牛膝多糖作為飼料添加劑的用途及相應(yīng)飼料的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于飼料添加劑領(lǐng)域，涉及一種中草藥飼料添加劑，具體涉及一種牛膝多 糖以飼料添加劑的形式添加在仔豬日糧（仔豬日常飼料）中以抑制病原菌侵染制、降低仔 豬黃白痢發(fā)病率。
【背景技術(shù)】
[0002] 仔豬黃白痢又稱新生豬腹瀉，是仔豬黃痢和仔豬白痢的合稱，都是由致病性大腸 桿菌等引起的一種急性傳染病。目前已分離的仔豬黃痢、白痢的血清型眾多，各血清型疫苗 之間有效的交叉保護(hù)性差，給本病防治造成了很大的難度。國(guó)內(nèi)的仔豬黃白痢的發(fā)病率達(dá) 20% -60%，出現(xiàn)混合感染和繼發(fā)感染時(shí)，病死率可達(dá)60%以上，給養(yǎng)豬業(yè)造成了嚴(yán)重的危 害。隨著畜牧業(yè)集約化程度的提高和飼料工業(yè)的發(fā)展，全球范圍內(nèi)，由于抗生素的亂用，耐 藥菌株增多，導(dǎo)致此病也在日益惡化，多呈季節(jié)流行性和地方流行性。針對(duì)仔豬黃白痢、生 長(zhǎng)受阻等應(yīng)激，國(guó)內(nèi)外做了大量研究，主要是抗生素、高鋅、益生素、寡糖、酶制劑、酸化劑等 方面的研究。近年來也有許多研究表明，植物多搪具有促進(jìn)機(jī)體免疫力、抗菌、抗病毒、抗寄 生蟲、抗腫瘤、抗輻射、抗衰老、抗炎、降低血脂等一系列生物學(xué)活性，在一量劑量范圍內(nèi)具 有改善動(dòng)物生產(chǎn)性能等作用。
[0003] 我國(guó)地域遼闊，中草藥資源十分豐富，開發(fā)利用中草藥飼料添加劑具有得天獨(dú)厚 的條件。牛膝多糖是從莧科植物牛膝中提取、分離、純化得到的一種生物活性多糖，其相對(duì) 分子質(zhì)量為1300-1400,水溶性好，具有安全性高、作用穩(wěn)定、副作用小、適用面廣、對(duì)機(jī)體損 害小和可注射又可服用等優(yōu)點(diǎn)，已作為一種中草藥應(yīng)用于腫瘤等疾病的防制。其主要具有 免疫調(diào)節(jié)作用、抑菌、抗腫瘤、抗衰老、抗凝血、降糖、治療哮喘等生物學(xué)功能，尤以提高機(jī)體 免疫力和抗病、抑菌能力作用明顯，并可望在調(diào)控新陳代謝、提高動(dòng)物健康水平和畜產(chǎn)品品 質(zhì)方面發(fā)揮重要作用，具有寬廣的藥物開發(fā)及應(yīng)用前景。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是：針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)中仔豬抗應(yīng)激能力差，易感染病原 菌，黃白痢發(fā)病率和死亡率高的問題，提供一種中草藥牛膝多糖作為飼料添加劑的用途及 相應(yīng)飼料。該中草藥牛膝多糖作為飼料添加劑添加到仔豬日糧中，能顯著促進(jìn)仔豬生長(zhǎng)，抑 制病原菌對(duì)仔豬腸道組織的侵染，降低仔豬黃白痢發(fā)病率，增強(qiáng)仔豬腸上皮細(xì)胞緊密連接 主要相關(guān)基因的表達(dá)。
[0005] 為了解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明所采用的技術(shù)方案是：牛膝多糖在制備仔豬用抑 制腸道病原菌侵染劑和仔豬用降低黃白痢發(fā)病率藥劑中的應(yīng)用。
[0006] 本發(fā)明采用的另一種技術(shù)方案是：牛膝多糖在制備抑制腸道病原菌侵染和降低黃 白痢發(fā)病率的飼料中的應(yīng)用。
[0007] 本發(fā)明同時(shí)提供一種仔豬用飼料，該飼料中添加有牛膝多糖，該牛膝多糖的添加 量為每1千克飼料添加〇. 5-1. 5克。
[0008] 上述提及的牛膝多糖為市購(gòu)產(chǎn)品，可為市面上流通或貯藏的按不同工藝技術(shù)生產(chǎn) 的各種形態(tài)的牛膝多糖。使用時(shí)，可將牛膝多糖應(yīng)用于被法規(guī)許可添加于仔豬飼料或飼料 添加劑中的載體或者基質(zhì)。
[0009] 當(dāng)牛膝多糖添加到仔豬日常飼料中時(shí)，可采用的添加方式包括將其以固體混合的 方式直接與仔豬日常飼料混合，攪勻，或是加水溶解后以噴霧形式均勻噴灑在仔豬日常飼 料中或是其他添加方法。如果適當(dāng)?shù)脑挘Ｏザ嗵强梢院屯ǔ５淖胸i飼料添加劑一起添加， 如維生素、礦物質(zhì)、微量元素等。
[0010] 本發(fā)明通過將牛膝多糖作為飼料添加劑添加在仔豬日常飼料中，具有顯著增強(qiáng)仔 豬腸上皮細(xì)胞緊密連接主要相關(guān)基因表達(dá)，抑制病原菌對(duì)仔豬腸道組織的侵染，降低仔豬 黃白痢發(fā)病率，促進(jìn)仔豬生長(zhǎng)的優(yōu)點(diǎn)。
【具體實(shí)施方式】
[0011] 以下結(jié)合實(shí)施例旨在進(jìn)一步說明本發(fā)明，而非限制本發(fā)明。
[0012] 實(shí)施例1牛膝多糖對(duì)仔豬生長(zhǎng)性能的影響
[0013] 試驗(yàn)飼料及分組：選取母豬胎次相同、產(chǎn)活仔數(shù)相同的8窩仔豬（調(diào)整為每窩12 頭，與母豬同籠），隨機(jī)分為兩個(gè)處理組，分別為對(duì)照組和牛膝多糖添加組（本發(fā)明飼料 組），每個(gè)處理4個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)為一窩（或籠），分別飼喂基礎(chǔ)日糧和本發(fā)明飼料日糧。 仔豬的基礎(chǔ)日糧配制參照NRC(1998)豬的營(yíng)養(yǎng)需要（< 5kg)。本發(fā)明飼料日糧為每1千 克基礎(chǔ)日糧中用1.0克牛膝多糖替代基礎(chǔ)日糧中相應(yīng)質(zhì)量的玉米粉。配制試驗(yàn)飼料時(shí)，每 種飼料原料采用錘片式粉碎機(jī)粉碎（篩片孔徑為1_)，按比例混合并攪拌均勻，制成直徑 2mm、長(zhǎng)度3mm的硬顆粒，在室溫下風(fēng)干后4°C冰箱貯存?zhèn)溆谩?br>[0014] 試驗(yàn)方法：試驗(yàn)在同一棟封閉豬舍內(nèi)進(jìn)行。本發(fā)明飼料組的仔豬從7日齡開始喂 飼本發(fā)明飼料日糧至35日齡，為期28天，自由采食、飲水，免疫消毒程序按豬場(chǎng)常規(guī)方法進(jìn) 行。以重復(fù)籠為單位飼喂，每天觀察記錄試驗(yàn)豬的采食、排糞等情況。
[0015] 試驗(yàn)結(jié)果：從表1可知，本發(fā)明飼料組的仔豬喂飼添加有牛膝多糖的飼料后，平均 日增重顯著提高，黃白痢發(fā)病率顯著降低。表明：牛膝多糖能顯著促進(jìn)仔豬生長(zhǎng)，顯著降低 仔豬黃白痢發(fā)病率。
[0016] 表1牛膝多糖對(duì)仔豬生長(zhǎng)性能的影響
[0018] 注：同行數(shù)據(jù)中標(biāo)有不同字母者為差異顯著（P<0.05)，下同。
[0019] 實(shí)施例2牛膝多糖對(duì)沙門氏菌侵染IPEC-1 (仔豬小腸上皮細(xì)胞）的影響
[0020] 沙門氏菌準(zhǔn)備：將LB固體培養(yǎng)基上分離培養(yǎng)獲得的單個(gè)沙門氏菌菌落，接種到 5ml液體LB培養(yǎng)基中，37°C，225r/min震蕩培養(yǎng)過夜后，取10 μ 1含有沙門氏菌的液體LB 培養(yǎng)基接種到5ml液體LB培養(yǎng)基中，37°C過夜，使得沙門氏桿菌達(dá)到指數(shù)生長(zhǎng)期。
[0021 ] 沙門氏桿菌侵染試驗(yàn)，將IPEC-1細(xì)胞接種于24孔細(xì)胞培養(yǎng)板，每孔含5 X 104個(gè)細(xì) 胞，每組設(shè)3個(gè)平行孔，待細(xì)胞貼壁后，分別每天更換原來的培養(yǎng)基（對(duì)照組）和含牛膝多 糖（lOOμg/ml)的培養(yǎng)基，培養(yǎng)2天。將之前準(zhǔn)備的沙門氏菌1000r/min，離心10min，棄去 上清，用5ml的DMEM/F12培養(yǎng)液（不含青/鏈霉素）重新懸浮細(xì)菌。每孔接種100 μ 1含 沙門氏菌的DMEM/F12培養(yǎng)基，并將培養(yǎng)板800r/min，離心10min，從而將細(xì)菌沉淀至培養(yǎng)板 底充分與IPEC-1細(xì)胞接觸。在37°C，5% C02細(xì)胞培養(yǎng)箱中孵育60min。60min后移去培養(yǎng) 基，用PBS洗滌2遍，每孔加入lml含有100μg/ml Gentamicin，在37°C，5% C02細(xì)胞培養(yǎng) 箱中孵育120min以除去未侵染進(jìn)細(xì)胞內(nèi)的沙門氏菌。用PBS洗滌3遍后，每孔加入200ul l%Triton X-100,在37°C的孵箱中裂解5min，再于每孔加入800 μ1 PBS充分混勻。再將 獲得的裂解液稀釋1X 1〇3后，取100 μ 1接種于固體LB培養(yǎng)基，培養(yǎng)過夜后計(jì)數(shù)培養(yǎng)板上 的菌落數(shù)。由表2可以得知，牛膝多糖能夠顯著減少沙門氏菌對(duì)IPEC-1細(xì)胞的侵染。
[0022] 表2牛膝多糖對(duì)沙門氏菌侵染IPEC-1細(xì)胞的影響
[0024] 實(shí)施例3牛膝多糖對(duì)IPEC-1細(xì)胞緊密連接主要相關(guān)基因表達(dá)的影響
[0025] 將IPEC-1細(xì)胞接種于6孔細(xì)胞培養(yǎng)板，每孔含1 X 106個(gè)細(xì)胞，每處理設(shè)3個(gè)平 行孔，待細(xì)胞貼壁后，吸棄原培養(yǎng)基，分別每天更換原來的培養(yǎng)基（對(duì)照組）和含牛膝多糖 (100 μ g/ml)的培養(yǎng)基，待細(xì)胞生長(zhǎng)覆蓋培養(yǎng)板底部大于90 %后棄上清，用冰冷的PBS洗 細(xì)胞2次，每孔加 lml Trizol裂解細(xì)胞，然后按常規(guī)方法提取RNA、cDNA反轉(zhuǎn)錄、實(shí)時(shí)熒光 PCR，采用2 (AAet)計(jì)算各基因 mRNA的相對(duì)表達(dá)量。由表3可以得知，牛膝多糖能顯著上調(diào) IPEC-1細(xì)胞緊密連接主要相關(guān)基因表達(dá)，說明牛膝多糖有利于改善腸道上皮組織的屏障功 能。
[0026] 表3牛膝多糖對(duì)IPEC-1細(xì)胞緊密連接主要相關(guān)基因表達(dá)的影響
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 牛膝多糖在制備仔豬用抑制腸道病原菌侵染劑中的應(yīng)用。2. 牛膝多糖在制備仔豬用降低黃白痢發(fā)病率藥劑中的應(yīng)用。3. 牛膝多糖在制備抑制腸道病原菌侵染和降低黃白痢發(fā)病率的飼料中的應(yīng)用。4. 一種仔豬用飼料，其特征在于，該飼料中添加有牛膝多糖，該牛膝多糖的添加量為每 1千克該飼料添加〇. 5-1. 5克。5. 如權(quán)利要求4所述的仔豬用飼料，其特征在于，所述仔豬用飼料是將牛膝多糖是直 接添加于仔豬日常飼料中，混合，攪勻得到。6. 如權(quán)利要求4所述的仔豬用飼料，其特征在于：所述仔豬用飼料是將牛膝多糖溶于 水后，再把溶有牛膝多糖的水均勻噴灑在仔豬日常飼料中，得到。
【專利摘要】一種牛膝多糖作為飼料添加劑的用途及相應(yīng)飼料，牛膝多糖作為飼料添加劑添加在仔豬日常飼料中，能顯著增強(qiáng)腸上皮細(xì)胞緊密連接主要相關(guān)基因的表達(dá)，抑制仔豬腸道病原菌的侵染，降低仔豬黃白痢發(fā)病率，提高仔豬的生長(zhǎng)速度；具有綠色、天然、無(wú)耐藥、無(wú)殘留，功能多、兼顧生長(zhǎng)和抗疾病等特性；能較大地降低仔豬黃白痢發(fā)病率、降低仔豬養(yǎng)殖成本，適合產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)。
【IPC分類】A23K20/163, A23K50/30
【公開號(hào)】CN105285420
【申請(qǐng)?zhí)枴緾N201510887533
【發(fā)明人】王紅權(quán), 趙玉蓉, 賀建華, 禹利君, 鄔靜
【申請(qǐng)人】湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)
【公開日】2016年2月3日
【申請(qǐng)日】2015年12月7日