀酒酵母的遺傳學(xué)和生理學(xué)以及大規(guī)模發(fā)酵特征的深入了解。
E Hinchcliffe E Kenny(1993，“酵母作為異源基因表達的載體”，酵母，5卷，Anthony H Rose和J Stuart Harrison著，第2版，學(xué)術(shù)出版有限公司)對在釀酒酵母中異源基因表達和基因產(chǎn)物分泌的原理做過綜述。
現(xiàn)有若干種類型的酵母載體，包括整合載體，這種載體需要與宿主基因組重組以便其保持；以及自主性復(fù)制的質(zhì)粒載體。
為了制備轉(zhuǎn)基因酵母，通過將本發(fā)明的核苷酸序列插入為了在酵母中表達而設(shè)計的結(jié)構(gòu)上，制備表達結(jié)構(gòu)。業(yè)已開發(fā)了若干種類型的用于異源表達的結(jié)構(gòu)。所述結(jié)構(gòu)含有與本發(fā)明核苷酸序列融合的、在酵母中有活性的啟動子，通常使用源于酵母的啟動子，如GAL1啟動子。通常使用源于酵母的信號序列，如編碼SUC2信號肽的序列。該表達系統(tǒng)的末端是在酵母中有活性的終止子。
為了轉(zhuǎn)化酵母，業(yè)已開發(fā)了若干種轉(zhuǎn)化方法。例如，本發(fā)明的轉(zhuǎn)基因酵母可以按照以下文獻所披露的方法制備Hinnen等(1978，美國科學(xué)院院報75，1929)；Beggs，J D(1978，自然，倫敦，275，104)；和Ito，H等(1983，細菌學(xué)雜志153，163-168)。
轉(zhuǎn)化的酵母細胞用各種篩選標記篩選。用于轉(zhuǎn)化的標記包括多種營養(yǎng)缺陷型標記，如LEU2，HIS4和TRP1，以及顯性抗生素抗性標記，如氨基糖苷抗生素標記，例如，G418。
另一種宿主生物是植物。構(gòu)建遺傳修飾的植物的基本原理是將遺傳信息插入植物基因組，以便實現(xiàn)插入遺傳材料的穩(wěn)定保持。
現(xiàn)有若干種插入遺傳信息的技術(shù)，兩種主要的方法是直接導(dǎo)入所述遺傳信息，以及利用載體系統(tǒng)導(dǎo)入遺傳信息。對有關(guān)總體方法的綜述可以參見以下文章Potrykus(植物生理學(xué)植物分子生物學(xué)年度綜述 42205-225)和Christou(農(nóng)業(yè)食品工業(yè)高技術(shù)3月/4月，1994，17-27)。
因此，本發(fā)明一方面涉及一種載體系統(tǒng)，它攜帶有本發(fā)明的核苷酸序列或結(jié)構(gòu)，并且能夠?qū)⑺龊塑账嵝蛄谢蚪Y(jié)構(gòu)導(dǎo)入諸如植物的生物中。
所述載體系統(tǒng)可以包括一種載體，但也可以包括兩種載體。在兩種載體的情況下，該載體系統(tǒng)通常被稱為二元載體系統(tǒng)。在GynheungAn等的文章中對二元載體系統(tǒng)有更詳盡的說明(1980，二元載體，植物分子生物學(xué)手冊A3，1-19)。
一種用特定核苷酸序列轉(zhuǎn)化植物細胞的被廣泛采用的系統(tǒng)基于源于根癌農(nóng)桿菌的Ti質(zhì)粒的使用或源于毛根農(nóng)桿菌的Ri質(zhì)粒的使用，An等(1986)，植物生理學(xué)81，301-305和Butcher D.N.(1980)，植物病理學(xué)家的組織培養(yǎng)方法，D.S.Ingrams和J.P.Helgeson著，203-208。
業(yè)已構(gòu)建了若干種不同的Ti和Ri質(zhì)粒，它們適于構(gòu)建上述植物或植物細胞結(jié)構(gòu)。所述Ti質(zhì)粒的一種非限制性例子是pGV3950。
本發(fā)明的核苷酸序列或結(jié)構(gòu)優(yōu)選被插入Ti質(zhì)粒的T-DNA的末端序列之間，或者靠近一個T-DNA序列，以避免破壞緊靠T-DNA臂的序列，因為至少有一個所述片段似乎對于將修飾過的T-DNA插入植物基因組很重要。
通過以上說明可以理解，如果生物是植物，那么本發(fā)明的載體系統(tǒng)優(yōu)選包括感染植物所必需的序列(例如vir片段)以及至少一個T-DNA序列的邊界部分，該邊界部分與所述遺傳結(jié)構(gòu)位于同一個載體上。所述載體系統(tǒng)優(yōu)選是根癌農(nóng)桿菌Ti質(zhì)?；蛎r(nóng)桿菌Ri質(zhì)?；蚱溲苌铮驗檫@些質(zhì)粒是眾所周知的，并被廣泛應(yīng)用于構(gòu)建轉(zhuǎn)基因植物，現(xiàn)有的很多種載體系統(tǒng)就是基于所述質(zhì)?；蚱溲苌锏?。
在構(gòu)建轉(zhuǎn)基因植物時，首先在一種微生物中構(gòu)建本發(fā)明的核苷酸序列或結(jié)構(gòu)，所述載體可以在這種微生物中復(fù)制，并且在插入植物中之前容易操作。有用的微生物的例子是大腸桿菌，不過，也可以使用具有上述特征的其他微生物。當在大腸桿菌中構(gòu)建了上文所述載體系統(tǒng)的一種載體之后，如果需要將其轉(zhuǎn)入合適的農(nóng)桿菌屬菌株中，例如根癌農(nóng)桿菌。因此，優(yōu)選將具有本發(fā)明核苷酸序列或結(jié)構(gòu)的Ti質(zhì)粒轉(zhuǎn)入合適的農(nóng)桿菌屬菌株，例如，根癌農(nóng)桿菌，以便獲得本發(fā)明核苷酸序列或結(jié)構(gòu)的農(nóng)桿菌細胞，然后將所述DNA轉(zhuǎn)入待修飾的植物細胞。
這樣，可將本發(fā)明的核苷酸或結(jié)構(gòu)導(dǎo)入所述載體上的合適的限制位點。將所述包含的質(zhì)粒用于轉(zhuǎn)化大腸桿菌。在合適的營養(yǎng)培養(yǎng)基上培養(yǎng)所述大腸桿菌細胞，然后收獲并裂解。然后回收質(zhì)粒。作為分析方法，通常使用序列分析、限制分析、電泳和進一步的生化-分子生物學(xué)方法。在每次操作之后，可以對所使用的DNA序列進行限制，并與下一個DNA序列連接?？梢詫⒚恳粋€序列克隆到相同的或不同的質(zhì)粒上。
在每一次將需要的本發(fā)明的核苷酸序列導(dǎo)入植物之后，可能需要其他DNA序列的存在和/或插入。例如，如果用Ti或Ri質(zhì)粒轉(zhuǎn)化植物細胞，可以連接至少Ti和Ri質(zhì)粒T-DNA的右側(cè)邊界，不過，通常是右側(cè)和左側(cè)作為導(dǎo)入基因的旁側(cè)區(qū)。業(yè)已對T-DNA在轉(zhuǎn)化植物細胞方面的應(yīng)用做過深入研究，并且披露于以下文獻中EP-A-120516；Hoekema，二元植物載體系統(tǒng)，Offset-drukkerij Kanters B.B.，Alblasserdam，1985，第5章；Fraley等，植物科學(xué)評論綜述，41-46；和An等，EMBO(1985)4277-284。
用農(nóng)桿菌直接感染植物組織是一種簡單的方法，該方法業(yè)已被廣泛采用，并且披露于以下文獻中Butcher D.N.(1980)，植物病理學(xué)家的組織培養(yǎng)方法，D.S.Ingrams和J.P.Helgeson著，293-208。對這一問題的進一步介紹可以參見Potrykus(植物生理學(xué)植物分子生物學(xué)年度綜述(1990)42205-225)和Christou(農(nóng)業(yè)食品工業(yè)高技術(shù)3月/4月，1994，17-27)。采用這種技術(shù)可以對植物的特定部分或組織進行感染，即對葉片、根、莖的一部分或植物的其他部分進行感染。
通常，在用攜帶有所述核苷酸序列的農(nóng)桿菌直接感染植物組織時，要創(chuàng)傷待感染的植物，例如，通過用刀片切割植物或者用針頭穿刺植物或者用刷子摩擦植物。然后用所述農(nóng)桿菌接種所述創(chuàng)面。然后在合適的培養(yǎng)基上生長所述接種過的植物或植物部分，并讓其發(fā)育成成熟的植株。
在構(gòu)建植物細胞時，可以按照眾所周知的組織培養(yǎng)方法生長并保持所述細胞，如在補充了諸如氨基酸、植物激素、維生素等的必需生長因子的合適的培養(yǎng)基中培養(yǎng)所述細胞?？梢杂脧募毎蚪M織培養(yǎng)物再生植株的已知方法，將所述轉(zhuǎn)化細胞再生成遺傳上修飾過的植物，例如，用一種抗生素篩選轉(zhuǎn)化過的幼苗，并在含有合適營養(yǎng)成分、植物激素等的培養(yǎng)基上對所述幼苗進行繼代培養(yǎng)。
對植物轉(zhuǎn)化的進一步介紹可以參見EP-A-0449375。多肽的生產(chǎn)根據(jù)本發(fā)明，本發(fā)明多肽的生產(chǎn)可以通過在一種常規(guī)應(yīng)用發(fā)酵培養(yǎng)基中培養(yǎng)業(yè)已用本發(fā)明的一種或多種多核苷酸轉(zhuǎn)化過的諸如微生物的表達宿主而實現(xiàn)。合適培養(yǎng)基的選擇可基于表達宿主和/或基于該表達結(jié)構(gòu)的調(diào)控要求。對本領(lǐng)域技術(shù)人員來說，所述培養(yǎng)基是眾所周知的。如果需要，所述培養(yǎng)基可以含有有利于轉(zhuǎn)化的表達宿主的其他成分，它超過了其他潛在的污染微生物?？贵w本發(fā)明的氨基酸序列還可用于制備抗該氨基酸序列的抗體-如通過使用標準技術(shù)制備。為了生產(chǎn)抗體，可以通過注射所述抑制劑或具有免疫原特性的它的任何部分、變體、同系物、片段或衍生物或寡肽，對包括山羊、兔子、大鼠、小鼠在內(nèi)的各種宿主進行免疫。根據(jù)宿主的種類，可以使用各種佐劑，以便增強免疫反應(yīng)。所述佐劑包括，但不限于Freund’s礦物凝膠，如氫氧化鋁和表面活性物，如溶血卵磷脂，pluronic多元醇、聚陰離子、肽、油性乳劑、匙孔嘁血藍蛋白、和二硝基苯酚。卡介苗(BCG)和小棒桿菌是潛在的有用的人類佐劑，也可以使用它們。
所述氨基酸序列的單克隆抗體甚至可以用任何技術(shù)制備，這種技術(shù)能通過培養(yǎng)基中連續(xù)的細胞系生產(chǎn)抗體分子。其中包括，但不限于最初由Koehler和Milstein(1975，自然256495-497)披露的雜交瘤技術(shù)，人類B-細胞雜交瘤技術(shù)(Kosbor等(1983)今日免疫學(xué)472；Cole等(1983)美國科學(xué)院院報802026-2030)和EBV-雜交瘤技術(shù)(Cole等(1985)單克隆抗體和癌癥治療(Alan R Liss公司，77-96頁)。另外，可以使用為了生產(chǎn)“嵌合抗體”而開發(fā)的技術(shù)，該技術(shù)將小鼠抗體基因剪接到人類抗體基因上，以便獲得具有合適的抗原專一性和生物學(xué)活性的分子(Morrison等(1984)美國科學(xué)院院報816851-6855；Neuberger等(1984)自然312604-608；Takeda等(1985)自然314452-454)。另外，可以采用所公開的用于生產(chǎn)單鏈抗體的技術(shù)(US-A-4946779)生產(chǎn)抑制劑專一性單鏈抗體。
還可以按如下方法生產(chǎn)抗體通過在淋巴細胞群體中誘導(dǎo)體內(nèi)生產(chǎn)或通過篩選重組免疫球蛋白文庫或具有高度專一性結(jié)合試劑的類型，如在以下文獻中所披露的Orlandi等(1989，美國科學(xué)院院報863833-3837)，和Winter G和Milstein C(1991)；自然349293-299)。
方法方法1木聚糖酶測定(內(nèi)切-β-1，4-木聚糖酶活性)在檸檬酸(0.1M)-磷酸氫二鈉(0.2M)緩沖液，pH5.0中稀釋木聚糖酶樣品，以便在最終的測定中達到大約OD＝0.7。將所述樣品的三種稀釋液和具有特定活性的內(nèi)標在40℃下恒溫培養(yǎng)5分鐘。當時間＝5分鐘時，將一個Xylazyme tab(交聯(lián)的、染色的木聚糖底物)加入所述酶溶液中。當時間＝15分鐘時，通過添加10毫升的2％的Tris終止反應(yīng)。對反應(yīng)混合物進行離心，并在590nm波長下測定上清液的OD。綜合考慮稀釋液和木聚糖酶的量，可以計算樣品相對所述標準物的活性(TXU，總木聚糖酶單位)。
方法2粘性方法(粘性測定)用SMS面團粘性儀在TA-XT2系統(tǒng)(穩(wěn)定的微型系統(tǒng))上測定面團粘性。該方法是Chen和Hoseney(1995)所述方法的改進形式。用Farinograph(AACC方法54-21)由面粉、2％氯化鈉和水制備面團，使其達到400Brabender單位(BU)。將面粉和氯化鈉干燥混合1分鐘。加入水，并將面團再混合5分鐘。所獲得的面團最好在密封的容器中，在30℃下放置10、30或45分鐘。
將大約4克面團放入面團粘性儀中。取出4mm的面團，以便獲得均勻的擠壓。然后按照穩(wěn)定的微型系統(tǒng)方法進行5種測定(測定面團粘性的TA-XT2應(yīng)用研究)。簡單地講，擠出1mm的面團，以預(yù)定的力將與所述TA-XT2系統(tǒng)連接的探頭(25mm的介電有機玻璃筒狀探頭)壓入擠壓的面團中。將面團取出，并記錄面團和探頭之間的粘性。采用以下TA-XT2參數(shù)選項 粘性測定測定前速度2.0mm/s測定速度 2.0mm/s測定后速度10.0mm/s距離 15mm力40g時間 0.1s觸發(fā)類型自動-5g數(shù)據(jù)獲得速度 400pps在該實驗中所記錄的結(jié)果是最大力，表示將探頭從擠壓的面團中拔出所需要的力。所述距離表示面團連接在探頭上的距離。面積表示位于所獲得的曲線下部的面積。
面團粘性取決于所使用的面粉的質(zhì)量和配方。因此，非粘性面團是與對照面團相比，其粘性相差100％-200％(相對)的面團，優(yōu)選在以能在烘烤實驗中產(chǎn)生相同的體積增加的水平制備時具有低于用商業(yè)真菌木聚糖酶(即Pentopan mono BG，Novo Nordisk)所獲得粘性的不到70％(相對)。
方法3抑制劑測定方法(抑制劑測定)為了在分離和鑒定期間檢測所述抑制劑，使用以下所述方法。混合100微升抑制劑組分、250微升木聚糖酶溶液(含有12TXU/ml)和650微升緩沖液(0.1M檸檬酸-0.2M磷酸氫二鈉緩沖液，pH5.0)。在40℃下對該混合物進行5分鐘恒溫培養(yǎng)。在時間＝5分鐘時，加入一個Xylazyme tab。在時間＝15分鐘時，通過添加10毫升的2％Tris終止該反應(yīng)。對該反應(yīng)混合物進行離心(3500g，10分鐘，室溫)，并在550nm波長下測定上清液。以相對空白的殘余活性形式計算抑制作用。所述空白是用相同方法制備的，所不同的是用100微升緩沖液(0.1M檸檬酸-0.2M磷酸氫二鈉緩沖液，pH5.0)取代100微升的抑制劑。舉例來說，可以認為XM-1具有對該抑制劑的高度的抗性(參見圖20)?？梢哉J為XM-2和XM-3具有對該抑制劑的中度的抗性(參見圖20)。
方法4葡聚糖酶方法1(內(nèi)切-β-1，4-葡聚糖酶活性)在檸檬酸(0.1M)-磷酸氫二鈉(0.2M)緩沖液，pH5.0中稀釋葡聚糖酶樣品，以便在最終的測定中達到大約OD＝0.7。將所述樣品的三種稀釋液和具有特定活性的內(nèi)標在40℃下恒溫培養(yǎng)5分鐘。當時間＝5分鐘時，將一個Glucazyme tab(交聯(lián)的、染色的葡聚糖底物)加入所述酶溶液中。當時間＝15分鐘時，通過添加10毫升的2％的Tris終止反應(yīng)。對反應(yīng)混合物進行離心，并在590nm波長下測定上清液的OD。綜合考慮稀釋液和葡聚糖酶的量，可以計算樣品相對所述標準物的活性(BGU，β葡聚糖酶單位)。
方法5抑制劑測定方法2(抑制劑動力學(xué)測定)為了研究所述抑制劑的動力學(xué)，使用一種可溶性底物(疊氮木聚糖，Megazyme)。按照生產(chǎn)商的方法用20mM NaPi，pH6.0制備所述底物的2％(w/v)溶液。該測定是在40℃下預(yù)熱底物、木聚糖酶和抑制劑5分鐘完成的。
為了進行初步抑制劑鑒定，將使用的木聚糖稀釋到40TXU/ml。為了進行Ki測定，將木聚糖酶稀釋到40TXU/ml。
當時間＝0分鐘時，在40℃下混合0.5毫升底物、0.1毫升木聚糖酶和0.1毫升抑制劑。當時間＝125分鐘時，通過添加2毫升的乙醇(95％)，然后渦旋攪拌10秒鐘終止該反應(yīng)。通過離心(3500Xg，10分鐘，室溫)除去沉淀的未水解的底物。在590nm下測定上清液相對水的OD。
用相同方法制備空白。唯一的改進是用20mM NaPi，pH6.0取代所述抑制劑。
為了用降低的底物濃度進行動力學(xué)實驗，通過用20mM NaPi，pH6.0稀釋制備以下底物濃度2％、1％、0.5％和0.25％可溶性疊氮木聚糖(w/v)。
為了進行Ki測定，使用上述木聚糖酶和底物濃度。在該測定中與以下濃度的抑制劑提取物組合0，2，5，10，25，50和100微升。使用微升抑制劑而不是摩爾濃度的抑制劑，Ki以微升抑制劑形式表示。
總結(jié)總而言之，本發(fā)明特別提供了a.從小麥面粉中分離內(nèi)源內(nèi)切-β-1，4木聚糖酶抑制劑。
b.鑒定從小麥面粉中分離的內(nèi)源內(nèi)切-β-1，4木聚糖酶抑制劑。
c.鑒定內(nèi)源內(nèi)切-β-1，4木聚糖酶抑制劑對不同木聚糖酶的作用。
d.一種篩選不會受到內(nèi)源內(nèi)切-β-1，4木聚糖酶抑制劑負面影響的木聚糖酶的方法。
e.一種篩選不會受到內(nèi)切-β-1，4木聚糖酶抑制劑的負面影響的木聚糖酶的方法。
f.與含有真菌木聚糖酶的面團相比能提供具有有利的體積和可接受的粘性的木聚糖酶。
g.一種用于篩選木聚糖酶和/或用一種內(nèi)源內(nèi)切-β-1，4木聚糖酶抑制劑誘變該木聚糖酶的方法，并將所述木聚糖酶或其突變體用于生產(chǎn)面團。
h.用本發(fā)明的木聚糖酶制備的食品。
保藏物根據(jù)布達佩斯條約將以下樣品保存在被認可的保藏機構(gòu)國立工業(yè)和海洋微生物保藏有限公司(NCIMB)，Machar Drive，Aberdeen，蘇格蘭，AB2 1RY，1998年12月22日DH5αPcr2.1-BS木聚糖酶 NCIMB編號NCIMB40999BL21(DE3)pET24A-XM1NCIMB編號NCIMB41000BL21(DE3)pET24A-XM3NCIMB編號NCIMB41001DH5αPcr2.1-BS木聚糖酶含有野生型木聚糖酶。
BL21(DE3)pET24A-XM1含有XM1木聚糖酶。
BL21(DE3)pET24A-XM3含有XM2木聚糖酶。
本發(fā)明還包括可以由所述保藏物衍生和/或表達的序列，以及含有它的實施方案。
對實施例部分和附圖的介紹下面僅以舉例形式結(jié)合附圖對本發(fā)明進行說明，其中

圖1表示曲線；圖2表示曲線；圖3表示曲線；圖4表示曲線；圖5表示曲線；圖6表示曲線；圖7表示曲線；圖8表示曲線；圖9表示曲線；圖10表示曲線；圖11表示SDS PAGE實驗的圖象結(jié)果；
圖12表示曲線；圖13表示曲線；圖14表示曲線；圖15表示曲線；圖16表示曲線；圖17表示IEF實驗的圖象結(jié)果；圖18表示曲線；圖19表示曲線；圖20表示曲線；圖21表示曲線；圖22表示曲線；圖23表示曲線；圖24表示曲線；圖25表示曲線；圖26表示曲線；圖27表示曲線；圖28表示曲線；圖29表示曲線；圖30表示曲線；和圖31表示曲線。
更詳細地講圖1-木聚糖酶、劑量和駐留時間對粘性的影響。
圖2-木聚糖酶、劑量和駐留時間對粘性的影響。
圖3-75毫升抑制劑提取樣品的凝膠過濾層析。柱500毫升Superdex G-25F，流速10毫升/分鐘，級份大小30毫升。
圖4-240毫升凝膠過濾的抑制劑提取樣品陽離子交換層析。柱50毫升Sepharose SP，流速5.0毫升/分鐘，級份大小10毫升。
圖5-添加硫酸銨到1.0M的147毫升離子交換的抑制劑提取樣品的HIC層析。柱10毫升Phenyl HIC，流速2.0毫升/分鐘，級份大小2.5毫升。
圖6-25毫升濃縮抑制劑樣品的制備凝膠過濾層析。抑制劑在176毫升時洗脫。柱330毫升Superdex 75PG(Pharmacia)。洗脫液50mM乙酸鈉，200毫升氯化鈉，pH5.0。流速1毫升/分鐘，級份大小5.5毫升。
圖7-木聚糖酶+煮沸的抑制劑提取物的陽離子交換層析譜。樣品1毫升脫鹽的980601+煮沸的抑制劑提取物。柱1毫升SourceS15。緩沖系統(tǒng)A50mM乙酸鈉，pH4.5，BA+1M氯化鈉。流速2毫升/分鐘。
圖8-純木聚糖酶在與抑制劑提取物培養(yǎng)3小時之后的陽離子交換層析譜。樣品1毫升脫鹽的980601+煮沸的抑制劑提取物。柱1毫升Source S15。緩沖系統(tǒng)A50mM乙酸鈉，pH4.5，BA+1M氯化鈉。流速2毫升/分鐘。
圖9-100微升濃縮抑制劑樣品的分析凝膠過濾層析。抑制劑在10.81毫升時洗脫。柱24毫升Superdex 75 10/30(Pharmacia，瑞典)。洗脫液50mM乙酸鈉，100毫升氯化鈉，pH5.0。流速0.5毫升/分鐘，級份大小2.0毫升。
圖10-通過Superdex 75 10/30的標準蛋白的Kav對Log(MW)的影響。
圖11-來自制備凝膠過濾的級份31、32和33SDS PAGE。泳道1和3是分子量標記(Pharmacia’s MLW標記，瑞典)。泳道2和4是分別以10微升和25微升加樣的級份32。泳道6和8是分別以10和25加樣的級份31。泳道7和9是分別以10和25加樣的級份33。
圖12-是來自凝膠過濾層析級份33的反向?qū)游鲎V。層析譜上出現(xiàn)了4個不同的峰。峰3是木聚糖酶抑制劑。對峰4、5和6進行測序，并表現(xiàn)出與小麥蛋白絲氨酸蛋白酶抑制劑具有極高的同源性。
圖13-來自RP-層析的級份3的MS。圖譜表示一種分子量為39503Da的分子。
圖14-來自級份33的反向?qū)游鲎V(參見圖12)的羧基甲基化級份3的反向?qū)游?。該層析譜出現(xiàn)了兩個獨立的峰(級份2和3)，表示一種二肽。
圖15-來自羧基甲基化反向?qū)游?參見圖14)的級份的MS。圖譜表示一種分子量為12104Da的肽。
圖16-來自羧基甲基化反向?qū)游?參見圖14)的級份3的MS。圖譜表示一種分子量為28222Da的肽。
圖17-來自制備凝膠過濾層析的級份33和34的IEF。泳道2是pI3-10標準物，泳道3是pI2.53-6.5標準物泳道4和5分別是級份33和34，泳道6是Trysin抑制劑(pI4.55)，泳道7是乳球蛋白(pI5.20)，而泳道8和9分別是級份33和34。箭頭表示級份33中不同的帶。
圖18-來自木聚糖酶抑制劑層析聚焦層析的級份對pH和相對OD(來自抑制劑測定)的影響。從該圖可以看出，在級份7中相對OD降低，表示有抑制劑活性。它與pH9.4相應(yīng)。
圖19-抑制劑濃度對四種木聚糖酶的百分殘余活性的影響。所使用的四種木聚糖酶是--◆-X1，-■-X3，-x-BX，-▲-Novo。
圖20-980601(coli-1)、980603(Belase)和980601的三種突變型(SM1、SM2和SM3)這與面粉提取物培養(yǎng)之后的殘余活性。
圖21-木聚糖酶(980601)+/-抑制劑的Line-weaver-Burk圖。底物濃度為疊氮木聚糖的百分比。V是來自測定的相對OD590(其中100為S＝2％)。
圖22-不同木聚糖酶Ki，以微升抑制劑表示。
圖23-pH對三種木聚糖酶(980601＝枯草芽孢桿菌wt，980801＝X1和980901＝Thermomyces)的抑制作用的影響。數(shù)據(jù)是比較相關(guān)的空白而獲得的。
圖24-三種木聚糖酶(980601＝BX，980801＝X1和980901＝Novo)的最佳pH。
圖25-比體積＝f(木聚糖酶X劑量)。
圖26-比體積增加＝f(木聚糖酶X劑量)。
圖27-粘性＝f(木聚糖酶X劑量)。
圖28-在駐留時(-10)和(-45)分鐘之后，測定的不同木聚糖酶制劑和對照對粘性的影響。980603是純化的Rohm木聚糖酶，XM1是木聚糖酶突變體1而#2199是Rohm’s Veron特殊制品。
圖29-在駐留時(-10)和(-45)分鐘之后，三種木聚糖酶制劑對粘性增加的影響。980603是純化的Rohm木聚糖酶，XM1是木聚糖酶突變體1而#2199是Rohm’s Veron特殊制品。
圖30-在駐留時(-10)和(-45)分鐘之后，兩種木聚糖酶制劑對粘性的影響。XM1是木聚糖酶突變體1而#2199是Rohm’s Veron特殊制品。
圖31-添加的內(nèi)切-β-1，4-木聚糖酶對粘性增加的影響。1沒有木聚糖酶的對照面團，27500TXU純的Rohm木聚糖酶/kg面粉，37500TXU純的Rohm木聚糖酶/kg面粉+158PGU/kg面粉，415000TXU純的Rohm木聚糖酶/kg面粉，515000TXU純的Rohm木聚糖酶/kg面粉+316PGU/kg面粉。在10(Stik-10)和(Stik-45)分鐘之后，測定的面團。
實施例例1不同木聚糖酶、劑量和駐留時間對面團粘性的影響測定了以下木聚糖酶產(chǎn)生面團粘性的能力。
(同樣參見Chen，W.Z.和Hoseney，R.C.(1995)。一種評價面團粘性的客觀方法的開發(fā)。Lebensmittel Wiss u.-Technol.，28，467-473)。
酶“X1”相當于源于黑曲霉的內(nèi)切-β-1，4-木聚糖酶的純化樣品。該木聚糖酶的活性為8400TXU(15000TXU/毫克)“Novo”相當于源于Thermomyces的Novo Nordisk’s BentopanMono BZ。這種木聚糖酶的活性為350.000TXU(56000TXU/毫克)“BX”相當于新型細菌木聚糖酶的純化樣品。該樣品的活性為2000TXU(25000TXU/毫克)“Rohm”相當于Rohm GmbH’s細菌木聚糖酶，Veron Speviel。該樣品的活性為10500TXU(35000TXU/毫克)木聚糖酶測定木聚糖酶測定是按方法1進行的。
面粉在該實驗中使用了兩種面粉丹麥面粉，批號為98022，德國面粉，批號為98048。這兩種類型的面粉在400BU的條件下的吸水量分別為58％和50％。
面團制備按方法2制備面團。在混合面團之后，在30℃下在密封的容器中分別放置10分鐘和45分鐘。
粘性測定按方法2測定粘性。
結(jié)果和討論真菌木聚糖酶與新型細菌木聚糖酶。
制備以下面團，并在10分鐘和45分鐘之后測定面團粘性，使用的面粉是98048。
表1用不同劑量的兩種真菌木聚糖酶和一種細菌木聚糖酶制備的面團(劑量是以每千克面粉計算的)

表1中的面團所產(chǎn)生的面團粘性結(jié)果表示在表2和圖1中。
表2用不同劑量的不同木聚糖酶和空白制備的面團。
面團分別放置10分鐘和45分鐘。粘性以g×s形式給出。粘性數(shù)字是5次測定的平均值

來自表2的數(shù)據(jù)表示在圖1中。
從表2和圖1可以看出，真菌木聚糖酶X1和Novo產(chǎn)品中的木聚糖酶能增加面團粘性。新型細菌木聚糖酶不能增加同一種面團的粘性。另外，粘性似乎比對照低。
新型細菌木聚糖酶與Rohm’s細菌木聚糖酶為了實驗新型細菌木聚糖酶與Rohm制品Veron Special中的細菌木聚糖酶相比的功能，用面粉98022制備以下面團(參見表3)
表3用不同劑量的兩種細菌木聚糖酶制備的面團(劑量是以每千克面粉計算的)

表3中面團所產(chǎn)生的面團粘性結(jié)果在表4和圖2中表示。
表4用不同劑量的不同木聚糖酶和空白物制備的面團粘性以g×x形式給出。粘性數(shù)字是5次測定的平均值

表4的數(shù)據(jù)在圖2中示出。
以上結(jié)果表明，BX(新型細菌木聚糖酶)所產(chǎn)生的粘性遠遠低于實驗的真菌木聚糖酶所產(chǎn)生的粘性。另外，發(fā)現(xiàn)所述新型木聚糖酶所產(chǎn)生的面團粘性遠遠低于Rohm細菌木聚糖酶的。例2抑制劑純化、鑒定和對木聚糖酶的影響面粉在該實驗中使用三種不同類型的面粉(批號為98002、98026和98058)。面粉批號98002和98058是丹麥面粉。面粉批號98026是德國面粉。抑制劑提取使用冰鎮(zhèn)的蒸餾水并攪拌，從所述面粉中提取抑制劑。將1等份的面粉添加到2等份的冰鎮(zhèn)蒸餾水中。在該混合物中放入一個磁力棒，并放在冰浴中，攪拌20分鐘。在攪拌之后將面糊注入離心管，并離心(10000g，4℃，10分鐘)。上清液中含有木聚糖酶抑制劑。抑制劑測定按方法3進行抑制劑測定。抑制劑分離在對100克面粉樣品(98026)進行提取之后，通過以下層析技術(shù)純化木聚糖酶抑制劑。凝膠過濾層析(該方法進行2次)以10毫升/分鐘的速度，將75毫升提取物加樣到用20mM乙酸，pH4.25平衡的500毫升Superdex G-25F(Pharmacia，瑞典)柱上。用相同的流速以30毫升的級份收集洗脫液。所有級份都含有抑制劑。陽離子交換層析(該方法進行2次)以5毫升/分鐘的速度將從凝膠過濾中收集的抑制劑峰(240毫升)加樣到50毫升SP Sepharose(Pharmacia，瑞典)柱上。在加樣之后，用緩沖液(200mM乙酸鈉，pH4.25)將該柱洗脫到本底水平。用線性梯度的A-B緩沖液(BA+350mM氯化鈉)以10倍柱體積，以相同的流速洗脫抑制劑。以10毫升的級份收集洗脫液。每隔1個級份對木聚糖酶抑制劑進行抽樣檢查。疏水性相互作用層析(該方法進行2次)向來自陽離子交換層析的抑制劑峰(110毫升)中添加硫酸銨至1.0M，并以2毫升/分鐘的速度加樣到10毫升Phenyl Sepharose HIC(Pharmacia，瑞典)柱中。用12倍柱體積的從A(20mM NaPi，1M硫酸銨，pH6.0)至B(20mM NaPi，pH6.0)的線性梯度將所述抑制劑從柱中洗脫。洗脫液以2.5毫升的級份收集，每隔1個級份對木聚糖酶抑制劑進行抽樣檢查。制備凝膠過濾層析用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器將來自HIC層析的5毫升抑制劑峰進行向上濃縮至2毫升。將該樣品以1毫升/分鐘的速度加樣到330毫升Superdex 75PG(Pharmacia，瑞典)柱上。所使用的緩沖系統(tǒng)是50mM乙酸鈉，0.2M氯化鈉，pH5.0。以5.5毫升的級份收集洗脫液。每隔1個級份對木聚糖酶抑制劑進行抽樣檢查。
蛋白酶活性分析為了確定發(fā)現(xiàn)的抑制劑作用是由于抑制劑還是由于蛋白酶水解了木聚糖酶，進行了以下實驗。培養(yǎng)試驗在40℃下將2毫升純的木聚糖酶980601(參見內(nèi)切-β-1，4-木聚糖酶)與0.25毫升抑制劑提取物一起培養(yǎng)3小時。作為對照，與煮沸的(5分鐘)抑制劑提取物進行相同的培養(yǎng)。在培養(yǎng)之后向該樣品中添加50mM乙酸鈉，pH4.5，達到2.5毫升，并在PG-10柱(Pharmacia，瑞典)上通過凝膠過濾脫鹽，獲得存在于50mM乙酸鈉，pH4.5中的3.5ml樣品。水解分析在SOURCE 15S柱上，對來自所述培養(yǎng)試驗的純木聚糖酶的兩個樣品進行分析。以2毫升/分鐘的速度將1毫升凝膠過濾樣品加樣到所述柱上(用A緩沖液平衡50mM乙酸鈉，pH4.5)。所述樣品用從A-B(BA+1M氯化鈉)的線性梯度，用20倍柱體積洗脫，并以2毫升級份收集。用OD280nm檢測木聚糖酶，并在級份中對木聚糖酶活性進行抽樣檢查(100微升級份+900微升緩沖液(0.1M檸檬酸-0.2M磷酸氫二鈉緩沖液，pH5.0)+1個Xylazyme tab，10分鐘，40℃。用10毫升2％Tris終止反應(yīng)。蘭色＝木聚糖酶活性)。抑制劑鑒定分析凝膠過濾層析以0.5毫升/分鐘的速度將來自HIC層析的100微升(在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器上濃縮2次)抑制劑峰加樣到24毫升Superdex75 10/30(Pharmacia，瑞典)上。所使用的洗脫緩沖液是50mM乙酸鈉，0.1M氯化鈉，pH5.0。以2毫升的級份收集洗脫液。抽樣檢查所述級份的抑制劑。
為了能夠確定該抑制劑的大小，將一系列已知的蛋白加樣到24毫升Superdex10/30柱上。進行洗脫的條件與上文所述相同。所使用的標準蛋白為蛋白 大小，KDaBSA 67卵清蛋白 43胰凝乳蛋白酶 25核糖核酸酶A 13.7在280nm波長下檢測所述蛋白。
SDS PAGE向來自制備凝膠過濾層析的級份中添加SDS樣品緩沖液(按照NOVEX方法制備)，煮沸3分鐘，并加樣到8-16％PAGE凝膠(NOVEX)中。按照NOVEX’s方法對所述凝膠進行銀染色。用Pharmacia’s LMW標記作為分子量標記。等電聚焦(IEF)為了測定天然抑制劑的pI，將純化抑制劑(來自330毫升Superdex 75PG的級份33)的樣品加樣到pH3-10的IEF GEL(NOVEX)上。按照生產(chǎn)商的方法對所述凝膠進行電泳。使用Pharmacia’s(瑞典)寬pI試劑盒，3.5-9.3作為標準物。按照生產(chǎn)商的方法用考馬斯亮蘭對所述凝膠進行染色。層析聚焦層析將來自制備凝膠過濾層析的級份33的樣品凝膠過濾到水中。將100微升脫鹽樣品加樣到Mono P HR5/5(Pharmacia，瑞典)柱上。起始條件是用25mM乙醇胺-HCl，pH9.4獲得的。用1∶10的Poly緩沖液96水洗脫該柱。將pH調(diào)整到6.0(流速0.5毫升/分鐘；級份大小0.5毫升)。在用Po1y緩沖液96洗脫之后，進一步用1∶10的Poly緩沖液74水洗脫該柱。將pH調(diào)整到3.80(流速0.5毫升/分鐘；級份大小0.5毫升)。
測定所有級份的pH，并用方法3對木聚糖酶抑制劑進行抽樣檢查。氨基酸序列使用制備純化的純抑制劑的樣品(從330毫升Superdex75PG的級份33獲得)。將200微升加樣到C4反向柱(應(yīng)用生物系統(tǒng))上。所使用的緩沖液緩沖系統(tǒng)為A用水制備的0.1％TFA，和B用100％乙腈制備的0.1％的TFA。對來自該層析的抑制劑峰進行羧甲基化，并再次通過C4柱。這樣，獲得了兩種感興趣的抑制劑肽。對這些肽進行N-末端測序。另外，用Lys-C消化所述肽。用反向?qū)游龇椒ɑ厥账@得的肽，并進行氨基酸測序。
為了證實通過氨基酸測序所獲得的序列，用MS(Voyager)對感興趣的樣品的一小部分進行分析。
抑制劑動力學(xué)按照方法5進行抑制劑測定。就此而言，為了進行初步抑制劑鑒定研究，所使用的木聚糖酶是980601，稀釋到40TXU/毫升，并且抑制劑是從面粉98002中提取的。為了進行Ki測定，使用以下木聚糖酶980601、980603、980801、980901、980903、980906、和980907，稀釋到大約40TXU/毫升。用于Ki測定的抑制劑是從面粉98058中提取的。
測定pH對抑制作用的影響這些實驗是按照方法3所述方法完成的，進行了以下改進。在該測定中除了使用650微升緩沖液(0.1M檸檬酸-0.2M磷酸氫二鈉)pH5.0之外，該測定還用pH為4、6和7的相同的緩沖系統(tǒng)進行。
內(nèi)切-β-1，4-木聚糖酶使用以下木聚糖酶制劑980601(BX)在大腸桿菌中表達的Danisco’s新型細菌木聚糖酶的純化制劑(1225TXU/毫升)。
980603(Rohm)Frimond’s Belase木聚糖酶(與Rohm’s相同)的純化制劑(1050TXU/毫升)。
980801(X1)來自黑曲霉的純化X1(8400TXU/克)。
980801(Rohm)Frimond’s Belase木聚糖酶(與Rohm’s相同)的純化制劑(26TXU/毫升)。
980901(Novo)來自Novo’s Pentopan mono BG的Thermomyces木聚糖酶的純化制劑(2900TXU/毫升)。
980903(XM1)在大腸桿菌中表達的枯草芽孢桿菌野生型木聚糖酶的突變體(1375TXU/毫升)。
980906(XM1)在大腸桿菌中表達的枯草芽孢桿菌野生型木聚糖酶的突變體(1775TXU/毫升)。
980907(XM2)在大腸桿菌中表達的枯草芽孢桿菌野生型木聚糖酶的突變體(100TXU/毫升)。
9535(X1)來自黑曲霉的純化木聚糖酶X3(6490TXU/毫升)。結(jié)果和討論用于分離和鑒定的抑制劑提取對100克面粉(98026)進行提取。在離心之后獲得150毫升上清液。檢查抑制劑在該提取物中的存在(表5)并發(fā)現(xiàn)呈陽性。
表5+/-添加來自小麥面粉(98026)的抑制劑提取物對殘余活性的影響。
所使用的木聚糖酶是980601。

抑制劑分離將75毫升抑制劑提取物加樣到500毫升凝膠過濾柱(圖3)上。在進行抑制劑的抽樣檢查之后，可以確定其存在于級份[4-11]中(表6)。
表6對來自凝膠過濾層析的75毫升抑制劑提取物的級份進行木聚糖酶抑制劑測定。OD處理1和2分別相應(yīng)于在該柱上進行的兩種處理。發(fā)現(xiàn)抑制劑存在于級份[4-11]中。在每一輪處理中收集這些級份，得到兩個240毫升。

兩輪凝膠過濾柱處理的抑制劑峰收集物大約為240毫升。
將來自凝膠過濾的兩個240毫升的收集物加樣到陽離子交換器上。發(fā)現(xiàn)流通液中的抑制劑呈陰性。從圖4和表7中可以看出，所述抑制劑結(jié)合在所述柱上，并被大約750mM氯化鈉洗脫。
表7分析來自240毫升凝膠過濾抑制劑提取物的陽離子交換層析的級份中木聚糖酶抑制劑的存在。OD處理1和2分別相應(yīng)于在所述柱上進行的兩輪處理。發(fā)現(xiàn)抑制劑存在于級份[44-54]中。

來自每一輪離子交換處理的抑制劑收集物為110毫升。向這兩種收集級份中添加硫酸銨至1.0M，并分兩次處理加樣到HIC柱上。對流通液中的抑制劑進行抽樣檢查，并發(fā)現(xiàn)呈陰性。從圖5和表8中可以看出，所有抑制劑結(jié)合在所述柱上，并獲得了良好的分別。
對來自HIC層析的級份進行的分析如表8所示。
表8分析來自147毫升抑制劑提取物的HIC層析的級份。OD處理1和2分別相應(yīng)于在該柱上進行的兩輪處理。發(fā)現(xiàn)抑制劑存在于級份[15-23]中。

將來自HIC層析的級份17和18濃縮大約2倍，并加樣到制備凝膠過濾柱上(圖6)。
對來自制備凝膠過濾的級份所做的分析如表9所示。
表9分析來自2毫升濃縮制劑樣品的制備凝膠過濾層析的級份中木聚糖酶抑制劑的存在。發(fā)現(xiàn)抑制劑存在于級份[31-33]中。

蛋白酶活性分析根據(jù)對木聚糖酶抑制劑所做的以上測定，不能排除在與淀粉提取物混合時木聚糖酶活性的降低不是由于木聚糖酶的蛋白水解作用。因此，將純化的木聚糖酶與一種“抑制劑”提取物培養(yǎng)。從圖7和8可以看出，似乎沒有發(fā)生水解。在采用活性抑制劑的層析譜上存在很少的背景(圖8)。不過，該背景相當于所述僅有所述抑制劑的層析譜(抑制劑的層析譜沒有示出)。背景的差別一定是由于在煮沸的抑制劑樣品中的沉淀作用。
抑制劑鑒定分析凝膠過濾層析將來自第2個HIC處理的級份18的100微升濃縮2倍的抑制劑樣品加樣到24毫升分析Superdex75 10/30(Pharmacia，瑞典)上(圖9)。以2毫升的級份收集洗脫液。測定所述級份中的木聚糖酶抑制劑(表10)。
表10分析來自100微升濃縮抑制劑樣品的分析凝膠過濾層析級份中木聚糖酶抑制劑的存在。發(fā)現(xiàn)抑制劑存在于級份[6-7]中。

在對向上濃縮的抑制劑樣品進行凝膠過濾之后，用完全相同的方法將四種標準分子量蛋白的混合物加樣到所述柱上(層析譜未示出)。在表11中歸納了所述蛋白的分子量和洗脫時間。
表11用于測定所述抑制劑分子量的標準蛋白。所使用的縮寫和公式在下面的表中解釋。

＊)Kav＝(Ve-Vo)/Vt-Vo)其中Ve＝駐留時間，ml＝Vo＝間隙體積，ml＝8.54Vt＝24ml＝24用log(MW)作為Kav的函數(shù)作圖?？梢垣@得一個公式，并估算一種未知分子的分子大小(圖10)。
使用在圖10中獲得的公式和所述抑制劑的駐留時間，可以計算出該抑制劑的分子大小(-2,2248×kav+1.9602)MW.kDa＝10(-2,4485×0.173559+1.9602)＝ 101.5352＝ 10＝ 34.29發(fā)現(xiàn)該抑制劑的分子量高于我們按照Rouvu和Surget(1998，戊聚糖酶抑制劑在小麥面粉中存在的證據(jù)。谷類科學(xué)雜志，2863-70)的方法預(yù)計的分子量。該分子的分子量為大約8KDa。通過凝膠過濾所獲得的分子量可以通過若干抑制劑分子的聚合來解釋。為了進一步研究這一問題，對來自制備凝膠過濾層析的級份31、32和33進行SDS PAGE凝膠處理(圖11)。從該凝膠上可以看出，在用純化抑制劑樣品加樣的泳道上出現(xiàn)了三條帶。這些帶相當于分子量為大約40、30和10KDa的蛋白。
用MS測定分子量用Presob系統(tǒng)和5倍體積的20mM乙酸對來自制備凝膠過濾的抑制劑的級份33的樣品進行脫鹽。將200微升樣品加樣到C4反向柱(應(yīng)用生物系統(tǒng))上。在該處理中獲得了三個峰。其中的一個峰(峰3)明顯占有優(yōu)勢，并被認為是所述抑制劑(圖12)。對來自該處理的其他峰也進行了測序。從所獲得的序列可以斷定，這些峰都源于相同的小麥蛋白絲氨酸蛋白酶抑制劑，并且與所述抑制劑(峰3)不同。因此，峰3被認定為感興趣的木聚糖酶抑制劑。還用MS(Voyager)對該峰作進一步鑒定。用芥子酸作基質(zhì)進行的MS譜分析發(fā)現(xiàn)了與一種39503Da的蛋白相應(yīng)的信號。
如上文所述，SDS PAGE凝膠揭示了三條帶。一條帶大約為10KDa，一條帶大約為30KDa，而另一條帶為大約40KDa。為了解釋在SDS PAGE中觀察到的結(jié)果，收集純的占優(yōu)勢的級份，裂解并進行羧甲基化，然后再一次用C4柱處理，所使用的條件與上文所述相同。
用MS分析通過該再次處理所獲得的級份(圖54)。從圖15和16可以看出，所述多肽的分子量為12104和28222Da。
并不受理論的約束，我們認為所述木聚糖酶抑制劑要么是一種天然的二肽(分子量為39503Da)，要么就是在分子過程中變性并降解(分子量分別為12104和28222Da的兩種肽)。
用IEF和層析聚焦層析測定所述木聚糖酶抑制劑pIIEF凝膠在堿性部位(分別為大約9.3、8.6和8.2)表現(xiàn)出三條帶，并且在酸性部位(分別為大約5.1、5.3和5.5)表現(xiàn)出三條帶(圖17)。僅僅根據(jù)以上結(jié)果，不容易確定所述天然木聚糖酶抑制劑的pI。就此而言，我們從測序結(jié)果了解到，所述樣品僅含有所述木聚糖酶抑制劑和絲氨酸蛋白酶抑制劑的三個分子量大約為4500Da的片段。理論計算的絲氨酸蛋白酶抑制劑的pI為5.58，而根據(jù)我們通過測序所獲得的片段所計算的pI為5.46(使用Swiss Prot程序)。這可以表明，在所述凝膠上所出現(xiàn)的三條酸性帶是在反向?qū)游鲋兴^察到的絲氨酸蛋白酶抑制劑的三個峰(圖12)，而三條堿性帶是所述木聚糖酶抑制劑的三種不同的形式，即天然的二肽形式和所述兩種肽(通過測序證實)。
從圖18中的層析聚焦層析結(jié)果可以看出，所述木聚糖酶抑制劑在所給定的條件下不與柱結(jié)合。這意味著，天然木聚糖酶抑制劑的pI為8.5甚至更高。因此上文所提出的假設(shè)可能是正確的，就是說在IEF凝膠上有三條堿性帶，并且可能存在三種形式的木聚糖酶抑制劑。
總之，我們認為所述天然木聚糖酶抑制劑的pI在8.0-9.5的范圍內(nèi)。在該范圍內(nèi)有三條帶。這三條帶可能是相當于可能是以三種形式存在的木聚糖酶抑制劑(參見用IEF測定的結(jié)果)。就此而言，在使用IEF時，所述蛋白以天然蛋白形式運行，但是某些二肽蛋白可能被該技術(shù)部分破壞，因此產(chǎn)生了一條以上的帶。
序列資料對構(gòu)成所述抑制劑的兩種肽進行測序，得到N-末端和內(nèi)部序列。所得到的結(jié)果以序列13-19的形式提供在所附序列表中。
構(gòu)成第1條鏈(鏈A)的序列用序列13和14表示。構(gòu)成第2條鏈(鏈B)的序列用序列15-19表示。
對測序的多肽所作的數(shù)據(jù)庫同源性檢索呈陰性。以前尚沒有對所述多肽的任一種進行過測序或披露。
抑制劑對不同木聚糖酶的作用進行了若干實驗，以便研究不同木聚糖酶的抑制作用。首先，我們認為木聚糖酶活性的降低是由于提取物中的蛋白降解活性。因此，讓不同的木聚糖酶與不同體積的“抑制劑”提取物一起培養(yǎng)(圖19)。發(fā)現(xiàn)所述木聚糖酶受到了不同程度的抑制。我們還發(fā)現(xiàn)似乎作用的增強受“抑制劑”濃度的影響。
圖19所示結(jié)果表明，所述降低是由于蛋白水解或抑制劑。不過，用穩(wěn)定的木聚糖酶和抑制劑濃度進行的時間進程實驗以及上述在“分析蛋白酶活性”條件下獲得的結(jié)果未能證實降低的活性受時間影響。為了能夠區(qū)分蛋白酶和抑制劑，必須進行真實的動力學(xué)(參見“抑制劑動力學(xué))。
對兩種枯草芽孢桿菌木聚糖酶的有關(guān)烘烤的特性進行了相關(guān)性研究。這兩種木聚糖酶在其作用方面差別不大，這表明其中的一種在以相同的劑量烘烤時能達到略微高一些的比體積。一種解釋是，可能其活性在面粉中受到不同的抑制。因此，進行了一種實驗來證實這一觀點。重復(fù)該實驗兩次，使用兩種不同類型的面粉作為抑制劑的來源(表14)。
表14從兩種面粉(98002和98020)中提取的抑制劑對兩種木聚糖酶(9806001和980603)的抑制作用。抑制作用是以與空白相比較的百分抑制作用和百分殘余活性形式計算的。

以上實驗證實，這兩種木聚糖酶受到所述抑制劑的不同程度的抑制。所述木聚糖酶僅有6個氨基酸的差別。
基于980601，制備了三種木聚糖酶突變體(XM1、XM2和XM3)。分析了這三種突變型的抑制作用(圖20)。
從圖20可以看出，這三種突變體的殘余活性不同，這表明它們受到所述木聚糖酶抑制劑的不同程度的抑制。五種木聚糖酶中的四種(BX，Rohm，XM1和XM2)具有相同的比活性(大約25000TXU/毫克蛋白)。預(yù)計XM2具有相同的比活性。
XM1和XM2之間抑制作用的差別為大約250％(XM1的殘余活性比XM2的殘余活性高2.5％)，這種差別是由于一個氨基酸而造成的。XM2上的氨基酸122從精氨酸變成了天冬酰胺，在靠近其活性位點的部位引入了較弱的正電荷。
抑制劑動力學(xué)進行了簡單的初步動力學(xué)研究。僅能夠確定所述抑制劑是競爭性的還是非競爭性的。
用不同量的底物與相同量的木聚糖酶-和抑制劑濃度培養(yǎng)(圖21)。從圖21可以看出，有和沒有抑制劑的木聚糖酶的Vmax均大約為1.19。這表明抑制作用是競爭性的。
由于上述初步抑制劑實驗證實了研究過的木聚糖酶之間Ki的差別。測定了若干種木聚糖酶的實際Ki。從圖22中的數(shù)據(jù)可以看出，所述木聚糖酶之間的Ki值沒有明顯差別。這證實了通過所述簡單的初步抑制劑鑒定所得出的結(jié)果。
pH對抑制作用的影響在不同pH下對木聚糖酶抑制劑所做的簡單的估樣檢查發(fā)現(xiàn)，pH似乎能影響木聚糖酶的抑制作用。因此，設(shè)計了一種實驗來驗證這種作用。從圖23可以看出，對木聚糖酶的抑制作用受pH的影響。圖24說明了所述木聚糖酶的最佳pH。如果比較以上兩條曲線，我們可以看出，對木聚糖酶的最大抑制作用出現(xiàn)在最佳pH處，唯一的另外是Novo木聚糖酶(980901)的pH4測定。
為了確定本文所披露的在所述測定中測定的抑制作用的比例與面團相關(guān)，可以進行某些計算抑制劑提取克 6面粉毫升水 12g0.5面粉/毫升測定的面粉g0.05木聚糖酶溶液TXU/ml 12測定的TXU/ml3抑制劑木聚糖酶比例
TXU/kg面粉60000抑制劑測定TXU/kg面粉3000 烘烤應(yīng)用根據(jù)以上計算，在該測定中抑制劑木聚糖酶的比例可以計算為比在面團中的比例低20倍。這僅僅意味著木聚糖酶在面團中必須受到更強的抑制。不過，在面團中的遷移性和水活性也更低，并且這會影響其抑制作用。
一般討論小麥面粉含有內(nèi)源內(nèi)切-β-1，4-木聚糖酶抑制劑。這種抑制劑可以通過用水進行簡單的提取從小麥面粉中提取，這表明該抑制劑是水溶性的。用凝膠過濾、離子交換、和疏水性相互作用層析計算對該抑制劑進行純化。
用分析凝膠過濾層析、SDS PAGE、反向?qū)游龊蚆S鑒定純化抑制劑，發(fā)現(xiàn)了一種大約為40KDa的多肽。這種多肽是一種二肽，它含有分子量分別為12104和28222的兩種肽。對純化的抑制劑(更確切的講是以上兩種肽)進行N-末端測序，然后消化獲得肽的序列。
用所述抑制劑進行的初步實驗證實，木聚糖酶活性的降低可能是由蛋白水解作用。不過，對該抑制劑所做的培養(yǎng)實驗(木聚糖酶+抑制劑)和動力學(xué)分析證實，所觀察到的木聚糖酶活性的降低是由于競爭性抑制劑。
用若干種木聚糖酶進行的抑制劑實驗證實了對該抑制劑敏感性的差別。某些木聚糖酶幾乎能受到該抑制劑100％的抑制(抑制劑木聚糖酶的比例低于在面粉中的比例。通過改變抑制劑測定中的pH，發(fā)現(xiàn)其抑制作用高度依賴于測定中的pH。檢驗?zāi)揪厶敲傅耐蛔凅w發(fā)現(xiàn)，改變一個氨基酸能夠?qū)е乱种谱饔糜?50％的降低。
為了證實以上結(jié)果，測定了若干種木聚糖酶的Ki值。結(jié)果證實，不同的Ki取決于所使用的木聚糖酶。證實了對該抑制劑承受能力的差別受木聚糖酶的影響，正如在初步結(jié)果中所觀察到的。
例3烘烤試驗以下的數(shù)據(jù)來自用XM1突變體進行的烘烤試驗。這些數(shù)據(jù)表明，這種新型木聚糖酶突變體在體積方面明顯優(yōu)于BX(枯草芽孢桿菌野生型)。根據(jù)粘性測定，在這兩種木聚糖酶之間沒有明顯差別。
酶980902(BX)在大腸桿菌中表達的純化的枯草芽孢桿菌野生型木聚糖酶(2000TXU/毫升)。
980903(XM1)在大腸桿菌中表達的純化的枯草芽孢桿菌野生型木聚糖酶(1375TXU/毫升)。
面粉丹麥面粉，批號98022。
烘烤實驗(硬面包圈)在Hopart混合妻中用鉤子糅合面粉2000克，干酵母4000克，糖32克，鹽32克，GRINDSTEDTMPANODAN A20204克，水400Brabender單位+4％，低速揉合，并高速揉合9分鐘。面粉溫度為26℃。稱量面團的重量為1350克。在30℃下放置10分鐘，然后用一個Fortuna模具進行模塑。在34℃，85％RH條件下烘烤45分鐘。在Bago爐中以220℃的溫度烘烤18分鐘，并用蒸汽蒸12秒。
在面包圈冷卻之后，進行稱量，并通過菜籽排出方法測定其體積。 粘性測定粘性測定是按照方法2進行。
從表15中可以看出，新型的木聚糖酶突變體(XM1)與BX相比能產(chǎn)生明顯較大的面包體積增加。
表15以不同劑量使用的兩種木聚糖酶(BX和XM1)對面包體積增加(毫升/克)和粘性(g×s)的影響。

以上數(shù)據(jù)表示在圖25、26和27中。
例4XM1、Rohm VERON特種木聚糖酶和Rohm VERON特種木聚糖酶的純化形式對面團粘性的影響為了確定新型木聚糖酶XM1所產(chǎn)生的面團粘性比Rohm VERON特種木聚糖酶(及其純化形式)是高還是低，制備了面團，并測定木聚糖酶對粘性的影響。
面粉使用丹麥面粉98022。
面團制備按方法2所述制備面團。在混合之后，在粘性測定之前，在密封的容器中分別放置面團10分鐘和45分鐘。
粘性測定粘性測定是按方法2進行的。
酶980903(XM1)在大腸桿菌表達的純化的枯草芽孢桿菌野生型木聚糖酶的突變體(1375TXU/毫升)。
#2199Rohm VERON特種木聚糖酶(10500TXU/克)。
980603(Rohm)Frimond’s Belase木聚糖酶的純化制劑(與Rohm’s相同)(1050TXU/毫升)。
制備以下面團(表16)。
表16為了測定粘性而制備的面團

表16中的面團所得到的粘性結(jié)果在表17中示出。
表17對用純化的Rohm木聚糖酶、對照、XM1和Rohm VERON特種木聚糖酶制備的面團進行粘性測定得到的結(jié)果。

以上數(shù)據(jù)表示在圖28、29和30中。使用XM1所導(dǎo)致的粘性增加低于使用純化的Rohm木聚糖酶所導(dǎo)致的粘性增加。用未純化的Rohm木聚糖酶所獲得的粘性增加更高。
例5細菌內(nèi)切-β-1，4-葡聚糖酶對面團粘性的影響以下結(jié)果來自為了研究細菌內(nèi)切-β-1，4-葡聚糖酶產(chǎn)生粘性的能力而設(shè)計的實驗。
酶981102-1(Xy1)相當于來自產(chǎn)品Veron Special的Rohm’s細菌木聚糖酶的純化制劑。該制劑是純的木聚糖酶，并且不含有任何內(nèi)切-β-1，4-葡聚糖酶(350TXU/毫升)。
981102-2(Xy1+Glu)相當于來自產(chǎn)品Veron Special的Rohm’s細菌木聚糖酶的純化制劑，含有內(nèi)切-β-1，4-葡聚糖酶(900TXU/毫升+19BGU/毫升)。
木聚糖酶測定木聚糖酶測定是按方法1進行的。
葡聚糖酶測定葡聚糖酶測定是按方法4進行的。
面粉使用丹麥面粉，批號為98058。在400BG下的吸水率為60％。
面團制備按方法2所述制備面團。在混合之后，在30℃下，在密封的容器中將面團分別放置10分鐘和45分鐘。
粘性測定粘性測定按方法2進行。
制備表18中所列舉的面團，并檢測其粘性。
表18為了檢測粘性而制備的面團

表18所列舉的面團的粘性結(jié)果如表19所示。
表19粘性結(jié)果來自使用木聚糖酶和木聚糖酶+葡聚糖酶的面團面團編號是指表18中的面團編號Stik-10表示10分鐘之后得到的粘性測定結(jié)果Stik-45在放置45分鐘之后的測定結(jié)果

從表19可以看出，向面團中添加內(nèi)切-β-1，4-葡聚糖酶可以提高面團的粘性。表19的結(jié)果表示在圖31中。
總結(jié)總而言之，本發(fā)明特別提供了a.從小麥面粉中分離內(nèi)源內(nèi)切-β-1，4木聚糖酶抑制劑。
b.鑒定從小麥面粉中分離的內(nèi)源內(nèi)切-β-1，4木聚糖酶抑制劑。
c.鑒定內(nèi)源內(nèi)切-β-1，4木聚糖酶抑制劑對不同木聚糖酶的作用。
d.一種篩選不會受到內(nèi)源內(nèi)切-β-1，4木聚糖酶抑制劑負面影響的木聚糖酶的方法。
e.一種篩選不會受到內(nèi)切-β-1，4木聚糖酶抑制劑的負面影響的木聚糖酶的方法。
f.與含有真菌木聚糖酶的面團相比能提供具有有利的體積和可接受的粘性的木聚糖酶。
g.一種用于篩選木聚糖酶和/或用一種內(nèi)源內(nèi)切-β-1，4木聚糖酶抑制劑誘變該木聚糖酶的方法，并將所述木聚糖酶或其突變體用于生產(chǎn)面團。
h.用本發(fā)明的木聚糖酶制備的食品。
在以上說明中所提到的所有文獻被收作本文參考。在不脫離本發(fā)明范圍和構(gòu)思的前提下，對所述本發(fā)明和系統(tǒng)所做的各種改進和改變對本領(lǐng)域技術(shù)人員來說是顯而易見的。盡管業(yè)已結(jié)合特定的優(yōu)選實施方案對本發(fā)明進行了說明，應(yīng)當理解的是，要求保護的本發(fā)明不受所述特定實施方案的限定。實際上，對所述實施本發(fā)明的方案所做的在生物化學(xué)和生物技術(shù)或相關(guān)領(lǐng)域技術(shù)人員看來顯而易見的各種改進都包括在以下權(quán)利要求書的范圍內(nèi)。
權(quán)利要求
1.一種氨基酸序列，包括序列7、序列9或序列11所示氨基酸序列的任一種、或其變體、同系物或片段。
2.一種編碼權(quán)利要求1所述氨基酸序列的核苷酸序列。
3.一種核苷酸序列，選自(a)包括序列8、序列10或序列12所示核苷酸序列任一種的核苷酸序列或其變體、同系物或片段；(b)序列8、序列10或序列12所示任一種核苷酸序列或其互補物；(c)能夠與序列8、序列10或序列12所示核苷酸序列的任一種或其片段雜交的核苷酸序列；(d)能夠與序列8、序列10或序列12所示核苷酸序列的任一種或其片段的互補物雜交的核苷酸序列；和(e)由于遺傳密碼的簡并性而作為(a)、(b)、(c)或(d)所述核苷酸的簡并物的核苷酸序列。
4.如權(quán)利要求2或權(quán)利要求3的核苷酸序列，可操作地連接于一個啟動子上。
5.一種含有權(quán)利要求2-4中任一項所述的核苷酸序列的載體。
6.一種轉(zhuǎn)化宿主細胞，含有權(quán)利要求2-5中任一項所述的核苷酸序列。
7.一種宿主細胞，含有權(quán)利要求2-5中任一項所述的核苷酸序列，其中，所述核苷酸序列與該細胞的基因組異源。
8.一種制備權(quán)利要求1的氨基酸的方法，包括表達權(quán)利要求2-4中任一項所述的合適的核苷酸序列。
9.將序列7、9、11所示任一種氨基酸序列或其變體、衍生物或同系物用于制備食品，優(yōu)選制備烘烤食品或用于生產(chǎn)食品的物料(例如，面團)的用途。
10.將序列5或其變體、衍生物或同系物的任一種所示氨基酸序列用于制備食品、或用于生產(chǎn)食品的物料(例如，面團)的用途。
11.一種食品，如烘烤食品或用于生產(chǎn)烘烤食品的物料(例如面團)，包括序列7、9、11所示任一種氨基酸序列或其變體、衍生物或同系物或用它們制備。
12.一種烘烤食品，或用于生產(chǎn)烘烤食品的物料(例如面團)，包括序列5所示氨基酸序列或其變體、衍生物或同系物，或用它們制備。
13.用含有序列3、5、7、9、11所示任一種氨基酸序列或其變體、衍生物或同系物的氨基酸序列制備一種其粘性低于含有真菌木聚糖酶的面團的面團的用途。
14.一種源于枯草芽孢桿菌的木聚糖酶或其突變體，其中，所述木聚糖酶適于制備非粘性面團。
15.一種能夠生產(chǎn)適于制備非粘性面團的木聚糖酶的枯草芽孢桿菌菌株。
16.如權(quán)利要求15的枯草芽孢桿菌，其中，所述菌株是菌株168。
17.一種源于枯草芽孢桿菌菌株的木聚糖酶，其中，所述木聚糖酶適于制備非粘性面團。
18.如權(quán)利要求17的木聚糖酶，其中，所述枯草芽孢桿菌菌株是菌株168。
19.一種木聚糖酶制劑，其中，所述木聚糖酶制劑基本上不含葡聚糖酶。
20.一種用上述任一項權(quán)利要求所述的發(fā)明制備的烘烤食品。
21.一種可以從小麥面粉中獲得的內(nèi)切-β-1，4-木聚糖酶抑制劑。
22.如權(quán)利要求21的抑制劑，其中，所述抑制劑的分子量大約為40kDa(通過MS或SDS PAGE測定)。
23.如權(quán)利要求21或22的抑制劑，其中，所述抑制劑的pI為大約8-大約9.5。
24.如權(quán)利要求21-23中任一項的抑制劑，其中，所述抑制劑包括序列13、序列14、序列15、序列16、序列17、序列18和/或序列19所示氨基酸序列或其變體、同系物或片段的一種或多種。
25.一種如權(quán)利要求21-24中任一項所述的呈分離形式的抑制劑。
26.一種用于測定木聚糖酶對木聚糖酶抑制劑的耐受程度的方法，其中，該方法包括(a)讓感興趣的木聚糖酶與上述任一項權(quán)利要求所述的抑制劑接觸；(b)測定所述抑制劑抑制(如果有的話)所述感興趣的木聚糖酶活性的程度。
27.一種用權(quán)利要求26的方法鑒定的木聚糖酶，其中，所述木聚糖酶對所述抑制劑具有高度的耐受性。
28.一種含有權(quán)利要求27所述木聚糖酶的食品，其中，所述食品優(yōu)選為烘烤食品。
29.一種方法，包括以下步驟(a)實施權(quán)利要求26的方法；(b)鑒定對所述抑制劑具有高度(或中度或低度)抗性的一種或多種木聚糖酶；(c)制備一定量的所鑒定的一種或多種木聚糖酶。
30.一種方法，包括以下步驟(a)實施權(quán)利要求26的方法；(b)鑒定對所述抑制劑具有高度(或中度或低度)抗性的一種或多種木聚糖酶；(c)制備一種含有所述一種或多種鑒定的木聚糖酶的面團。
31.一種用于鑒定適用于制備烘烤食品的細菌木聚糖酶或其突變體的方法，該方法包括(a)將感興趣的細菌木聚糖酶摻入面團混合物中；(b)測定所得到的面團混合物的粘性；以便所述細菌木聚糖酶或其突變體適用于制備烘烤食品，條件是所得到的面團混合物的粘性低于含有真菌木聚糖酶的類似面團混合物的粘性。
32.一種烘烤食品，含有用權(quán)利要求31的方法鑒定的合適的細菌木聚糖酶或其突變體，其中，所述食品優(yōu)選為烘烤食品。
33.一種方法，包括以下步驟(a)實施權(quán)利要求32的方法；(b)鑒定適用于制備烘烤食品的一種或多種木聚糖酶；(c)制備一定量的所鑒定的一種或多種木聚糖酶。
34.一種方法，包括以下步驟(a)實施權(quán)利要求32的方法；(b)鑒定適用于制備烘烤食品的一種或多種木聚糖酶；(c)制備含有所鑒定的一種或多種木聚糖酶的面團。
35.能夠用權(quán)利要求32的方法鑒定為適于制備非粘性的面團的細菌木聚糖酶或其突變體的用途。
36.一種用于鑒定適用于制備烘烤食品的木聚糖酶組合物或?qū)⒁谄渲兄苽淠揪厶敲傅慕橘|(zhì)或待向其中添加木聚糖酶的介質(zhì)的方法，該方法包括(a)提供一種含有感興趣的木聚糖酶的組合物或?qū)⒁谄渲兄苽淠揪厶敲傅慕橘|(zhì)或待向其中添加木聚糖酶的介質(zhì)；和(b)測定所述組合物或介質(zhì)中活性葡聚糖酶的存在；這樣，如果在所述組合物或介質(zhì)中至多存在低含量的活性葡聚糖酶的話，該組合物或介質(zhì)適用于制備烘烤食品。
37.一種含有用權(quán)利要求16的方法鑒定的合適的組合物或介質(zhì)的食品，其中，所述食品優(yōu)選為烘烤食品。
38.一種方法，包括以下步驟(a)實施權(quán)利要求36的方法；(b)鑒定適用于制備烘烤食品的一種或多種所鑒定組合物或介質(zhì)；(c)制備一定量的所鑒定的一種或多種組合物或介質(zhì)。
39.一種方法，包括以下步驟(a)實施權(quán)利要求36的方法；(b)鑒定適用于制備烘烤食品的一種或多種組合物或介質(zhì)；和(c)制備含有所鑒定的一種或多種組合物或介質(zhì)的面團。
40.能夠用權(quán)利要求36的方法鑒定為適于制備非粘性面團的組合物或介質(zhì)的用途。
41.一種方法，包括(a)測定小麥面粉中權(quán)利要求21-24中任一項所述抑制劑的含量，所述小麥面粉可以是小麥面粉本身或者可以存在于含有小麥面粉的介質(zhì)中；(b)篩選適于添加到所述小麥面粉中的木聚糖酶和/或篩選適于添加到所述小麥面粉中的木聚糖酶的用量；和(c)將所述合適的木聚糖酶和/或合適用量的木聚糖酶添加到所述小麥面粉中。
42.一種組合方法，包括包括權(quán)利要求26的方法的第一步驟和包括權(quán)利要求31的方法的第二步驟。
43.一種組合方法，包括以下步驟中的兩個或兩個以上包括權(quán)利要求26的方法的第一步驟，包括權(quán)利要求31的方法的第二步驟，包括權(quán)利要求36的方法的第三步驟，和包括權(quán)利要求41的方法的第四步驟。
全文摘要
本發(fā)明披露了一種內(nèi)切－β－l,4－木聚糖酶抑制劑以及木聚糖酶。
文檔編號A21D2/26GK1342197SQ99816179
公開日2002年3月27日 申請日期1999年12月17日 優(yōu)先權(quán)日1998年12月23日
發(fā)明者O·斯貝森, J·F·索倫森 申請人:丹尼斯科有限公司