專利名稱：多肽的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及多肽，更具體地，具有纖維素降解活性的多肽，其有助于生物量的有益應(yīng)用。本發(fā)明也涉及通過(guò)基因工程對(duì)產(chǎn)生上述多肽有用的基因。
背景技術(shù)：
纖維素用(C6H10O5)n表示。含有纖維素并作為主要成分的物質(zhì)有，以樹(shù)木為例，如松樹(shù)、香柏、山毛櫸和白楊；以莖和韌皮為例，如大麻、紙灌木、稻桿、蔗渣和谷殼；種子絨毛如棉花；舊紙張例如報(bào)紙、雜志和起皺的厚紙板廢紙；其他的纖維廢物；還有纖維素粉和類(lèi)似物。近來(lái)，辦公室的舊紙張開(kāi)始增多。
纖維素分子的結(jié)構(gòu)是D-吡喃葡萄糖通過(guò)β-1，4鍵相連并且沒(méi)有側(cè)鏈。因此，纖維素由葡萄糖組成，其可作為用于酒精發(fā)酵的原材料。如果能將纖維素降解為葡萄糖，從舊紙張或纖維廢物中，制造用作燃料或類(lèi)似物的酒精就將成為可能。
已經(jīng)將通過(guò)酸方法或酶方法將纖維素水解為葡萄糖作為降解(糖化)纖維素的方法。在酸方法中，將纖維素與鹽酸或硫酸接觸，劇烈降解纖維團(tuán)塊。因?yàn)殡y于適當(dāng)判定該水解狀態(tài)，在強(qiáng)酸存在的情況下，此產(chǎn)生的葡萄糖可繼續(xù)反應(yīng)。因此，該酸方法具有難以高產(chǎn)量回收葡萄糖或類(lèi)似的問(wèn)題。所以，現(xiàn)在還沒(méi)有實(shí)際應(yīng)用該酸方法。相反地，應(yīng)用纖維素水解酶的酶方法具有高度反應(yīng)選擇性，并且就環(huán)境保護(hù)而言是有優(yōu)勢(shì)的。因此該酶方法已成為水解方法的主要方法。多種方法已有報(bào)道[Wood，B.E.，等人，生物技術(shù)進(jìn)展(BiothechnologyProgress)，13223-237(1997)；美國(guó)專利號(hào)5，508，183；ZhaoXin，等人，酶微生物技術(shù)(Enzyme Microbial Technology)，1562-65(1993)，等等]。
纖維素水解酶，例如有內(nèi)切葡聚糖酶(EC 3.2.1.4)、β-D-葡糖苷酶(EC3.2.1.21)、外切-1，4-β-D-葡糖苷酶(EC3.2.1.74)和纖維二糖水解酶(EC3.2.1.91)。內(nèi)切葡聚糖酶的推薦名稱是纖維素酶，并且該系統(tǒng)名稱是1，4-(1，3，1，4)-β-D-葡聚糖3(4)-葡聚糖水解酶。
經(jīng)常將含有內(nèi)切葡聚糖酶、β-D-葡糖苷酶、外切-1，4-β-D-葡糖苷酶、維維水解酶和類(lèi)似物的混合物用于水解纖維素。這些酶協(xié)同作用于纖維素，將其降解成葡萄糖。已知有多種關(guān)于該作用方式的學(xué)說(shuō)。Murao等人，已經(jīng)推薦以下模型。首先，通過(guò)內(nèi)切葡聚糖酶作用，將斷裂導(dǎo)入纖維素的非-結(jié)晶區(qū)域。在破壞該晶體時(shí)，纖維二糖水解酶作用于該裂隙。通過(guò)內(nèi)切葡聚糖酶和纖維二糖水解酶的作用產(chǎn)生寡糖。通過(guò)β-D-葡糖苷酶的作用將寡糖降解，產(chǎn)生葡萄糖[Sawao Murao等人，“纖維素酶(Cellulase)”，pp.102-104，Kodansha(May10，1987)]大多數(shù)情況下，纖維素不以單纖維素鏈的形式存在。形成許多纖維素鏈通過(guò)氫鍵結(jié)合的結(jié)構(gòu)。在此結(jié)構(gòu)中，有其中許多纖維素鏈密集積聚的結(jié)晶區(qū)域和其中纖維素鏈散置的非-結(jié)晶區(qū)域。在酶方法的水解反應(yīng)中，限速步驟是在結(jié)晶區(qū)域分離和分散許多纖維素鏈的步驟。相應(yīng)地，在高溫下進(jìn)行酶降解反應(yīng)具有以下好處(1)因?yàn)槔w維素晶體易于破壞，該反應(yīng)高效進(jìn)行；(2)各種細(xì)菌污染的危險(xiǎn)性很小；并且(3)在需要加熱的工業(yè)過(guò)程中，在酶反應(yīng)之前毋需冷卻。
已知取自激烈熱球菌(Pyrococcus furiosus)的β-D-葡糖苷酶、取自熱球菌SP.的β-D-葡糖苷酶、內(nèi)切葡聚糖酶和取自海棲熱袍菌(Thermotoga Maritima)、取自那不勒斯棲熱袍菌(ThermotogaNeapolitana)及其類(lèi)似菌的內(nèi)切葡聚糖酶和β-D-葡糖苷酶為取自極嗜熱生物的纖維素水解酶。[Bauer等人，現(xiàn)代生物技術(shù)評(píng)論(CurrentOpinion In Biotechnology)，9141-145]。描述取自極嗜熱生物的β-D-葡糖苷酶基因克隆，例如，見(jiàn)美國(guó)專利號(hào)5,744,345。描述取自極嗜熱生物的內(nèi)葡聚糖酶基因克隆，例如，見(jiàn)WO97/44361。
已經(jīng)從嗜熱菌、棲熱袍菌sp.EJSS-B.1分離出纖維二糖水解酶[Ruttersmith，等人，生物化學(xué)雜志(Biochemical Journal)，277887-890(1991)]。因?yàn)樵撁傅睦w維二糖的抑制常數(shù)(Ki)是低的(0.2mM)，所以該酶易于產(chǎn)生抑制作用。應(yīng)用4-甲基繖形基-β-D-纖維二糖苷作為底物的特異活性的是3.6U/mg。而且，因?yàn)樵摷?xì)菌需在高溫厭氧狀況下進(jìn)行培養(yǎng)，大量地工業(yè)生產(chǎn)該酶是困難的。再者，該酶不能通過(guò)基因工程產(chǎn)生，因?yàn)檫€未克隆編碼該酶的基因。
發(fā)明目的本發(fā)明的該主要目的是提供對(duì)纖維二糖具有高抑制常數(shù)和具有熱抵抗性的纖維二糖水解酶，以及低成本生產(chǎn)上述纖維二糖水解酶的方法。發(fā)明概述已經(jīng)測(cè)定出全部堀越熱球菌OT3(Pyrococcus Horikoshii OT3)基因組DNA的核苷酸序列[Kawarabayasi，等人，DNA研究(DNAResearch)，555-76(1998)；Kawarabayasi，等人，DNA研究，5147-155(1998)]。已經(jīng)公布一些蛋白質(zhì)在氨基酸序列中，與由各自開(kāi)放閱讀框架獲得的蛋白質(zhì)具有同源性。(http//www.bio.nite.go.jp/ot3db_index.html)。根據(jù)與編碼在此目錄中已知纖維素水解酶的核酸同源性的比較，已經(jīng)預(yù)言在堀越熱球菌OT3基因組中編碼例如α-淀粉酶、α-甘露糖苷酶、β-D-半乳糖苷酶、β-D-糖苷酶、β-D-甘露糖苷酶和內(nèi)切葡聚糖酶多肽的開(kāi)放閱讀框架的存在。但是還未預(yù)言與編碼已知的纖維二糖水解酶的核酸具有同源性的開(kāi)放閱讀框架的存在。
經(jīng)過(guò)深入細(xì)致的研究，本發(fā)明者發(fā)現(xiàn)在堀越熱球菌OT3基因組中存在編碼具有纖維二糖水解酶酶活性的多肽的開(kāi)放閱讀框架(PH1171)。意想不到地是，證實(shí)盡管其與多種內(nèi)切葡聚糖酶包括取自古細(xì)菌AEPIIIa的內(nèi)葡聚糖酶具有同源性，具有通過(guò)該開(kāi)放閱讀框架編碼的氨基酸序列的多肽具有纖維二糖水解酶活性。而且本發(fā)明者已經(jīng)建立通過(guò)基因工程產(chǎn)生該多肽的方法。因此，本發(fā)明已經(jīng)成功完成。
本發(fā)明提供如下內(nèi)容(1)具有SEQ ID NO1氨基酸序列，或具有在SEQ ID NO1氨基酸序列中一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基缺失、加入、插入和/或替換所得氨基酸序列的多肽，并且其具有纖維二糖水解酶活性；(2)上述(1)中的多肽，其具有熱穩(wěn)定性纖維二糖水解酶活性；(3)編碼上述(1)或(2)中的多肽的核酸；(4)上述(3)中的核酸，其具有SEQ ID NO2核苷酸序列；(5)編碼具有纖維二糖水解酶活性的多肽的核酸，其能在嚴(yán)格的條件下與上述(3)中的核酸序列雜交；
(6)上述(5)中的核酸，其編碼具有熱穩(wěn)定性纖維二糖水解酶活性的多肽；(7)含有上述(3)至(6)中任一項(xiàng)的核酸的重組DNA；(8)用上述(7)中的重組DNA轉(zhuǎn)化的轉(zhuǎn)化體；(9)產(chǎn)生上述(1)中多肽的方法，該方法包括培養(yǎng)上述(8)中的轉(zhuǎn)化體和從培養(yǎng)物中收集具有纖維二糖水解酶活性的多肽；(10)降解通過(guò)β-1，4鍵相連的D-吡喃葡萄糖聚合物的方法，該方法包括使上述(1)中的多肽作用于通過(guò)β-1，4鍵相連的D-吡喃葡萄糖聚合物，以釋放纖維二糖；(11)具有纖維二糖水解酶活性和對(duì)纖維二糖的抑制常數(shù)Ki大于或等于10mM的多肽；和(12)上述(11)中的多肽，其在95℃ 5小時(shí)的處理后，能保持20％或更多的纖維二糖水解酶活性。
附圖簡(jiǎn)述

圖1圖示本發(fā)明之多肽的CMC-降解活性與反應(yīng)pH的關(guān)系。
圖2圖示本發(fā)明之多肽的CMC-降解活性與反應(yīng)溫度的關(guān)系。
圖3圖示反應(yīng)混合物中NaCL濃度對(duì)本發(fā)明之多肽的CMC-降解活性的影響。
圖4圖示當(dāng)該多肽在95℃加熱10分鐘時(shí)，該處理pH與本發(fā)明之多肽的CMC-降解活性的關(guān)系。
圖5圖示當(dāng)該多肽在95℃加熱時(shí)，該處理時(shí)間與本發(fā)明之多肽的CMC-降解活性的關(guān)系。
圖6圖示本發(fā)明之多肽的pNPC-降解活性與本發(fā)明之多肽用量的關(guān)系。
圖7圖示多種試劑對(duì)本發(fā)明之多肽的pNPC-降解活性的影響。
發(fā)明詳述1.本發(fā)明之多肽本發(fā)明之多肽的特征是具有SEQ ID NO1氨基酸序列，或具有在SEQ ID NO1氨基酸序列中一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基缺失、加入、插入和/或替換所得氨基酸序列，并且具有纖維二糖水解酶活性。
在此處應(yīng)用，纖維二糖水解酶活性是指水解由β-1，4鍵相連的D-吡喃葡萄糖組成的多糖或寡糖、由β-1，4鍵相連的D-葡萄糖的二糖中的糖苷鍵以產(chǎn)生纖維二糖的活性，但是不水解在纖維素中的糖苷鍵。通過(guò)已知的方法，舉例說(shuō)明用于檢測(cè)纖維二糖水解酶活性的方法，其中應(yīng)用磷酸膨脹纖維素作為底物進(jìn)行酶反應(yīng)，并且通過(guò)薄層硅膠層析證實(shí)在反應(yīng)中纖維二糖的存在。
本發(fā)明之多肽具有纖維二糖水解酶活性。該多肽可具有其它糖苷酶活性，例如內(nèi)切葡聚糖酶活性和β-D-糖苷酶活性。
在一實(shí)施例中，具有熱穩(wěn)定性纖維二糖水解酶活性是本發(fā)明之多肽的特征。
本文中所用“熱抵抗性”是指多肽具有酶活性，在一段需要降解纖維素的時(shí)間內(nèi)，從生物量生產(chǎn)酒精的工業(yè)進(jìn)程中，其在高溫情況下進(jìn)行溫育時(shí)不發(fā)生不可逆變性。本文所用不可逆變性是指永久和完全的酶活性的喪失。下文中，具有熱抵抗性的纖維二糖水解酶活性是指熱穩(wěn)定性纖維二糖水解酶活性。盡管未特意對(duì)本發(fā)明加以限定，在75℃ 20分鐘、95℃ 10分鐘或95℃ 5小時(shí)的處理后，具有SEQ ID NO1氨基酸序列的該多肽保持80％或更多的纖維二糖水解酶活性。而且，在如90℃或更高，或100℃或更高的高溫條件下，該多肽仍表現(xiàn)出纖維二糖水解酶。在95℃ 5小時(shí)的處理后，具有熱穩(wěn)定性纖維二糖水解酶活性的本發(fā)明之多肽，保持優(yōu)選地20％或更多的、更優(yōu)選地40％或更多的、最優(yōu)選地80％或更多的纖維二糖水解酶活性。
作為本發(fā)明該多肽實(shí)施例的具有SEQ ID NO1氨基酸序列的多肽，具有從，例如磷酸膨脹纖維素或纖維寡糖中產(chǎn)生纖維二糖的活性。該多肽熱穩(wěn)定性纖維二糖水解酶活性的最佳pH為5到6.5。在65℃到113℃該多肽表現(xiàn)熱穩(wěn)定性纖維二糖水解酶活性。該多肽具有高熱抵抗性。在底物存在時(shí)，在pH6、95℃下，加熱5小時(shí)后，其保持大約90％的活性。在另外加熱24小時(shí)后，大約80％的該活性得以保持。在無(wú)底物時(shí)，在95℃、pH5-7將該多肽加熱10分鐘時(shí)，該活性未曾降低。應(yīng)用4-甲基繖形基-β-D-纖維二糖苷作為底物，在98℃、pH6.0下20分鐘的反應(yīng)中，當(dāng)進(jìn)行該提純的多肽的纖維二糖水解酶活性測(cè)定時(shí)，該比活性為17.0U/mg。
該多肽可作用于羧甲基纖維素(CMC)或纖維寡糖。也可以將糖還原端的量作為指數(shù)，檢測(cè)該多肽的纖維二糖水解酶活性，其還原端是以CMC或纖維寡糖作為底物產(chǎn)生的。該多肽也作用于發(fā)色團(tuán)底物，例如對(duì)硝基苯基-β-D-纖維二糖苷，或作用于熒光底物，例如，4-甲基繖形基-β-D-纖維二糖苷。因此通過(guò)檢測(cè)反應(yīng)中產(chǎn)生的發(fā)色團(tuán)或熒光物質(zhì)的量，可方便地檢測(cè)該多肽的纖維二糖水解酶活性。
在0.5-1.0M NaCl存在的情況下，該多肽表現(xiàn)最大熱穩(wěn)定性纖維二糖水解酶活性。無(wú)NaCl存在，該多肽表現(xiàn)在0.5M NaCl存在情況下的大約80％的表現(xiàn)活性。在2.5M NaCl存在的情況下，該多肽表現(xiàn)在0.5M NaCl存在情況下的大約60％的表現(xiàn)活性。因此，NaCl濃度對(duì)熱穩(wěn)定性纖維二糖水解酶活性的影響是很小的。
在一實(shí)施方案中，反應(yīng)產(chǎn)物，例如，纖維二糖或葡萄糖對(duì)本發(fā)明之多肽的纖維二糖水解酶活性的抑制作用是很小的。該多肽對(duì)纖維二糖的抑制常數(shù)(Ki)優(yōu)選大于或等于10mM，更優(yōu)選大于或等于30mM，最優(yōu)選大于或等于100mM。例如，含有SEQ ID NO1氨基酸序列的本發(fā)明之多肽對(duì)纖維二糖的抑制常數(shù)為212mM。在本發(fā)明之前，未知有對(duì)纖維二糖具有如此高抑制常數(shù)的多肽。幾乎沒(méi)有發(fā)現(xiàn)葡萄糖對(duì)該活性的抑制。而且，與未存在這些試劑時(shí)相比，0.5mM Fe3+、Cu2+或Zn2+抑制大約90％的該活性，或1mM Co3+、Ca2+、Mg2+或乙二胺四乙酸抑制大約50％的該活性。幾乎未發(fā)現(xiàn)10mM二硫蘇糖醇對(duì)該活性的抑制作用。
只要其表現(xiàn)纖維二糖水解酶活性，本發(fā)明之多肽包括具有在SEQID NO1氨基酸序列中一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基的缺失、添加、插入和/或替換得來(lái)的氨基酸序列的多肽。
在自然發(fā)生的蛋白質(zhì)中可產(chǎn)生突變，例如，在氨基酸序列中氨基酸的缺失、插入、添加或替換。由于編碼該蛋白質(zhì)DNA的多態(tài)性或突變，或由于在體內(nèi)或合成后提純時(shí)蛋白質(zhì)的修飾，可產(chǎn)生這些突變。但是，已知如果這些突變的部分表現(xiàn)對(duì)該蛋白質(zhì)的活性或結(jié)構(gòu)的保留不重要的話，這些突變蛋白質(zhì)可表現(xiàn)與那些無(wú)突變的蛋白質(zhì)實(shí)質(zhì)相等的生理或生物活性。
對(duì)蛋白質(zhì)而言，將突變?nèi)斯さ匾氲鞍踪|(zhì)的氨基酸序列中是可行的。在此情況下，可能產(chǎn)生更多的突變。例如，已知用絲氨酸替換人白介素-2(IL-2)氨基酸序列中的半胱氨酸殘基得到的多肽保留白介素-2的活性(科學(xué)(Science)，2241431(1984))。
而且，已知某些蛋白質(zhì)具有對(duì)它們的活性非絕對(duì)必要的肽區(qū)域。例如，這些肽區(qū)域可以是細(xì)胞外分泌的蛋白質(zhì)中的信號(hào)肽或蛋白酶前體中發(fā)現(xiàn)的前序列。在翻譯后或轉(zhuǎn)化為活性蛋白質(zhì)時(shí)，將多數(shù)此類(lèi)區(qū)域去除。此蛋白質(zhì)具有與未去除該區(qū)域的蛋白質(zhì)不同的一級(jí)結(jié)構(gòu)，但是最終表現(xiàn)相等的功能。該SEQ ID NO1氨基酸序列是將SEQ ID NO5氨基酸序列的N-端28個(gè)氨基酸殘基的信號(hào)域去除后得到的序列。具有SEQ ID NO6核苷酸序列的核酸，編碼具有SEQ ID NO5氨基酸序列的多肽。當(dāng)培養(yǎng)具有含此核酸載體的大腸埃希氏桿菌時(shí)，將該信號(hào)肽從該表達(dá)多肽中去除，并且產(chǎn)生具有SEQ ID NO1氨基酸序列的多肽。
當(dāng)通過(guò)基因工程生產(chǎn)蛋白質(zhì)時(shí)，可將與靶蛋白質(zhì)活性無(wú)關(guān)的肽鏈添加在該蛋白質(zhì)的氨基端或羧基端。例如，為了增加靶蛋白質(zhì)的表達(dá)水平，可以制備融合蛋白質(zhì)，其中將在所用宿主中高表達(dá)的蛋白質(zhì)的部分氨基端區(qū)域添加在該氨基端區(qū)域。可選擇地，為促進(jìn)該表達(dá)蛋白質(zhì)的提純，在該靶蛋白質(zhì)的氨基或羧基端可添加對(duì)特定物質(zhì)具有親和力的肽。如果其對(duì)靶蛋白質(zhì)的活性沒(méi)有有害影響的話，可保持該添加的多肽的添加。如果需要的話，通過(guò)適宜的處理，為能夠?qū)⑵鋸陌械鞍踪|(zhì)中去除，可對(duì)其進(jìn)行操作，比如，應(yīng)用蛋白酶的限制性酶切。
這樣，只要其具有纖維二糖水解酶活性，具有在此處所示氨基酸序列(SEQ ID NO1)中一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基缺失、插入、添加和/或替換后得到的氨基酸序列的多肽包括在本發(fā)明之內(nèi)。優(yōu)選地，該多肽具有熱穩(wěn)定性纖維二糖水解酶活性和對(duì)纖維二糖的高抑制常數(shù)。
例如通過(guò)，(1)從產(chǎn)生本發(fā)明之多肽的微生物的培養(yǎng)物中提純，或(2)從含有編碼本發(fā)明之多肽的核酸的轉(zhuǎn)化體的培養(yǎng)物中提純，能夠產(chǎn)生本發(fā)明之多肽。
(1)從產(chǎn)生本發(fā)明之多肽的微生物的培養(yǎng)物中提純例如，堀越熱球菌OT3(JCM9974)是產(chǎn)生本發(fā)明之多肽的微生物，其可以在日津(物理和化學(xué)研究所)買(mǎi)到。
在適宜該微生物生長(zhǎng)的條件下培養(yǎng)該微生物。優(yōu)選地，應(yīng)用增加興趣多肽表達(dá)水平的培養(yǎng)條件。根據(jù)用于提純蛋白質(zhì)的傳統(tǒng)方法，提純?cè)诩?xì)胞中或培養(yǎng)物中產(chǎn)生的興趣多肽。
可將傳統(tǒng)用于培養(yǎng)超嗜熱菌的方法用于上述的細(xì)菌株的培養(yǎng)。將細(xì)菌株可利用的營(yíng)養(yǎng)成分加入培養(yǎng)基中。例如，淀粉可用作碳源，胰胨、蛋白胨和酵母提取物可作為氮源?？蓪⒔饘冫}，例如，鎂鹽、鈉鹽或鐵鹽加入培養(yǎng)基中作為微量元素。而且，例如，將人工海水用于培養(yǎng)基的制備可以是有益的。需要不含固體緩沖劑的干凈培養(yǎng)基。應(yīng)用此培養(yǎng)基，通過(guò)檢測(cè)培養(yǎng)物的濁度，可隨時(shí)進(jìn)行細(xì)胞生長(zhǎng)的檢測(cè)。
該培養(yǎng)可以是直立式或旋轉(zhuǎn)式培養(yǎng)。例如，可應(yīng)用如在應(yīng)用和環(huán)境微生物(Applied and Environmental Microbiology)552086-2088(1992)中描述的透析培養(yǎng)方法。一般地，該培養(yǎng)溫度優(yōu)選95℃。培養(yǎng)大約16小時(shí)后，明顯數(shù)量的多肽常常在培養(yǎng)物中積聚。為使多肽的生產(chǎn)能力最大化，依據(jù)該細(xì)胞或所用培養(yǎng)基的成分來(lái)判定該培養(yǎng)狀態(tài)是優(yōu)選的。
為獲取多肽，首先制備無(wú)細(xì)胞提取物。例如，通過(guò)離心、濾過(guò)或類(lèi)似方法，從培養(yǎng)物中收集細(xì)胞，然后破壞細(xì)胞，可制備無(wú)細(xì)胞提取物?？蓮某曁幚?、應(yīng)用磁珠破裂、用裂解酶處理、應(yīng)用表面活性劑和類(lèi)似物處理的方法中，選擇提取該目標(biāo)酶的高效的細(xì)胞破裂方法。如果該多肽分泌至培養(yǎng)物中，通過(guò)硫酸銨鹽析、超濾或類(lèi)似的方法使該多肽濃縮。該濃縮的多肽用作無(wú)細(xì)胞提取物。傳統(tǒng)的提純蛋白質(zhì)的方法可用于將多肽從獲得的無(wú)細(xì)胞培養(yǎng)物中分離。例如，可將硫酸銨鹽析、離子交換層析、疏水層析、凝膠濾過(guò)層析及類(lèi)似的方法結(jié)合應(yīng)用。
(2)從含有編碼本發(fā)明之多肽核酸的重組DNA轉(zhuǎn)化的轉(zhuǎn)化體培養(yǎng)物中進(jìn)行的提純典型的編碼本發(fā)明之多肽的核酸序列如SEQ ID NO2中所示。從SEQ ID NO2核苷酸序列推算的本發(fā)明之多肽的氨基酸序列見(jiàn)于SEQ ID NO1中。這樣，關(guān)于本發(fā)明獲得的多肽典型的氨基酸序列見(jiàn)于SEQ ID NO1中。
該轉(zhuǎn)化的宿主不局限于某一種，例如可以是，大腸埃希氏桿菌、枯草芽孢桿菌、酵母和絲狀真菌。
例如，應(yīng)用含有pECEL211的大腸埃希氏桿菌BL21、在T7啟動(dòng)子下游連接SEQ ID NO6的質(zhì)?？色@得本發(fā)明之多肽。從SEQ ID NO6核苷酸序列推算的本發(fā)明之多肽的氨基酸序列見(jiàn)于SEQ ID NO5中。將用pECEL211轉(zhuǎn)化的大腸埃希氏桿菌JM109命名為大腸埃希氏桿菌JM109/pECEL211，并于1998年12月11日將其保藏在通商產(chǎn)業(yè)省工業(yè)技術(shù)院生命工學(xué)人體技術(shù)研究所，日本茨城縣筑波市東1丁目1番3號(hào)，保藏號(hào)為FERM P-17075，1999年11月15日根據(jù)布達(dá)佩斯條約轉(zhuǎn)為國(guó)際保藏，保藏號(hào)為FERM BP-6939。
在傳統(tǒng)培養(yǎng)條件下，如，37℃下在含有100μg/ml氨芐青霉素的LB培養(yǎng)基(10g/l胰胨、5g/l酵母提取物、5g/l NaCl、pH7.2)中，通過(guò)培養(yǎng)具有pECEL211的大腸埃希氏桿菌BL21(DE3)直至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，向其加入終濃度0.1mM的異丙基-β-D-硫代半乳吡喃糖苷，并且在15℃下再行培養(yǎng)，可在培養(yǎng)細(xì)胞中表達(dá)該多肽。
在培養(yǎng)后，通過(guò)離心收集細(xì)胞，應(yīng)用超聲破壞細(xì)胞并通過(guò)離心收集上清液，可將該上清液用作無(wú)細(xì)胞提取物。可將該無(wú)細(xì)胞提取物用于酶反應(yīng)。通過(guò)應(yīng)用已知的方法，例如，離子交換層析、凝膠濾過(guò)、疏水層析、硫酸銨鹽析，可以從該無(wú)細(xì)胞培養(yǎng)物中提純本發(fā)明之多肽。自然地，也可以將部分提純的產(chǎn)物用于酶反應(yīng)。因?yàn)榫哂衟ECEL211的大腸埃希氏桿菌BL21(DE3)表達(dá)的本發(fā)明之多肽是高度熱穩(wěn)定性的，該培養(yǎng)細(xì)胞和/或該無(wú)細(xì)胞提取物，可以在，例如，在95℃加熱10分鐘以便提純。
或者，通過(guò)例如具有pNCEL101的枯草芽孢桿菌DB104可獲取本發(fā)明之多肽，該質(zhì)粒中SEQ ID NO2 DNA與枯草芽孢桿菌蛋白酶啟動(dòng)子下游相連。具體地，通過(guò)在傳統(tǒng)條件下，如在含有10μg/ml卡那霉素的LB培養(yǎng)基中37℃過(guò)夜，培養(yǎng)具有pNCEL101的枯草芽孢桿菌DB104，可在培養(yǎng)物中積聚本發(fā)明之多肽。通過(guò)上述應(yīng)用大腸埃希氏桿菌作為宿主用于生產(chǎn)的已知方法，可在培養(yǎng)物中提純本發(fā)明之多肽。
如上所述，當(dāng)在常溫(例如37℃)下應(yīng)用編碼該多肽的核酸表達(dá)本發(fā)明之多肽時(shí)，產(chǎn)生的表達(dá)產(chǎn)物保持活性、熱抵抗性及類(lèi)似性質(zhì)。也就是說(shuō)，即使在與原有生產(chǎn)細(xì)胞的生長(zhǎng)溫度明顯不同的溫度下表達(dá)本發(fā)明之多肽，本發(fā)明之多肽能表現(xiàn)出其固有的更加規(guī)則的結(jié)構(gòu)。
2.本發(fā)明的核酸本發(fā)明的核酸是編碼上述本發(fā)明之多肽的核酸。具體地，例證是(1)編碼一種多肽的核酸，該多肽具有SEQ ID NO1氨基酸序列，或具有在SEQ ID NO1氨基酸序列中缺失、添加、插入和/或替換一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基所得到的氨基酸序列，并且該多肽具有纖維二糖水解酶活性；(2)具有SEQ ID NO2核苷酸序列的核酸；(3)編碼具有纖維二糖水解酶活性的多肽，在嚴(yán)格條件下能與上述(1)或(2)中的核酸雜交的核酸。
本文中所指的核酸意為單鏈或雙鏈DNA或RNA。
如果上述(2)中所述的核酸是RNA的話，其表示的核苷酸序列是SEQ ID NO2核苷酸序列，其中用U替換T。
例如，可以通過(guò)以下方法獲取本發(fā)明的核酸。
如上所述，為得到本發(fā)明之多肽，可以從堀越熱球菌OT3(JCM9974，日津)中分離上述(2)的含有SEQ ID NO2核苷酸序列的核酸。
而且，以編碼本發(fā)明提供之多肽的核酸的核苷酸序列為基礎(chǔ)，可獲取編碼具有與本發(fā)明之多肽相似的纖維二糖水解酶活性的多肽的核酸。具體地，可通過(guò)應(yīng)用編碼本發(fā)明之多肽的核酸或該核酸的一部分作為探針進(jìn)行雜交，或應(yīng)用引物進(jìn)行基因擴(kuò)增方法如PCR，來(lái)篩選編碼具有細(xì)胞生物水解活性之多肽的DNA。通過(guò)這樣的方法，可獲得上述(1)和(3)中的核酸。
通過(guò)上述方法，可獲取僅含有部分興趣核酸的核酸片段。在這種情況下，通過(guò)下面的方法可獲得完整的興趣核酸。測(cè)定所得核酸片段的核苷酸序列以確認(rèn)該片段為興趣核酸的一部分。應(yīng)用該核酸片段或其部分作為探針進(jìn)行雜交?；蛘撸瑧?yīng)用以該核酸片段的核苷酸序列為基礎(chǔ)而合成的引物進(jìn)行PCR。
“嚴(yán)格條件下的雜交”是指能夠例如，在以下條件下進(jìn)行雜交。固定有核酸的膜與探針在含有0.5％SDS、0.1％的牛血清白蛋白(BSA)、0.1％聚乙烯吡咯烷酮、0.1％菲可400和0.01％變性鮭精核酸的6×SSC(1×SSC、0.15M NaCl、0.015檸檬酸鈉，pH7.0)中，50℃下溫育12-20小時(shí)。溫育后，在含有0.5％SDS的2×SSC中，37℃下洗滌該膜，其間，使SSC濃度降至0.1×，溫度升至50℃直至所固定的核酸信號(hào)能夠與背景區(qū)分開(kāi)來(lái)，然后檢測(cè)該探針。如上所述測(cè)定由所得的新核酸編碼的蛋白質(zhì)的活性，從而確認(rèn)該核酸是否為目標(biāo)核酸。
另外，向該核酸插入合適的表達(dá)載體或類(lèi)似物以構(gòu)建含有本發(fā)明之核酸的重組DNA。然后產(chǎn)生含有該重組DNA的轉(zhuǎn)化體。該轉(zhuǎn)化體可用于工業(yè)生產(chǎn)該多肽。
如上所述，本發(fā)明也包括不同于此處所發(fā)現(xiàn)之核苷酸序列的核苷酸序列，只要其編碼具有纖維二糖水解酶活性的多肽。
已知每一氨基酸由1-6個(gè)定義基因中的氨基酸的密碼子(3聯(lián)體堿基)來(lái)確定。這樣，根據(jù)其氨基酸序列，許多核酸可編碼一特定的氨基酸序列。自然條件下的核酸并不穩(wěn)定。常常在核苷酸序列中產(chǎn)生突變。核酸中產(chǎn)生的突變可能不會(huì)改變所編碼的氨基酸序列(此命名為沉默突變)。在這種情況下，編碼相同氨基酸的不同核酸得以產(chǎn)生。這樣，不能否認(rèn)在含有編碼一特定氨基酸序列的獨(dú)立核酸的有機(jī)體傳代過(guò)程中，可產(chǎn)生編碼相同氨基酸序列的多種核酸。還有，應(yīng)用基因工程的多種方法不難人工產(chǎn)生編碼相同氨基酸序列的多種核酸。
例如，如果原來(lái)編碼靶蛋白質(zhì)的核酸中所用的密碼子，在通過(guò)基因工程(的方法)產(chǎn)生該蛋白質(zhì)的所用宿主中使用率很低的話，該蛋白質(zhì)表達(dá)水平可能很低。在這種情況下，為了增加靶蛋白質(zhì)的表達(dá)水平而不改變?cè)摼幋a的氨基酸序列，人工地將該密碼子轉(zhuǎn)換成在宿主中常用的密碼子(例如，JP-B7-102146)。如上所述，當(dāng)然能人工制備多種編碼一特定氨基酸序列的多種核酸。它們也可以在自然條件下產(chǎn)生。
3.應(yīng)用本發(fā)明之多肽降解通過(guò)β-1，4鍵相連的D-吡喃葡萄糖聚合體的方法可將本發(fā)明之多肽用于從通過(guò)β-1，4鍵相連的D-吡喃葡萄糖聚合物釋放纖維二糖。在本發(fā)明中對(duì)通過(guò)β-1，4鍵相連的D-吡喃葡萄糖聚合體中葡萄糖的聚合化程度沒(méi)有特別限定。該聚合物包括纖維三糖和纖維素。用SEQ ID NO1表示的本發(fā)明之多肽是高度熱穩(wěn)定性的。其可更有效地降解纖維素，部分由于通過(guò)加熱與底物的結(jié)構(gòu)變化相協(xié)同的效應(yīng)。
具體地，通過(guò)例如，使具有SEQ ID NO1氨基酸序列的多肽與底物98℃下在50mM MES-NaOH緩沖劑中(pH6.0)的反應(yīng)，可釋放纖維二糖。自然地，根據(jù)底物的類(lèi)型(纖維素、纖維四糖、等等)，該反應(yīng)條件可以變化?？蓪⒈景l(fā)明之多肽加入自由狀態(tài)的底物懸浮液中。但是，如果該多肽與固定在適宜載體上的底物反應(yīng)的話，反應(yīng)后該多肽容易復(fù)原。
而且，通過(guò)共同應(yīng)用熱穩(wěn)定的內(nèi)葡聚糖酶、外-1，4-β-D-糖苷酶、β-D-糖苷酶與本發(fā)明之多肽，高效地降解纖維素為D-葡萄糖是可能的。
實(shí)施例下面的實(shí)施例還詳細(xì)地說(shuō)明本發(fā)明，但無(wú)意于限定其范圍。
在本文描述的操作中，包括質(zhì)粒DNAs的制備和限制性酶切在內(nèi)的基礎(chǔ)操作按T.Maniatis等人(eds)，分子克隆實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)第二版(1989)冷泉港實(shí)驗(yàn)室中所述進(jìn)行。除非另外說(shuō)明，大腸埃希氏桿菌JM109或HB101用作利用大腸埃希氏桿菌構(gòu)建質(zhì)粒的宿主，并且在37℃富氧情況下，應(yīng)用含有100μg/ml氨芐青霉素的LB培養(yǎng)基(1％胰胨、0.5％酵母提取物、0.5％NaCl、pH7.0)或通過(guò)向LB培養(yǎng)基中加入濃度為1.5％的瓊脂并固化該產(chǎn)生的混合物而制備的LB平板進(jìn)行培養(yǎng)。
實(shí)施例1含有堀越熱球菌OT3基因組中開(kāi)放閱讀框架PH1171的重組DNA的構(gòu)建。
(1)含有開(kāi)放閱讀框架PH1171的DNA的制備。
依據(jù)堀越熱球菌OT3基因組的核苷酸序列合成含有SEQ ID NO3的核苷酸序列的寡核苷酸1171FN和含有SEQ ID NO4的核苷酸序列的寡核苷酸1171RA，以便通過(guò)PCR，以堀越熱球菌OT3基因組DNA作為模板獲取含有開(kāi)放閱讀框架PH1171的約1.6-Kb的擴(kuò)增DNA片段。
在95℃JCM目錄(Riken)所述的培養(yǎng)基中培養(yǎng)堀越熱球菌OT3JCM9974(購(gòu)自Riken)16小時(shí)。從培養(yǎng)的細(xì)胞中提純基因組DNA。
為了獲取含有開(kāi)放閱讀框架PH1171的DNA，以寡核苷酸1171FN和1171RA作為引物對(duì)，上述基因組DNA作為模板進(jìn)行PCR。依據(jù)TaKaRa Ex Taq(Takara Shuzo)所附的實(shí)驗(yàn)方法進(jìn)行該P(yáng)CR，方法如下94℃ 0.5分鐘進(jìn)行25個(gè)循環(huán)、50℃ 2分鐘和94℃ 1.5分鐘。將該P(yáng)CR產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖膠電泳。將約1.6kb的擴(kuò)增DNA片段提取和純化。對(duì)所得DNA的核苷酸序列進(jìn)行分析表明，該DNA含有開(kāi)放閱讀框架PH1171。
(2)重組DNA pECEL101的構(gòu)建用限制酶StuI和AvaI(均來(lái)自Takara Shuzo)酶切上述(1)中獲取的約1.6kb的擴(kuò)增的DNA片段，用T4 DNA聚合酶(TakaraShuzo)切平末端并進(jìn)行瓊脂糖膠電泳。然后將大約1.5kb的擴(kuò)增的DNA片段提取和純化。另一方面，用限制酶BamHI(Takara Shuzo)酶切pET21a(Novagen)，用堿性磷酸酶(Takara Shuzo)將其去磷酸化并用T4 DNA聚合酶切平末端。應(yīng)用DNA連接酶(Takara Shuzo)將該平端DNA片段連接。該連接混合物用于轉(zhuǎn)化大腸埃希桿菌JM109。篩選幾個(gè)轉(zhuǎn)化體，并且純化含在各自轉(zhuǎn)化體中的質(zhì)粒DNAs。制備質(zhì)粒DNAs的限制酶圖譜，以篩選其中開(kāi)放閱讀框架PH1171在載體中與T7啟動(dòng)子具有相同插入方向的質(zhì)粒DNA。將所選的質(zhì)粒DNA命名為pECEL101。
(3)重組DNA pECEL211的構(gòu)建按下面的方法制備由上述(1)中所得約1.6-kb的擴(kuò)增DNA片段和pET21d(Novagen)組成的重組DNA。
上述(1)中所得約1.6kb的擴(kuò)增DNA片段用AvaI酶切，用T4 DNA聚合酶切平末端并用限制酶NcoI(Takara Shuzo)酶切以使PH1171的第一個(gè)密碼子操作性地置于pET21d中T7啟動(dòng)子的下游。另一方面，pET21d用BamHI酶切，T4 DNA聚合酶切平末端，NcoI酶切并用堿性磷酸酶去磷酸化。
應(yīng)用DNA連接酶連接上述方法處理的該兩DNA片段。該連接混合物用于轉(zhuǎn)化大腸埃希氏桿菌JM109。篩選幾個(gè)轉(zhuǎn)化體，并進(jìn)行培養(yǎng)。純化各自轉(zhuǎn)化體中含有的質(zhì)粒DNAs。制備質(zhì)粒DNAs的限制酶圖譜，以篩選PH1171插入的質(zhì)粒DNA。將所選的質(zhì)粒DNA命名為pECEL211。含pECEL211的大腸埃希氏桿菌JM109命名為大腸埃希氏桿菌JM109/pECEL211，保藏于通商產(chǎn)業(yè)省工業(yè)技術(shù)院生命工學(xué)和人體技術(shù)研究所，保藏號(hào)為FERM BP-6939。
實(shí)施例2本發(fā)明之多肽的生產(chǎn)。
(1)多肽的表達(dá)將實(shí)施例1(3)制備的pECEL211或作為載體對(duì)照的pET21d用于轉(zhuǎn)化大腸埃希氏桿菌BL21(DE3)(Novagen)。將每一產(chǎn)生的轉(zhuǎn)化體分別接種于5ml含有100μg/ml氨芐青霉素的LB培養(yǎng)基中，并且在37℃富氧情況下過(guò)夜培養(yǎng)。在1％的濃度下，將該培養(yǎng)物接種到相同的新鮮的培養(yǎng)基中，并且在37℃富氧情況下培養(yǎng)。當(dāng)濁度達(dá)到OD600＝0.4-0.7時(shí)，加入異丙基-β-D-硫吡喃半乳糖苷(IPTG，TakaraShuzo)使之終濃度為1mM。在15℃下再過(guò)夜培養(yǎng)該細(xì)胞。培養(yǎng)后，通過(guò)離心收集細(xì)胞，將其懸浮于0.5ml 100mM檸檬酸鈉緩沖劑(pH5.0)中并用超聲破碎。通過(guò)離心收集上清，將其用作無(wú)細(xì)胞提取物。
用纖維素水解酶比如內(nèi)切葡聚糖酶或纖維二糖水解酶降解纖維素時(shí)，新產(chǎn)生葡萄糖殘基的還原端。然后，根據(jù)Park和Johnson的方法測(cè)量單位反應(yīng)時(shí)間內(nèi)中還原端的增加量，該方法使用羧甲基纖維素(CMC)作為底物，以便證實(shí)大腸埃希氏桿菌提取物中是否存在具有新生成葡萄糖殘基還原端的纖維素之水解活性的多肽。
通過(guò)將CMC(Sigma)以1％的濃度溶解于100mM的檸檬酸鈉(pH5.0)來(lái)制備CMC溶液。將50μl CMC溶液和50μl用100mM的檸檬酸鈉(pH5.0)稀釋的無(wú)細(xì)胞提取物混合一起，上覆礦物油。在98℃下溫育60分鐘后，離心收集水層。將10μl反應(yīng)混合物、90μl水、100μl碳酸氰化物溶液和100μl 0.05％氰化鐵鉀水溶液混合一起，沸水中反應(yīng)15分鐘。碳酸氰化物溶液的制備方法是將5.3g碳酸鈉和0.65g氰化鉀溶于1升水中。該反應(yīng)混合物于500μl鐵鋁溶液混合。該鐵鋁溶液的制備方法是將1.5g鐵鋁和1g十二烷基磺酰鈉(SDS)溶于1升0.15N的硫酸中。產(chǎn)生的混合物在室溫下平衡15分鐘。然后在690nm測(cè)量吸收度。測(cè)定還原端的含量，根據(jù)已知濃度的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線求出相應(yīng)的葡萄糖濃度。
一單位(U)的CMC-降解活性定義為在上述反應(yīng)體系中一分鐘內(nèi)提高相當(dāng)于1μmol葡萄糖的還原能量的活性。
按照上述方法測(cè)定的相應(yīng)的無(wú)細(xì)胞提取物的CMC-降解活性如表1所示。表1表示在98℃下上述制備的無(wú)細(xì)胞提取物的CMC-降解活性。表1

如表1所示，在轉(zhuǎn)化有pECEL211的大腸埃希氏桿菌的無(wú)細(xì)胞提取物中明顯檢測(cè)到了CMC-降解活性，而轉(zhuǎn)化有pET21d的大腸埃希氏桿菌的無(wú)細(xì)胞提取物中未檢測(cè)到CMC-降解活性。這樣，自堀越熱球菌OT3中的開(kāi)放閱讀框架PH1171表達(dá)的多肽具有新產(chǎn)生葡萄糖殘基還原端之纖維素水解活性。
(2)所表達(dá)多肽的纖維素水解活性的鑒別在測(cè)定前，如下制備表達(dá)多肽溶液。
將含有pECEL211的大腸埃希氏桿菌(DE3)接種到10ml含有50μg/ml氨芐青霉素的LB培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)過(guò)夜。將培養(yǎng)物接種到1升同樣的培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)2.5小時(shí)。冰上冷卻培養(yǎng)管。向其內(nèi)加入IPTG至終濃度0.1mM。在20℃下培養(yǎng)細(xì)胞過(guò)夜。通過(guò)離心收集細(xì)胞，將其懸浮于50ml 20mM磷酸鈉緩沖液(pH7.0)并超聲。離心所得上清經(jīng)95℃處理10分鐘，再離心得到上清。這樣得到的上清用作以下實(shí)驗(yàn)中的表達(dá)多肽溶液。
如下鑒定表達(dá)多肽的纖維素水解活性。具體地，可使該表達(dá)多肽溶液與多種底物作用。然后在薄層層析上鑒定產(chǎn)物。
首先將磷酸膨脹纖維素作為底物。如下制備磷酸膨脹纖維素。
將2g Avicel SF(Asahi Kasei)緩慢加入50ML 85％的冰冷磷酸中。將該混合物在冰上攪拌并間或進(jìn)行超聲以溶解Avicel SF。將該溶液倒入1.5升冰水中。通過(guò)離心收集纖維素凝膠。為去除磷酸將纖維素凝膠在水中沖洗6次，將其懸浮于40ml 0.1M檸檬酸鈉緩沖液中，并在隨后的實(shí)驗(yàn)中用作磷酸膨脹纖維素。
將75μl該表達(dá)多肽溶液加入75μl的磷酸膨脹纖維素中。該混合物在98℃反應(yīng)8小時(shí)。60μl的乙腈加入等量的該反應(yīng)混合物中并混合。在低壓力下，將通過(guò)離心獲取的上清蒸發(fā)變干。將該殘余物溶解于10μl的水中。取2μl該溶液用于硅膠薄層層析。應(yīng)用硅膠60F254(Merck)作為薄層板并且將乙醇∶丁醇∶水＝5∶5∶1作為顯影溶劑來(lái)進(jìn)行兩次顯影。在顯影后將地衣酚-硫酸試劑噴至該薄層板上并且應(yīng)用熱板將該板加熱以觀察斑點(diǎn)。通過(guò)在22.8ml硫酸中溶解400mg地衣酚(Sigma)，并加入水使之總量達(dá)200ml來(lái)制備地衣酚-硫酸試劑。
結(jié)果，證實(shí)生成了纖維二糖。
其次，將多種寡糖作為底物。
通過(guò)將纖維二糖(Sigma)、纖維三糖、纖維四糖或纖維五糖(后三者購(gòu)自Seikagaku公司)溶解于0.1M MES-NaOH緩沖劑(pH6.0)中使之濃度為1％(W/V)來(lái)制備寡糖溶液。將25μl的每一寡糖溶液加到25μl的10-、50-或250-倍用MES緩沖液稀釋的該表達(dá)多肽的稀釋液中。該混合物在98℃反應(yīng)20分鐘。用MES緩沖液替換該稀釋的表達(dá)多肽溶液或該寡糖溶液加到混合物中，在同樣的時(shí)間進(jìn)行反應(yīng)以作為對(duì)照。如上述的將磷酸膨脹纖維素用作底物的情況，將在反應(yīng)后通過(guò)離心獲得的1μl上清液進(jìn)行硅膠-薄層層析。以纖維二糖、纖維三糖或纖維四糖作底物時(shí)，進(jìn)行兩次顯影。以纖維五糖作底物時(shí)，進(jìn)行三次顯影。
不添加該表達(dá)多肽溶液，檢測(cè)作為反應(yīng)底物的纖維二糖、纖維三糖、纖維四糖和纖維五糖的斑點(diǎn)。當(dāng)不向反應(yīng)中加入底物時(shí)，未檢測(cè)到斑點(diǎn)。當(dāng)加入該表達(dá)多肽溶液和其中一種底物進(jìn)行反應(yīng)時(shí)，除纖維二糖外，每一寡糖產(chǎn)生比完整底物的RF值大的斑點(diǎn)物質(zhì)。該物質(zhì)的數(shù)量依據(jù)所添加的表達(dá)多肽的量而增加。
如上所述應(yīng)用寡糖作為底物，進(jìn)行反應(yīng)，只是該表達(dá)多肽溶液稀釋率為10，并且反應(yīng)時(shí)間為2小時(shí)。如上所述在硅膠薄層層析上分析通過(guò)離心該反應(yīng)混合物獲取的上清液。
結(jié)果，除纖維二糖外的底物幾乎完全消耗。纖維三糖、纖維四糖產(chǎn)生纖維二糖。纖維五糖產(chǎn)生纖維三糖和纖維二糖。對(duì)每一作為底物的寡糖來(lái)說(shuō)，主要的降解產(chǎn)物為纖維二糖。
這些結(jié)果證實(shí)，堀越熱球菌OT3基因組中的開(kāi)放閱讀框架PH1171表達(dá)的多肽具有纖維二糖水解酶活性。
實(shí)施例3本發(fā)明多肽的纖維二糖水解酶活性的物理和化學(xué)特性在此實(shí)施例中應(yīng)用實(shí)施例2-(2)中制備的本發(fā)明的多肽溶液。以下列活性測(cè)定纖維二糖水解酶活性1)依據(jù)Park和Johnson方法，通過(guò)檢測(cè)應(yīng)用CMC作為底物產(chǎn)生的纖維二糖的量作為還原糖的量，測(cè)定的CMC-降解活性；2)通過(guò)檢測(cè)應(yīng)用pNPC作為底物產(chǎn)生的纖維二糖的量作為對(duì)硝基苯酚的量，測(cè)定的對(duì)硝基苯基-β-D-纖維二糖苷(pNPC)-降解活性；3)通過(guò)檢測(cè)應(yīng)用4-MUC作為底物產(chǎn)生的纖維二糖的量作為4-甲基繖形酮(4-MU)的量，測(cè)定的4-甲基繖形酮基-β-D-纖維二糖苷(pNPC)-降解活性。
(1)對(duì)反應(yīng)pH的依賴(關(guān)系)制備如下緩沖劑。pH為2.8、3.8、4.9或6.0的0.2M的檸檬酸鈉緩沖劑、pH為4.6、5.5或6.5的MES-NaOH緩沖劑、pH為5.6、6.6或7.7的0.2M的Tris-HCl緩沖劑和pH為7.7、8.7或9.8的0.2M的甘氨酸-NaOH緩沖劑。在80℃檢測(cè)pH。
將50μl本發(fā)明之多肽50倍的水稀釋液、25μl的2％CMC水溶液和25μl一種上述的緩沖劑混合一起。該混合物在98℃反應(yīng)20分鐘。依據(jù)Park和Johnson方法，檢測(cè)通過(guò)離心該反應(yīng)混合物獲取的上清液中所含的還原糖的量，并且計(jì)算該CMC-降解活性。
結(jié)果如圖1所示。圖1闡述反應(yīng)pH和CMC-降解活性之間的關(guān)系。該橫軸代表pH，縱軸代表CMC-降解活性(相對(duì)值，％)。空心圓(○)、實(shí)心圓(●)、空心方塊(□)和實(shí)心方塊(■)分別代表檸檬酸鈉緩沖劑、MES-NaOH緩沖劑、Tris-HCl緩沖劑和甘氨酸-NaOH緩沖劑的結(jié)果。
本發(fā)明的多肽在pH4.9-6.5表現(xiàn)最大活性。
(2)對(duì)反應(yīng)溫度的依賴(關(guān)系)將50μl在0.1M MES-NaOH緩沖劑(pH6.0)中的1％CMC溶液加入到50μl用0.1M MES-NaOH緩沖劑(pH6.0)稀釋的本發(fā)明多肽的稀釋液中。該混合物在37、65、98、108或113℃反應(yīng)20分鐘。依據(jù)Park和Johnson方法，通過(guò)檢測(cè)產(chǎn)生的還原糖的量來(lái)測(cè)定的CMC-降解活性。
結(jié)果見(jiàn)圖2。圖2闡述反應(yīng)溫度和本發(fā)明之多肽的CMC-降解活性之間的關(guān)系。該橫軸代表反應(yīng)溫度(℃)，縱軸代表CMC-降解活性(相對(duì)值，％)。
在108℃本發(fā)明之多肽表現(xiàn)最大的CMC-降解活性，在90℃時(shí)表現(xiàn)大約80％最大活性和在80℃時(shí)表現(xiàn)大約60％最大活性。
(3)鹽濃度效應(yīng)用水或1、2、3、4或5M NaCl將本發(fā)明之多肽溶液稀釋50倍。將50μl在0.1M MES-NaOH緩沖劑(pH6.0)中的1％CMC溶液加入到50μl一種本發(fā)明之多肽溶液的稀釋液中。該混合物在98℃反應(yīng)20分鐘。依據(jù)Park和Johnson方法，通過(guò)檢測(cè)產(chǎn)生的還原糖的量來(lái)測(cè)定CMC-降解活性。
結(jié)果見(jiàn)圖3。圖3闡述NaCl濃度和本發(fā)明之多肽的CMC-降解活性之間的關(guān)系。該橫軸代表NaCl濃度(M)，縱軸代表CMC-降解活性(相對(duì)值，％)。
在0.5-0.6M NaCl存在時(shí)，本發(fā)明之多肽表現(xiàn)最大CMC-降解活性。
(4)pH穩(wěn)定性將25μl本發(fā)明之多肽的溶液和25μl在實(shí)施例3-(1)中制備的緩沖劑一起混合。該混合物在95℃加熱10分鐘。將50μl在0.1MMES-NaOH緩沖劑(pH6.0)中的1％CMC溶液加入到50μl該加熱的混合物的50倍水稀釋液中。該混合物在98℃反應(yīng)20分鐘。依據(jù)Park和Johnson方法，檢測(cè)通過(guò)離心該反應(yīng)混合物獲取的上清液中所含的還原糖的量，并且計(jì)算該CMC-降解活性。
結(jié)果見(jiàn)圖4。圖4闡述該多肽在95℃加熱10分鐘時(shí)，pH和其保留的CMC-降解活性之間的關(guān)系。該橫軸代表加熱時(shí)的pH，縱軸代表保留的CMC-降解活性(U/ml)?？招膱A(○)、實(shí)心圓(●)、空心方塊(□)和實(shí)心方塊(■)分別代表檸檬酸鈉緩沖劑、MES-NaOH緩沖劑、Tris-HCl緩沖劑和甘氨酸-NaOH緩沖劑的結(jié)果。
在pH5-7時(shí)，本發(fā)明之多肽的CMC-降解活性表現(xiàn)最大穩(wěn)定性。
(5)熱穩(wěn)定性將CMC溶解于0.1M MES-NaOH緩沖劑(pH6.0)中以制備1％的CMC溶液(pH6.0)。將50μl MES緩沖劑加入到本發(fā)明之多肽的溶液中。在95℃加熱0、1、5或24小時(shí)。將50μl 1％的CMC溶液加入通過(guò)離心該加熱的混合物獲取的上清液與MES緩沖劑的50-、200-或500-倍的稀釋液中。該混合物在98℃反應(yīng)20分鐘。依據(jù)Park和Johnson方法，通過(guò)檢測(cè)在該反應(yīng)混合物中所含的還原糖的量來(lái)測(cè)定的CMC-降解活性。
結(jié)果見(jiàn)圖5。圖5闡述熱處理-時(shí)間和在加熱后該保留活性之間的關(guān)系。該橫軸代表熱處理-時(shí)間(小時(shí))，縱軸代表加熱后的保留活性(％)。
在95℃加熱24小時(shí)后，本發(fā)明之多肽保留約90％的CMC-降解活性。
(6)對(duì)合成底物的降解活性將50μl 0.1M MES-NaOH緩沖劑(pH6.0)中的10mM pNPC加入到50μl本發(fā)明之多肽溶液或其2-、5-、10-或20-倍用0.1M MES-NaOH緩沖劑(pH6.0)稀釋的稀釋液中。該混合物在98℃反應(yīng)20分鐘。依據(jù)釋放的對(duì)硝基苯酚(pNP)的量，檢測(cè)通過(guò)離心獲取的上清液的405nm的吸收率，以測(cè)定pNPC-降解活性。
結(jié)果見(jiàn)圖6。圖6闡述本發(fā)明之多肽溶液的稀釋率和每一稀釋液pNPC-降解活性之間的關(guān)系。該橫軸代表該稀釋率的倒數(shù)，縱軸代表pNPC-降解活性(mU/ml)。
該pNPC-降解活性依據(jù)本發(fā)明多肽溶液濃度(的增加)而增加。
(7)葡萄糖和纖維二糖的抑制作用含有0、10、20、50、100或200mM葡萄糖或0、5、10、25或50mM纖維二糖、0.4、0.8、1.2或1.6mM pNPC和本發(fā)明多肽溶液的50mM MES-NaOH緩沖劑(pH6.0)在98℃反應(yīng)20分鐘，并且檢測(cè)405nm吸收率。對(duì)應(yīng)葡萄糖或纖維二糖的濃度(橫軸)標(biāo)記405nm吸收率(縱軸)的倒數(shù)。測(cè)定通過(guò)連接各自的pNPC濃度的點(diǎn)獲取的線的交叉點(diǎn)。通過(guò)倒轉(zhuǎn)交叉點(diǎn)在橫軸上的值的正或負(fù)號(hào)來(lái)測(cè)定抑制常數(shù)Ki。
因?yàn)槠咸烟菍?duì)本發(fā)明多肽的pNPC-降解活性的抑制作用很小，因此不可能計(jì)算Ki。另一方面，纖維二糖的Ki為212mM。
(8)多種試劑的作用含有0、0.5、1、2或10mM CoCl2、CuCl2、CaCl2、FeCl3、ZnCl2、MgCl2、二硫蘇糖醇(DTT)或乙二胺四乙酸(EDTA)、5mM對(duì)硝基苯基-β-D-纖維二糖苷(pNPC，Sigma)和本發(fā)明多肽溶液的50mMMES-NaOH緩沖劑在98℃反應(yīng)20分鐘，并且檢測(cè)405nm吸收率。應(yīng)用對(duì)硝基苯酚(pNP)濃度和在405nm吸收率之間關(guān)系的標(biāo)準(zhǔn)曲線來(lái)計(jì)算pNPC-降解活性。將本發(fā)明之多肽的一個(gè)單位(U)的pNPC降解活性定義為，一分鐘內(nèi)，在上述的反應(yīng)混合物中釋放1μmmolpNP的量。
結(jié)果見(jiàn)圖7。圖7闡述多種試劑pNPC-降解活性之間的關(guān)系。該橫軸代表該試劑的濃度，縱軸代表pNPC-降解活性(相對(duì)值，％)。在圖7中，空心圓(○)、實(shí)心圓(●)空心方塊(□)、實(shí)心方塊(■)、空心三角(△)、實(shí)心三角(▲)、空心菱形(◇)和實(shí)心菱形(◆)分別代表CoCl2、CuCl2、CaCl2、FeCl3、ZnCl2、MgCl2、DTT或EDTA。
DTT不抑制本發(fā)明多肽的pNPC-降解活性。濃度為0.5mM的Cu2+、Fe3+或Zn2+抑制(該多肽)大約90％的活性。濃度為1mM的Co2+、Ca2+、Mg2+或EDTA抑制(該多肽)大約50％的活性。
(9)本發(fā)明之多肽的提純除了熱處理為75℃ 20分鐘外，如實(shí)施例2-(2)所述的方法制備表達(dá)多肽溶液。
應(yīng)用HiTrap Q柱(pharmacia)對(duì)通過(guò)離心所加熱的上清而獲取的上清液進(jìn)行陰離子交換層析。將該樣品加到兩個(gè)系列連接的5mlHiTrap Q柱上。20分鐘內(nèi)用自50mM MES-NaOH緩沖液(pH6.0)至含有200mM NaCl的同一緩沖液的線性梯度液洗脫，流速2ml/分鐘。將50μl 6mM 4-MUC溶液(溶于100mM MES-NaOH緩沖液(pH6.0))加到50μl相應(yīng)組分的系列稀釋液之一中。該混合物在98℃反應(yīng)20分鐘。以355nm為激發(fā)波長(zhǎng)，460nm為發(fā)射波長(zhǎng)測(cè)量熒光。根據(jù)釋放的4-MU的量來(lái)計(jì)算4-MUC降解活性。
應(yīng)用HiTrap苯瓊脂糖6快速柱(低分子量)(Pharmacia)對(duì)經(jīng)該陰離子交換柱層析的活性組分進(jìn)行疏水柱層析。將飽和的硫酸銨加到經(jīng)該陰離子交換柱層析的活性組分中至20％的飽和度。將該混合物加到已用20％的硫酸銨平衡的疏水柱上(1ml體積)。15分鐘內(nèi)應(yīng)用自含20％飽和度的硫酸銨的MES緩沖液至無(wú)硫酸銨的MES緩沖液的線性梯度液洗脫，流速1ml/分鐘。在用約0％飽和硫酸銨洗脫的組分中檢測(cè)4-MUC降解活性。
(10)比活性的測(cè)定將2ml經(jīng)疏水柱層析的活性組分通過(guò)超濾脫鹽、凍干，然后在氣相HCl存在的情況下135℃水解3小時(shí)。使水解物溶于100μl水。用氨基酸分析儀(L-8500 Hitachi)對(duì)50μl該溶液進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)所分析的樣本含有3.61μg蛋白質(zhì)。對(duì)具有60MU 4-MUC降解活性的相應(yīng)多肽進(jìn)行氨基酸分析。這樣，測(cè)得比活性為17.0U/mg。這樣獲得的提純多肽在物理和化學(xué)性質(zhì)上與實(shí)施例3中所測(cè)的(性質(zhì))類(lèi)似。
(11)N-端氨基酸序列分析按照常規(guī)方法對(duì)實(shí)施例3中制備的提純多肽進(jìn)行SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳。電泳后，在含10mM DTT的100mM琥珀酸鹽緩沖液(pH5.8)中沖洗該凝膠，然后在含1mM 4-MUC的100mM琥珀酸鹽緩沖液(pH5.8)中，60℃反應(yīng)一小時(shí)。340nm紫外線照射該凝膠，觀察熒光帶。
按照半干印跡法將凝膠中的蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到聚偏乙烯雙氟化物(PVDF)膜上。該膜用考馬斯亮藍(lán)(CBB)染色。切下一部分PVDF膜。此部分對(duì)應(yīng)于具有4-MUC降解活性的帶并已用CBB染色。用肽測(cè)序儀分析N-端氨基酸序列。
N-端六個(gè)氨基酸殘基的序列為Glu-Asn-Thr-Thr-Tyr-Gln。如前所證明，在大腸埃希氏桿菌中表達(dá)的本發(fā)明之多肽N-端28個(gè)氨基酸殘基已得以去除。
實(shí)施例4應(yīng)用枯草芽孢桿菌生產(chǎn)本發(fā)明的多肽(1)構(gòu)建枯草芽孢桿菌表達(dá)載體構(gòu)建如WO 97/21823所述的質(zhì)粒pNAPS1，用HindIII(TakaraShuzo)酶切并進(jìn)行瓊脂膠電泳。按照傳統(tǒng)方法，從瓊脂膠中提取和純化大約4.5Kb的含有源于枯草芽孢桿菌的復(fù)制起點(diǎn)、枯草芽孢桿菌蛋白酶基因啟動(dòng)子和編碼枯草芽孢桿菌蛋白酶分泌信號(hào)之序列的DNA片段。用HindIII酶切pUC119(Takara Shuzo)并且用堿性磷酸酶將其去磷酸化。用DNA連接酶將這些DNA片段連接。按照傳統(tǒng)的方法，進(jìn)行大腸埃希氏桿菌的轉(zhuǎn)化、轉(zhuǎn)化體的培養(yǎng)和質(zhì)粒的提取和純化。從這些獲取的質(zhì)粒中，篩選其中插入該4.5Kb的DNA片段從而使pUC119中的lac啟動(dòng)子和枯草芽孢桿菌蛋白酶基因啟動(dòng)子方向相反的質(zhì)粒，并將其命名為pUC119-BV。
用BamHI酶切在實(shí)施例1中構(gòu)建的pECEL101并進(jìn)行瓊脂膠電泳。按照傳統(tǒng)的方法，從該瓊脂膠中，提取和純化開(kāi)放閱讀框架PH1171中編碼從19位亮氨酸殘基到終末端密碼子部分片段的大約1.5Kb的DNA片段。用BamHI酶切上述方法獲得的pUC119-BV并進(jìn)行瓊脂膠電泳。按照傳統(tǒng)方法，從瓊脂膠中提取和純化大約4.5Kb的含有源于枯草芽孢桿菌的復(fù)制起點(diǎn)和類(lèi)似物的DNA片段。用DNA連接酶將這些DNA片段連接。按照傳統(tǒng)的方法，進(jìn)行枯草芽孢桿菌DB104的轉(zhuǎn)化、轉(zhuǎn)化體的培養(yǎng)和質(zhì)粒的提取和純化。
從這些獲取的質(zhì)粒中，篩選其中插入與該載體中枯草芽孢桿菌蛋白酶基因啟動(dòng)子方向相同的開(kāi)放閱讀框架PH1171的質(zhì)粒，并將其命名為pNECEL101。質(zhì)粒pNECEL101編碼在枯草芽孢桿菌中構(gòu)成性表達(dá)的枯草芽孢桿菌蛋白酶基因啟動(dòng)子之下游的融合多肽。在該融合多肽中，來(lái)源于該載體、包括由在N-端29個(gè)氨基酸殘基組成的枯草芽孢桿菌蛋白酶分泌性信號(hào)序列在內(nèi)的31個(gè)氨基酸殘基的前導(dǎo)序列與始于19位亮氨酸殘基的PH1171相連。當(dāng)該質(zhì)粒分泌時(shí)，獲取與在該載體中的枯草芽孢桿菌蛋白酶基因啟動(dòng)子相反的方向而插入開(kāi)放閱讀框架PH1171的質(zhì)粒和該載體自身連接得到的質(zhì)粒，并將它們分別命名為pNCEL001和pNBV。這些質(zhì)粒用作檢測(cè)表達(dá)的載體對(duì)照。
(2)本發(fā)明之多肽的表達(dá)在含有10μg/ml卡那霉素的LB培養(yǎng)基中溫育和在富氧情況下37℃過(guò)夜培養(yǎng)如上述方法獲得的用pNCEL101、pNCEL001或pNBV轉(zhuǎn)化的枯草芽孢桿菌DB104。如實(shí)施例2-(1)所述應(yīng)用得到的培養(yǎng)物代替該無(wú)細(xì)胞提取物，檢測(cè)在培養(yǎng)物中的CMC-降解活性。
具體地，將50μl一種枯草芽孢桿菌轉(zhuǎn)化體培養(yǎng)物和50μl在100mM檸檬酸鈉緩沖劑中的1％CMC溶液一起混合，并且在該混合物上覆蓋礦物油。在98℃孵育60分鐘后，將該混合物離心并重新獲取上清液。按照如實(shí)施例2-(1)所述的Park和Johnson方法，檢測(cè)該反應(yīng)混合物的還原能。應(yīng)用pNCEL101轉(zhuǎn)化的枯草芽孢桿菌DB104的培養(yǎng)物的反應(yīng)混合物，明顯地比應(yīng)用自身-連接載體來(lái)源的質(zhì)粒pNBV轉(zhuǎn)化的DB104的培養(yǎng)物的反應(yīng)混合物(對(duì)照)，表現(xiàn)較高的還原能。依據(jù)還原能而計(jì)算的CMC-降解活性為0.63mU/ml培養(yǎng)物，該還原能通過(guò)減去對(duì)照組的值并轉(zhuǎn)化為相應(yīng)的葡萄糖的量來(lái)測(cè)定。對(duì)以相反方向插入PH1171的質(zhì)粒pNCEL001而言，只發(fā)現(xiàn)與pNBV相等的還原能。
實(shí)施例5應(yīng)用本發(fā)明之多肽對(duì)紙張的降解將25mg的Kimwipe(Crecia)約1mm2的小片。將480μl 50mMMES-NaOH(pH6.0)和20μl同樣的緩沖劑或在實(shí)施例2-(1)中制備的pECEL211轉(zhuǎn)化的大腸埃希氏桿菌的無(wú)細(xì)胞提取物加入其中。該混合物在95℃反應(yīng)66個(gè)小時(shí)。將100μl乙腈加入到50μl離心獲取的上清中。通過(guò)離心去掉不可溶的物質(zhì)。在減壓下將該上清液蒸發(fā)致干。將該殘留物再重新溶解于10μl 50％的乙腈水溶液中。將1μl的該溶液用于如實(shí)施例2-(1)中所述的硅膠薄層層析。
結(jié)果，只有在加入了用pECEL211轉(zhuǎn)化的大腸埃希氏桿菌的無(wú)細(xì)胞提取物的標(biāo)本中，觀察到具有與纖維二糖相同RF值的點(diǎn)。
工業(yè)應(yīng)用本發(fā)明提供具有纖維二糖水解酶活性的多肽。本發(fā)明之多肽具有高度耐熱性并且能高效降解纖維素。由于通過(guò)與來(lái)源于極度嗜熱菌的內(nèi)切葡聚糖酶、外切-1，4-β-D-葡糖苷酶和β-D-葡糖苷酶聯(lián)合應(yīng)用，本發(fā)明之多肽能高效地從纖維素中生產(chǎn)葡萄糖，因此可方便地利用纖維素-類(lèi)型的生物量。
序列表SEQ ID NO3命名為1171FN的寡核苷酸引物，設(shè)計(jì)用以擴(kuò)增含有開(kāi)放閱讀框架PH1171的1.6-kb的DNA片段。
SEQ ID NO4命名為1171RA的寡核苷酸引物，設(shè)計(jì)用以擴(kuò)增含有開(kāi)放閱讀框架PH1171的1.6-kb的DNA片段。
權(quán)利要求
1.一種具有SEQ ID NO1的氨基酸序列或具有通過(guò)在SEQ IDNO1氨基酸序列中缺失、加入、插入和/或替換一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基所得到的氨基酸序列的多肽，其具有纖維二糖水解酶活性。
2.權(quán)利要求1的多肽，其具有熱穩(wěn)定性的纖維二糖水解酶活性。
3.一種編碼權(quán)利要求1或2之多肽的核酸。
4.權(quán)利要求3的核酸，其具有SEQ ID NO2的核苷酸序列。
5.一種編碼具有纖維二糖水解酶活性的多肽的核酸，它在嚴(yán)格情況下能與權(quán)利要求3中的核酸雜交。
6.權(quán)利要求5的核酸，其編碼具有熱穩(wěn)定的纖維二糖水解酶活性的多肽。
7.一種含有權(quán)利要求3-6中任一項(xiàng)的核酸的重組DNA。
8.一種用權(quán)利要求7的重組DNA轉(zhuǎn)化的轉(zhuǎn)化體。
9.一種生產(chǎn)權(quán)利要求1的多肽的方法，該方法包括培養(yǎng)權(quán)利要求8中的轉(zhuǎn)化體和從培養(yǎng)物中收集具有纖維二糖水解酶活性的多肽。
10.一種降解通過(guò)β-1，4鍵相連的D-吡喃葡萄糖聚合物的方法，該方法包括使權(quán)利要求1或2中的多肽，作用于通過(guò)β-1，4鍵相連的D-吡喃葡萄糖聚合物，以釋放纖維二糖。
11.一種具有纖維二糖水解酶活性和對(duì)纖維二糖的抑制常數(shù)Ki大于或等于10mM的多肽。
12.權(quán)利要求11的多肽，其在95℃處理5小時(shí)后能保持20％或更多的纖維二糖水解酶活性。
全文摘要
具有SEQ ID NO:1所示氨基酸序列的多肽或應(yīng)用缺失、添加、插入或替換中的至少一種方法,而缺失、添加、插入或替換一或多個(gè)氨基酸而得到具有纖維二糖水解酶活性的多肽。
文檔編號(hào)C12P19/04GK1334868SQ99816216
公開(kāi)日2002年2月6日 申請(qǐng)日期1999年12月14日 優(yōu)先權(quán)日1998年12月24日
發(fā)明者高山正范, 梅田香穗子, 小山信人, 淺田起代蔵, 加藤郁之進(jìn) 申請(qǐng)人:寶酒造株式會(huì)社 被以下專利引用 (2),