包含乳酸菌的腸道屏障功能促進劑的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明在于提供能夠促進腸道屏障功能并由此能夠預防或治療代謝綜合征的腸道屏障功能促進劑以及包含該腸道屏障功能促進劑的醫(yī)藥品以及飲食品。具體而言，為包含面包乳桿菌(Lactobacillus crustorum)的菌體或菌體處理物的腸道屏障功能促進劑。本發(fā)明的腸道屏障功能促進劑促進腸道屏障功能，而且對于起因于代謝綜合征等的腸道屏障功能障礙的狀態(tài)或疾病的預防及治療有效地發(fā)揮功能。NITE BP-0172120131017 NITE BP-0172220131017 NITE BP-0172320131017
【專利說明】
包含乳酸菌的腸道屏障功能促進劑
技術領域
[0001] 本發(fā)明設及包含乳酸菌的飲食品及腸道屏障功能促進劑W及包含腸道屏障功能 促進劑的醫(yī)藥組合物W及飲食品。更詳細而言，設及包含面包乳桿菌化actobacillus crustorum)的飲食品及腸道屏障功能促進劑W及包含腸道屏障功能促進劑的醫(yī)藥組合物 W及飲食品。
【背景技術】
[0002] 糖尿病、高血壓、高脂血癥等被稱作生活習慣病的疾病與內臟脂肪型肥胖密切相 關。將除內臟脂肪型肥胖W外，還并發(fā)高血糖、高血壓、高脂血癥中任意巧中W上的狀態(tài)稱作 代謝綜合征(代謝癥候群或內臟脂肪癥候群）。尤其是由于在處于飽食狀態(tài)的發(fā)達國家中， 代謝綜合征患者人數(shù)有增加趨勢，并且也擔屯、醫(yī)療費增加，故而代謝綜合征的對策成為當 務之急。
[0003] 作為代謝綜合征共通的基礎病癥，指出了在生物體中輕度的慢性炎癥(非專利文 獻2、3)。作為誘發(fā)炎癥的物質，已知有飽和脂肪酸、酒精W及牙周病菌等。
[0004] 近年來，還指出了腸內細菌、腸內環(huán)境與伴隨慢性炎癥的肥胖的關系(非專利文獻 4)。在每一個人的腸內，100種W上、100兆個W上的腸內細菌形成腸內菌群（腸內微生物 叢）。腸內細菌中的某種細菌能夠在生物體內引起炎癥反應。例如，顯示出在小鼠、人中，作 為腸內革蘭氏陰性菌的細胞壁成分的脂多糖（lip〇p〇lysaccharide，LPS)促進促炎因子的 釋放(非專利文獻4)。
[0005] 在腸道上皮細胞下，大量存在巨隧細胞、樹突狀細胞、T細胞、B細胞運樣的免疫類 細胞。通常，腸道上皮細胞通過緊密連接結構而相互牢固地連接，嚴密控制W便不使高分子 量物質透過細胞間隙。此外，腸道上皮細胞上還存在用于從細胞排出疏水性異物的轉運蛋 白。運些緊密連接結構、轉運蛋白等承擔防止異物侵入的腸道屏障功能。然而，因飽和脂肪 酸、酒精等的原因，腸道屏障受損而腸道透過性升高時，腸道內存在的腸內細菌或其菌體成 分等的高分子量物質介由細胞間隙而向生物體內移動并刺激免疫類細胞等，從而促進促炎 因子的釋放并誘發(fā)炎癥。
[0006] 期望有能夠促進腸道屏障功能從而預防慢性炎癥，并由此來預防或治療代謝綜合 征的方法。
[0007] 已知作為產生乳酸的細菌的乳酸菌為了調整腸內菌群的均衡性、維持健康的腸內 環(huán)境而發(fā)揮重要的功能。作為研究乳酸菌對腸道屏障功能的影響的例子，報道了能夠附著 于腸道細胞的乳桿菌使巧等的礦物質的腸道透過性提高(專利文獻1)。此外，報道了鼠李糖 乳桿菌化actobacillus 1'11日1]1]1〇3113)0化2838、德氏乳桿菌保加利亞亞種化日(31:〇6日(3；[11113 delbrueckii subsp . Bulgaricus)MEP190901、加氏乳桿菌化actobacillus gasseri) MEP190903及作為它們菌體成分的脂憐壁酸具有抑制腸道透過性升高的作用(專利文獻2)。 [000引現(xiàn)有技術文獻
[0009] 專利文獻
[0010] 專利文獻1日本特表2002-507997號公報
[0011] 專利文獻2日本特開2008-212006號公報
[0012] 非專利文獻
[0013] 非專利文獻1平成23年（2011年）日本國民健康?營養(yǎng)調查（日本語原文「國民健 康?栄養(yǎng)調査」）
[0014] 非專利文獻2 F邸S Lett. ,582,97-105(2008)
[0015] 非專利文獻3 J.Clin. Invest. ,116,1793-1801(2006)
[0016] 非專利文獻4日本腸內細菌學雜志（日本語原文「腸內細菌學雑誌」），24,193-201 (2010)

【發(fā)明內容】
[0017] 技術問題
[0018]本發(fā)明所要解決的技術課題在于提供能夠促進腸道屏障功能并由此能夠預防或 治療代謝綜合征的腸道屏障功能促進劑W及包含該腸道屏障功能促進劑的醫(yī)藥品W及飲 食品。
[0019]技術方案
[0020] 本
【發(fā)明人】發(fā)現(xiàn)面包乳桿菌在培養(yǎng)人腸道上皮細胞中使作為腸道屏障功能的指標 的跨膜電阻升高。此外，還發(fā)現(xiàn)面包乳桿菌在培養(yǎng)人腸道上皮細胞W及小鼠小腸上皮中誘 導緊密連接相關基因的表達。進而，發(fā)現(xiàn)對攝取高脂肪食物的小鼠給予面包乳桿菌時，顯示 出糖代謝異常抑制效果，從而完成了本發(fā)明。
[0021] 旨P，本發(fā)明包含W下內容，但并不限定于此。
[0022] [1]-種飲食品，其特征在于，包含面包乳桿菌的菌體或菌體處理物。
[0023] [2]根據(jù)[1]所述的飲食品，其特征在于，面包乳桿菌為面包乳桿菌SAM2695株、面 包乳桿菌SAM2697株、面包乳桿菌SAM2698株、面包乳桿菌JCM 15951T株或巧巾W上所述菌株 的組合。
[0024] [3]根據(jù)[1]或[2]所述的飲食品，其特征在于，包含面包乳桿菌的活菌體。
[0025] [4]-種腸道屏障功能促進劑，其特征在于，包含面包乳桿菌的菌體或菌體處理 物。
[0026] [5]根據(jù)[4]所述的腸道屏障功能促進劑，其特征在于，面包乳桿菌為面包乳桿菌 SAM2695株、面包乳桿菌SM2697株、面包乳桿菌SAM2698株、面包乳桿菌JCM 15951T株或巧中 W上所述菌株的組合。
[0027] [6]根據(jù)[4]或[引所述的腸道屏障功能促進劑，其特征在于，包含面包乳桿菌的活 菌體。
[0028] [7] -種醫(yī)藥組合物，其特征在于，包含[4]~[6]中任一項所述的腸道屏障功能促 進劑，且用于預防或治療選自糖尿病、高血壓、高脂血癥W及肥胖中的1種W上的狀態(tài)或者 疾病。
[0029] [引一種飲食品，其特征在于，包含[4]~[6]中任一項所述的腸道屏障功能促進 劑。
[0030] [9]根據(jù)[引所述的飲食品，其特征在于，用于預防或治療選自糖尿病、高血壓、高 脂血癥W及肥胖中的1種W上的狀態(tài)或者疾病。
[0031] [10]根據(jù)[7]所述的醫(yī)藥組合物或[9]所述的飲食品，其特征在于，狀態(tài)或疾病為 糖尿病。
[0032] [11]根據(jù)[7]所述的醫(yī)藥組合物或[9]所述的飲食品，其特征在于，狀態(tài)或疾病為 肥胖與選自糖尿病、高血壓W及高脂血癥中的1種W上疾病的組合。
[0033] [12]根據(jù)[7]~[11]中任一項所述的醫(yī)藥組合物或飲食品，其特征在于，糖尿病為 2型糖尿病。
[0034] [13] -種醫(yī)藥組合物或飲食品的制造方法，其特征在于，包括配合[4]~[6]中任 一項所述的腸道屏障功能促進劑的工序。
[0035] [14]根據(jù)[13]所述的制造方法，其特征在于，醫(yī)藥組合物或飲食品用于預防或治 療選自糖尿病、高血壓、高脂血癥W及肥胖中的1種W上的狀態(tài)或者疾病。
[0036] [1引根據(jù)[14]所述的制造方法，其特征在于，狀態(tài)或疾病為糖尿病。
[0037] [16]根據(jù)[14]所述的制造方法，其特征在于，狀態(tài)或疾病為肥胖與選自糖尿病、高 血壓W及高脂血癥中的1種W上的疾病的組合。
[0038] [17]根據(jù)[13]~[16]中任一項所述的制造方法，其特征在于，糖尿病為2型糖尿 病。
[0039] 有益效果
[0040] 由于本發(fā)明的腸道屏障功能促進劑包含面包乳桿菌的菌體或菌體處理物，從而能 夠促進腸道屏障功能。此外，本發(fā)明的腸道屏障功能促進劑能夠有效地用于醫(yī)藥組合物或 飲食品，該醫(yī)藥組合物或飲食品用于預防或治療糖尿病、高血壓、高脂血癥W及肥胖W及代 謝綜合征等起因于腸道屏障功能障礙的狀態(tài)或者疾病。
【附圖說明】
[0041] 圖1表示使用人腸道上皮細胞化C02的面包乳桿菌促進腸道屏障功能的評價結果。
[0042] 圖2表示與面包乳桿菌共培養(yǎng)的腸道上皮細胞化C02中的微陣列分析結果。
[0043] 圖3表示給予了面包乳桿菌的小鼠的小腸上皮組織的緊密連接蛋白1(化DN1)基因 表達的變化。
[0044] 圖4表示面包乳桿菌對高脂肪食物負荷模型小鼠的糖代謝異常抑制效果。
[0045] 圖5表示面包乳桿菌對高脂肪食物負荷模型小鼠的糖代謝異常抑制效果。
【具體實施方式】
[0046] <面包乳桿菌>
[0047]面包乳桿菌是屬于乳桿菌屬的乳酸菌的一種，從小麥酵母(sourdou曲)分離，提倡 分類為新型的品種（International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology(2007)，57,146101467)。小麥酵母是指使用包含乳酸菌W及酵母的多個微生 物，使小麥粉、黑麥粉與水混合后的生面團進行發(fā)酵的面包種酵母。
[004引面包乳桿菌具有W下的菌學性質。
[0049] 形態(tài)學性質
[0化0] (1)桿菌，2-15皿的長度，0.5-1皿的寬度
[00引](2)運動性:無
[0052] (3)抱子形成:無
[0053] 培養(yǎng)學性質
[0054] (1)液體或固體MRS培養(yǎng)基中，在厭氧條件或好氧條件下均可良好生長繁殖
[0055] (2Η5Γ下的生長繁殖:5、6W及7%食鹽的存在下生長繁殖
[0056] (3)45°C下的生長繁殖:5、6W及7%食鹽的存在下生長繁殖 [0化7] 生理學性質
[0化引（1)革蘭氏染色：陽性
[0059] (2)觸酶試驗：
[0060] (3)發(fā)酵形式:純乳酸發(fā)酵
[0061] (4)錠產生(來自精氨酸）:無
[0062] (5)氣體產生(葡萄糖或葡萄糖酸鹽）:無
[0063] (6)有無酸產生(關于LMG 23699株、LMG 23701 株、LMG 23702株、R-30103株）：
[0064] 半乳糖、葡萄糖、果糖、甘露糖、N-乙酷葡糖胺、屯葉巧W及水楊巧:有
[0065] 甘油、赤薛糖醇、D-阿拉伯糖、心阿拉伯糖、核糖、D-木糖、k木糖、側金盞花醇、β- 甲基-D-木糖巧、山梨糖、衛(wèi)矛醇、肌醇、甘露醇、山梨糖醇、α-甲基-D-甘露糖巧、α-甲基-D- 葡萄糖巧、蜜二糖、薦糖、菊糖、松Ξ糖、棉子糖、淀粉、糖原、木糖醇、D-松二糖、D-來蘇糖、D- 巖藻糖、心巖藻糖、D-阿拉伯糖醇、k阿拉伯糖醇、葡糖酸、2-酬葡糖酸W及5-酬葡糖酸:無。
[0066] 在本發(fā)明中，只要是具有上述菌學性質的分類為面包乳桿菌的細菌，則還可使用 任意的菌株。例如，可例示東京農業(yè)大學分離的SAM2695株、SAM2697株、SAM2698株等。 SAM2695株作為保管編號NITE BP-0172USAM2697株作為保管編號NITE BP-01722W及 SAM2698株作為保管編號NITE BP-01723均于平成25年(2013年）10月17日保藏于獨立行政 法人日本產品評價技術基礎機構專利微生物保藏中屯、(NPMDK日本千葉縣木更津市上綜鑲 足2-5-8,郵編292-0818 )。此外，還可使用可從比利時微生物保藏中屯、（Belgian Co? ordinated Collections of Micro-organisms) 獲得的作為模式培養(yǎng)物（type culture) 的 面包乳桿菌LMG 2369滬。面包乳桿菌LMG 23699T作為JCM 15951T還可從獨立行政法人日本 理化學研究所生物資源中屯、微生物材料開發(fā)室（Japan Collection of Microorganisms) 獲得。在本發(fā)明中，可W使用上述菌株中的巧中，此外還可使用巧中W上菌株的組合。例如，本 發(fā)明的腸道屏障功能促進劑可包含巧巾面包乳桿菌的菌株，還可包含巧巾W上的面包乳桿菌 的菌株。
[0067] 用于本發(fā)明的面包乳桿菌只要是能夠培養(yǎng)乳酸菌的液體培養(yǎng)基或固體培養(yǎng)基，貝U 可使用任意的培養(yǎng)基進行培養(yǎng)。作為培養(yǎng)基的例子，可列舉MRS培養(yǎng)基(MRS肉湯）W及MRS瓊 月旨培養(yǎng)基（Sharpe Μ. ,et 曰1, "Identif ic曰tion of the Lactic Acid B曰cteri曰"in" Identification Method for Microbiologists Part A"London and New York,Academic Press，pages 65-79，1966) eMRS培養(yǎng)基W及MRS瓊脂培養(yǎng)基還可根據(jù)常規(guī)方法來制備，例如 還可使用來自日本關東化學株式會社等的市售品。此外，還可將牛、馬、羊等哺乳類的奶作 為培養(yǎng)基進行使用?？蓪⒚姘闂U菌的培養(yǎng)溫度適當設定在15~45°C之間，但優(yōu)選30°C。面 包乳桿菌的培養(yǎng)條件還可使用厭氧培養(yǎng)W及好氧培養(yǎng)中的任一種。
[006引 < 腸道屏障功能促進劑>
[0069] 本發(fā)明的腸道屏障功能促進劑包含面包乳桿菌的菌體或菌體處理物，具有腸道屏 障功能促進作用。
[0070] 在本發(fā)明中，腸道屏障功能是指防止物質從腸道上皮細胞外(腸道內）侵入到體內 的功能。將與正常的狀態(tài)相比，物質從腸道上皮細胞外向體內的侵入被促進的狀態(tài)稱作腸 道上皮細胞中的透過性升高的狀態(tài)。腸道屏障功能的促進意味著抑制腸道上皮細胞中的透 過性的升高W及使腸道上皮細胞中的透過性降低中的任一種。例如，通過使相互連接腸道 上皮細胞的緊密連接結構正?；驈娀蛘呤箤⒋嬖谟谀c道上皮細胞的異物從細胞排出 的轉運蛋白的功能正?；驈娀瑥亩龠M腸道屏障功能。
[0071] 例如通過使從腸道上皮細胞的腸道側向體內側移動的物質的量減少，或者使腸道 上皮細胞的電阻值(跨膜電阻（transepithelial electric resistance:Τ邸））升高來顯示 腸道屏障功能促進效果。本領域技術人員可根據(jù)目的選擇腸道屏障功能促進效果的具體評 價方法，例如像后述的實施例所示的那樣，可適合地使用測定人腸道上皮細胞(化co2細胞） 中的T邸的方法。具體而言，在Caco2單層培養(yǎng)細胞中添加受試物質，與對照細胞相比顯示出 TER升高，則可評價為該受試物質具有腸道屏障功能促進效果。
[0072] 本發(fā)明的腸道屏障功能促進劑包含面包乳桿菌的菌體或菌體處理物。在本說明書 中，作為意味著活菌體與死菌體中的任一種的術語而使用"菌體"。菌體可為除去培養(yǎng)上清 而純化后的物質，也可為包含固體培養(yǎng)基、液體培養(yǎng)基等的夾雜物的物質。此外，本發(fā)明的 腸道屏障功能促進劑中所包含的菌體可為濕潤狀態(tài)或干燥狀態(tài)中的任一種狀態(tài)。本發(fā)明的 腸道屏障功能促進劑中可包含濕潤狀態(tài)的菌體，例如含有面包乳桿菌的菌體與固體培養(yǎng)基 或液體培養(yǎng)基的培養(yǎng)物本身，或者濃縮了培養(yǎng)物的濃縮物。本發(fā)明的腸道屏障功能促進劑 可包含干燥狀態(tài)的菌體，通過噴霧干燥、冷凍干燥、真空干燥等的方法干燥后的菌體本身， 或者粉末化、顆?；蟮木w。死菌體可通過將面包乳桿菌的培養(yǎng)物、培養(yǎng)物的濃縮物、純 化后的菌體或干燥后的菌體進行加熱處理、放射線處理等的殺菌處理來得到。此外，本發(fā)明 的腸道屏障功能促進劑還可包含面包乳桿菌的菌體處理物。菌體處理物意味著通過超聲波 破碎、物理破碎等的破碎處理或粉碎處理所得到的菌體破碎物、菌體粉碎物，通過細胞壁分 解酶等的酶處理所得到的菌體溶解物，將菌體固定化于固體載體、微囊等的固定化菌體等， 菌體培養(yǎng)液上清運樣的除去了菌體后的培養(yǎng)物。
[0073] 在本發(fā)明中，可直接將面包乳桿菌的菌體或菌體處理物作為腸道屏障功能促進劑 使用。此外，還可將在面包乳桿菌的菌體或菌體處理物中添加了藥理學上可允許的載體、賦 形劑的物質作為腸道屏障功能促進劑使用。作為載體的例子，可列舉培養(yǎng)基、水、生理鹽水、 乙醇、丙二醇、甘油等。作為賦形劑的例子，可列舉葡萄糖、薦糖、乳糖、糊精、環(huán)糊精、黃原 膠、瓜爾膠、阿拉伯膠、黃著膠、結冷膠、刺槐豆膠、卡拉膠、果膠、瓊脂等。此外，還可適當配 合在制劑化中通常使用的乳化劑、等張劑(等滲劑）、緩沖劑、助溶劑、防腐劑、穩(wěn)定化劑、抗 氧化劑等。
[0074] 作為本發(fā)明的腸道屏障功能促進劑的有效成分的面包乳桿菌的菌體或菌體處理 物的含量可考慮到效果方面來任意決定。例如，作為有效成分，使用面包乳桿菌的菌體時， 作為菌體的干燥重量，優(yōu)選在腸道屏障功能促進劑中包含0.00001~99.9重量％、更優(yōu)選包 含0.0005~50重量％、進一步優(yōu)選包含0.0001~10重量％?；蛘撸鳛榫w數(shù)，優(yōu)選在1.0X 102~1.0 X 1〇12個/g的范圍內，更優(yōu)選在1.0 X 106~1.0 X 10"個/g的范圍內。此外，作為有 效成分使用面包乳桿菌的菌體處理物時，作為固體成分重量，優(yōu)選在腸道屏障功能促進劑 中包含0.00001~99.9重量％、更優(yōu)選包含0.0005~50重量％、進一步優(yōu)選包含0.0001~10 重量％。此外，作為有效成分而組合使用面包乳桿菌的菌體與菌體處理物時，優(yōu)選合并菌體 的干燥重量與菌體處理物的固體成分重量而在腸道屏障功能促進劑中包含0.00001~99.9 重量％、更優(yōu)選包含0.0005~50重量％、進一步優(yōu)選包含0.0001~10重量％。
[0075] <包含腸道屏障功能促進劑的醫(yī)藥組合物>
[0076] 本發(fā)明還提供包含上述腸道屏障功能促進劑的醫(yī)藥組合物。
[0077] 由于本發(fā)明的醫(yī)藥組合物包含腸道屏障功能促進劑，故而用于預防及治療與腸道 屏障功能的異常相關的狀態(tài)或疾病也有效。與腸道屏障功能的異常相關的狀態(tài)或疾病沒有 限制，包括肥胖、糖尿病、高血壓、高脂血癥、炎癥性腸道疾病、食物過敏等。在此，肥胖的狀 態(tài)是指由于脂肪細胞的數(shù)量增加或脂肪細胞中脂肪滴過剩蓄積，從而與身高相比體重的比 例增大的狀態(tài)。肥胖的狀態(tài)還包括沒有達到作為疾病的肥胖癥(并發(fā)起因于肥胖W及相關 的健康障礙，或者可預測到其并發(fā)的病情)的狀態(tài)。除肥胖W外，并發(fā)選自糖尿病、高血壓W 及高脂血癥中的巧巾W上疾病的狀態(tài)可定位于代謝綜合征的前一階段。此外，也將除肥胖W 夕h還并發(fā)選自糖尿病、高血壓W及高脂血癥中的巧中W上疾病的狀態(tài)稱作代謝綜合征。
[0078] 在本說明書中提到"狀態(tài)或疾病的預防"時，是指提高對象對于狀態(tài)或疾病的抵抗 性，防止狀態(tài)或疾病的發(fā)病。此外，在本說明書中提到"狀態(tài)或疾病的治療"時，是指使對象 從狀態(tài)或疾病恢復、改善狀態(tài)或疾病的重篤度、防止狀態(tài)或疾病的進一步發(fā)展。
[0079] 本發(fā)明的醫(yī)藥組合物能夠根據(jù)目的與藥理學上允許的載體或賦形劑等一起通過 通常的方法來制劑化。作為載體的例子，可列舉培養(yǎng)基、水、生理鹽水、乙醇、丙二醇、甘油 等。作為賦形劑的例子，可列舉葡萄糖、薦糖、乳糖、糊精、環(huán)糊精、黃原膠、瓜爾膠、阿拉伯 膠、黃著膠、結冷膠、刺槐豆膠、卡拉膠、果膠、瓊脂等。此外，還可適當配合制劑化中通常使 用的乳化劑、等張劑(等滲劑）、緩沖劑、助溶劑、防腐劑、穩(wěn)定化劑、抗氧化劑等。
[0080] 只要不有損于面包乳桿菌的菌體或菌體處理物的腸道屏障功能促進效果，即只要 與面包乳桿菌的菌體或菌體處理物進行配合時不產生不優(yōu)選的相互作用，則可在本發(fā)明的 醫(yī)藥組合物中根據(jù)需要混合礦物質；維生素 E、維生素 C、維生素 A等的維生素類;營養(yǎng)成分； 香料;色素等其他的添加劑。上述添加劑均可使用醫(yī)藥品中通常所使用的添加劑。此外，只 要不有損于面包乳桿菌的菌體或菌體處理物的腸道屏障功能促進效果，則還可在本發(fā)明的 醫(yī)藥組合物中混合1種W上其他的生理活性成分。
[0081] 本發(fā)明的醫(yī)藥組合物還可與其他藥劑組合使用。將本發(fā)明的醫(yī)藥組合物與其他藥 劑組合使用時，還可W將本發(fā)明的醫(yī)藥組合物與其他的藥劑合并而作為一個組合物使用， 本發(fā)明的醫(yī)藥組合物與其他藥劑還可W分別包含于單個的配合物中從而用于合并給藥。合 并給藥時，本發(fā)明的醫(yī)藥組合物可W在其他藥劑的給藥之前、與其同時或在其之后進行給 藥。
[0082] 作為其他藥劑的例子，可列舉例如氯苯咪嗎I噪、奧利司他等的減肥藥，甲苯橫下 脈、那格列奈、阿卡波糖、二甲雙脈、郵格列酬、西他列汀、依帕司他等的抗糖尿病藥，氯嚷 酬、氨氯嚷嗦、嗎I達帕胺、巧塞米、托拉塞米、螺內醋等的利尿藥，硝苯地平、氨氯地平、地爾 硫卓等的巧括抗劑，咪達普利、貝那普利等的血管緊張素轉換酶抑制劑，氯沙坦、鄉(xiāng)沙坦等 的血管緊張素受體括抗劑，阿利克侖等直接的腎素抑制劑，酪妥拉明、贓挫嗦等的α受體阻 斷劑，阿替洛爾、塞利洛爾等的β受體阻斷劑，卡維地洛等的αιβ阻斷劑，可樂寧等的02受體激 動劑，美伐他汀、普伐他汀、阿伐他汀等的他汀類降脂藥，苯扎貝特、非諾貝特等的貝特類降 脂藥，考來替蘭等的樹脂(膽汁酸結合藥），普羅布可、依折麥布等其他的降脂藥等。
[0083] 本發(fā)明的醫(yī)藥組合物不特別限制于其形態(tài)，例如，可制備成粉末狀、顆粒狀、片劑 狀等的固體狀;溶液狀、乳液狀、分散液狀等的液狀;或糊狀等的半固體狀等任意的形態(tài)。作 為具體的劑型，可例示散劑、顆粒劑、細粒劑、片劑、丸劑、含片劑、膠囊劑(包括軟膠囊劑、硬 膠囊劑）、巧嚼片劑、溶液劑等。
[0084] 作為一個方式，作為菌體的干燥重量，本發(fā)明的醫(yī)藥組合物優(yōu)選W0.00001~99.9 重量％、更優(yōu)選W0.0001~10重量％的量來含有面包乳桿菌的菌體。此外，作為一個方式， 作為固體成分重量，本發(fā)明的醫(yī)藥組合物優(yōu)選W0.00001~99.9重量％、更優(yōu)選W0.0001~ 10重量％的量含有面包乳桿菌的菌體處理物。此外，作為一個方式，作為菌體的干燥重量與 菌體處理物的固體成分重量的合并量，本發(fā)明的醫(yī)藥組合物優(yōu)選W0.00001~99.9%重 量％、更優(yōu)選W0.0001~10重量％的量含有面包乳桿菌的菌體W及菌體處理物。
[0085] 本發(fā)明的醫(yī)藥組合物的給藥量、給藥方式只要根據(jù)對象、病情或其發(fā)展情況、其他 條件來適當選擇即可。例如，使用面包乳桿菌的菌體時，例如，為了得到W人(成人)為對象 的腸道屏障功能促進效果而進行經口攝取的情況下，使面包乳桿菌的菌體的1日當量為 0.01~lOOOmg，優(yōu)選0.1~200mg，進一步優(yōu)選0.3~2mg左右，1天分1~3次左右經口攝取為 佳?；蛘?，作為菌體數(shù)，使一日當量成為1.0 X 1〇6個W上Ag體重、優(yōu)選1.0 X 107個W上/kg體 重、進一步優(yōu)選1.ΟΧΙΟ8個W上/kg體重的量，分1~數(shù)次經日攝取為佳。使用面包乳桿菌的 菌體處理物時，例如，為了得到W人(成人)為對象的腸道屏障功能促進效果而進行經口給 藥的情況下，作為固體成分重量，使面包乳桿菌的菌體處理物的1日當量成為0.01~ lOOOmg、優(yōu)選0.1~200mg、進一步優(yōu)選0.3~2mg左右，1天分1~3次左右連續(xù)給藥為佳。合并 面包乳桿菌的菌體W及菌體處理物進行使用時，例如，為了得到W人(成人)為對象的腸道 屏障功能促進效果而進行經口給藥的情況下，作為菌體的干燥重量與菌體處理物的固體成 分重量的合并量，使面包乳桿菌的菌體W及菌體處理物的1日當量成為0.01~lOOOmg、優(yōu)選 0.1~200mg、進一步優(yōu)選0.3~2mg左右，1天分1~3次左右連續(xù)給藥為佳。
[0086] <飲食品>
[0087] 本發(fā)明還提供包含上述腸道屏障功能促進劑的飲食品。
[0088] 由于本發(fā)明的飲食品包含腸道屏障功能促進劑，故而用于預防及治療肥胖、糖尿 病、高血壓、高脂血癥、炎癥性腸道疾病、食物過敏運樣的與腸道屏障功能異常相關的狀態(tài) 或疾病也有效。
[0089] 本發(fā)明的飲食品可為任意的形態(tài)，可制成例如果汁、牛奶、乳飲料、清涼飲料、茶飲 料、保健飲料等的飲料，湯、腰燭菜(stew)等的液狀食品，果漿、酸奶等的糊狀食品，果凍、橡 皮糖等的半固體狀食品，面包、蛋糕、糖、曲奇、口香糖等的固體狀食品，調味汁、蛋黃醬等的 含油脂食品，膠囊、藥片、含片等的醫(yī)藥制劑的形態(tài)等。
[0090] 作為本發(fā)明的飲食品的進一步的例子，可列舉營養(yǎng)輔助食品、健康食品、功能性食 品、幼兒用食品、嬰兒用制備乳、早產兒用制備乳、老人用食品、飲料等，但并不限定于此。
[0091] 營養(yǎng)輔助食品是指特定的營養(yǎng)成分被強化的食品。健康食品是指健康的或有益于 健康的食品，包括營養(yǎng)輔助食品（膳食補充劑）、天然食品、減肥食品等。功能性食品是指用 于補給可起到機體調節(jié)功能的營養(yǎng)成分的食品，與特定保健用食品具有相同意義。幼兒用 食品是指用于提供給約6歲W下兒童的食品。老人用食品是指與無處理的食品相比，處理成 易于消化及吸收的食品。嬰兒用制備乳是指用于提供給約1歲W下兒童的制備乳。早產兒用 制備乳是指用于提供到早產兒出生后約6個月為止的制備乳。
[0092] 本發(fā)明的飲食品的形態(tài)沒有特別限制，例如，可制備成粉末狀、顆粒狀、片劑狀等 的固體狀;溶液狀、乳液狀、分散液狀等的液狀;或糊狀等的半固體狀等任意形態(tài)。作為具體 的劑型，可例示散劑、顆粒劑、細粒劑、片劑、丸劑、含片劑、膠囊劑(包括軟膠囊劑、硬膠囊 劑）、巧嚼片劑、溶液劑等。
[0093] 只要不有損于面包乳桿菌的菌體或菌體處理物的腸道屏障功能促進效果，即只要 與面包乳桿菌的菌體或菌體處理物配合時不產生不優(yōu)選的相互作用，則可在本發(fā)明的飲食 品中根據(jù)需要混合礦物質;維生素 E、維生素 C、維生素 A等的維生素類;營養(yǎng)成分;香料;色素 等其他的添加劑。上述添加劑均可使用飲食品中通常所使用的添加劑。
[0094] 此外，只要不有損于面包乳桿菌的菌體或菌體處理物的腸道屏障功能促進效果， 則還可在本發(fā)明的飲食品中混合1種W上其他的生理活性成分。
[00M]作為一個方式，作為菌體的干燥重量，本發(fā)明的飲食品優(yōu)選W0.00001~99.9重 量％、更優(yōu)選W0.0001~10重量％的量含有面包乳桿菌的菌體。此外，作為一個方式，作為 菌體處理物的固體成分重量，本發(fā)明的飲食品優(yōu)選W0.00001~99.9重量％、更優(yōu)選W 0.0001~10重量％的量含有面包乳桿菌的菌體處理物。此外，作為一個方式，作為菌體的干 燥重量與菌體處理物的固體成分重量的合并量，本發(fā)明的飲食品優(yōu)選W0.00001~99.9% 重量％、更優(yōu)選W0.0001~10重量％的量含有面包乳桿菌的菌體W及菌體處理物。
[0096] <醫(yī)藥組合物或飲食品的制造方法>
[0097] 由于本發(fā)明的時鐘基因的腸道屏障功能促進劑作為有效成分包含面包乳桿菌的 菌體或菌體處理物，從而能夠促進腸道屏障功能并預防或治療基于腸道屏障功能異常的狀 態(tài)或者疾病。其次，可作為醫(yī)藥組合物或飲食品提供。
[0098] 目P，從另外的觀點出發(fā)，本發(fā)明為包括如下工序的醫(yī)藥組合物或飲食品的制造方 法，即配合包含面包乳桿菌的菌體或菌體處理物的腸道屏障功能促進劑。
[0099] W下，基于實施例更為具體地說明本發(fā)明。且，本發(fā)明并不限定于運些實施例。
[0100] 實施例
[0101] 實施例1
[0102] 使用了人腸道上皮細胞化co2的面包乳桿菌促進腸道屏障功能的評價。
[0103] < 材料 >
[0104] 作為面包乳桿菌，使用面包乳桿菌SAM2695株、面包乳桿菌SAM2697株、面包乳桿菌 SAM2698株W及作為模式培養(yǎng)物的面包乳桿菌JCM 15951T。
[0105] 在促進腸道屏障功能的評價中使用人腸道上皮細胞Caco2。已知該細胞來自人大 腸癌并作為體外小腸模型而廣泛使用，且發(fā)現(xiàn)了細胞的屏障功能與跨膜電阻 (trans邱ithelial electric resis1:ance :TER)高的相關關系。將面包乳桿菌與化co2共培 養(yǎng)所引起的TER值正向的變化作為促進腸道屏障功能的指標來進行評價。
[0106] < 方法 >
[0107] 菌的制備
[0108] 在預培養(yǎng)中，從各菌株的保存瓶中取10化1接種到10ml的MRS培養(yǎng)基中，在30°C下 培養(yǎng)24小時。接下來，在主培養(yǎng)中將10ml預培養(yǎng)液接種到1升的MRS培養(yǎng)基中，在3(TC下培養(yǎng) 24小時。培養(yǎng)24小時后，將培養(yǎng)液WSOOOrpm離屯、分離10分鐘并除去上清。加入滅菌水進行 清洗，并在該條件下進行離屯、分離。除去上清，再進行1次清洗并最后用滅菌水混懸。
[0109] 化co2細胞的制備
[0110] 在Millicell 24孔細胞培養(yǎng)板(MERCK MILLIPORE)中，在0.7X105細胞/孔的條件 下將化co2接種到腸腔側的孔中，在37°C、5%C02的條件下培養(yǎng)2周。培養(yǎng)基使用Du化ecco's Modified Eagle Medium(DMEM)(Sigma-Al化ich,D6429)、胎牛血清（FBS)(Equiteck Bio, Inc) W及作為抗生素的抗菌-抗真菌混合儲備溶液（lOOx)(化calai tesque株式會社）。培 養(yǎng)基為在500ml的DMM中添加50ml的FBSW及5ml的抗生素來進行制備。在腸腔側的孔中添 加400μ1培養(yǎng)基，在基底側的孔中添加80化1培養(yǎng)基。培養(yǎng)基每隔2~3天更換一次。
[0111] 將面包乳桿菌添加前的膜電阻值顯示為300 Ω . cm2 W上的化co2單層細胞作為充 分形成了緊密連接的化co2單層細胞來用于檢測。
[0112] 實驗方法
[0113] 在進行了 2周培養(yǎng)的化co2細胞中添加40μ1調整為IX 109細胞/ml的菌混懸液(對 照為培養(yǎng)基），在37°C、5%C02的條件下進行2小時共培養(yǎng)。膜電阻值的測定使用Millicell ERS-2電阻儀(MERCK MILLIPORE),測定面包乳桿菌的添加前W及添加24小時后的膜電阻 值。實驗W各個均為η = 6進行實施。
[0114] < 結果 >
[011引結果如圖1所示。
[0116] 在面包乳桿菌JCM 1595lT、SAM 2695W及SAM 2698中，與對照相比，顯示出TER顯 著升高。SAM 2697顯示出TER升高的趨勢。
[0117] 實施例2
[0118] 與面包乳桿菌共培養(yǎng)的腸道上皮細胞化C02中的微陣列分析
[0119] 將化co2與面包乳桿菌SAM 2698株共培養(yǎng)，研究腸道屏障相關基因的表達。
[0120] < 材料 >
[0121] 菌的制備
[0122] 作為面包乳桿菌，使用面包乳桿菌SAM 2698株。
[0123] 在預培養(yǎng)中，從菌株的保存瓶中取10化1接種到10ml的MRS培養(yǎng)基中，在30°C下培 養(yǎng)24小時。其后，將10ml預培養(yǎng)液接種到1升的MRS培養(yǎng)基中，在30°C下培養(yǎng)24小時。接下來， 將培養(yǎng)液WSOOOrpm離屯、分離10分鐘并除去上清。加入滅菌水進行清洗，并在該條件下進行 離屯、分離。除去上清，再進行1次清洗并最后用滅菌水混懸。
[0124] 化co2細胞的制備
[0125] 在12孔細胞培養(yǎng)板(BD Falcon)中，在0.63X 105細胞/2ml/孔的條件下接種化co2 細胞，在37°C、5%C02的條件下培養(yǎng)2周。培養(yǎng)基使用Du化ecco's Modified Eagle Medium (DMEM) (Sigma-Al化ich，D6429)、胎牛血清(FBSKEquiteck Bio，Inc) W及作為抗生素的抗 菌-抗真菌混合儲備溶液（lOOx) (Nacalai tesque株式會社）。培養(yǎng)基為在500ml的DMEM中添 加 50ml的FBSW及5ml的抗生素進行制備。培養(yǎng)基每隔2~3天更換一次。
[0126] < 方法 >
[0127]實驗方法
[01%]在進行了2周培養(yǎng)的Caco2細胞中，將用DMEM混懸的面包乳桿菌W1X109細胞/ 2ml/孔進行添加，并進行5小時共培養(yǎng)。實驗均Wn數(shù)為3來實施。5小時后除去上清，用PBS (-)清洗后，從回收的細胞使用RNeasy Mini Kit(QIAGEN)來制備RNA。
[0129] 微陣列分析
[0130] 委托TaKaRa Bio株式會社進行Agilent Expression Array分析，并實施Human SurePrint G3(8X60k)ver2.0。
[0131] 微陣列分析結果
[0132] 著眼于緊密連接相關基因緊密連接蛋白進行分析，并將其結果示于圖2。與對照相 比，在與面包乳桿菌SAM 2698共培養(yǎng)的化co2細胞中，緊密連接蛋白1(化DN 1)的表達量增 加(約1.1倍）。此外，CLDN 3W及CLDM的表達量也顯著增加(各約1.6倍）。
[0133] 實施例3
[0134] 給予面包乳桿菌的小鼠的小腸上皮組織的CLDN1表達變化
[0135] 將面包乳桿菌SAM 2698活菌給予小鼠，研究小腸上皮組織中的CLDN1的表達變化。
[0136] < 材料 >
[0137] 作為面包乳桿菌，使用面包乳桿菌SAM 2698株。
[0138] 試驗動物使用雄性、7周齡的巧7BL/6J小鼠。試驗組設定為滅菌給藥組W及面包乳 桿菌SAM 2698活菌給藥組。各組的η數(shù)為6只。
[0139] < 方法 >
[0140] 實驗方法
[0141] 單次經口給予120億細胞/ml的活菌混懸液25化1(30億細胞/小鼠）。給藥5小時后 采集小腸上皮組織。
[0142] 從小腸上皮組織進行RNA提取
[0143] 在小腸上皮組織中添加150-21化m的玻璃珠（SIGMA公司制），使用Multi-beads aiocker(YASUI KIKAI公司制）W3000rpm處理3分鐘。其后，使用RNeasy Mini Kit(QIAGEN) 按照操作說明來制備RNA。
[0144] 引物的設計
[0145] 用于小鼠化DN1基因的引物序列W公開的基因序列信息為基礎進行設計。序列如 下所示。小鼠 CLDN1正向引物：CCTATGCTGGGGACAACATC/小鼠 CLDN1反向引物： TGCACCTCATCATCTTCCAG。表達分析將GAPDH基因表達作為對照。用于GAPDH基因的引物序列 WShineGene Molecular Biotech, Inc公開的Housekeeping Gene Primers for RT-PCR作 為參考進行設計。序列如下所示。小鼠 GAPDH F49 : GGTGAAGGTCGGTGTGAACG/R281 : CTCGCTCCTGGAAGATGGTG。
[0146] 實時PCR條件
[0147] 表達分析使用實時PCR(Step One Plus,Applied Biosystems公司制）進行實施。
[0148] 提取的RNA用RNase化ee水調整為lOOng/μΙ，在1祉1包含ΙΟμΜ各引物的反應溶液 中加入化1的RNA溶液來實施實時PCR。實時PCR使用化wer SYBR(注冊商標)Green RNA-to- CTTM 1-Step Kit(Applied Biosystems公司制），按照試劑盒的操作說明進行。
[0149] < 結果 >
[0150] 著眼于緊密連接相關基因化DNl進行分析，并將其結果示于圖3。與滅菌水給藥組 相比，在給予了面包乳桿菌SAM 2698的小鼠的小腸上皮中，緊密連接蛋白UCLDN 1)的表達 顯著增加。
[0151] 實施例4
[0152] 面包乳桿菌對高脂肪食物負荷模型小鼠的糖代謝異常抑制效果
[0153] < 材料 >
[0154] 作為面包乳桿菌，使用面包乳桿菌SAM2695株、面包乳桿菌SAM2698株W及作為模 式培養(yǎng)物的面包乳桿菌JCM 15951T。
[01巧]試驗動物使用雄性、7周齡的巧7BL/6J小鼠。試驗組設定為正常食物組、60%高脂 肪食物組、在60 %高脂肪食物中給予了各面包乳桿菌活菌組。各組的η數(shù)為10只。
[0156] < 方法 >
[0157] 實驗方法
[0158] 試驗期間為25天，經口給予120億細胞/ml的活菌混懸液25化1(30億細胞/天/只）。
[0159] 動物實驗飼料
[0160] 正常食物W及60%高脂肪食物使用Research Diets公司的純化飼料lOkcal%的 脂肪(豬油）W及純化飼料eOkcal %的脂肪(豬油）。
[0161] 糖代謝異常抑制試驗(糖負荷試驗）
[0162] 在試驗第25天實施糖負荷試驗。在lg/kg(5ml/kg)的條件下經口給予20%葡萄糖 溶液，在給藥前、給藥后15、30、60及90分鐘后由尾靜脈采血。血糖通過Glutest neo Super (株式會社Ξ和化學研究所)進行測定。
[0163] 糖代謝異常抑制試驗結果(糖負荷試驗）
[0164] 結果如圖4W及圖5所示。
[0165] 測定各組的糖負荷后的血中糖濃度的結果與正常食物攝取組相比，在60%高脂肪 食物攝取組中的15、30、60及90分鐘顯示出顯著高的值。另一方面，在60%高脂肪食物中給 予了面包乳桿菌JCM 15951T的組中，與60%高脂肪食物攝取組相比，在15分鐘顯示出顯著 抑制血糖升高的趨勢，在30分鐘顯示出抑制血糖升高的趨勢。在60%高脂肪食物中給予面 包乳桿菌SAM 2695的組中，與60%高脂肪食物攝取組相比，在30分鐘W及60分鐘顯示出顯 著抑制血糖的升高。在從15分鐘到90分鐘的AUC中，與60%高脂肪食物攝取組相比發(fā)現(xiàn)血糖 顯著降低。接下來，在60%高脂肪食物中給予了面包乳桿菌SAM 2698的組中，在30、60W及 90分鐘顯示出顯著抑制血糖升高。在15分鐘到90分鐘的AUC中，與60 %高脂肪食物攝取組相 比發(fā)現(xiàn)血糖顯著降低。
[0166] 產業(yè)上的可利用性
[0167] 由于本發(fā)明的腸道屏障功能促進劑包含面包乳桿菌的菌體或菌體處理物，故而能 夠促進腸道屏障功能。本發(fā)明的腸道屏障功能促進劑可有效用于醫(yī)藥組合物或飲食品，該 醫(yī)藥組合物或飲食品用于預防或治療糖尿病、高血壓、高脂血癥W及肥胖W及代謝綜合征 等起因于腸道屏障功能障礙的狀態(tài)或者疾病。
【主權項】
1. 一種飲食品，其特征在于，包含面包乳桿菌的菌體或菌體處理物。2. 根據(jù)權利要求1所述的飲食品，其特征在于，面包乳桿菌為面包乳桿菌SAM2695株、面 包乳桿菌3纟12697株、面包乳桿菌5纟12698株、面包乳桿菌】01 159517株或2種以上所述菌株 的組合。3. 根據(jù)權利要求1或2所述的飲食品，其特征在于，包含面包乳桿菌的活菌體。4. 一種腸道屏障功能促進劑，其特征在于，包含面包乳桿菌的菌體或菌體處理物。5. 根據(jù)權利要求4所述的腸道屏障功能促進劑，其特征在于，面包乳桿菌為面包乳桿菌 5八12695株、面包乳桿菌5艦2697株、面包乳桿菌5纟12698株、面包乳桿菌凡1 159517株或2種 以上所述菌株的組合。6. 根據(jù)權利要求4或5所述的腸道屏障功能促進劑，其特征在于，包含面包乳桿菌的活 菌體。7. -種醫(yī)藥組合物，其特征在于，包含權利要求4~6中任一項所述的腸道屏障功能促 進劑，且用于預防或治療選自糖尿病、高血壓、高脂血癥以及肥胖中的1種以上的狀態(tài)或者 疾病。8. -種飲食品，其特征在于，包含權利要求4~6中任一項所述的腸道屏障功能促進劑。9. 根據(jù)權利要求8所述的飲食品，其特征在于，用于預防或治療選自糖尿病、高血壓、高 脂血癥以及肥胖中的1種以上的狀態(tài)或者疾病。10. 根據(jù)權利要求7所述的醫(yī)藥組合物或權利要求9所述的飲食品，其特征在于，狀態(tài)或 疾病為糖尿病。11. 根據(jù)權利要求7所述的醫(yī)藥組合物或權利要求9所述的飲食品，其特征在于，狀態(tài)或 疾病為肥胖與選自糖尿病、高血壓以及高脂血癥中的1種以上疾病的組合。12. 根據(jù)權利要求7~11中任一項所述的醫(yī)藥組合物或飲食品，其特征在于，糖尿病為2 型糖尿病。13. -種醫(yī)藥組合物或飲食品的制造方法，其特征在于，包括配合權利要求4~6中任一 項所述的腸道屏障功能促進劑的工序。14. 根據(jù)權利要求13所述的制造方法，其特征在于，醫(yī)藥組合物或飲食品用于預防或治 療選自糖尿病、高血壓、高脂血癥以及肥胖中的1種以上的狀態(tài)或者疾病。15. 根據(jù)權利要求14所述的制造方法，其特征在于，狀態(tài)或疾病為糖尿病。16. 根據(jù)權利要求14所述的制造方法，其特征在于，狀態(tài)或疾病為肥胖與選自糖尿病、 高血壓以及高脂血癥中的1種以上的疾病的組合。17. 根據(jù)權利要求13~16中任一項所述的制造方法，其特征在于，糖尿病為2型糖尿病。
【文檔編號】A61K35/74GK105899090SQ201480071496
【公開日】2016年8月24日
【申請日】2014年11月7日
【發(fā)明人】星子浩之
【申請人】三得利控股株式會社