一種雙期發(fā)酵生產(chǎn)海藻酵素的方法
【專利說明】
[0001]技術(shù)領(lǐng)域生物技術(shù)
【背景技術(shù)】海藻是海產(chǎn)藻類植物(Algae)的統(tǒng)稱，最常見的大型海藻包括褐藻(海帶、裙帶菜、羊棲菜等)、紅藻(紫菜、石花菜、龍須菜、角叉菜、麒麟菜等)和綠藻(石莼、滸苔等)等，這些藻類可以食用，有的也可以入藥。紅藻、褐藻和綠藻的主要成分是具有不同基團特征和結(jié)構(gòu)的大分子多糖，海藻多糖含量大于20%，分子量大，無還原性，人體不易吸收。不同的海藻多糖可以被專一性酵素降解成特征性的寡糖，寡糖具有還原性，可以用高錳酸鉀滴定法和二硝基水楊酸法(DNS)方法檢測出還原性，還原性的高低代表了產(chǎn)生寡糖的多少，特異性寡糖的產(chǎn)生賦予了這些海藻不同的生理功能。海藻酵素是以海藻為基質(zhì)，經(jīng)過微生物代謝和生物轉(zhuǎn)化過程生成的具有海藻特定活性成分的酵素和特定產(chǎn)物的產(chǎn)品。
[0002]
【發(fā)明內(nèi)容】
本發(fā)明提供了一種發(fā)酵生產(chǎn)營養(yǎng)海藻酵素的方法，該生產(chǎn)技術(shù)是以兩種主要微生物在海藻漿中的代謝為基礎(chǔ)，采用合理的工藝，使得海藻得以充分的發(fā)酵，產(chǎn)生高活性的酵素和特定的生理活性物質(zhì)特別是改善了海藻的口味和易消化性，形成高品質(zhì)的海藻酵素。該技術(shù)發(fā)明是通過將海藻粉碎、勻漿、加熱、調(diào)節(jié)PH，經(jīng)食用級枯草芽孢桿菌進行一期發(fā)酵和食用級植物乳桿菌二期發(fā)酵、分離而獲得液體海藻酵素。具體通過以下步驟實施:
(O原料處理:選擇符合食品衛(wèi)生標準的海藻原料，鮮海藻原料或干海藻復(fù)水后經(jīng)剪切、加水均質(zhì)后移入發(fā)酵罐，攪拌滅菌，降溫至30?50°C備用；
(2)發(fā)酵菌種準備:將食用級枯草芽孢桿菌固體干粉菌劑與植物乳桿菌干粉菌劑，接種前用無菌生理鹽水分別配制成5?20%的菌懸液，備用；
(3)—期發(fā)酵:將滅菌好的發(fā)酵基質(zhì)30?50°C保溫狀態(tài)下，按接種量I?2%無菌接入配制好的枯草芽孢桿菌懸液，攪拌發(fā)酵，發(fā)酵條件:30?50°C發(fā)酵2?5天，停止攪拌，結(jié)束發(fā)酵；
(4)二期發(fā)酵:一期發(fā)酵結(jié)束以后，溫度降至20?40°C，按接種量I?2%無菌接入配制好的植物乳桿菌懸液，20?40°C，攪拌5分鐘，停止攪拌，靜置培養(yǎng)2?4天，pH 4?5 ;
(5)后期處理:將發(fā)酵好的海藻酵素通過固液分離獲得液體酵素，亦可進一步將液體酵素通過噴霧干燥制成海藻酵素干粉；
(6)活性成分檢測:該方法獲得的海藻酵素具有蛋白酶活性、淀粉酶活性，同時具備海藻活性寡糖等活性成分。
[0003]本發(fā)明提供的海藻酵素可分為褐藻酵素、紅藻酵素和綠藻酵素。褐藻酵素是以海帶{Laminaria、昆布{Ecklonia 左tfrcwe)、裙帶菜{Undaria pinnatifida) >羊棲菜fusifarme)等褐藻中的一種或多種制備成的海藻楽為基礎(chǔ)發(fā)酵而成；紅藻酵素是以紫菜(Porphyra)、石花菜{Gelidium amansii)、tlM (Craci7aria)、角叉菜{Chondrus ocellatus //ο7?.)、麒麟菜{Eucheuma muricatum)等食用紅藻中的一種或多種為基礎(chǔ)發(fā)酵而成；綠藻是以石藥iUlva Iactuca)、講爺{Enteromorpha)等綠藻中的一種或多種為基礎(chǔ)發(fā)酵而成。
[0004]本發(fā)明的特點是獲得的海藻酵素具有蛋白酶活性、淀粉酶活性，同時具備經(jīng)發(fā)酵產(chǎn)生的大量(>2%)海藻活性寡糖如甘露糖醛酸寡糖、古羅糖醛酸寡糖、半乳寡糖、半乳內(nèi)醚寡糖和鼠李寡糖中一種或多種寡糖，海藻酵素寡糖的生成是通過其特定的海藻多糖發(fā)酵過程被降解成相應(yīng)的寡糖該方法生產(chǎn)的酵素產(chǎn)生的蛋白酶、淀粉酶和不同海藻的特定性寡糖的采用以下國標方法檢測:
蛋白酶活性測定采用GB/T 23527-2009或SB/T 10317-1999 ；
淀粉酶活性測定方法采用GBT 24401-2009 ；
寡糖含量測定采用GB/T 5009.7-2008或二硝基水楊酸法。
【具體實施方式】
[0005]下面結(jié)合具體實施例對本發(fā)明作進一步說明實施例1
褐藻酵素的發(fā)酵方法，包括以下步驟:
原料處理:選擇干凈且符合食品衛(wèi)生標準的海帶原料，鮮海帶原料經(jīng)剪切，按重量1:10的比例(Ikg海帶+1kg的水)加水均質(zhì)后移入發(fā)酵罐，干海帶要先進行8-10小時復(fù)水，瀝干水后經(jīng)剪切，按重量1:10的比例(Ikg海帶+1kg的水)加水均質(zhì)后移入發(fā)酵罐，攪拌滅菌，降溫至40 ± 2 °C備用。
[0006]準備發(fā)酵菌種:將食用級枯草芽孢桿菌固體干粉菌劑(101(lCFU/g)接種前用無菌生理鹽水配制成10%的菌懸液；植物乳桿菌干粉菌劑(109CFU/g)，接種前用無菌生理鹽水配制成10%的菌懸液。
[0007]—期發(fā)酵:將滅菌好的發(fā)酵基質(zhì)40°C保溫狀態(tài)下，按接種量1%無菌接入配制好的枯草芽孢桿菌懸液，攪拌發(fā)酵，發(fā)酵條件:40°C發(fā)酵2天，停止攪拌，結(jié)束發(fā)酵。
[0008]二期發(fā)酵:一期發(fā)酵結(jié)束以后，溫度降至30°C，按接種量I %無菌接入配制好的植物乳桿菌懸液，30°C，攪拌5分鐘，停止攪拌，靜置培養(yǎng)2天，pH 4-4.5。
[0009]后期處理:將發(fā)酵好的海藻酵素通過固液分離獲得液體酵素，也可以進一步將固液分離的海藻酵素液通過噴霧干燥制成海藻酵素干粉。
[0010]活性成分檢測:該方法獲得的海藻酵素具有蛋白酶活性、淀粉酶活性，同時具備甘露糖醛酸和古羅糖醛酸寡糖等活性成分。檢測方法:蛋白酶活性GB/T 23527-2009 ;淀粉酶活性:GBT 24401-2009，寡糖含量測定:二硝基水楊酸法。
[0011]實施例2
紅藻酵素的發(fā)酵方法，包括以下步驟:
原料處理:選擇干凈且符合食品衛(wèi)生標準的紫菜原料，鮮紫菜原料經(jīng)剪切，按重量1:15的比例(Ikg混合海藻+15kg的水)加水均質(zhì)后移入發(fā)酵罐，干海藻要先進行8-10小時復(fù)水，瀝干水后經(jīng)剪切，按重量1:15的比例(Ikg混合海藻+15kg的水)加水均質(zhì)后移入發(fā)酵罐，攪拌滅菌，降溫至40 ± 2 °C備用。
[0012]準備發(fā)酵菌種:將食用級枯草芽孢桿菌固體干粉菌劑(101(lCFU/g)接種前用無菌生理鹽水配制成10%的菌懸液，植物乳桿菌干粉菌劑(109CFU/g)，接種前用無菌生理鹽水配制成10%的菌懸液。
[0013]一期發(fā)酵:將滅菌好的發(fā)酵基質(zhì)40°C保溫狀態(tài)下，按接種量1.5%無菌接入配制好的枯草芽孢桿菌懸液，攪拌發(fā)酵，發(fā)酵條件:40°C發(fā)酵4天，停止攪拌，結(jié)束發(fā)酵。
[0014]二期發(fā)酵:一期發(fā)酵結(jié)束以后，溫度降至30°C，按接種量1%無菌接入配制好的植物乳桿菌懸液，30 0C，攪拌5分鐘，停止攪拌，靜置培養(yǎng)2-3天，pH4-4.5。
[0015]后期處理:將發(fā)酵好的紅藻酵素通過固液分離獲得液體酵素，也可以進一步將固液分離的紅藻酵素液通過噴霧干燥制成紅藻酵素干粉。
[0016]活性成分檢測:該方法獲得的海藻酵素具有蛋白酶活性、淀粉酶活性，同時具備半乳寡糖和半乳內(nèi)醚寡糖等活性成分。檢測方法:蛋白酶活性GB/T 23527-2009 ;淀粉酶活性:GBT 24401-2009，寡糖含量測定:二硝基水楊酸法。
[0017]實施例3
綠藻酵素的發(fā)酵方法，包括以下步驟:
原料處理:選擇干凈且符合食品衛(wèi)生標準的石莼原料，鮮石莼原料經(jīng)剪切，按重量1:10的比例(Ikg石莼+1kg的水)加水均質(zhì)后移入發(fā)酵罐，干石莼要先進行8-10小時復(fù)水，瀝干水后經(jīng)剪切，按重量1:10的比例(Ikg石莼+1kg的水)加水均質(zhì)后移入發(fā)酵罐，攪拌滅菌，降溫至40 ± 2 °C備用。
[0018]準備發(fā)酵菌種:將食用級枯草芽孢桿菌固體干粉菌劑(101(lCFU/g)接種前用無菌生理鹽水配制成10%的菌懸液，植物乳桿菌干粉菌劑(109CFU/g)，接種前用無菌生理鹽水配制成10%的菌懸液。
[0019]一期發(fā)酵:將滅菌好的發(fā)酵基質(zhì)40°C保溫狀態(tài)下，按接種量1.5%無菌接入配制好的枯草芽孢桿菌懸液，攪拌發(fā)酵，發(fā)酵條件:40°C發(fā)酵3天，停止攪拌，結(jié)束發(fā)酵。
[0020]二期發(fā)酵:一期發(fā)酵結(jié)束以后，溫度降至30°C，按接種量1%無菌接入配制好的植物乳桿菌懸液，30°C，攪拌5分鐘，停止攪拌，靜置培養(yǎng)2天，pH4-5。
[0021]后期處理:將發(fā)酵好的綠藻酵素通過固液分離獲得液體酵素，也可以進一步將固液分離的綠藻酵素液通過噴霧干燥制成綠藻酵素干粉。
[0022]活性成分檢測:該方法獲得的海藻酵素具有蛋白酶活性、淀粉酶活性，同時具備鼠李寡糖，檢測方法:蛋白酶活性GB/T 23527-2009 ;淀粉酶活性:GBT 24401-2009，寡糖含量測定:二硝基水楊酸法。
【主權(quán)項】
1.一種雙期發(fā)酵生產(chǎn)海藻酵素的方法，其特征是采用枯草芽孢桿菌進行一期發(fā)酵，再采用植物乳桿菌進行二期發(fā)酵獲得具有酶活性和特征性寡糖的海藻酵素，包括以下步驟: (1)原料處理:選擇符合食品衛(wèi)生標準的海藻原料，鮮海藻原料或干海藻復(fù)水后經(jīng)剪切、加水均質(zhì)后移入發(fā)酵罐，攪拌滅菌，降溫至30?50°C備用； (2)發(fā)酵菌種準備:將食用級枯草芽孢桿菌固體干粉菌劑與植物乳桿菌干粉菌劑，接種前用無菌生理鹽水分別配制成5?20%的菌懸液，備用； (3)—期發(fā)酵:將滅菌好的發(fā)酵基質(zhì)30?50°C保溫狀態(tài)下，按接種量I?2%無菌接入配制好的枯草芽孢桿菌懸液，攪拌發(fā)酵，發(fā)酵條件:30?50°C發(fā)酵2?5天，停止攪拌，結(jié)束發(fā)酵； (4)二期發(fā)酵:一期發(fā)酵結(jié)束以后，溫度降至20?40°C，按接種量I?2%無菌接入配制好的植物乳桿菌懸液，20?40°C，攪拌5分鐘，停止攪拌，靜置培養(yǎng)2?4天，pH 4?5 ; (5)后期處理:將發(fā)酵好的海藻酵素通過固液分離獲得液體酵素，亦可進一步將液體酵素通過噴霧干燥制成海藻酵素干粉； (6)活性成分檢測:該方法獲得的海藻酵素具有蛋白酶活性、淀粉酶活性，同時具備海藻活性寡糖等活性成分，均可采用相關(guān)國標方法檢測。
2.根據(jù)權(quán)利要求1，以一種或多種褐藻為原料經(jīng)上述雙期發(fā)酵而獲得褐藻酵素，其特征是含有特征性活性寡糖一一甘露糖醛酸寡糖和古羅糖醛酸寡糖。
3.根據(jù)權(quán)利要求1，以一種或多種紅藻為原料經(jīng)上述雙期發(fā)酵而獲得紅藻酵素，其特征是含有特征性活性寡糖一一半乳寡糖和半乳內(nèi)醚寡糖。
4.根據(jù)權(quán)利要求1，以一種或多種綠藻為原料經(jīng)上述雙期發(fā)酵而獲得綠藻酵素，其特征是含有特征性活性寡糖一一鼠李寡糖。
【專利摘要】本發(fā)明提供了一種發(fā)酵生產(chǎn)營養(yǎng)海藻酵素的方法，以褐藻、紅藻和綠藻等大型海藻中的一種或多種為基礎(chǔ)，通過粉碎、勻漿、加熱、調(diào)節(jié)PH等工藝，經(jīng)食用級枯草芽孢桿菌進行一期發(fā)酵和食用級植物乳桿菌二期發(fā)酵，產(chǎn)生高活性的蛋白酶、淀粉酶等酵素成分和海藻活性寡糖等特定的生理活性物質(zhì)，特別是改善了海藻的口味和易消化性，形成高品質(zhì)的海藻酵素。
【IPC分類】A23L1-337
【公開號】CN104705709
【申請?zhí)枴緾N201510159810
【發(fā)明人】江曉路, 沈照鵬, 張京良, 王鵬
【申請人】青島海洋生物醫(yī)藥研究院股份有限公司
【公開日】2015年6月17日
【申請日】2015年4月7日