Aspergillus niger曲霉谷氨酸肽酶改善動(dòng)物生產(chǎn)性能的用圖
【專利摘要】本發(fā)明涉及將Aspergillus niger曲霉谷氨酸肽酶用于包含谷類、豆類、含油種子和/或塊莖的飼料組合物來改善動(dòng)物生產(chǎn)性能、減少氮排泄和/或減少腸道炎癥的用途。此外，本發(fā)明涉及包含Aspergillus niger曲霉谷氨酸肽酶的飼料組合物或飼料添加劑。本發(fā)明涉及以下發(fā)現(xiàn)：Aspergillus niger曲霉谷氨酸肽酶能夠有效地水解小麥、大麥和相關(guān)谷類物種中存在的α?淀粉酶/胰蛋白酶抑制劑，以及水解豆類、含油種子和塊莖中存在的胰蛋白酶抑制劑。此外，本發(fā)明涉及改善動(dòng)物生產(chǎn)性能的方法，包括改善飼料轉(zhuǎn)化率、和/或改善每日體重增加、和/或減少腸道炎癥、和/或減少氮排泄，所述動(dòng)物用包含α?淀粉酶和/或胰蛋白酶抑制劑的飼料喂養(yǎng)，所述方法包括經(jīng)口施用足夠量的所述Aspergillus niger曲霉谷氨酸肽酶。本發(fā)明還涉及用Aspergillus niger曲霉谷氨酸肽酶預(yù)處理飼料。
【專利說明】ASPERGILLUS NIGER曲霉谷氨酸肽酶改善動(dòng)物生產(chǎn)性能的 用途
[0001 ] 發(fā)明簡(jiǎn)述
[0002]本發(fā)明涉及將Aspergillus niger曲霉谷氨酸肽酶用于包含谷類、豆類、含油種子 和/或塊莖的飼料組合物來改善動(dòng)物生產(chǎn)性能、減少氮排泄和/或改善蛋白質(zhì)消化的用途。 此外，本發(fā)明涉及包含AspergiIlus niger曲霉谷氨酸肽酶的飼料組合物或飼料添加劑。本 發(fā)明涉及以下發(fā)現(xiàn):AspergiIIus niger曲霉谷氨酸肽酶能夠有效地水解小麥、大麥和相關(guān) 谷類物種中存在的淀粉酶/胰蛋白酶抑制劑，以及水解豆類、含油種子和塊莖中存在的胰 蛋白酶抑制劑。此外，本發(fā)明涉及改善動(dòng)物生產(chǎn)性能的方法，包括改善飼料轉(zhuǎn)化率、和/或改 善每日體重增加、和/或減少腸道炎癥、和/或減少氮排泄，所述動(dòng)物用包含α-淀粉酶和/或 胰蛋白酶抑制劑的飼料喂養(yǎng)，所述方法包括經(jīng)口施用足夠量的AspergiIIus niger曲霉谷 氨酸肽酶。本發(fā)明還涉及用AspergiIIus niger曲霉谷氨酸肽酶預(yù)處理飼料。本發(fā)明還涉及 包含AspergiIlus niger曲霉谷氨酸肽酶的飼料組合物用于減少動(dòng)物腸道炎癥的用途。
[0003] 發(fā)明背景
[0004] 蛋白質(zhì)是動(dòng)物和人類必要的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)。大多數(shù)牲畜和人類從植物蛋白質(zhì)來源獲得 大部分必要的蛋白質(zhì)。重要的植物蛋白質(zhì)來源為例如含油種子作物、豆類和谷類。當(dāng)單胃動(dòng) 物諸如豬和家禽的飼料包含例如豆柏時(shí)，大部分豆柏固體未被消化。例如，仔豬和生長(zhǎng)期的 豬中的表觀回腸蛋白質(zhì)消化率分別記錄為僅77%和84%。
[0005] 確實(shí)，谷物糧食、豆類和塊莖包含大量抗?fàn)I養(yǎng)因子和潛在的過敏原，諸如小麥、大 麥和相關(guān)谷類中存在的α-淀粉酶/胰蛋白酶抑制劑，或大豆胰蛋白酶抑制劑(Kunitz型抑制 劑和/或Bowman-Birk抑制劑），該抑制阻礙了最佳生長(zhǎng)性能，可改變動(dòng)物的健康，并導(dǎo)致氮 不必要地釋放到環(huán)境中。
[0006] 大多數(shù)植物貯藏器官諸如種子和塊莖包含其總蛋白質(zhì)的1-10%的具有不同生物 化學(xué)性質(zhì)和結(jié)構(gòu)性質(zhì)的蛋白酶抑制劑，所述蛋白酶抑制劑抑制不同類型的蛋白酶。蛋白質(zhì) 抑制劑根據(jù)其抑制的酶類型分為:絲氨酸蛋白酶抑制劑、半胱氨酸蛋白酶抑制劑、天冬氨酸 蛋白酶抑制劑或金屬羧基蛋白酶抑制劑。
[0007] 植物過敏原是一群廣泛的植物蛋白，其包含植物防御體系的Cupin和醇溶谷蛋白 超家族以及蛋白類分子。所述醇溶谷蛋白超家族包括豆類、堅(jiān)果、谷物、水果和蔬菜的幾種 重要類型的過敏原，以及谷物α-淀粉酶和蛋白酶抑制劑?；诮Y(jié)構(gòu)相似，具有植物來源的蛋 白類α-淀粉酶抑制劑通常分為六個(gè)家族，包括血凝素樣（lect in-1 ike)、諾特樣(knottin-like)、CM-蛋白、庫(kù)尼茲樣(Kunitz-Iike)、C-噪呤硫素樣以及奇異果甜蛋白樣(1:1^111]^1:;[11-like) (Richardson，1990)。CM(氯仿-甲醇)-蛋白來自谷物種子的大蛋白家族，包含120至 160個(gè)氨基酸殘基和五個(gè)二硫鍵。它們顯示了典型的雙頭α-淀粉酶/胰蛋白酶結(jié)構(gòu)域。這一 特性使得它們有可能抑制α_淀粉酶和胰蛋白酶樣的酶的活性。α-淀粉酶抑制劑0.19是該家 族被研究最多的抑制劑之一;其具有廣泛的特異性，并抑制來自昆蟲、鳥類和哺乳動(dòng)物的α-淀粉酶。大豆胰蛋白酶抑制劑(Kuni tz型)在1945年首先由Kuni tz發(fā)現(xiàn)。
[0008] WO 2011/137322最近公開，小麥和相關(guān)谷類中包含的α-淀粉酶/胰蛋白酶抑制劑 家族成員是人類腸道中先天免疫應(yīng)答的強(qiáng)誘導(dǎo)劑。在家畜中，此效應(yīng)轉(zhuǎn)化為亞最佳動(dòng)物生 產(chǎn)性能、消化率降低以及腸道炎癥。
[0009] 如Munir與Maqsood，EJFA，2013,25:66-80的最近評(píng)述所概述，在動(dòng)物飼料中使用 外源酶是改善動(dòng)物生產(chǎn)性能的最有前途的策略之一。
[0010] WO 2011/137322公開了將抗α-淀粉酶抗體CM 3用于治療乳糜瀉患者或處理食物 組合物的用途，并考慮將蛋白酶的使用作為替代。然而，關(guān)于有效地水解動(dòng)物胃腸道中的α-淀粉酶/胰蛋白酶抑制劑或大豆胰蛋白酶抑制劑以改善消化率和動(dòng)物生產(chǎn)性能的特異性酶 沒有記載。
[0011] 期望提供一種安全、有效且具有成本競(jìng)爭(zhēng)力的途徑來分解家畜胃腸道中谷類的α-淀粉酶/胰蛋白酶抑制劑以及豆類、含油種子和塊莖的胰蛋白酶抑制劑，以減少腸道炎癥、 減少氮排泄以及改善動(dòng)物生產(chǎn)性能，所述家畜用包含所述抑制劑的組合物飼養(yǎng)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0012]出人意料的是，本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，酶即Aspergillus niger曲霉谷氨酸肽酶具有水解 動(dòng)物胃腸系統(tǒng)中的植物過敏原/抗?fàn)I養(yǎng)因子，諸如α-淀粉酶和/或胰蛋白酶抑制劑，從而改 善動(dòng)物生產(chǎn)性能、減少氮排泄和減少腸道炎癥的巨大潛力。
[0013]因此本發(fā)明涉及Aspergillus niger曲霉谷氨酸肽酶用于包含谷類、豆類、含油種 子和/或塊莖的飼料組合物來改善動(dòng)物生產(chǎn)性能的用途。
[0014] Aspergillus niger曲霉谷氨酸肽酶(AGP)(EC 3.4.23.19)此前稱為曲霉胃蛋白 酶II，從AspergiIIus niger var ·macrosporus分離，是屬于肽酶家族A4的獨(dú)特蛋白酶。該 酶與屬于肽酶家族Al(典型的胃蛋白酶型酸性蛋白酶)的天冬氨酸蛋白酶不同源，因此對(duì)其 特異性抑制劑諸如胃酶抑素 A不敏感。因此，該酶也被歸為"胃酶抑素不敏感的"酸性蛋白 酶。在目前已知的谷氨酸肽酶中，AGP的特征在于它是唯一的雙鏈酶。酶的氨基酸序列與典 型的天冬氨酸蛋白酶的序列無同源性。
[0015] 根據(jù)本發(fā)明的術(shù)語Aspergillus niger曲霉谷氨酸肽酶包括與Aspergillus niger曲霉谷氨酸肽酶(11]1丨？1'〇1:103/3￥丨88-?1'〇1:識(shí)別號(hào)？24665)的氨基酸序列具有至少70% 同一性的酶，例如與P24665具有至少80%、85%、90 %、95 %、98%、99%同一性的酶。根據(jù)本 發(fā)明的最優(yōu)選的同源酶是來自Scytalidium Iignicolum的scytalidoglutamis肽酶、來自 Crypphonectria parasitica的酸性肽酶B和C以及來自 Sclerotina sclerotiorum的酸性 蛋白酶。
[0016] 本文所公開的Aspergillus niger曲霉谷氨酸肽酶可以以純的形式，或以包含 Aspergillus niger曲霉谷氨酸肽酶的制劑的形式存在，其中至少40%、50%、60%、70%、 80%、90%、95%或更多的蛋白酶活性來源于Aspergillus niger曲霉谷氨酸肽酶，其中活 性以HPU(組氨酸蛋白酶單位)表示；一個(gè)HPU為每分鐘水解血紅蛋白的量的酶的量，得到溶 液在275nm下的光密度等于在0. lmol/L的HCl溶液中含有每mLlyg L-酪氨酸的溶液的光密 度。測(cè)試條件為:PHl. 75，溫度40°C，孵育期間的血紅蛋白濃度16.7g/L。
[0017] 活性(HPU/mL) = (0D|?-0Ete/S) X11/30
[0018] 其中：
[0019] 〇D|?:樣本濾液的光密度（275nm)
[0020] 0??:空白樣本濾液的光密度(27 5nm)
[0021 ] S: 1 · lyg/mL L-酪氨酸標(biāo)準(zhǔn)溶液的OD(mLAig)
[0022] 30:孵育時(shí)間（分鐘）
[0023] 11:反應(yīng)混合物的總體積(mL)。
[0024] 根據(jù)本發(fā)明的Aspergillus niger曲霉谷氨酸肽酶可根據(jù)Handbook of Proteolytic Enzymes,A.J.Barret,N.D.Rawlings,and J.F.ffoessner eds.；Academic Press;或 PCT/EP2013/066899所公開制備。
[0025] 根據(jù)本發(fā)明，改善的動(dòng)物生產(chǎn)性能的特征在于改善的飼料轉(zhuǎn)化率、改善的每日體 重增加、改善的消化率、減少的氮排泄和/或減少的腸道炎癥。動(dòng)物生產(chǎn)性能可通過本領(lǐng)域 熟知的方法評(píng)估，并且通常以飼料轉(zhuǎn)化率、飼料攝入量、消化率、體重增加、胴體產(chǎn)率表征。 腸道炎癥將導(dǎo)致飼料攝入減少，或消化率降低。
[0026] 術(shù)語"動(dòng)物"包括所有動(dòng)物，包括人類在內(nèi)。根據(jù)本發(fā)明的優(yōu)選的動(dòng)物是單胃動(dòng)物 (單室胃），更優(yōu)選的是選自非反芻動(dòng)物的單胃動(dòng)物，特別是：寵物(包括但不限于馬、貓和 狗）、家禽(包括但不限于火雞、鴨和雞）、豬或豚(包括但不限于仔豬、生長(zhǎng)期的豬和母豬）、 魚(包括但不限于鮭魚、鱒魚、羅非魚、鯰魚和鯉魚）以及兔子。
[0027] 術(shù)語"飼料"或"飼料組合物"意指適于或旨在用于動(dòng)物攝入的任何化合物、制劑、 混合物或組合物。在一個(gè)實(shí)施方式中，飼料具有能量?jī)?nèi)容(例如治療劑除外）。在另一個(gè)實(shí)施 方式中，飼料中包括一種或多種植物蛋白質(zhì)。這些植物蛋白質(zhì)可部分來源于豆類例如大豆、 菜豆或豌豆，部分來源于谷類例如小麥、大麥或玉米，部分來源于含油種子例如向日葵種子 或油菜籽，和/或部分來源于塊莖例如馬鈴薯。在根據(jù)本發(fā)明的用途中，Aspergillus niger 曲霉谷氨酸肽酶可在膳食之前、之后或與膳食同時(shí)飼喂動(dòng)物。后者是優(yōu)選的。
[0028] 毫無疑問，Aspergillus niger曲霉谷氨酸肽酶應(yīng)以有效量，即足以改善淀粉酶/ 胰蛋白酶抑制劑、Kun i tz抑制劑和/或Bowman-Birk抑制劑的消化和/或分解，從而改善飼 料的營(yíng)養(yǎng)值的量施用。目前設(shè)想，酶例如以下述量中的一者或多者施用：約〇. Olmg至約 IOOmg酶/kg動(dòng)物飼料，或優(yōu)選地約0.05mg至約50mg酶/kg動(dòng)物飼料，更優(yōu)選地0.1至IOmg酶/ kg動(dòng)物飼料。
[0029] 提供給動(dòng)物的酶正常日劑量/飼料攝入量取決于動(dòng)物的種類及其狀況，并且可由 本領(lǐng)域的技術(shù)人員容易地調(diào)整。就根據(jù)本發(fā)明的用途而言，飼料包含下述量的酶單位的 AspergiIIus niger曲霉谷氨酸肽酶/Kg飼料，所述量能夠消化60%至95%的在小麥、大豆 或相關(guān)谷類中攜帶的α_淀粉酶/胰蛋白酶抑制劑。優(yōu)選地，飼料組合物包含1至10000HPU/Kg 飼料，更優(yōu)選地10至5000HPU/Kg飼料，甚至更優(yōu)選地50至lOOOHPU/Kg飼料。
[0030] 改善的動(dòng)物生產(chǎn)性能優(yōu)選地以改善的飼料轉(zhuǎn)化率、改善的每日體重增加、改善的 消化率和/或減少的腸道炎癥測(cè)量。飼料轉(zhuǎn)化率(FCR)可根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)動(dòng)物生長(zhǎng)試驗(yàn)確定，包括 其中酶以合適的濃度/kg飼料加入動(dòng)物飼料的第一處理，和酶不加入動(dòng)物飼料的第二處理 (對(duì)照KFCR以飼料攝入(g)/動(dòng)物除以體重增加(g)/動(dòng)物計(jì)算。改善的FCR小于對(duì)照FCR是公 知的。更優(yōu)選地，就本發(fā)明的用途而言，改善的飼料轉(zhuǎn)化率意指在常規(guī)的動(dòng)物生產(chǎn)性能試驗(yàn) 中測(cè)量時(shí)減少最少1%。優(yōu)選地，飼料轉(zhuǎn)化率減少至少2%，更優(yōu)選地減少至少2.5%，甚至更 優(yōu)選地減少至少3%，最優(yōu)選地減少至少3.5%。
[0031] 就Aspergillus niger曲霉谷氨酸肽酶用于動(dòng)物飼料的用途的實(shí)現(xiàn)而言，酶可通 過飼料配制和加工領(lǐng)域本身已知的方法摻入飼料。在【具體實(shí)施方式】中，如US 2008/0031998 所述，酶配制為包含有機(jī)酸的鋅鹽的酶顆粒，以使其耐受蒸汽制粒。因此，本發(fā)明涉及將 Aspergillus niger曲霉谷氨酸肽酶用于包含小麥、大麥或大豆的飼料組合物以改善動(dòng)物 生產(chǎn)性能的用途，其中AspergilIus niger曲霉谷氨酸肽酶是包含有機(jī)酸的鋅鹽的顆粒的 形式。在【具體實(shí)施方式】中，有機(jī)酸的鋅鹽是水溶性的。當(dāng)與動(dòng)物飼料使用時(shí)，重要的是用于 顆粒的材料具有某種純度，因此在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方式中，有機(jī)酸的鋅鹽是食品級(jí)。有機(jī) 酸的有機(jī)鋅鹽可選自但不限于:檸檬酸、蘋果酸、馬來酸、丙二酸、甲二磺酸、琥珀酸、乳酸、 甲酸、乙酸、丁酸、丙酸、苯甲酸、酒石酸、抗壞血酸、葡糖酸的鋅鹽、氨基酸水合物的鋅螯合 物以及它們的組合所組成的組。
[0032] 在本發(fā)明的【具體實(shí)施方式】中，有機(jī)酸的鋅鹽選自：檸檬酸、蘋果酸、馬來酸、丙二 酸、甲二磺酸、琥珀酸、乳酸、甲酸、乙酸的鋅鹽和氨基酸水合物的鋅螯合物組成的組。有機(jī) 酸的鋅鹽可選自：檸檬酸鋅、蘋果酸鋅、馬來酸鋅、丙二酸鋅、甲二磺酸鋅、琥珀酸鋅、乳酸 鋅、甲酸鋅、乙酸鋅、丁酸鋅、丙酸鋅、苯甲酸鋅、酒石酸鋅、抗壞血酸鋅、葡糖酸鋅、甲二磺酸 鋅、賴氨酸鋅、甲硫氨酸鋅以及它們的組合組成的組。有機(jī)酸的鋅鹽可選自：檸檬酸鋅、蘋果 酸鋅、馬來酸鋅、丙二酸鋅、甲二磺酸鋅、琥珀酸鋅、乳酸鋅、甲酸鋅、乙酸鋅、丁酸鋅、丙酸 鋅、苯甲酸鋅、酒石酸鋅、抗壞血酸鋅、葡糖酸鋅、甲二磺酸鋅、賴氨酸鋅以及它們的組合組 成的組。
[0033] 此外，根據(jù)本發(fā)明的飼料組合物還可包含一種或多種額外的外源酶，所述外源酶 選自：植酸酶（EC 3.1.3.8或3.1.3.26)、木聚糖酶（EC 3.2.1.8)、半乳聚糖酶（EC 3·2·1·89)、α-半乳糖苷酶(EC 3.2.1.22)、蛋白酶(EC 3.4·)、磷脂酶A1(EC 3.1.1.32)、磷 脂酶八2^0 3.1.1.4)、溶血磷脂酶^0 3.1.1.5)、磷脂酶(：^0 3.1.4.3)、磷脂酶0^〇 3.1.4.4)、淀粉酶諸如例如α-淀粉酶(EC 3.2.1.1)和/或β-葡聚糖酶(EC 3.2.1.4或EC 3.2.1.6)或它們的任何混合物。
[0034] 優(yōu)選地，根據(jù)本發(fā)明的飼料組合物或飼料添加劑還包含一種或多種額外的外源 酶，該外源酶選自額外的蛋白酶（例如：RONOZYME-ProAct)和/或植酸酶（例如：R0N0ZYME-HiPhos)〇
[0035] 本發(fā)明涉及Aspergi Ilus niger曲霉谷氨酸肽酶的組合物和用途，因此上述實(shí)施 方式特別地涉及包含AspergiIlus niger曲霉谷氨酸肽酶的飼料組合物或飼料添加劑。優(yōu) 選地，飼料組合物包含2至10000HPU/Kg飼料，更優(yōu)選地10至5000HPU/Kg飼料，甚至更優(yōu)選地 50 至 lOOOHPU/Kg 飼料。
[0036]在根據(jù)本發(fā)明的所有實(shí)施方式中，谷類選自小麥、大麥、玉米或黑麥，豆類選自大 豆、菜豆或豌豆，含油種子選自向日葵種子或油菜籽，并且塊莖為馬鈴薯。優(yōu)選地，谷類選自 小麥、大麥、玉米，并且豆類選自大豆。在優(yōu)選的發(fā)明的最優(yōu)選的實(shí)施方式中，谷類為小麥以 及豆類為大豆。
[0037]因此，根據(jù)本發(fā)明的優(yōu)選飼料組合物包含選自小麥、大麥或玉米的谷類，選自大豆 的豆類，含油種子和/或塊莖，更優(yōu)選地，其包含選自小麥的谷類，以及選自大豆的豆類。
[0038]本發(fā)明的飼料組合物的具體例子如下：
[0039] -動(dòng)物飼料添加劑，其包含(a)Aspergillus niger曲霉谷氨酸肽酶，（b)至少一種 脂溶性維生素，（c)至少一種水溶性維生素，和/或(d)至少一種痕量礦物質(zhì)；
[0040] -動(dòng)物飼料組合物，其包含AspergiIlus niger曲霉谷氨酸肽酶和50-800g/kg飼 料的粗蛋白含量。
[0041] -動(dòng)物飼料組合物，其包含Aspergillus niger曲霉谷氨酸肽酶和選自小麥、大麥 或相關(guān)谷類物種的谷類。優(yōu)選地，所述飼料組合物包含5-60重量％選自小麥、大麥或相關(guān)谷 類物種的谷類，更優(yōu)選地，所述谷類是小麥。
[0042]所謂的預(yù)混物為本發(fā)明的動(dòng)物飼料添加劑的例子。預(yù)混物是指優(yōu)選地一種或多種 微量成分與稀釋劑和/或載體的均勻混合物。預(yù)混物用于促進(jìn)微量成分在大型混合物中的 均勻分散。
[0043]在另一個(gè)實(shí)施方式中，本發(fā)明涉及用于飼料組合物的Aspergillus niger曲霉谷 氨酸肽酶，該飼料組合物包含小麥、大麥、大豆或相關(guān)谷類，以減少動(dòng)物的腸道炎癥。
[0044]在又一個(gè)實(shí)施方式中，本發(fā)明涉及改善動(dòng)物生產(chǎn)性能的方法，包括改善用谷類、豆 類、含油種子和/或塊莖飼養(yǎng)的動(dòng)物的飼料轉(zhuǎn)化率，和/或改善每日體重增加，和/或減少氮 排泄，和/或減少腸道炎癥，該方法包括經(jīng)口施用足夠量的AspergiIIus niger曲霉谷氨酸 肽酶。更優(yōu)選地，谷類選自小麥或大麥，豆類為大豆;甚至更優(yōu)選地，谷類為小麥以及豆類為 大豆。
[0045]在另一個(gè)實(shí)施方式中，本發(fā)明涉及將Aspergillus niger曲霉谷氨酸肽酶用于預(yù) 處理包含谷類、豆類、含油種子和/或塊莖的動(dòng)物飼料或動(dòng)物飼料組分的用途。優(yōu)選地，谷類 選自小麥或大麥，以及豆類為大豆;更優(yōu)選地，谷類為小麥以及豆類為大豆。本領(lǐng)域的技術(shù) 人員將根據(jù)被處理的飼料組合物估算加入飼料的AspergiIlus niger曲霉谷氨酸肽酶的 量，以及分解蛋白酶抑制劑所需的時(shí)間。就小麥類飼料而言，AspergiIlus niger曲霉谷氨 酸肽酶以50至5000HPU/Kg小麥，優(yōu)選地100至2000HPU/Kg小麥加入。
[0046]由根據(jù)本發(fā)明的Aspergillus niger曲霉谷氨酸肽酶分解的植物過敏原蛋白酶 抑制劑優(yōu)選地為特別地在小麥、大麥、黑麥、燕麥及其雜交(cross-related)品種中發(fā)現(xiàn)的 那些抑制劑，諸如α-淀粉酶/胰蛋白酶抑制劑，更優(yōu)選地，根據(jù)其被AspergiIIus niger曲霉 谷氨酸肽酶的快速分解，植物過敏原為CM 2、CM 3、CM 16和0.19,甚至更優(yōu)選地CM 3和 0.19<ΧΜ 3氨基酸序列標(biāo)識(shí)號(hào)為SwissProt P01083,而0.19氨基酸序列標(biāo)識(shí)號(hào)為Swiss Prot P01085。此外，Kunitz型（Swiss Prot ID:P01070)和Bowman-Birk型（Swiss Prot ID: P01055)大豆蛋白酶抑制劑也被Aspergillus niger曲霉谷氨酸肽酶有效地分解，從而有助 于改善動(dòng)物生產(chǎn)性能。
[0047] 在上述方法中，加入飼料組合物的優(yōu)選的酶量取決于飼料基質(zhì)和α-淀粉酶/胰蛋 白酶抑制劑的預(yù)估量。
[0048] 在又一個(gè)實(shí)施方式中，本發(fā)明涉及由上述方法制備的、用于分解飼料組合物中的 淀粉酶/蛋白酶抑制劑的飼料，該方法包括用AspergiIlus niger曲霉谷氨酸肽酶孵育包含 植物過敏原/蛋白酶抑制劑的飼料組合物足以水解植物過敏原/蛋白酶抑制劑的時(shí)間，所述 飼料組合物包含被分解的α-淀粉酶/胰蛋白酶抑制劑。
[0049]在又一個(gè)實(shí)施方式中，本發(fā)明涉及將所有上述實(shí)施方式的Aspergillus niger曲 霉谷氨酸肽酶用于包含谷類、豆類、含油種子和/或塊莖的食物組合物，以改善人的蛋白質(zhì) 消化率的用途。
[0050]在又一個(gè)實(shí)施方式中，本發(fā)明涉及將Aspergillus niger曲霉谷氨酸肽酶用于預(yù) 處理包含谷類、豆類、含油種子和/或塊莖的食物或食品材料，以防止加工期間的熱預(yù)處理 的用途。優(yōu)選的食品材料為包含食物成分的大豆。
[0051 ] 里盤
[0052]里i:小麥《淀粉酶抑制劑與不同的蛋白酶+胃蛋白酶在模擬胃條件下的各種孵育 的4-12 % SDS-PAGE (4-12 % Bi s-Tr i s凝膠)分析。包括兩個(gè)無額外的酶的具有胃蛋白酶處理 的對(duì)照。箭頭表示α淀粉酶制劑中存在的三種主要蛋白質(zhì)產(chǎn)物的位置。
[0053]-分子量標(biāo)記:第1、2和15道
[0054] -Aspergillus niger脯氨酸特異性內(nèi)切蛋白酶處理:t = 0,第3道;t = 90分鐘，第4 道
[0055] -Aspergillus niger曲霉谷氨酸肽酶：t = 0,第5道;t = 90分鐘，第6道
[0056] -胃蛋白酶:t = 0,第7道;t = 90分鐘，第8道 [0057]-木瓜蛋白酶:t = 0,第9道;t = 90分鐘，第10道
[0058] -Multifect PR 15L:t = 0,第 11 道；t = 90分鐘，第 12道
[0059] -曲霉胃蛋白酶l:t = 0,第13道;t = 90分鐘，第14道
[0060] -胃蛋白酶:t = 0,第16道;t = 90分鐘，第17道。
[00611圖2:小麥α淀粉酶抑制劑的制備性SDS-PAGE，來鑒定帶Bl至Gl中存在的豐度最高 的蛋白質(zhì)的性質(zhì)。
[0062] _:大豆來源胰蛋白酶-胰凝乳蛋白酶抑制劑與不同的蛋白酶+胃蛋白酶在模擬 胃條件下的各種孵育的4-12 % SDS-PAGE (4-12 % Bi s-Tr i s凝膠)分析。包括一個(gè)無額外的酶 的具有胃蛋白酶處理的對(duì)照。箭頭表示被分解的大豆來源胰蛋白酶-胰凝乳蛋白酶抑制劑 中存在的上部主要蛋白質(zhì)產(chǎn)物的位置。
[0063]-分子量標(biāo)記:第M道
[0064]-胃蛋白酶:t = 0,第1道;t = 60分鐘，第2道
[0065] -Aspergillus niger脯氨酸特異性內(nèi)切蛋白酶:t = 0,第3道;t = 60分鐘，第4道
[0066] -Aspergillus niger曲霉谷氨酸肽酶:t = 0,第5道;t = 60分鐘，第6道
[0067] -Multifect PR 15L:t = 0,第7道；t = 60分鐘，第8道
[0068] -曲霉胃蛋白酶l:t = 0,第9道;t = 60分鐘，第10道
[0069] 圖4:小麥來源嘌呤硫素與不同的蛋白酶+胃蛋白酶在模擬胃條件下的各種孵育的 4-12%SDS-PAGE(4-12%Bis-Tris凝膠)分析。箭頭表示純化的嘌呤硫素的位置。
[0070] -分子量標(biāo)記:第1、2、9和10道
[0071] -Aspergillus niger曲霉谷氨酸肽酶:t = 0,第3道;t = 90分鐘，第4道 [0072] -Aspergillus niger脯氨酸特異性內(nèi)切蛋白酶:t = 0,第5道;t = 90分鐘，第6道
[0073] -Multifect PR 15L(來自里氏木霉(Trichoderma reesei)的曲霉胃蛋白酶I樣蛋 白酶）：t = 0,第7道;t = 90分鐘，第8道。
[0074] 通過以下實(shí)施例進(jìn)一步說明本發(fā)明。 實(shí)施例
[0075]實(shí)施例1:AspergiIlus niger曲霉谷氨酸肽酶在模擬胃條件下有效地裂解小麥來 源α淀粉酶/胰蛋白酶抑制劑，而其他酸性內(nèi)切蛋白酶則無此效果。
[0076] 材料和方法
[0077] 來自AspergiIlus niger的曲霉胃蛋白酉每I的產(chǎn)生
[0078] 來自Aspergillus niger的曲霉胃蛋白酶I的基因 （pepA;Anl4g04710)使用如WO 98/46772所述的方法在Aspergillus niger宿主中過表達(dá)。WO 98/46772公開了如何在包含 乙酰胺的瓊脂平板上選擇轉(zhuǎn)化體，以及如何選擇目標(biāo)多拷貝整合體。選擇包含表達(dá)盒的多 拷貝的A.niger轉(zhuǎn)化體用于樣本材料的進(jìn)一步產(chǎn)生。在改良的CSM-發(fā)酵培養(yǎng)基pH 6.2(40g/ 1 麥芽糖、30g/l Bacto-大豆胨、70g/l檸檬酸三鈉二水合物、15g/l (NH4)2S〇4、lg/1 NaH2P〇4* 2H2〇、lg/l MgS〇4*7H2〇、lg/l L_Arg、0.25ml/l Clerol消泡劑）中發(fā)酵轉(zhuǎn)化的Aspergillus niger菌株。通過過濾、無菌過濾然后通過超濾濃縮獲得培養(yǎng)液。將酶施加到Q-sepharose XK 26/10柱，在50mmol/l乙酸鈉 pH5.6中進(jìn)行色譜分析，然后用鹽梯度洗脫。各級(jí)分中存在 的曲霉胃蛋白酶I蛋白通過4-12%SDS-PAGE(NuPAGE Bis-TrisGeI，Invitrogen)后判斷染 色蛋白帶的強(qiáng)度來定量。
[0079] 酶法測(cè)定
[0080]孵育在50mmol/l檸檬酸鈉 pH4.0中37°C下進(jìn)行90分鐘。在所有相關(guān)孵育中，胃蛋白 酶以0.2mg/ml的酶蛋白濃度存在。脯氨酸特異性內(nèi)切蛋白酶以0.5mg酶蛋白/ml的濃度，其 他酸性內(nèi)切蛋白酶以0.05mg酶蛋白/ml的濃度測(cè)試。淀粉酶抑制劑最后加入，并以2mg/ml 的濃度存在。
[0081 ] 在t = 0時(shí)，將100微升反應(yīng)混合物轉(zhuǎn)移到400微升25%TCA。在37°C下孵育90分鐘 后，將另外100微升轉(zhuǎn)移到400微升新鮮TCA溶液。在4 °C下2小時(shí)后，在HOOOrpm下離心樣本 10分鐘。在離心后，加入65微升磷酸鹽緩沖液pH7、25微升十二烷基硫酸鋰(LiDS)和10微升 樣本還原劑。樣本在4 °C下保存過夜，然后按照Invitrogen方案（Invitrogen， WWW. Iifetechnologies · com)制備用于SDS-PAGE。
[0082] Aspergillus niger曲霉谷氨酉愛肽酉每活性(HPU)的確定
[0083] 將20.Og來自牛血的血紅蛋白（Sigma產(chǎn)品H2625)在室溫下攪拌10分鐘，懸浮于大 約700mL水中。在加入3.73g氯化鉀(KC1)后，用0.5mol/L鹽酸將pH調(diào)整為1.75。用水將血紅 蛋白懸浮液的體積調(diào)整至1L。再次檢查pH，并調(diào)整為pHl. 75。
[0084]酶溶液通過如下步驟制備:將如上文所公開產(chǎn)生的純化的曲霉谷氨酸肽酶溶解于 包含3.73g/l KCl的KC1/HC1緩沖液中，用2.0mol/L HCl調(diào)至pHl.75。為測(cè)試曲霉谷氨酸肽 酶活性，在40 °C下加熱5ml血紅蛋白溶液，隨后加入ImL活性在5和25個(gè)組氨酸蛋白酶單位 (HPU/mL)之間的酶溶液來啟動(dòng)反應(yīng)。在30分鐘后，加入5mL三氯乙酸溶液（140g/L)停止反 應(yīng)，以沉淀較大的肽片段。通過向5mL血紅蛋白溶液和5mL三氯乙酸溶液的混合物中加入 1.0 mL酶樣本來進(jìn)行空白測(cè)量。將試管在40°C下孵育30分鐘以完成沉淀。在離心后，在275nm 下測(cè)量包含小肽的澄清上清液的光密度。將結(jié)果與lyg/mL L-酪氨酸溶液進(jìn)行比較。
[0085] 一個(gè)HPU為每分鐘的水解血紅蛋白的量的酶的量，得到溶液在275nm下的光密度等 于在0. lmol/L的HCl溶液中含有每mL Iyg L-酪氨酸的溶液的光密度。測(cè)試條件為:ρΗ1.75， 溫度40°C，孵育期間的血紅蛋白濃度16.7g/L。
[0086] 活性(HPU/mL) = (0_-0Ete/S) X 11/30
[0087] 其中：
[0088] 0?本:樣本濾液（275nm)的光密度
[0089] 0??:空白樣本濾液(27 5nm)的光密度
[0090] S: 1 · lyg/mL L-酪氨酸標(biāo)準(zhǔn)溶液的OD(mLAig)
[0091] 30:孵育時(shí)間（分鐘）
[0092] 11:反應(yīng)混合物的總體積(mL)
[0093] LC-MS/MS 分析
[0094] 體外消化
[0095] 將樣本溶解于MiIliQ水中至lmg/ml。溶液在IOOmM MMCO3(pH7.8)中稀釋10倍。通 過加入DTT 5mM，在室溫下孵育30分鐘還原樣本，并且通過加入碘乙酰胺（IAA)5.5mM，在室 溫下黑暗中孵育30分鐘烷基化樣本。胰蛋白酶的消化在37°C下過夜進(jìn)行。
[0096] 膠內(nèi)消化
[0097] 使用ExQuest點(diǎn)切膠儀(Biorad ,Hercules，CA，美國(guó)）從凝膠切下凝膠帶，并轉(zhuǎn)移到 Io-蛋白質(zhì)結(jié)合MTP(Eppendorf ,Hamburg德國(guó)）。膠塊通過加入75μ1 50mM NH4HCO3至溶脹以 及加入75μ1乙腈收縮來洗滌，總共洗滌3次。用胰蛋白酶消化洗滌的膠塊，消化在37°C下孵 育過夜進(jìn)行。樣本超聲處理1分鐘，并將上清液收集到注射瓶中。
[0098] LC-MS/MS 分析
[0099] 樣本酸化至1 % 甲酸，并在Accela-LTQ-Velos(Thermo Scientific，San Diego， CA，美國(guó)）上分析。色譜分離用2·lX100mml·8微米粒度、80A孔徑、C-18EclipseXDB Zorbax柱(Agilent Santa Clara，CA，美國(guó)）進(jìn)行，使用(A)包含0· 1% 甲酸的LC-MS級(jí)水(B) 包含0· 1%甲酸溶液的LC-MS級(jí)乙腈(Biosolve BV，the Netherlands)作為移動(dòng)相進(jìn)行梯度 洗脫。梯度為在83分鐘內(nèi)從5 %至40 % B。流速保持0.4ml/min，使用25μ1的注射體積，柱溫度 設(shè)定為50ns數(shù)據(jù)采集使用前10數(shù)據(jù)依賴性采集進(jìn)行，質(zhì)量范圍400-2000m/z，使用動(dòng)態(tài) 排除，包括僅2和3的電荷狀態(tài)。進(jìn)行MS/MS實(shí)驗(yàn)，分離寬度設(shè)定為3.0，歸一化碰撞能設(shè)定為 35。使用Sorcerer 2 (S〇rcererTM-SEQUEST?)搜索引擎和Trans Proteome Pipeline (TPP)進(jìn)行數(shù)據(jù)庫(kù)搜索，使用胰蛋白酶作為優(yōu)選的酶。僅考慮置信度>90%的蛋白質(zhì)。搜索 Swissprot數(shù)據(jù)庫(kù)的數(shù)據(jù)。
[0100] 題
[0101] 在本實(shí)施例中，我們展示了（參見圖1)，在模擬胃條件下，在多個(gè)酸性內(nèi)切蛋白酶 中，僅Aspergillus niger曲霉谷氨酸肽酶能夠有效地分解包括各種小麥α淀粉酶抑制劑 (來自小麥種子的α淀粉酶抑制劑，1型，Sigma)的純化制劑。在實(shí)驗(yàn)中，在存在胃蛋白酶(對(duì) 照）的情況下比較以下酶的功效：
[0102] -胃蛋白酶(豬胃粘膜，Sigma)
[0103] -來自Aspergillus niger的腫氨酸特異性內(nèi)切蛋白酶(MaxiPro PSP，DSM Food Specialities，Delft，荷蘭）
[0104] -木瓜蛋白酶（Collupuline，DSM Food Specialities，Delft，荷蘭）
[0105] -Aspergillus niger曲霉谷氨酸肽酶也稱為曲霉胃蛋白酶II(MaxiPro HSP，DSM Food Specialities，Delft，荷蘭）
[0106] -曲霉胃蛋白酶I (參見材料和方法）
[0107] -Multifect PR 15L(來自Trichoderma reesei的曲霉胃蛋白酶I樣蛋白酶； http//biosciences·dupont·com)〇
[0108] 結(jié)果（參見圖1)顯示，純化的小麥麩質(zhì)α淀粉酶抑制劑制劑包括三個(gè)主要蛋白質(zhì) 帶，大小為大約12kDa(參見箭頭）。這些數(shù)據(jù)還顯示，在模擬胃條件下和在存在胃蛋白酶和 等量各種蛋白酶的情況下，AspergiIlus niger曲霉谷氨酸肽酶在α淀粉酶抑制劑的純化制 劑中存在的這三條主要的帶的分解中最有效。
[0109] 為確認(rèn)這些帶的每個(gè)中存在的不同蛋白質(zhì)的性質(zhì)，如上文材料和方法所述，切下 并提取樣本的膠帶，使用LC-MS/MS分析鑒定存在的蛋白質(zhì)。
[0110]在這種情況下，lOmg/ml Sigmaa淀粉酶抑制劑溶液用水稀釋10倍。然后將65微升 該溶液與25微升LiDS樣本緩沖液和10微升樣本還原劑混合，在70°C下加熱10分鐘，然后根 據(jù)Invitrogen方案通過SDS-PAGE分離蛋白質(zhì)。然后用50%甲醇/7%乙酸固定凝膠1小時(shí)，用 脫礦質(zhì)水漂洗兩次，并用Sypro Ruby染色過夜。獲得三條推定的α淀粉酶抑制劑帶的凝膠樣 本，如圖2所示。根據(jù)從提取的蛋白質(zhì)獲得的LC-MS/MS數(shù)據(jù)，帶Cl和Bl中存在的豐度最高的 蛋白質(zhì)是小麥α淀粉酶抑制劑，SwissProt登錄號(hào)為P17314(CM 3)和P16159(CM 16)，帶El和 01中為小麥〇淀粉酶抑制劑?01085(0.19)、？16851(012)和？16159(0116)，帶61和？1中為 P01083(CM 3)〇
[0111]該數(shù)據(jù)顯示，出人意料的是，在胃條件下，Aspergillus niger曲霉谷氨酸肽酶在 小麥來源α淀粉酶抑制劑，最顯著的是，小麥α淀粉酶抑制劑:CM 2、CM 3、CM 16和0.19的分 解中是最有效的。
[0112]實(shí)施例2:動(dòng)物飼料添加劑
[0113] 動(dòng)物飼料添加劑通過向以下預(yù)混物(每千克預(yù)混物)加入100000HPU Aspergillus niger曲霉谷氨酸肽酶來制備： 1100000IE 維生素 A 50004 mg 氯化膽堿 300000 ΓΕ 維中. ^D3 6000 mg Fe 4000IE 維中.? E 3000 mg Cu 250 mg 維十素 BI 5400 mg Zn 800 mg 維生素 B2 8000 mg Mn 1200 rng D-泛酸鈣 124 mg I 500 mg 維十.素 B6 60 rng Co
[0114] _ 2.5 mg 維生素 B12 29.7 mg Se 5000 rag 煙酸 9000 mg 拉沙洛西鈉 (Avatec) 10000 mg 維生素 C 17.3% Ca 300 rng 維生素 K3 0.8% Mg 15 mg 生物素 11.7% Na 150 mg 葉酸
[0115] 實(shí)施例3:動(dòng)物飼料
[0116] 具有以下組合物（％，w/w)的肉雞生長(zhǎng)期(grower)膳食通過將成分混合來制備。小 麥、黑麥和SBM 48購(gòu)自Moulin Moderne Hirsinque，Hirsingue，法國(guó)。在混合后，飼料在所 需溫度例如約70°C下制粒(3 X 25mm)。 小 ? 46.00 黑麥 15.00 豆粕（SBM 4:8) 30.73 大豆油 4,90 DL·-甲硫氨酸 （X04
[0117] DCP (磷酸二鈣） 1,65 心灰心 0.43 鹽 0.15 Ti02 0.10 動(dòng)物飼料添加劑（如上）1.00
[0118] 所得的動(dòng)物飼料包含1000HPU Aspergillus niger曲霉谷氨酸肽酶/kg〇
[0119] 實(shí)施例4:仔豬飼料
[0120] 包含Aspergillus niger曲霉谷氨酸肽酶的仔豬飼料可通過在室溫下使用常規(guī)混 合設(shè)備將以下成分混合在一起來制備。
[0121] 成分 .量（重量.％) 小麥 32.6 玉米 18.7 稻米 5.0 麥麩 9.0 豆粕 23.0 大豆油 2.0 小麥淀粉 4.5 礦物質(zhì)* 2.9 合成氨基酸預(yù)混物** 0.8
[0122] 維生素和痕量元素預(yù)混物*~ 1.0 m'ger曲霉谷氨酸肽酶預(yù)混物（10%小麥淀粉中） 0.5
[0123] 原則上，AspergiIIus niger曲霉谷氨酸肽酶預(yù)混物可包含1-20%的AspergiIIus niger曲霉谷氨酸肽酶。
[0124] *海鹽，磷酸二鈣和碳酸鈣；
[0125] **賴氨酸、甲硫氨酸和蘇氨酸；
[0126] ***維生素 A、E、D3、K3、BI、B2、B6、BI 2、C，生物素，葉酸，煙酸，泛酸，氯化膽堿，硫酸 銅，硫酸鐵，氧化錳，氧化鋅，碳酸鈷，碘化鈣和亞硒酸鈉。
[0127] 實(shí)施例5:生長(zhǎng)期的豬飼料
[0128] 包含AspergiIlus niger谷氨酸肽酶的生長(zhǎng)期的豬飼料可通過在室溫下使用常規(guī) 混合設(shè)備將以下成分混合在一起來制備。
[0129] 成分 量（重量％) 丑粕 18.0 玉米 52,3 大変 13.0 燕麥粕 6.0 麥麩 5.2 大豆油 2.0 礦物質(zhì)* 1.5 合成氨基酸預(yù)混物0.5 維生素和痕量元素預(yù)混物μ* 1.0 《/ger曲霉谷氨酸肽酶預(yù)混物（10%小麥淀粉中） 0.5
[0130] 實(shí)施例6:肉雞幼雛期（starter)飼料
[0131 ]包含Aspergillus niger曲霉谷氨酸肽酶的肉雞飼料（"幼雛期"）可通過在室溫下 使用常規(guī)混合設(shè)備將以下成分混合在一起來制備。
[0132] 成分 量（重量％) 豆粕 34.50 丨(米 20.00 小麥 37,80 大豆油 3.13 礦物質(zhì)* 2,90 合成氨基酸預(yù)混物** 0.17 維生素和痕量元素預(yù)混物*** 丨.00 ?/ger曲霉谷氣酸肽酶預(yù)混物（10%小麥淀粉中） 0.50
[0133] 實(shí)施例7:肉雞生長(zhǎng)期飼料
[0134] 包含Aspergillus niger曲霉谷氨酸肽酶的肉雞飼料（"生長(zhǎng)期"）可通過在室溫下 使用常規(guī)混合設(shè)備將以下成分混合在一起來制備。
[0135] 成分 量（重量％): 豆粕 31.2 丨;:米 20.0 小麥 41.3 大豆油 3.4 礦物質(zhì)* 2.5 合成氨基酸預(yù)混物** 0.1 維生素和痕量元素預(yù)混物1.0 曲霉谷氨酸肽酶預(yù)混物（10%小麥淀粉中） 0.5
[0136] 實(shí)施例8:AspergiIlus niger曲霉谷氨酸肽酶在模擬胃條件下有效地裂解大豆來 源胰蛋白酶-胰凝乳蛋白酶抑制劑，而其他酸性內(nèi)切蛋白酶則無此效果。
[0137] 材料和方法
[0138] 酶法分析
[0139] 孵育在50mmol/l檸檬酸鈉 pH4.0中37°C下進(jìn)行60分鐘。在所有相關(guān)孵育中，胃蛋白 酶以0.2mg/ml的酶蛋白濃度存在。所有肽酶在0.5mg酶蛋白/ml的濃度中測(cè)試。胰蛋白酶-胰 凝乳蛋白酶抑制劑(購(gòu)自Sigma T9777)最后加入，并以2mg/ml的濃度存在。
[0140] 在t = 0時(shí)，將100微升反應(yīng)混合物轉(zhuǎn)移到400微升25%TCA。在37°C下孵育60分鐘 后，將另外100微升轉(zhuǎn)移到400微升新鮮TCA溶液。在4 °C下18小時(shí)后，在HOOOrpm下離心樣本 30分鐘。在離心后，加入65微升磷酸鹽緩沖液pH7,25微升十二烷基硫酸鋰(LiDS)和10微升 樣本還原劑，并按照Invitrogen方案（Invitrogen，WWW. Iifetechnologies · com)準(zhǔn)備SDS-PAGE0
[0141] 結(jié)果
[0142] 在本實(shí)施例中，我們展示了，在模擬胃條件下，在多個(gè)酸性內(nèi)切蛋白酶中，僅 Aspergillus niger曲霉谷氨酸肽酶能夠有效地分解包括來自大豆的胰蛋白酶-胰凝乳蛋 白酶(Sigma)的純化制劑。在實(shí)驗(yàn)中，在存在胃蛋白酶(對(duì)照）的情況下比較以下酶的功效：
[0143] -胃蛋白酶(豬胃粘膜，Sigma)
[0144] -來自Aspergillus niger的腫氨酸特異性內(nèi)切蛋白酶(MaxiPro PSP，DSM Food Specialities，Delft，荷蘭）
[0145] -Aspergillus niger曲霉谷氨酸肽酶也稱為曲霉胃蛋白酶II(MaxiPro HSP，DSM Food Specialities，Delft，荷蘭）
[0146] -曲霉胃蛋白酶I (參見材料和方法）
[0147] -Multifect PR 15L(來自Trichoderma reesei的曲霉胃蛋白酶I樣蛋白酶； http//biosciences·dupont·com)〇
[0148] 結(jié)果(參見圖3)顯示，純化的胰蛋白酶-胰凝乳蛋白酶抑制劑制劑包括大小為大 約IOkDa的蛋白質(zhì)帶。這些數(shù)據(jù)還顯示，在模擬胃條件下和在存在胃蛋白酶和等量各種蛋白 酶的情況下，AspergiIIus niger曲霉谷氨酸肽酶在胰蛋白酶-胰凝乳蛋白酶抑制劑的純化 制劑中存在的上部帶的分解中最有效。
[0149]實(shí)施例9:AspergiIlus niger曲霉谷氨酸肽酶以劑量依賴方式裂解α淀粉酶/胰蛋 白酶抑制劑。
[0150]在本實(shí)施例中，我們確定了在模擬胃條件下水解1克小麥麩質(zhì)中存在的α淀粉酶/ 蛋白酶抑制劑所需的AspergiIIus niger曲霉谷氨酸肽酶酶蛋白的量。為此，將來自小麥的 麩質(zhì)（3丨811^)溶解于5〇1111]1〇1/1朽1檬酸口!14.0中，濃度為9.3511^/1111。向該充分?jǐn)嚢璧幕旌衔镏?加入胃蛋白酶蛋白，達(dá)到〇. 2mg/ml的終濃度，然后取六個(gè)Iml樣本。向這六個(gè)樣本中加入量 逐漸增加的純AspergiIIus niger曲霉谷氨酸肽酶。樣本1:不加入AGP，樣本2:0.09mg，樣本 3:0.19mg，樣本4:0.28mg，樣本5:0.37mg，以及最后一個(gè)樣本:0.47mg。然后使不同的樣本在 37 °C下孵育60分鐘，在t = 0分鐘和t = 60分鐘在每個(gè)樣本中取等分試樣用于SDS-PAGE分析。 SDS-PAGE分析根據(jù)Invitrogen方案進(jìn)行。
[0151] 結(jié)果（參見圖4)顯示，通過加入0 · 28mg純Aspergillus niger曲霉谷氨酸肽酶， 9.35mg小麥麩質(zhì)中存在的α淀粉酶/蛋白酶抑制劑可在一小時(shí)期間內(nèi)被水解。這意味著，在 此類模擬胃條件下，30mg純Aspergi I Ius niger曲霉谷氨酸肽酶(對(duì)應(yīng)于15000HPU)可處理1 克小麥麩質(zhì)。因此，在通過口服AspergiIlus niger曲霉谷氨酸肽酶制劑的α淀粉酶/蛋白酶 抑制劑的部分片段化后，新生成的抑制肽在通過胃期間通過胃蛋白酶以及在進(jìn)入十二指腸 后通過胰腺蛋白酶諸如胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶被進(jìn)一步分解為非免疫原性寡肽。
【主權(quán)項(xiàng)】
1 .Aspergillus niger曲霉谷氨酸肽酶用于包含谷類、豆類、含油種子和/或塊莖的飼 料組合物來減少飼料轉(zhuǎn)化率、改善每日體重增加、改善飼料消化率和/或減少氮排泄的用 途。2. 根據(jù)權(quán)利要求1的用途，其中所述動(dòng)物是單胃動(dòng)物。3. 根據(jù)權(quán)利要求1或2中任一項(xiàng)的用途，其中所述飼料包含1至10000HPU單位的 Aspergillus niger曲霉谷氨酸肽酶/Kg飼料。4. 根據(jù)權(quán)利要求1至3中任一項(xiàng)的用途，其中所述飼料組合物還包含另外的蛋白酶和/ 或植酸酶。5. -種包含Aspergillus niger曲霉谷氨酸肽酶的飼料組合物或飼料添加劑。6. 根據(jù)權(quán)利要求5的飼料組合物，包含1至10000HPU單位的Aspergillus niger曲霉谷 氨酸肽酶/Kg飼料。7. 根據(jù)權(quán)利要求5或6的飼料組合物，還包含 (a) 至少一種脂溶性維生素； (b) 至少一種水溶性維生素;和/或 (c) 至少一種痕量礦物質(zhì)。8. 根據(jù)權(quán)利要求5至7中任一項(xiàng)的飼料組合物，具有50-800g/kg的粗蛋白含量。9. 根據(jù)權(quán)利要求5至8中任一項(xiàng)的飼料組合物，還包含選自小麥、大麥或玉米的谷類，選 自大豆的豆類，含油種子和/或塊莖。10. 根據(jù)權(quán)利要求5至9中任一項(xiàng)的飼料組合物，用于治療動(dòng)物來減少腸道炎癥。11. 改善動(dòng)物生產(chǎn)性能的方法，包括改善飼料轉(zhuǎn)化率，和/或改善每日體重增加，和/或 減少腸道炎癥，和/或減少氮排泄，所述動(dòng)物用谷類、豆類、含油種子和/或塊莖飼養(yǎng)，所述方 法包括經(jīng)口施用足夠量的Aspergillus niger曲霉谷氨酸肽酶。12. 根據(jù)權(quán)利要求11的方法，其中所述谷類選自小麥、大麥或玉米，并且豆類為大豆。13. 根據(jù)權(quán)利要求11的方法，其中所述動(dòng)物是單胃動(dòng)物。 14. Aspergillus niger曲霉谷氨酸肽酶用于預(yù)處理包含谷類、豆類、含油種子和/或塊 莖的動(dòng)物飼料或動(dòng)物飼料組分的用途。15. 根據(jù)權(quán)利要求14的用途，其中所述谷類選自小麥、大麥或玉米，并且豆類為大豆。
【文檔編號(hào)】C12N9/62GK105979790SQ201480067433
【公開日】2016年9月28日
【申請(qǐng)日】2014年12月11日
【發(fā)明人】馬艾克·約翰娜·布魯因斯, 魯波·伊登斯, 南·萊恩克
【申請(qǐng)人】帝斯曼知識(shí)產(chǎn)權(quán)資產(chǎn)管理有限公司, 諾維信專利公司