一種具有降尿酸活性的秋刀魚美拉德肽及其制法和應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種具有降尿酸活性的秋刀魚美拉德肽及其制備方法和應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 尿酸是人體嘌呤代謝的產(chǎn)物。正常狀態(tài)下，人體血尿酸含量為200~410 y mol/ L，女性普遍低于男性。人體尿酸水平的升高通常與人體嘌呤代謝異?；蚰I臟排泄異常息息 相關(guān)，國(guó)際上將男性血尿酸濃度超過420 y mol/L、女性超過357 y mol/L時(shí)定義為高尿酸血 癥。而高尿酸血癥往往會(huì)引起通風(fēng)。痛風(fēng)在公元前2640年即被埃及人定義，并于公元前 400年被記錄到希波克拉底的醫(yī)學(xué)著作中。如今，由于飲食結(jié)構(gòu)和生活方式的改變，高尿酸 血癥及痛風(fēng)患者也隨之增加，已成為現(xiàn)代社會(huì)常見的一種風(fēng)濕性疾病。
[0003] 人們一般很少關(guān)注自已的血尿酸水平，往往是等到出現(xiàn)了痛風(fēng)的癥狀才采取治 療。目前以消炎、鎮(zhèn)痛治療為主，如秋水仙堿及非留體抗炎藥物，持續(xù)用藥1到2周后能明顯 改善痛風(fēng)癥狀。吲哚美辛也能夠治療急性痛風(fēng)，而注射促腎上腺皮質(zhì)激素具有更好的、更快 速的療效。別嘌呤醇是目前市面上唯一一款通過抑制黃嘌呤氧化酶活性而減少尿酸生成、 降低血尿酸濃度的藥物，其作用靶點(diǎn)明確，但起效慢，且在使用初期會(huì)加劇痛風(fēng)癥狀。但無 論是消炎、鎮(zhèn)痛藥物，還是作用機(jī)理明確的別嘌呤醇藥物，在治療時(shí)往往會(huì)出現(xiàn)一定的毒副 作用，因此對(duì)于已患有痛風(fēng)石的患者多采取手術(shù)剔除痛風(fēng)石、矯正關(guān)節(jié)來進(jìn)行治療。而在無 癥狀高尿酸血癥的治療中，醫(yī)生建議通過調(diào)整飲食結(jié)構(gòu)或口服一些食源性的藥物來進(jìn)行治 療，達(dá)到緩慢降低血尿酸水平的目的。
[0004] 蛋白質(zhì)是我們?nèi)粘Ｉ钪斜夭豢缮俚臓I(yíng)養(yǎng)元素，且在蛋白質(zhì)中蘊(yùn)含著很多的生物 活性物質(zhì)一一生物活性肽，其中可能具有降血壓、降膽固醇、抗血栓、抗癌、抗氧化等生物活 性。但這些生物活性肽隱藏在蛋白質(zhì)內(nèi)部或僅是蛋白質(zhì)的某個(gè)基因片段，當(dāng)人們攝食這些 蛋白質(zhì)食物時(shí)，蛋白質(zhì)進(jìn)入人體胃和腸道中，這些生物活性肽也不能被胃和腸道中酶系作 用而完全釋放出來?，F(xiàn)代生物酶解技術(shù)是一種可高效釋放蛋白質(zhì)內(nèi)部生物活性肽的方法， 該法主要是模仿人體內(nèi)消化系統(tǒng)的蛋白水解過程，且由于是在體外作用，其水解條件和蛋 白酶的種類和濃度均可調(diào)整，所以可高效獲取目標(biāo)生物活性的生物活性肽。
[0005] 另外，美拉德反應(yīng)是食品加工或儲(chǔ)存過程中常發(fā)生于還原糖與氨基酸、多肽、蛋白 質(zhì)或任何含氮化合物之間的非酶褐變反應(yīng)，其反應(yīng)歷程較快，內(nèi)部的成分變化復(fù)雜，甚至?xí)?生成某些具有較強(qiáng)生物活性的物質(zhì)，如目前報(bào)道較多的是美拉德反應(yīng)可以顯著增強(qiáng)蛋白肽 的抗氧化活性，因此，美拉德反應(yīng)也是一種提升蛋白肽生物活性的有效的處理手段之一。
[0006] 秋刀魚屬于海洋中上層魚類，其肉含有豐富的蛋白質(zhì)，但附加值較低，主要作為食 用或飼料，價(jià)格低廉。目前已有通過生物酶解制備抗氧化肽的研宄，仍未見利用秋刀魚來制 備降尿酸組分的研宄。如果以秋刀魚為原料制備出具有明顯降低尿酸的蛋白肽產(chǎn)品，不僅 可拓展秋刀魚的應(yīng)用領(lǐng)域和提高其經(jīng)濟(jì)價(jià)值，更重要的可改善人們的生活質(zhì)量，具有極大 的社會(huì)意義。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007] 本發(fā)明的首要目的在于提供一種具有降尿酸活性的秋刀魚美拉德肽的制備方法， 該方法的創(chuàng)新點(diǎn)在于實(shí)現(xiàn)酶解與美拉德反應(yīng)的連續(xù)作用，以及外加單體氨基酸作為酶解體 系的底物抑制劑來達(dá)到調(diào)節(jié)酶解進(jìn)程的目的。
[0008] 本發(fā)明的另一目的在于提供由上述方法制得的具有降尿酸活性的秋刀魚美拉德 肽。
[0009] 本發(fā)明的再一目的在于提供上述的秋刀魚美拉德肽的用途。
[0010] 本發(fā)明的目的通過下述技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)：
[0011] 一種具有降尿酸活性的秋刀魚美拉德肽的制備方法，包括以下步驟：
[0012] (1)秋刀魚預(yù)處理：秋刀魚去頭、去內(nèi)臟，清洗干凈，過絞肉機(jī)絞碎，加入秋刀魚碎 肉質(zhì)量3~5倍的水，在40~50°C下加熱攪拌1~2小時(shí)，調(diào)節(jié)體系pH值至4. 2,繼續(xù)攪 拌加熱1~1. 5小時(shí)，離心分離，棄除上清液和上層油脂，取沉淀物；
[0013] (2)酶解-美拉德連續(xù)發(fā)應(yīng)：往秋刀魚沉淀物中加入其質(zhì)量1~1. 5倍的水，然后 加入蛋白酶和單體氨基酸，調(diào)節(jié)體系pH值至7. 0,在50~55°C下保溫水解6~9小時(shí)后， 加入還原糖，在100~121°C下加熱1. 0~2. 0小時(shí)，離心，取上清液，得到秋刀魚美拉德肽 液；將美拉德肽液真空濃縮、噴霧干燥，得到秋刀魚美拉德肽干粉；
[0014] 以秋刀魚沉淀物的質(zhì)量為計(jì)算基準(zhǔn)，蛋白酶的加入量占1. 5~3. 0%，單體氨基酸 的加入量占〇. 1~〇. 3%，還原糖的加入量占0. 5~2. 5% ;
[0015] 所述的調(diào)節(jié)體系pH值是用0. 5mol/L的NaOH溶液或HC1溶液調(diào)節(jié)；
[0016] 所述的離心是5000r/min離心15~20min ;
[0017] 步驟⑵所述的蛋白酶是商業(yè)用的堿性蛋白酶和風(fēng)味蛋白酶，優(yōu)選諾維信公司的 喊性蛋白酶（Alcalase 2.4L)和風(fēng)味蛋白酶（Flavourzyme 500MG);
[0018] 步驟（2)所述的單體氨基酸為酪氨酸、苯丙氨酸或色氨酸，優(yōu)選色氨酸；
[0019] 步驟（2)所述的還原糖為葡萄糖、木糖或核糖。
[0020] 由上述方法制得的秋刀魚美拉德肽可用于制備降尿酸藥物或保健品；使用時(shí)，所 述的秋刀魚美拉德肽可以與具有降尿酸作用的中草藥復(fù)配。
[0021] 本發(fā)明相對(duì)于現(xiàn)有技術(shù)具有如下的優(yōu)點(diǎn)及效果：
[0022] (1)本發(fā)明結(jié)合生物酶解和美拉德反應(yīng)技術(shù)來制備具有降尿酸作用的美拉德肽， 首先通過在酶解前期添加單體氨基酸，一方面可直接增加最終酶解產(chǎn)物中某些氨基酸的含 量，另一方面通過對(duì)酶解體系進(jìn)行底物抑制，反向調(diào)控酶解進(jìn)程，促成或抑制某些氨基酸的 生成，改變酶解產(chǎn)物的氨基酸組成，提高酶解產(chǎn)物的降尿酸活性或美拉德反應(yīng)活性；然后在 酶解結(jié)束后直接添加還原糖實(shí)現(xiàn)酶解與美拉德反應(yīng)的連續(xù)作用制備出美拉德肽，既簡(jiǎn)化了 生產(chǎn)工藝流程，縮短生產(chǎn)周期，降低生產(chǎn)成本，又使制得的目標(biāo)美拉德肽的降尿酸作用顯著 增強(qiáng)，經(jīng)大鼠動(dòng)物實(shí)驗(yàn)表明采用本發(fā)明方法制備的降尿酸美拉德肽可顯著降低大鼠的血尿 酸水平，并對(duì)大鼠的腎臟功能具有一定程度的保護(hù)作用。
[0023] (2)本發(fā)明工藝操作簡(jiǎn)單、生產(chǎn)成本低、沒有任何污染、所得美拉德肽的降尿酸活 性強(qiáng)。
【附圖說明】
[0024] 圖1是實(shí)施例2和對(duì)比例產(chǎn)品的尿酸峰色譜圖。
【具體實(shí)施方式】
[0025] 下面結(jié)合實(shí)施例及附圖對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)的描述，但本發(fā)明的實(shí)施方式不限 于此。
[0026] 以下各實(shí)施例中，采用反相高效液相色譜法測(cè)定尿酸值的方法如下：
[0027] (1)溶液的配置
[0028] 0?2mol/L (pH 7. 5)磷酸緩沖液（PBS):準(zhǔn)確稱取 30. 0838g Na2HP04 ? 12H20 和 2. 4962g NaH2P04 ? 2H20,用去離子水溶解，定容至500ml。
[0029] 黃嘌呤溶液：準(zhǔn)確稱取6. 4mg黃嘌呤，先用1ml1M NaOH將其溶解，再加入100ml PBS，以1M HC1調(diào)節(jié)pH值至7. 5。
[0030] 黃嘌呤氧化酶：取120 y 1酶液，以PBS稀釋至8ml。
[0031] 尿酸標(biāo)曲：準(zhǔn)確稱取10mg尿酸，加入10ml水，再稀釋至0? 1~0? 9mg/ml。
[0032] 醋酸胺-冰醋酸：準(zhǔn)確稱取醋酸胺3. 85g定容至1000ml，然后加入4ml冰醋酸。
[0033] (2)樣品預(yù)處理：
[0034] 將樣品稀釋至40mg/ml，在96孔酶標(biāo)板中依次加入50 y 1樣品與50 y 1黃嘌呤，每 個(gè)樣品做3個(gè)平行，37°C保溫lOmin后加入150 y 1黃嘌呤氧化酶，37°C繼續(xù)保溫20min后 加入80 y 1 1M HC1終止反應(yīng)，過0. 25 y m水性膜，待測(cè)。
[0035]色譜柱：ZorbaxEclipseXDB-C18 柱（5ym，4. 6 X 250mm,安捷倫），
[0036] 液相條件：洗脫液為10%甲醇+90%醋酸胺-冰醋酸溶液，進(jìn)樣體積為20 y L，流 速lml/min，檢測(cè)波長(zhǎng)為290nm，運(yùn)行時(shí)間10min〇
[0037] (3)計(jì)算公式
[0038]
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種具有降尿酸活性的秋刀魚美拉德肽的制備方法，其特征在于包括以下步驟： (1) 秋刀魚預(yù)處理：秋刀魚去頭、去內(nèi)臟，清洗干凈，過絞肉機(jī)絞碎，加入秋刀魚碎肉質(zhì) 量3~5倍的水，在40~50°C下加熱攪拌1~2小時(shí)，調(diào)節(jié)體系pH值至4. 2,繼續(xù)攪拌加 熱1~1. 5小時(shí)，離心分離，棄除上清液和上層油脂，取沉淀物； (2) 酶解-美拉德連續(xù)發(fā)應(yīng)：往秋刀魚沉淀物中加入其質(zhì)量1~1. 5倍的水，然后加入 蛋白酶和單體氨基酸，調(diào)節(jié)體系pH值至7. 0,在50~55°C下保溫水解6~9小時(shí)后，加入 還原糖，在100~121°C下加熱I. 0~2. 0小時(shí)，離心，取上清液，得到秋刀魚美拉德肽液； 將肽液真空濃縮、噴霧干燥，得到秋刀魚美拉德肽干粉； 以秋刀魚沉淀物的質(zhì)量為計(jì)算基準(zhǔn)，蛋白酶的加入量占1. 5~3. 0%，單體氨基酸的加 入量占0. 1~0. 3%，還原糖的加入量占0. 5~2. 5% ; 步驟（2)所述的單體氨基酸為酪氨酸、苯丙氨酸或色氨酸； 步驟（2)所述的還原糖為葡萄糖、木糖或核糖。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的具有降尿酸活性的秋刀魚美拉德肽的制備方法，其特征在 于：步驟（2)所述的蛋白酶為堿性蛋白酶和風(fēng)味蛋白酶。
3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的具有降尿酸活性的秋刀魚美拉德肽的制備方法，其特征在 于：堿性蛋白酶為諾維信公司的Alcalase 2. 4L，風(fēng)味蛋白酶為諾維信公司的Flavourzyme 500MG。
4. 一種具有降尿酸活性的秋刀魚美拉德肽，其特征在于：是由權(quán)利要求1-3任一項(xiàng)所 述的方法制備得到。
5. 權(quán)利要求4所述的秋刀魚美拉德肽在制備降尿酸藥物或保健品中的應(yīng)用。
6. 根據(jù)權(quán)利要求5所述的秋刀魚美拉德肽在制備降尿酸藥物或保健品中的應(yīng)用，其特 征在于：所述的秋刀魚美拉德肽與具有降尿酸作用的中草藥復(fù)配。
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種具有降尿酸活性的秋刀魚美拉德肽及其制備方法和應(yīng)用，其制備方法包括以下步驟：將秋刀魚絞碎，加水加熱攪拌，調(diào)節(jié)pH值至4.2，離心分離，取沉淀；往沉淀物中加水、蛋白酶和單體氨基酸，調(diào)節(jié)pH值至7.0，水解后再加入還原糖反應(yīng)，離心，取上清液即為秋刀魚美拉德肽液；將肽液噴霧干燥得到秋刀魚美拉德肽干粉。本發(fā)明方法實(shí)現(xiàn)了酶解與美拉德反應(yīng)的連續(xù)作用制備出美拉德肽，簡(jiǎn)化生產(chǎn)工藝流程，縮短生產(chǎn)周期，降低生產(chǎn)成本，且制得的目標(biāo)美拉德肽的降尿酸作用顯著，經(jīng)大鼠動(dòng)物實(shí)驗(yàn)表明采用本發(fā)明方法制備的降尿酸美拉德肽可顯著降低大鼠的血尿酸水平，并對(duì)大鼠的腎臟功能具有一定程度的保護(hù)作用。
【IPC分類】A61P19-06, A23J1-04, A61K38-02
【公開號(hào)】CN104664039
【申請(qǐng)?zhí)枴緾N201510094674
【發(fā)明人】趙謀明, 劉洋, 蘇國(guó)萬, 趙容鐘, 趙強(qiáng)忠, 林戀竹
【申請(qǐng)人】華南理工大學(xué)
【公開日】2015年6月3日
【申請(qǐng)日】2015年3月3日