共生培養(yǎng)制備富含蝦青素的飼料添加劑的方法
【技術領域】
[0001] 本發(fā)明涉及共生培養(yǎng)制備富含蝦青素的飼料添加劑的方法，特別涉及共生培養(yǎng)制 備富含蝦青素的海洋紅酵母發(fā)酵飼料添加劑的方法，屬于生物飼料技術領域。
【背景技術】
[0002] 海洋紅酵母是指自然海域中存在的酵母菌，其細胞中富含蛋白質(zhì)、氨基酸、肝糖顆 粒、不飽和脂肪酸、類胡蘿卜素、蝦青素和各種未知營養(yǎng)因子等生物活性物質(zhì)。隨著水產(chǎn)養(yǎng)殖 業(yè)的蓬勃發(fā)展，海洋紅酵母已經(jīng)被廣泛選用為海參、蝦、蟹、貝的幼體浮游期的鮮活餌料。海 洋紅酵母的功能很大一部分與其含有的蝦青素有關，蝦青素是一種類胡蘿卜素，具有極強的 抗氧化、消除自由基的作用，被譽為"超級維生素 E"，在水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)中富含蝦青素的飼料能 能顯著地增加魚、蝦、蟹等的抗病能力，增強養(yǎng)殖對象的免疫能力，提高海洋生物的繁殖能 力而備受人們關注。
[0003] 當前傳統(tǒng)生產(chǎn)工藝生產(chǎn)的海洋紅酵母飼料普遍存在的問題是蝦青素的含量低，極 大地影響了海洋紅酵母發(fā)酵飼料的功能性，如何生產(chǎn)一種價格低廉的富含蝦青素的海洋紅 酵母發(fā)酵飼料成為亟待解決的問題。
[0004] 中國專利文獻CN104774900A(申請?zhí)?01510221380.6)公開了一種利用海洋紅酵 母菌發(fā)酵生產(chǎn)飼料添加劑蝦青素的工藝，以葡萄糖、酵母浸粉等為主要原料，進行特種酵母 菌種的液態(tài)深層發(fā)酵培養(yǎng);發(fā)酵成熟后的蝦青素酵母菌液用栗打入臥式低速離心機進行離 心;將離心獲得的蝦青素酵母菌渣懸液用箱式壓濾機壓榨到固形物含量為30%左右，移入 流化床中低溫干燥將水分含量降至5%以下，然后經(jīng)粉碎、過篩得到蝦青素含量10%的飼料 添加劑蝦青素。
[0005] 中國專利文獻CN 101703152A(申請?zhí)?00910193460.X)公開了一種利用啤酒麥糟 制備蝦青素飼料添加劑的方法，該方法包括下述步驟：啤酒麥糟的預處理；啤酒麥糟的酶 解;滅菌;紅發(fā)夫酵母種子液的制備;紅發(fā)夫酵母發(fā)酵培養(yǎng);以及干燥等。
[0006] 上述產(chǎn)品中，蝦青素含量依然較低，并且紅發(fā)夫酵母的培養(yǎng)由于條件苛刻，導致用 紅發(fā)夫酵母進行制備蝦青素時，成本明顯提高。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007] 本發(fā)明針對現(xiàn)有技術的不足，提供一種價格低廉、可廣泛應用于海洋養(yǎng)殖的共生 培養(yǎng)制備富含蝦青素的飼料添加劑的方法。
[0008] 本發(fā)明技術方案如下：
[0009] 共生培養(yǎng)制備富含蝦青素的飼料添加劑的方法，步驟如下：
[0010] (1)將含有1.5~2.5 X108個/ml的紅發(fā)夫酵母的種子液按體積百分比5~10%接 種于液體發(fā)酵培養(yǎng)基中，在溫度25~28°C、通氣量1.0~1.5vvm、pH 4.5~5.5的條件下，攪 拌發(fā)酵，發(fā)酵期間流加碳源溶液和氮源溶液，使發(fā)酵罐中的碳源濃度為10~20g/L，氮源濃 度為0.8~1.2g/L，發(fā)酵30~40h，得一次發(fā)酵液；
[0011]所述的液體發(fā)酵培養(yǎng)基每升組分如下：
[0012] 鹿糖20~30g，葡萄糖10~15g，玉米粉5~10g，酵母膏8~15g，大豆柏5~10g，磷酸 氫二鉀0.5~1.5g，氯化銨2.5~5g，無水硫酸鎂2.5~5g，水定容至1L，pH 5.0~5.5;
[0013] (2)直接向步驟（1)制得的一次發(fā)酵液中繼續(xù)接種含有濃度為5.5~7.5 X 108個/ ml的海洋紅酵母種子液，接種量為一次發(fā)酵液體積的5~20%，在溫度25~30°C、通氣量1.5 ~2.0vvm、pH 4.5~5.5的條件下，攪拌發(fā)酵，發(fā)酵期間流加碳源溶液和氮源溶液，使發(fā)酵罐 中的碳源濃度為20~30g/L，氮源濃度為1.80~2.5g/L，發(fā)酵20~30h，制得混合發(fā)酵液；
[0014] (3)將步驟(2)制得的混合發(fā)酵液經(jīng)離心，固液分離，取固體，經(jīng)真空冷凍干燥，制 得富含蝦青素的飼料添加劑。
[0015] 根據(jù)本發(fā)明優(yōu)選的，所述步驟⑴中，含有1.5~2.5X108個/ml的紅發(fā)夫酵母的種 子液，制備步驟如下：
[0016] a、將紅發(fā)夫酵母接種于活化培養(yǎng)基I中，20~30°C活化培養(yǎng)24~48h，制得活化紅 發(fā)夫酵母；
[0017] b、將步驟a制得的活化紅發(fā)夫酵母接種于搖瓶培養(yǎng)基I中，在20~30°C、200~ 240r/min條件下，培養(yǎng)24~48h，制得紅發(fā)夫酵母一級種子；
[0018] c、將步驟b制得的紅發(fā)夫酵母一級種子按5~10%的體積百分含量接種于種子培 養(yǎng)基I中，調(diào)節(jié)通氣量為0.5~l.Ovvm，通氣攪拌速度為150~300rpm、溫度為25~30°C培養(yǎng) 24~30h，制得紅發(fā)夫酵母的種子液。經(jīng)檢測，菌體濃度為1.5~2.5 X 108個/ml。
[0019] 進一步優(yōu)選的，所述活化培養(yǎng)基I每升組分如下：
[0020] 葡萄糖20~30g，蛋白胨5~10g，海水晶5~10g，磷酸氫二鉀0.5~1.5g，水定容至 lL，pH4.5~5.5。
[0021 ]進一步優(yōu)選的，所述搖瓶培養(yǎng)基I每升組分如下：
[0022] 葡萄糖20~30g，蛋白胨5~10g，酵母浸粉5~10g，海水晶5~10g，磷酸氫二鉀1~ 1.5g，無水硫酸鎂0.5~lg，水定容至lL，pH4.5~5.5。
[0023] 進一步優(yōu)選的，所述種子培養(yǎng)基I每升組分如下：
[0024] 葡萄糖25~35g，蛋白胨10~15g，酵母浸粉5~10g，海水晶2~10g，氯化銨2~10g， 磷酸氫二鉀10~15g，無水硫酸鎂0.5~1.5g，水定容至lL，pH 4.5~5.5。
[0025]根據(jù)本發(fā)明優(yōu)選的，所述步驟(2)中，含有濃度為5.5~7.5 X 108個/ml的海洋紅酵 母種子液，制備步驟如下：
[0026] A、將海洋紅酵母接種于活化培養(yǎng)基II中，20~30°C活化培養(yǎng)24~48h，制得活化海 洋紅酵母；
[0027] B、將步驟A制得的活化海洋紅酵母接種于搖瓶培養(yǎng)基II中，在20~30°C、200~ 240r/min條件下，培養(yǎng)24~48h，制得海洋紅酵母一級種子；
[0028] C、將步驟B制得的海洋紅酵母一級種子按5~10%的體積百分含量接種于種子培 養(yǎng)基II中，調(diào)節(jié)通氣量為0.5~l.Ovvm，通氣攪拌速度為150~300rpm、溫度為25~30°C培養(yǎng) 24~30h，制得海洋紅酵母的種子液。經(jīng)檢測，菌體濃度為5.5~7.5 X 108個/ml。
[0029] 進一步優(yōu)選的，所述活化培養(yǎng)基II每升組分如下：
[0030] 葡萄糖20~30g，酵母浸粉5~10g，磷酸氫二鉀1.0~5g，無水硫酸鎂0.5~1.5g，水 定容至lL，pH 4.0~5.5。
[0031 ]進一步優(yōu)選的，所述搖瓶培養(yǎng)基II每升組分如下：
[0032] 葡萄糖20~30g，蛋白胨10~20g，酵母浸粉5~10g，海水晶15~25g，磷酸氫二鉀 1.0~2.(^，無水硫酸鎂0.5~1.58，水定容至11^4!14.0~5.5。
[0033] 進一步優(yōu)選的，所述種子培養(yǎng)基II每升組分如下：
[0034] 葡萄糖20~30g，蛋白胨10~20g，酵母浸粉5~10g，海水晶7~15g，氯化銨5~10g， 磷酸氫二鉀7~15g，無水硫酸鎂1~3g，水定容至lL，pH4.0~5.5。
[0035] 根據(jù)本發(fā)明優(yōu)選的，所述步驟（1)和步驟(2)中流加碳源溶液的質(zhì)量濃度為50g/L， 流加氮源溶液的質(zhì)量濃度為3g/L。
[0036] 根據(jù)本發(fā)明優(yōu)選的，所述步驟(1)和步驟(2)中碳源選自葡萄糖、蔗糖或葡萄糖漿； 氮源選自蛋白胨、酵母浸粉、玉米漿粉、豆柏粉、硝酸鈉或硫酸銨。
[0037]根據(jù)本發(fā)明優(yōu)選的，所述步驟(3)中離心機轉(zhuǎn)速為1000~1500轉(zhuǎn)/分，離心時間20 ~30min〇
[0038] 根據(jù)本發(fā)明優(yōu)選的，所述步驟(3)中真空冷凍干燥溫度為-20°C~-30°C。
[0039] 有益效果
[0040] 1、本發(fā)明首次采用紅發(fā)夫酵母和海洋紅酵母共生發(fā)酵培養(yǎng)的方法制備得到富含 蝦青素的海洋紅酵母發(fā)酵飼料，極大地提高了海洋紅酵母飼料的功能性，應用在海洋水產(chǎn) 養(yǎng)殖中可顯著地增加魚、蝦、蟹等的抗病能力，增強養(yǎng)殖對象的免疫能力，且價格便宜，適宜 在水產(chǎn)養(yǎng)殖中大力推廣；
[0041] 2、本專利在發(fā)酵罐發(fā)酵階段添加玉米粉、大豆柏、葡萄糖漿等為原料，且先添加紅 發(fā)夫酵母培養(yǎng)，再添加海洋紅酵母培養(yǎng)，這樣添加的目的是因為相對于海洋紅酵母，紅發(fā)夫 酵母對培養(yǎng)基的要求比較苛刻，繁殖速度也慢，等紅發(fā)夫酵母生長完成后再加入海洋紅酵 母，由于海洋紅酵母生長比較旺盛，可以充分地利用剩余的營養(yǎng)物質(zhì)發(fā)酵，從而可以進一步 降低生產(chǎn)成本。
【具體實施方式】
[0042]下面結(jié)合實施例對本發(fā)明的技術方案做進一步闡述，但本發(fā)明的保護范圍并不僅 限于此。
[0043] 實施例中的紅發(fā)夫酵母和海洋紅酵母均購自中國海洋大學。
[0044] 實施例1
[0045] 共生培養(yǎng)制備富含蝦青素的飼料添加劑的方法，步驟如下：
[0046] (1)將含有2.5X108個/ml的紅發(fā)夫酵母的種子液按體積百分比5%接種于液體發(fā) 酵培養(yǎng)基中，在溫度25°(：、通氣量1.0^ 111、?!14.5的條件下，攪拌發(fā)酵，發(fā)酵期間流加碳源溶 液和氮源溶液，使發(fā)酵罐中的碳源濃度為l〇g/L，氮源濃度為0.8g/L，發(fā)酵30h，得一次發(fā)酵 液；
[0047] 所述的液體發(fā)酵培養(yǎng)基沒升組分如下：
[0048]蔗糖20g，葡萄糖10g，玉米粉5g，酵母膏8g，大豆柏10g，磷酸氫二鉀1.5g，氯化銨 5g，無水硫酸鎂5g，水定容至lL，pH 5.2;
[0049] (2)直接向步驟(1)制得的一次發(fā)酵液中繼續(xù)接種含有濃度為7.5 X 108個/ml的海 洋紅酵母種子液，接種量為一次發(fā)酵液體積的1〇%，在溫度25°(：、通氣量1.5^111、？!14.5的 條件下，攪拌發(fā)酵，發(fā)酵期間流加碳源溶液和氮源溶液，使發(fā)酵罐中的碳源濃度為20g/L，氮 源濃度為1.80g/L，發(fā)酵20h，制得混合發(fā)酵液；
[0050] (3)將步驟(2)制得的混合發(fā)酵液經(jīng)1000轉(zhuǎn)/分離心20min，固液分離，取固體，經(jīng)_ 20°C真空冷凍干燥，制得富含蝦青素的飼料添加劑。
[0051] 所述步驟(1)中，含有2.5X108個/ml的紅發(fā)夫酵母的種子液，制備步