蘆薈干細(xì)胞提取物及其制備方法和應(yīng)用
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種蘆薈干細(xì)胞提取物的制備方法，包括以下步驟：從蘆薈中獲取含有形成層的組織；將所述含有形成層的組織置于固體培養(yǎng)基中培養(yǎng)后，分離出蘆薈干細(xì)胞；再將所述蘆薈干細(xì)胞置于植物干細(xì)胞培養(yǎng)基中進(jìn)行體外培養(yǎng)，獲得擴(kuò)增后的蘆薈干細(xì)胞；所述擴(kuò)增后的蘆薈干細(xì)胞經(jīng)冷凍破碎后濃縮，即收獲蘆薈干細(xì)胞提取物。通過(guò)該方法所獲得的蘆薈干細(xì)胞提取物所含有的蘆薈活性成分較高，尤其是蘆薈苷，具有較高的醫(yī)用價(jià)值。
【專利說(shuō)明】
蘆薈干細(xì)胞提取物及其制備方法和應(yīng)用
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，特別涉及一種蘆薈干細(xì)胞提取物及其制備方法和應(yīng) 用。
【背景技術(shù)】
[0002] 植物干細(xì)胞(plant stem cell)是未分化的細(xì)胞，具有很強(qiáng)的自我更新和持續(xù)分 裂能力。植物干細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)，是在傳統(tǒng)組培技術(shù)的基礎(chǔ)上，以植物干細(xì)胞為目標(biāo)，誘導(dǎo)、分 離和培養(yǎng)外植體，建立相應(yīng)的干細(xì)胞培養(yǎng)體系植物干細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)，不僅豐富了植物培養(yǎng) 技術(shù)，而且為天然產(chǎn)物的商業(yè)化生產(chǎn)，乃至植物生物技術(shù)的發(fā)展，提供了新的研究方向和契 機(jī)。
[0003] 蘆薈是一種多年生的肉質(zhì)草本植物，屬百合科蘆薈屬，傳統(tǒng)上作為瀉藥使用，近年 來(lái)，也在化妝品和食品行業(yè)中得到了廣泛的應(yīng)用。隨著研究的深入，蘆薈的抗氧化能力、抑 菌、消炎、抗腫瘤、免疫調(diào)節(jié)和輔助治療糖尿病的作用也相繼被報(bào)道出來(lái)。蘆薈中的蘆薈素 A、創(chuàng)傷激素和聚糖肽甘露等具有抗病毒感染、促進(jìn)傷口愈合復(fù)原的作用，又可以消炎殺菌、 吸熱消腫、軟化皮膚、保持細(xì)胞活力，凝膠多糖與愈傷酸聯(lián)合還具有愈合創(chuàng)傷活性的功效。 因此，如何制備蘆薈干細(xì)胞提取物具有重要的意義。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 鑒于此，本發(fā)明提供一種蘆薈干細(xì)胞提取物及其制備方法。
[0005] 本發(fā)明解決其技術(shù)問(wèn)題所采用的技術(shù)方案是：一種蘆薈干細(xì)胞提取物的制備方 法，包括以下步驟：
[0006] 從蘆薈中獲取含有形成層的組織；
[0007] 將所述含有形成層的組織置于固體培養(yǎng)基中培養(yǎng)后，分離出蘆薈干細(xì)胞；
[0008] 再將所述蘆薈干細(xì)胞置于植物干細(xì)胞培養(yǎng)基中進(jìn)行體外培養(yǎng)，獲得擴(kuò)增后的蘆薈 干細(xì)胞；
[0009] 所述擴(kuò)增后的蘆薈干細(xì)胞經(jīng)冷凍破碎后濃縮，即收獲蘆薈干細(xì)胞提取物。
[0010] 在本發(fā)明提供的蘆薈干細(xì)胞提取物的制備方法中，所述冷凍破碎過(guò)程為:將所述 擴(kuò)增后的蘆薈干細(xì)胞放入-50~-100°C低溫環(huán)境下冷凍2~3小時(shí)，然后取出解凍，重復(fù)3~5 次。
[0011] 在本發(fā)明提供的蘆薈干細(xì)胞提取物的制備方法中，所述植物干細(xì)胞培養(yǎng)基包括無(wú) 機(jī)鹽、維生素、氨基酸、生長(zhǎng)素、糖類(lèi)和瓊脂。
[0012] 在本發(fā)明提供的蘆薈干細(xì)胞提取物的制備方法中，所述固體培養(yǎng)基包括無(wú)機(jī)鹽、 維生素、氨基酸、生長(zhǎng)素、糖類(lèi)和活性炭。
[0013] 在本發(fā)明提供的蘆薈干細(xì)胞提取物的制備方法中，所述固體培養(yǎng)基中還包括萘乙 酸和芐氨基腺嘌呤。
[0014] 在本發(fā)明提供的蘆薈干細(xì)胞提取物的制備方法中，所述糖類(lèi)為蔗糖或乳糖。
[0015] 在本發(fā)明提供的蘆薈干細(xì)胞提取物的制備方法中，所述體外培養(yǎng)過(guò)程是在恒溫培 養(yǎng)搖床中培養(yǎng)7~14天后，再轉(zhuǎn)移至生物反應(yīng)器中進(jìn)行大規(guī)模培養(yǎng)。
[0016] 在本發(fā)明提供的蘆薈干細(xì)胞提取物的制備方法中，所述體外培養(yǎng)的條件為溫度為 30°C~37°C，每小時(shí)光照5~lOmin。
[0017] 本發(fā)明進(jìn)一步保護(hù)上述蘆薈干細(xì)胞提取物的制備方法所獲得的蘆薈干細(xì)胞提取 物。
[0018] 本發(fā)明進(jìn)一步保護(hù)上述蘆薈干細(xì)胞提取物在制備食品、藥品、保健品或化妝品中 的應(yīng)用。
[0019] 實(shí)施本發(fā)明提供的蘆薈干細(xì)胞提取物及其的制備方法，可以達(dá)到以下有益效果： 通過(guò)本發(fā)明所獲得的蘆薈干細(xì)胞提取物所含有的蘆薈活性成分較高，特別是蘆薈苷，具有 較高的使用價(jià)值。
【具體實(shí)施方式】
[0020] 本發(fā)明提供的蘆薈干細(xì)胞提取物的制備方法，包括以下步驟：
[0021] Sl、從蘆薈中獲取含有形成層的組織；
[0022] S2、將步驟Sl中獲得的含有形成層的組織置于固體培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)后，分離出 蘆薈干細(xì)胞；
[0023] S3、將步驟S2中獲得的蘆薈干細(xì)胞置于植物干細(xì)胞培養(yǎng)基中進(jìn)行體外培養(yǎng)，獲得 擴(kuò)增后的蘆薈干細(xì)胞；
[0024] 其中，所述植物干細(xì)胞培養(yǎng)基包括無(wú)機(jī)鹽、維生素、氨基酸、生長(zhǎng)素、糖類(lèi)和瓊脂。 其中，無(wú)機(jī)鹽包括<&(：1 2、1(!1屮〇4、謂03、]\%3〇4、順4勵(lì)3、(：113〇4*5!1 20等;糖類(lèi)為蔗糖或乳糖等； 優(yōu)選地，植物干細(xì)胞培養(yǎng)基中，生長(zhǎng)素的濃度為0.5~1.5mg/L、蔗糖或乳糖的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2 ~5 %，瓊脂的濃度為5.5~7.5g/L;植物干細(xì)胞培養(yǎng)基為MS培養(yǎng)基。
[0025] S4、步驟S3獲得的擴(kuò)增后蘆薈干細(xì)胞經(jīng)冷凍破碎后濃縮，即收獲蘆薈干細(xì)胞提取 物。
[0026] 步驟Sl中，由于蘆薈莖尖中含有大量的具有自我更新能力又能產(chǎn)生具有持續(xù)分裂 能力的干細(xì)胞，因此，本發(fā)明中優(yōu)先采用從蘆薈莖尖中獲取蘆薈干細(xì)胞。含有形成層的組織 的獲取過(guò)程，包括以下步驟：
[0027]取蘆薈莖尖，沖洗15~20分鐘，酒精消毒，再用升汞液消毒10~20分鐘后，無(wú)菌水 沖洗數(shù)次，剝離獲取形成層的組織。
[0028] 步驟S2中，固體培養(yǎng)基包括無(wú)機(jī)鹽、維生素、氨基酸、生長(zhǎng)素、糖類(lèi)和活性炭;其中， 無(wú)機(jī)鹽包括:〇&(：12、10^〇4、謂0 3、]\%3〇4、順4勵(lì)3、〇13〇4.5!120等;糖類(lèi)為蔗糖或乳糖等。優(yōu)選 地，固體培養(yǎng)基為MS培養(yǎng)基;且生長(zhǎng)素的濃度為0.5~1.5mg/L、蔗糖或乳糖的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2 ~5 % ;更為優(yōu)選地，固體培養(yǎng)基中還包括萘乙酸和芐氨基腺嘌呤，萘乙酸的濃度為O . 5~ 1.5mg/L，芐氨基腺嘌呤的濃度為0.5~1.5mg/L。
[0029] 進(jìn)一步地，該步驟中，將含有形成層的組織置于固體培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)的條件為： 培養(yǎng)溫度為23~29 °C，光照10~12小時(shí)，光照強(qiáng)度1500~20001x，PH值為5.6~5.9,培養(yǎng)7~ 14天。
[0030] 進(jìn)一步地，含有形成層的組織經(jīng)固體培養(yǎng)基培養(yǎng)培養(yǎng)后獲得生長(zhǎng)良好的形成層干 細(xì)胞團(tuán)，還需要采用酶解法分離出蘆薈干細(xì)胞。本發(fā)明優(yōu)先采用質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.2-0.3%纖維 素酶溶液和質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.2-0.3%果膠酶溶液對(duì)形成層干細(xì)胞團(tuán)進(jìn)行酶解8~12小時(shí)。
[0031]步驟S3中，體外培養(yǎng)蘆薈干細(xì)胞的過(guò)程是在恒溫培養(yǎng)搖床中進(jìn)行的，搖床轉(zhuǎn)速為 100轉(zhuǎn)/分鐘~120轉(zhuǎn)/分鐘，溫度為30°C~37°C，每小時(shí)光照5~lOmin，培養(yǎng)時(shí)間為7天~14 天后，得到單細(xì)胞懸液。然后將單細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移至生物反應(yīng)器進(jìn)行大規(guī)模培養(yǎng)，在生物反應(yīng) 器中培養(yǎng)第4~7天時(shí)，加入新鮮的植物干細(xì)胞培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)后收獲擴(kuò)增后的蘆薈干細(xì) 胞。
[0032] 步驟S4中，將步驟S3中獲得的擴(kuò)增后的蘆薈干細(xì)胞放入-50~-100°C低溫環(huán)境下 冷凍2~3小時(shí)，然后取出解凍，重復(fù)3~5次，最后一次解凍后用超聲波破碎儀破碎細(xì)胞，收 集濾液，真空蒸發(fā)濃度，即獲得蘆薈干細(xì)胞提取物。
[0033]本發(fā)明進(jìn)一步保護(hù)上述方法所獲得的蘆薈干細(xì)胞提取物在制備食品、藥品、保健 品或化妝品中的應(yīng)用。
[0034]為了使本發(fā)明的目的、技術(shù)方案及優(yōu)點(diǎn)更加清楚明白，以下結(jié)合實(shí)施例，對(duì)本發(fā)明 進(jìn)行進(jìn)一步詳細(xì)說(shuō)明。應(yīng)當(dāng)理解，此處所描述的具體實(shí)施例僅用以解釋本發(fā)明，并不用于限 定本發(fā)明。
[0035] 實(shí)施例1
[0036] 本實(shí)施例中，蘆薈干細(xì)胞提取物的制備方法，包括以下步驟：
[0037] Sl、從蘆薈中獲取含有形成層的組織；
[0038] 選擇無(wú)化肥農(nóng)藥污染、綠色有機(jī)種植的蘆薈，并選取生長(zhǎng)狀況較佳的蘆薈莖尖，用 無(wú)菌水沖洗蘆薈莖尖表面附著物15~20分鐘，再用75%的酒精進(jìn)行表面消毒30秒，然后，用 〇. 1 %的升汞液消毒10~20分鐘，最后用無(wú)菌水反復(fù)沖洗5次，洗去植物表面的升汞殘液;將 滅菌后的蘆薈莖尖切成5_ X 5_大小，用接種刀剝離出含有形成層的組織。
[0039] S2、將含有形成層的組織置于固體培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)，分離出蘆薈干細(xì)胞；
[0040] 將步驟Sl中剝離出的含有形成層的組織接種至固體培養(yǎng)基中，以每Ig組織接種 5cm2固體培養(yǎng)基的密度進(jìn)行接種，培養(yǎng)后，形成層組織為均一生長(zhǎng)的平板狀組織，而其他組 織則為不規(guī)則的聚集生長(zhǎng)物；將再生的形成層組織與其他組織分離開(kāi)，以每Ig組織接種 5cm 2固體培養(yǎng)基的密度，將再生的形成層組織接種至新鮮的固體培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)。其中， 固體培養(yǎng)基中還含有濃度為I .Omg/L的萘乙酸和濃度為I .Omg/L的芐氨基腺嘌呤，且固體培 養(yǎng)基為MS培養(yǎng)基，含有濃度為232mg/L的CaCl2、140mg/U^KH 2P〇4、1642mg/U^KN03、 130.5411^/1的]\%5〇4、156〇11^/1的順4從)3、0.02111^/1的〇15〇4.5!12〇、6〇11^/1的維生素(：、、211^/ L的甘氨酸、1.0 mg/L的生長(zhǎng)素、質(zhì)量分?jǐn)?shù)為3 %的蔗糖和活性炭;培養(yǎng)條件為:溫度26 °C，光 照11小時(shí)，光照強(qiáng)度為18001x，PH值為5.6~5.9，培養(yǎng)14天；即可收獲形成層組織來(lái)源的蘆 薈干細(xì)胞團(tuán)；用質(zhì)量分?jǐn)?shù)為〇. 25%的果膠酶溶液和質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.25%的纖維素酶對(duì)蘆薈干 細(xì)胞團(tuán)進(jìn)行酶解12小時(shí)，分離出蘆薈干細(xì)胞。
[0041 ] S3、將蘆薈干細(xì)胞置于植物干細(xì)胞培養(yǎng)基中進(jìn)行體外培養(yǎng)；
[0042]將步驟S2中酶解后的蘆薈干細(xì)胞轉(zhuǎn)移至植物干細(xì)胞培養(yǎng)液中，并置于恒溫培養(yǎng)搖 床上培養(yǎng)。
[0043]其中，植物干細(xì)胞培養(yǎng)液為MS培養(yǎng)基，其中含有濃度為372mg/L的CaCl2、181mg/L 的KH2PO4、1790mg/L的KN〇3、173.54mg/L的MgS〇4、1840mg/L的NH4N〇3、0.022mg/L的CuS〇4 · 5H2〇、60mg/L的維生素 C、I · 58mg/L的甘氨酸、I · 5mg/L的生長(zhǎng)素、質(zhì)量分?jǐn)?shù)為3%的鹿糖和濃 度為6. Og/L的瓊脂等添加物;搖床的轉(zhuǎn)速為110轉(zhuǎn)/分鐘，培養(yǎng)溫度為34°C，每小時(shí)光照8分 鐘，培養(yǎng)第7天，加入新鮮的植物干細(xì)胞培養(yǎng)液至細(xì)胞密度為IX IO7個(gè)/ml，然后繼續(xù)培養(yǎng)， 培養(yǎng)后用100目的不銹鋼篩網(wǎng)過(guò)濾，除去細(xì)胞團(tuán)、殘?jiān)?，得到蘆薈干細(xì)胞懸液；
[0044]然后，將蘆薈干細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移至20L生物反應(yīng)器中進(jìn)行大規(guī)模培養(yǎng)，生物反應(yīng)器中 添加有5L的植物干細(xì)胞培養(yǎng)基，培養(yǎng)第7天時(shí)，加入IOL的新鮮培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)后收獲細(xì) 胞。對(duì)照組培養(yǎng)在生物反應(yīng)器中持續(xù)培養(yǎng)20天，中間不添加培養(yǎng)基。培養(yǎng)后收獲細(xì)胞，稱重。 LUU46J 步驟S4、戶會(huì)十細(xì)腿提取物的制爸；
[0047] 收集步驟S3中獲得蘆薈干細(xì)胞懸液，用Ium過(guò)濾器過(guò)濾，去掉培養(yǎng)基，收獲截留的 細(xì)胞;并將細(xì)胞放入-80 °C的超低溫冷凍2小時(shí)，然后取出解凍30分鐘，重復(fù)上述操作5次，最 后一次室溫解凍后，用超聲波破碎儀破碎細(xì)胞，過(guò)濾器過(guò)濾后，搜集濾液，于旋轉(zhuǎn)式真空蒸 發(fā)器內(nèi)濃縮，即可獲得蘆薈干細(xì)胞提取物，采用HPLC法測(cè)定蘆薈干細(xì)胞提取物中蘆薈苷的 含量為150.80mg/g;而直接從蘆薈萃取液中，蘆薈苷的含量?jī)H為32.35mg/g。
[0048] 以上對(duì)本發(fā)明的實(shí)施例進(jìn)行了描述，但是本發(fā)明并不局限于上述的具體實(shí)施方 式，上述的【具體實(shí)施方式】?jī)H僅是示意性的，而不是限制性的，本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員在本發(fā) 明的啟示下，在不脫離本發(fā)明宗旨和權(quán)利要求所保護(hù)的范圍情況下，還可做出很多形式，這 些均屬于本發(fā)明的保護(hù)之內(nèi)。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種蘆薈干細(xì)胞提取物的制備方法，其特征在于，包括以下步驟： 從蘆薈中獲取含有形成層的組織； 將所述含有形成層的組織置于固體培養(yǎng)基中培養(yǎng)后，分離出蘆薈干細(xì)胞； 再將所述蘆薈干細(xì)胞置于植物干細(xì)胞培養(yǎng)基中進(jìn)行體外培養(yǎng)，獲得擴(kuò)增后的蘆薈干細(xì) 胞； 所述擴(kuò)增后的蘆薈干細(xì)胞經(jīng)冷凍破碎后濃縮，即收獲蘆薈干細(xì)胞提取物。2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的蘆薈干細(xì)胞提取物的制備方法，其特征在于，所述冷凍破碎過(guò) 程為:將所述擴(kuò)增后的蘆薈干細(xì)胞放入-50~_100°C低溫環(huán)境下冷凍2~3小時(shí)，然后取出解 凍，重復(fù)3~5次。3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的蘆薈干細(xì)胞提取物的制備方法，其特征在于，所述植物干細(xì)胞 培養(yǎng)基包括無(wú)機(jī)鹽、維生素、氨基酸、生長(zhǎng)素、糖類(lèi)和瓊脂。4. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的蘆薈干細(xì)胞提取物的制備方法，其特征在于，所述固體培養(yǎng)基 包括無(wú)機(jī)鹽、維生素、氨基酸、生長(zhǎng)素、糖類(lèi)和活性炭。5. 根據(jù)權(quán)利要求4所述的蘆薈干細(xì)胞提取物的制備方法，其特征在于，所述固體培養(yǎng)基 中還包括萘乙酸和芐氨基腺嘌呤。6. 根據(jù)權(quán)利要求3或4所述的蘆薈干細(xì)胞提取物的制備方法，其特征在于，所述糖類(lèi)為 蔗糖或乳糖。7. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的蘆薈干細(xì)胞提取物的制備方法，其特征在于，所述體外培養(yǎng)過(guò) 程是在恒溫培養(yǎng)搖床中培養(yǎng)7~14天后，再轉(zhuǎn)移至生物反應(yīng)器中進(jìn)行大規(guī)模培養(yǎng)。8. 根據(jù)權(quán)利要求7所述的蘆薈干細(xì)胞提取物的制備方法，其特征在于，所述體外培養(yǎng)的 條件為溫度為30°C~37°C，每小時(shí)光照5~lOmin。9. 一種根據(jù)權(quán)利要求1~8任一項(xiàng)所述的蘆薈干細(xì)胞提取物的制備方法所獲得的蘆薈 干細(xì)胞提取物。10. 根據(jù)權(quán)利要求9所述的蘆薈干細(xì)胞提取物在制備食品、藥品、保健品或化妝品中的 應(yīng)用。
【文檔編號(hào)】A61K36/886GK105962367SQ201610268507
【公開(kāi)日】2016年9月28日
【申請(qǐng)日】2016年4月27日
【發(fā)明人】曾憲卓, 張哲
【申請(qǐng)人】深圳愛(ài)生再生醫(yī)學(xué)科技有限公司