保護(hù)親脂性營養(yǎng)物免于瘤胃降解的方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及的領(lǐng)域是增加親脂性營養(yǎng)物(如多不飽和脂肪酸)的十二指腸流動(dòng)和吸收，以增強(qiáng)其在動(dòng)物產(chǎn)品如肉和奶中的含量。這種增加被推薦用來改善消耗動(dòng)物產(chǎn)品的人類的和動(dòng)物本身的健康。更具體地，本發(fā)明涉及制備蛋白質(zhì)?苯酚基質(zhì)包封的親脂性營養(yǎng)物液滴的水包油乳液的方法。所述蛋白質(zhì)?苯酚基質(zhì)的形成需要從特定植物中提取的多酚氧化酶的存在以及二酚的加入這兩個(gè)條件。當(dāng)作為飼料供給時(shí)，后面的乳液可以保護(hù)親脂性營養(yǎng)物免受存在于動(dòng)物瘤胃中微生物的降解，因此使得這些未降解營養(yǎng)物可以進(jìn)一步在動(dòng)物的體內(nèi)進(jìn)行轉(zhuǎn)移。此外，后面的乳液也可以在存儲(chǔ)或加工過程中用于針對變質(zhì)(例如由于氧化)保護(hù)親脂性營養(yǎng)物。
【專利說明】保護(hù)親脂性營養(yǎng)物免于瘤胃降解的方法
[0001] 發(fā)明的技術(shù)領(lǐng)域
[0002] 本發(fā)明設(shè)及的領(lǐng)域是增加親脂性營養(yǎng)物(如多不飽和脂肪酸）的十二指腸流動(dòng)和 吸收，W增強(qiáng)其在動(dòng)物產(chǎn)品如肉和奶中的含量。運(yùn)種增加被推薦用來改善消耗動(dòng)物產(chǎn)品的 人類的和動(dòng)物本身的健康。更具體地，本發(fā)明設(shè)及制備蛋白質(zhì)-苯酪基質(zhì)包封的親脂性營養(yǎng) 物液滴的水包油乳液的方法。所述蛋白質(zhì)-苯酪基質(zhì)的形成需要從特定植物中提取的多酪 氧化酶的存在W及二酪的加入運(yùn)兩個(gè)條件。當(dāng)作為飼料供給時(shí)，后面的乳液可W保護(hù)親脂 性營養(yǎng)物免受存在于動(dòng)物瘤胃中微生物的降解，因此使得運(yùn)些未降解營養(yǎng)物可W進(jìn)一步在 動(dòng)物的體內(nèi)進(jìn)行轉(zhuǎn)移。此外，后面的乳液也可W在存儲(chǔ)或加工過程中用于針對變質(zhì)(例如由 于氧化)保護(hù)親脂性營養(yǎng)物。
【背景技術(shù)】
[0003] 瘤胃微生物為反當(dāng)動(dòng)物提供了利用結(jié)構(gòu)性碳水化合物和非蛋白質(zhì)氮的獨(dú)特能力。 但是，微生物與反當(dāng)動(dòng)物的運(yùn)種共生也導(dǎo)致親脂性營養(yǎng)物(諸如某些維生素和多不飽和脂 肪酸(PUFA))在瘤胃中的降解，使得運(yùn)些不再可用于吸收。運(yùn)種對高品質(zhì)營養(yǎng)物的低效率利 用會(huì)對反當(dāng)動(dòng)物的健康產(chǎn)生不良影響，并且會(huì)惡化動(dòng)物產(chǎn)品質(zhì)量。因此，已設(shè)想了瘤胃保護(hù) (也稱為瘤胃通過)營養(yǎng)物的施用。
[0004] 因?yàn)?n-3)PUFA對于人類和動(dòng)物的健康益處，幾種技術(shù)試圖保護(hù)它們在瘤胃中不 被生物氨化(飽和化）。保護(hù)技術(shù)依賴于如將油滴包埋入甲醒交聯(lián)蛋白質(zhì)基質(zhì)W，使用復(fù)合 凝膠(2)，形成化皂(2)或酷胺類(2)，非酶褐變(2)或者在Ξ酷基甘油醋中包封化S 6,013,286)。 然而，運(yùn)些技術(shù)中的每一種顯示出嚴(yán)重的缺點(diǎn)，設(shè)及保護(hù)功效、有毒物質(zhì)的使用和/或加工 的限制。事實(shí)上，針對瘤胃生物氨化保護(hù)油類的最有效的技術(shù)之一是將油滴包埋入蛋白質(zhì) 基質(zhì)，隨后甲醒處理W。運(yùn)里，在甲醒和蛋白質(zhì)基質(zhì)中的氨基酸之間形成的絡(luò)合物，產(chǎn)生保 護(hù)殼化S 3,925,560)。已經(jīng)表明，使用經(jīng)甲醒處理的富含運(yùn)些脂肪酸的乳化油可^使乳脂 中親脂性營養(yǎng)物水平提高一些。然而，甲醒是有毒的產(chǎn)品，在歐盟使用它是受嚴(yán)格規(guī)定 的（2011/391/抓）。
[0005] 如上所述，存在對通過PUFA的替代技術(shù)，如巧皂、酷胺制劑或者"復(fù)合凝膠"（US 2004/0058003)。然而，運(yùn)些技術(shù)都沒有效率。例如，由1)脂質(zhì)液滴的分散相和2)凝膠的連續(xù) (水)相中的交聯(lián)蛋白質(zhì)組成的復(fù)合凝膠的制備需要在80至125°C下加熱約20至80分鐘的步 驟。該加熱步驟可W在復(fù)合凝膠中產(chǎn)生化合物的氧化反應(yīng)。已知一些飼料補(bǔ)充物的氧化產(chǎn) 物是有毒的。因此，運(yùn)是在包封營養(yǎng)物之前的生產(chǎn)過程中使用熱的主要缺點(diǎn)。今天最常用的 另一種技術(shù)是將營養(yǎng)物包封在脂質(zhì)基質(zhì)中（US 6,013,286和Robinson等人W)。然而，運(yùn)種 脂質(zhì)基質(zhì)可能顯示出對如造粒、膨脹和擠壓的技術(shù)處理有限的耐性(6)。
[0006] 對紅Ξ葉草，已描述了一種基于多酪氧化酶(PP0)的自然機(jī)制，其能夠保護(hù)存在于 葉綠體中的膜脂肪酸(Van Ranst等人(7))。高PFO活性被認(rèn)為在運(yùn)方面是必要的(化η Ranst 等W)"PP〇是苯酪和二酪氧化酶，導(dǎo)致釀的形成。后來的作者總結(jié)，由pro介導(dǎo)的二酪氧化引 起的蛋白質(zhì)-苯酪絡(luò)合物的中的包封可能有效地針對前瘤胃和瘤胃降解保護(hù)植物膜中存在 的脂質(zhì)。Parveen等人w公開了許多從幾種飼草、豆類、谷類或蕓苔屬物種中鑒別的苯酪，它 們可作為PPO活性的結(jié)果被氧化。但是，在對特定的（二)苯酪(或基底）的PPO活性程度和針 對降解的親脂性營養(yǎng)物保護(hù)程度之間是否存在任何相關(guān)性是未知的！
[0007] 附圖簡述
[000引圖1:在水包亞麻巧油乳液中C18:化-3的瘤胃生物氨化，使用來自不同植物源的富 含PP0的蛋白質(zhì)提取物和不同濃度的4-甲基兒茶酪(0、12.5、25或501111)作為二酪劑在體外 溫育24h之后
[0009]圖2:C18:化-3的瘤胃生物氨化，使用來自不同植物源的富含PP0的蛋白質(zhì)提取物 和40mmol的4-甲基兒茶酪作為二酪劑在體外溫育24h之后
[0010]圖3:在體外溫育24h后C18:：3n-3的生物氨化是受油和二酪濃度影響的。實(shí)施例2的 乳液(通過在25M化下5次通過微流化床器制備的)使用紅Ξ葉草蛋白質(zhì)提取物作為乳化劑， 并且包含4個(gè)不同的油濃度(每升蛋白質(zhì)提取物中10、20、30或40g油），不同水平的額外酪蛋 白（每升蛋白質(zhì)提取物中〇、1或2g額外酪蛋白；平均值表示)和不同的二酪濃度(0、12.5、25 或50mM 4-甲基兒茶酪）。誤差條代表平均值的標(biāo)準(zhǔn)誤差。a、b、\d表示p《〇.〇5(n = 3)時(shí)油濃 度和4-甲基兒茶酪濃度之間的生物氨化差異
[OOW 圖4:根據(jù)對數(shù)曲線，保護(hù)效率隨著4-甲基兒茶酪的量/平方米在水包亞麻巧油乳 液內(nèi)液滴的界面表面積(mmol4-甲基兒茶酪/V)增大而增加，一旦每平方米存在于乳液中 的表面積上在系統(tǒng)中可用的4-MC超過0.25mmol就達(dá)到平臺。如在圖3中所述制備的乳液。 [0012] 圖5:將4-甲基兒茶酪加入紅Ξ葉草水包亞麻巧油乳液(通過在25MI^下5次通過微 流化床器制備的）和用4-己基間苯二酪使PPO失活之間的時(shí)間的增長導(dǎo)致C18:化-6和C18: 化-3生物氨化的降低，在體外溫育2地后
[001引圖6:水包魚油乳液中的C20: 5n-3和C22: 6n-3的瘤胃生物氨化，使用來自紅立葉草 的富含PPO的蛋白質(zhì)提取物和4-甲基兒茶酪(0或20mM)作為二酪劑在體外溫育24h后(灰條 代表沒有加入4-甲基兒茶酪的，黑條代表具有終濃度為20mM的4-甲基兒茶酪乳液，誤差條 代表平均值的標(biāo)準(zhǔn)誤差(n = 3))
[0014]圖7:在2% (w/v)新鮮或洗涂過的水包亞麻巧油乳液中C18:化-3的瘤胃生物氨化， 使用萊自紅Ξ葉草的富含PPO的蛋白質(zhì)提取物在不同濃度的4-甲基兒茶酪(0、12.5、25或 50mM)作為二酪劑，在體外溫育24h后
[001引圖8:連續(xù)五天(第1天至第5天）補(bǔ)充后，對于Lu化ell ComM和PPO乳液(含有前面 提到的脂肪酸并且使用馬鈴馨塊莖皮的蛋白質(zhì)提取物和20mM 4-甲基兒茶酪將其保護(hù))都 觀察到了牛奶中反-10、順-12共輛亞油酸濃度(g/lOOg檢測的脂肪酸）的增加，隨后在洗脫 期(第6天到第10天)降低濃度。誤差條代表標(biāo)準(zhǔn)偏差(n = 4奶牛）
[0016] 圖9:在連續(xù)五天向四頭奶牛補(bǔ)充了 7克反-10、順-12共輛亞油酸后，對于Lu化ell Combi和PPO乳液(含有前面提到的脂肪酸并且使用馬鈴馨塊莖皮的蛋白質(zhì)提取物和20mM 4-甲基兒茶酪將其保護(hù))都觀察到了膳食反-10、順-12共輛亞油酸向牛奶的轉(zhuǎn)移效率的增 加。誤差條代表標(biāo)準(zhǔn)偏差(n = 4)。在處理天數(shù)下粗斜體所示的數(shù)值代表相應(yīng)處理天數(shù)補(bǔ)充 的PK)乳液批次的體外瘤胃保護(hù)效率。
[0017] 圖10:在連續(xù)五天(第1天至第5天)補(bǔ)充后，對于Lu化ell Combi和PK)乳液(含有前 面提到的脂肪酸并且使用馬鈴馨塊莖皮的蛋白質(zhì)提取物和20mM 4-甲基兒茶酪將其保護(hù)） 都觀察到了乳脂百分率的降低，隨后在洗脫期(第6天到第10天)增加濃度直至常規(guī)水平。誤 差條代表標(biāo)準(zhǔn)偏差(n = 4奶牛）
[001引發(fā)明描述
[0019] 本發(fā)明設(shè)及W下令人驚訝的發(fā)現(xiàn)：1)可W經(jīng)由在蛋白質(zhì)溶液內(nèi)乳化該營養(yǎng)物來針 對降解保護(hù)親脂性營養(yǎng)物，其中一部分所述蛋白質(zhì)具有PP0活性，W及2)在來自植物的蛋白 質(zhì)提取物中測得的PP0活性與降解程度之間沒有相關(guān)性。因此，除了紅Ξ葉草提取物，只有 來自植物或植物部分的特定選擇的提取物可W用于針對降解保護(hù)親脂性營養(yǎng)物。例如，本 發(fā)明證明，具有與紅Ξ葉草的PP0活性可比的PP0活性的某些植物物種（如茄（Solanum melongena L.)或茄子，或者，小果野蕉（Musa acuminate Colla)AAA組栽培品種Grand 化in(AAA group cv Grand化in)或香蕉，或者，西洋梨(Pyrus communis)或梨）沒有或具 有非常有限的針對降解的保護(hù)效果，而其他具有與紅Ξ葉草的PK)活性可比的（如(Solanum tuberosum L.)馬鈴馨或±豆）或明顯更低的（如甘藍(lán)(Brassica oleracea L.)品種諸如花 挪菜或西蘭花)PP〇活性的植物物種確實(shí)具有運(yùn)樣的效果。盡管如此，當(dāng)在二酪(如4-甲基兒 茶酪(methylcathechol))基質(zhì)的存在下在沒有PP0活性的蛋白質(zhì)（如酪蛋白）溶液中乳化營 養(yǎng)物不針對降解保護(hù)時(shí)，一些PK)活性是必需的。
[0020] 因此本發(fā)明第一種情況設(shè)及基于從植物/植物物種的特定選擇中提取的含多酪氧 化酶的蛋白質(zhì)的使用來針對降解保護(hù)親脂性營養(yǎng)物的方法。術(shù)語"降解"在第一種情況下是 指由在瘤胃中的強(qiáng)微生物代謝引起的瘤胃降解，諸如水解(包括脂解）、生物氨化和發(fā)酵，但 是也指在親脂性營養(yǎng)物的轉(zhuǎn)換過程期間的降解(諸如但不限于脂解和氧化）。
[0021] 更具體地，本發(fā)明設(shè)及用于針對降解保護(hù)親脂性營養(yǎng)物的方法，其包括：
[0022] -制備乳化蛋白質(zhì)的溶液，其中所述蛋白質(zhì)的一部分具有多酪氧化酶活性，
[0023] -將所述親脂性營養(yǎng)物加入所述乳化蛋白質(zhì)的溶液，
[0024] -將所述親脂性營養(yǎng)物在所述蛋白質(zhì)溶液中乳化，W獲得穩(wěn)定的水包油乳液，W及
[0025] -在分子氧的存在下將一定量的二酪加入所述乳液，
[0026] 其中所述乳化蛋白質(zhì)提取自選自W下物種清單的植物或其一部分：馬鈴馨 (Solanum tuberosum L.)、番茄（Solanum lycopersicum L.)、洋劑（Cynara scolymus L.)、渡菜（Spinacia oleracea L)和甘藍(lán)（Brassica oleracea L.)物種。
[0027] 后一種方法的備選的實(shí)施方案中，也可W在將所述親脂性營養(yǎng)物乳化在所述蛋白 質(zhì)溶液中之前將二酪加入到所述乳化蛋白質(zhì)的溶液。
[0028] 術(shù)語"親脂性營養(yǎng)物"是指任何必須從環(huán)境中攝入的在生物體的新陳代謝中使用 的親脂性化學(xué)物質(zhì)。術(shù)語"親脂性"是指所述營養(yǎng)物溶解在甘油醋(如脂肪和油)和非極性溶 劑如己燒或甲苯中的能力。運(yùn)些非極性溶劑本身是親脂性的。因此親脂性營養(yǎng)物溶解在其 他親脂性物質(zhì)或化學(xué)物質(zhì)中，而親水性營養(yǎng)物傾向于溶解在水和其他親水性物質(zhì)或化學(xué)物 質(zhì)中。術(shù)語親脂性營養(yǎng)物是指源自植物或動(dòng)物的或從化學(xué)過程中獲得的任何油或脂肪。更 具體地，術(shù)語親脂性營養(yǎng)物是指一種油，諸如但不僅限于亞麻子油、魚油或者包含通常含有 80%的共輛亞油酸的和衍生自紅花油的甘油醋的油（例如來自BASF的TOMLIN? TG80)，或 者是指脂溶性維生素，諸如但不僅限于維生素 A、D或E。術(shù)語"親脂性營養(yǎng)物"可W還例如設(shè) 及任何ω -3和/或ω -6和/或ω -9和/或共輛多不飽和(甘油結(jié)合的）脂肪酸，W及諸如百里 酪的植物二次代謝物等。
[0029] 術(shù)語"制備乳化蛋白質(zhì)的溶液"基本上設(shè)及任何在本領(lǐng)域中公知的方法，首先從特 定植物中提取蛋白質(zhì)，并且其次將所述蛋白質(zhì)溶解在合適的溶劑(如憐酸鹽緩沖液）中，W 得到只有一相組成的均勻混合物。"制備乳化蛋白質(zhì)的溶液"的非限制性實(shí)施例可W依靠， 如Van Ranst等人描述的用于蛋白質(zhì)提取W評估PP0活性的方法W，并且包括:收獲適當(dāng)量 的特定植物材料，將所述植物材料與緩沖液、抗壞血酸(抗壞血酸抑制多酪氧化酶活性）W 及例如聚乙締化咯燒酬(pvp)的能夠捕捉酪類的化合物通過共混機(jī)混合W得到混合物，過 濾并離屯、后面的混合物W獲得上清液，添加丙酬至所述上清液并保持所獲得溶液在約-18 °C的溫度下至少35分鐘，離屯、所述溶液W獲得粒料，并且重新溶解所述粒料在合適的緩沖 液中。也可W使用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的制備乳化蛋白質(zhì)的溶液的其他方法。
[0030] 術(shù)語"蛋白質(zhì)，其中所述蛋白質(zhì)的一部分具有多酪氧化酶的活性"設(shè)及從如上所述 的特定植物提取的蛋白質(zhì)，其中多酪氧化酶的活性存在是由于多酪氧化酶(PP0)的存在。 PP0是包括存在于植物、動(dòng)物和真菌中的酪氨酸酶和兒茶酪氧化酶的廣泛分布的一組酶。 PP0具有雙核銅中屯、，并催化分子氧向苯酪中的已有徑基的鄰位插入W得到鄰二酪W及其 進(jìn)一步氧化成釀。所得的釀將容易與親核試劑(諸如某些氨基酸和酪類等結(jié)構(gòu)）反應(yīng)?？蒞 通過分光光度法在來自植物的蛋白質(zhì)提取物中測定植物材料中的PP0活性。因此蛋白質(zhì)提 取物可W如上所述獲得并且可W隨后是使用例如脫鹽柱或如上所述蛋白質(zhì)沉淀的蛋白質(zhì) 純化步驟。然后可W用分光光度計(jì)使用諸如4-甲基兒茶酪的基質(zhì)在緩沖液中測定活性。每 單位時(shí)間吸光度的增加被測量用于在蛋白質(zhì)提取物中的多酪氧化酶活性，并被報(bào)道為酶活 性的光密度或單位的變化(也參見Van Ranst等人W和Van Ranst等人W)。測量PP0活性的 詳細(xì)非限制性方法將在實(shí)施例中進(jìn)一步說明。還可W使用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的測量PP0 活性的其他方法。
[0031] 術(shù)語"將所述親脂性營養(yǎng)物加入至所述乳化蛋白質(zhì)的溶液并且將所述親脂性營養(yǎng) 物在所述蛋白質(zhì)溶液中乳化，W獲得穩(wěn)定的水包油乳液"基本設(shè)及在現(xiàn)有技術(shù)中已知的任 何獲得穩(wěn)定的水包油乳液的方法。例如，可W將適當(dāng)量例如20克親脂性營養(yǎng)物加入至每升 上述植物提取物中，并且可W使用諸如高速UUraturra/的均化器均化，如在實(shí)施例部分 中所描述的?？蒞隨后使運(yùn)樣得到的乳液通過微流化床(約5次）W生成具有小液滴尺寸的 穩(wěn)定乳液。均勻化的乳液的處理可W在約l.SMPaW下的壓縮空氣壓力W及在如實(shí)施例部分 描述的冷卻條件下進(jìn)行。也可W使用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的其他乳化方法，W及諸如在將 所述親脂性營養(yǎng)物在所述蛋白質(zhì)溶液中乳化之前將所述二酪加入至乳化蛋白質(zhì)的溶液。
[0032] 在所述水包油乳液中的液滴尺寸在某些情況下小于或等于化m(即2、1、0.5、 0.1...或更少皿)。然而，也可W得到更大的液滴尺寸(例如約10皿），只要該乳液是穩(wěn)定的！ 所述穩(wěn)定乳液的粒度分布可W使用配備有300RF透鏡的Masters izer (Malvern Instruments)或者使用任何其他方法或裝置進(jìn)行檢查。可W將樣品加入至分散單元，直至 達(dá)到10至15%的遮蔽水平并且可W使用多分散模型分析數(shù)據(jù)。液滴尺寸用W皿為單位的表 面或體積加權(quán)平均直徑來表征。
[0033] 術(shù)語"在分子氧的存在下將一定量的二酪加入所述乳液"是指加入任何(例如蒸饋 水中的）二酪溶液，其在氧的存在下加入至所述乳液，從而經(jīng)由在室溫下振搖乳液混合物約 24小時(shí)，引起蛋白質(zhì)-苯酪絡(luò)合和/或W達(dá)到約9/1的乳液/二酪溶液的濃度。乳液可W具有 約20mM二酪的最終濃度。后面的二酪可W是合成二酪如4-甲基兒茶酪、咖啡酸、綠原酸或任 何其他二酪。
[0034] 如前面提到的，本發(fā)明設(shè)及W下令人驚訝的發(fā)現(xiàn):在來自植物的蛋白質(zhì)提取物中 測定的PP0活性和瘤胃保護(hù)程度之間不存在相關(guān)性。因此，除了由Van Ranst等人建議W的 紅Ξ葉草提取物，只有來自植物或植物部分的特定選擇的提取可W用于針對間接保護(hù)親脂 性營養(yǎng)物。植物或其部位的特定選擇諸如但不限于根、塊莖、葉、莖、花、皮、果實(shí)、果核、豆 芙、組織、果渣...，具體設(shè)及W下物種：馬鈴馨（Solanum tuberosum 1^.)(±豆），番茄 (Solanum lycopersicum L.)(西紅柿），洋劑（Cynara scolymus L.)(朝鮮劑），渡菜 (Spinacia oleracea L)(渡菜）和蕓苔屬(Brassica)物種（十字花科蔬菜，白菜或芥菜)諸 如甘藍(lán)(Brassica oleracea L.K花挪菜，西蘭花，球芽甘藍(lán)，白菜...）。術(shù)語"物種"包含比 種更低的任何分類級別，諸如所述物種的任一種的如亞種、品種、栽培品種等。
[0035] 因此，本發(fā)明進(jìn)一步設(shè)及上述方法，其中所述植物或其部分是馬鈴馨塊莖的皮，番 茄植物的莖和/或葉，花挪菜的莖、葉和小花W及渡菜的葉。
[0036] 本發(fā)明還設(shè)及上述方法，其中所述親脂性營養(yǎng)物是油或脂溶性維生素。
[0037] 更具體地，本發(fā)明設(shè)及上述方法，其中所述油是包含多不飽和脂肪酸的油，或者其 中所述維生素是維生素 A、維生素 D或維生素 E，和/或，其中所述包含多不飽和脂肪酸的油是 亞麻子油、魚油或包含含有共輛亞油酸的甘油醋的油。
[003引本發(fā)明還設(shè)及上述方法，其中所述二酪是4-甲基兒茶酪。
[0039] 本發(fā)明還具體地設(shè)及上述方法，其中所述水包油乳液是穩(wěn)定。乳化穩(wěn)定性是指乳 液的抵抗其性質(zhì)隨時(shí)間變化的能力。當(dāng)液滴的尺寸（即，例如2至ΙΟμπι)不顯著隨時(shí)間變化 時(shí)，乳液是穩(wěn)定的，。乳液中有四種類型的不穩(wěn)定:絮凝、乳油化、聚結(jié)和奧斯特瓦爾德熟化。 當(dāng)液滴之間存在吸引力時(shí)發(fā)生絮凝，所W其形成絮凝物，像葡萄束。當(dāng)液滴相互撞擊結(jié)合W 形成更大的液滴時(shí)發(fā)生聚結(jié)，因此滴的平均尺寸隨著時(shí)間推移液而增加。乳液也可經(jīng)歷乳 油化，其中在浮力的影響下或者當(dāng)使用離屯、機(jī)時(shí)在離屯、力的影響下，液滴上升到乳液頂部。
[0040] 雖然所加入二酪的量將取決于在水包油乳液中液滴的尺寸和/或油的量，但本發(fā) 明還設(shè)及上述方法，其中所述二酪的量為最少0.25mmol/m2所述水包油乳液內(nèi)所述液滴的 界面表面積。
[0041] 本發(fā)明設(shè)及針對瘤胃降解保護(hù)親脂性營養(yǎng)物的方法。針對瘤胃生物氨化保護(hù)的評 估可W通過W下方式進(jìn)行:體外分批溫育，W評估對多不飽和脂肪酸(PUFA)的保護(hù)。因此， 可W在溫育燒瓶中厭氧條件下加入上述乳液、作為細(xì)菌的基質(zhì)的例如干草、緩沖溶液和從 例如瘤胃造擾的（fis化lated)羊收集的瘤胃液。溫育遵從在約39°C下約24小時(shí)期間內(nèi)的間 歇搖動(dòng)，W便允許微生物活性和因此生物氨化。生物氨化的脂肪酸的量可W利用氣相色譜 法或任何其他方法來分析并計(jì)算，例如在實(shí)施例部分所顯示的。
[0042] 針對瘤胃生物氨化的保護(hù)評估也可在體內(nèi)進(jìn)行。例如，本發(fā)明的乳液可W施用于 瘤胃動(dòng)物如?；蜓?。例如，后面的乳液可W包括馬鈴馨塊莖皮保護(hù)的（如上所述)含有反- 10，順-12共輛亞油酸(CLA)和順-9，反-11共輛亞油酸的混合物的可商購的甘油醋。即使當(dāng) W5至lOg/d的有限劑量施用時(shí)，反-10,順-12共輛亞油酸也是乳脂合成的強(qiáng)效抑制劑，但只 有當(dāng)其轉(zhuǎn)移到乳腺時(shí)才是，而運(yùn)需要在小腸中的吸附和針對瘤胃生物氨化的保護(hù)。因此，監(jiān) 測簡單的特性(乳脂含量)提供了瘤胃保護(hù)、后瘤胃吸附和向乳腺的轉(zhuǎn)移的證據(jù)。
[0043] 此外，本發(fā)明設(shè)及上述方法，用于針對在所述營養(yǎng)物儲(chǔ)存期間由于氧化或其他方 式的降解保護(hù)親脂性營養(yǎng)物。氧化程度是可W通過例如使用丙二醒(MDA)測量和通過例如 固相微萃取氣相色譜/質(zhì)譜法（SPME-GC/MS)的揮發(fā)性組分的測量來測量，如例如通過所 述W或通過技術(shù)人員公知的任何其他方法。維生素 E的降解程度可W例如通過如實(shí)施例10 中所述的維生素 E的HPLC分析測定。
[0044] 因此本發(fā)明設(shè)及包括PP0、提取自特定的植物組織的蛋白質(zhì)提取物的作為乳化劑 的用途，并且需要存在于該提取物中的蛋白質(zhì)的快速吸附在親脂性營養(yǎng)液滴的表面并將該 表面完全覆蓋。后者特別要求PP0在油水界面的存在。如果不存在，在油水界面上PP0引起的 二酪向釀的轉(zhuǎn)化W及蛋白質(zhì)-苯酪膠囊的形成受到阻礙并且親脂性營養(yǎng)物將幾乎得不到針 對瘤胃降解如生物氨化的保護(hù)。為了獲得pro在油水界面的最大吸附，PP0和其他乳化劑(如 其他蛋白質(zhì))之間的競爭應(yīng)該盡可能低。有效的吸附需要蛋白質(zhì)的一些解折疊，運(yùn)通常不是 蛋白質(zhì)的天然狀態(tài)。然而，在吸附狀態(tài)下酶活性的保留意味著對蛋白質(zhì)天然結(jié)構(gòu)的最小修 改。在吸附后經(jīng)歷非常小的構(gòu)造結(jié)構(gòu)上的變化的運(yùn)樣的（主要是球形）蛋白質(zhì)在文獻(xiàn)中通常 被稱為"硬"蛋白質(zhì)。與"軟蛋白質(zhì)"相反，前者在原生狀態(tài)下表現(xiàn)出很小的構(gòu)象靈活性，并且 通過分子間物理和共價(jià)鍵牢牢地結(jié)合在一起。在不同來源的蛋白質(zhì)提取物中測定的PP0活 性和針對瘤胃降解/生物氨化的保護(hù)程度之間沒有相關(guān)性，運(yùn)可能與蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)差異和/或 蛋白質(zhì)吸附時(shí)解折疊的程度有關(guān)。事實(shí)上，在本發(fā)明的范圍內(nèi)，除了其將二酪氧化為釀的能 力，PP0的乳化能力可能是同等重要的。后者乳化能力因此不應(yīng)該在與其他"硬蛋白質(zhì)"競 爭，并且當(dāng)考慮通過將乳化蛋白質(zhì)加入至存在于植物提取物中的蛋白質(zhì)來增加乳化能力W 獲得液滴尺寸的減小時(shí)，乳化能力是重要的。在運(yùn)方面，本發(fā)明設(shè)及W下令人驚訝的發(fā)現(xiàn)： 為進(jìn)一步穩(wěn)定乳液不應(yīng)加入酪蛋白，其是在哺乳動(dòng)物乳汁中常見的一族有關(guān)的憐蛋白質(zhì)。
[0045] 本發(fā)明因此還設(shè)及W上方法，其中不應(yīng)用酪蛋白或當(dāng)吸附在油水界面時(shí)與多酪氧 化酶競爭的任何其他蛋白質(zhì)(諸如"硬"蛋白質(zhì))補(bǔ)充所述乳化蛋白質(zhì)的溶液。"硬"蛋白質(zhì)的 實(shí)例為β-乳球蛋白質(zhì)、牛血清白蛋白質(zhì)和球蛋白質(zhì)...。"軟蛋白質(zhì)"的實(shí)例為酪蛋白。
[0046] 本發(fā)明還設(shè)及乳液，其包含通過上述任何方法可獲得的二酪保護(hù)的親脂性營養(yǎng) 物。后面的乳液可W最好通過其制造方法進(jìn)行表征。因此后面的乳液包含溶劑，其中存在特 定尺寸的液滴(如上所述），并且其中所述液滴是由被酪絡(luò)合蛋白質(zhì)膠囊包圍的親脂性營養(yǎng) 物制成的，并且其中所述蛋白質(zhì)包含ΡΡ0、植物蛋白質(zhì)W及任選地補(bǔ)充的非競爭"硬"蛋白 質(zhì)。
[0047] 此外，本發(fā)明設(shè)及飼料，其包含如上所述的任何乳液。術(shù)語"飼料"是指提供給反當(dāng) 動(dòng)物的食物，其包括但不僅限于壓縮和顆粒化的飼料、油和乳液，其包含根據(jù)本發(fā)明的被包 封和保護(hù)的親脂性營養(yǎng)物等組分。
[0048] 本發(fā)明因此還設(shè)及如上所述乳液或如上所述的飼料的用途，當(dāng)與未喂食如上所述 乳液或飼料的動(dòng)物中得到的量相比時(shí)，增加反當(dāng)動(dòng)物產(chǎn)品中的親脂性營養(yǎng)物的總量。
[0049] 現(xiàn)在將通過W下非限制性實(shí)施例來說明本發(fā)明。 實(shí)施例
[00加]實(shí)施例la
[0051]使用來自五種不同的植物來源的富含PP0的蛋白質(zhì)提取物W及四種不同濃度的4- 甲基兒茶酪作為二酪劑的水包亞麻巧油乳液針對瘤胃降解體外保護(hù)
[0化。材料和方法
[0053] 執(zhí)行一個(gè)Ξ步驟工藝:第一，將蛋白質(zhì)從植物源提取;第二，使用運(yùn)種蛋白質(zhì)提取 物將富PUFA的油乳化；W及第Ξ，通過加入所合成的二酪引起蛋白質(zhì)-苯酪絡(luò)合物的生成： 首先，對于蛋白質(zhì)提取物，分別采用不同的植物來源：紅Ξ葉草（紅車軸草（Trifolium pratense L.CV.Lemmon))、馬鈴馨塊莖皮（馬鈴馨（Solanum tuberosum L.))、蘋果(澳洲青 蘋（Malus domestica Mill CV.Granny Smith))、香蕉果肉（小果野蕉（Musa acuminate Colla)AAA組栽培品種Grand 化in(AAA group cv Grand 化in))W及茄子（茄子（Solanum melongena L.))。植物材料是從田地里采摘的，或者當(dāng)采不到時(shí)就在本地雜貨店里購買。在 收獲或切成小塊后將材料在-80°C下立即冷凍?？傊?，將約150g冷凍植物材料、含有30mM抗 壞血酸(抑=7.0)的500ml 0.1M憐酸緩沖液、0.5g Triton X-100和Ig聚乙締基化咯燒酬在 共混機(jī)中充分混合Imin。過濾和離屯、（10000 X g，15min，4°C)后，將丙酬加入到上清液中，直 至化00ml丙酬/升總體積的濃度，并在-18°C下保持35分鐘。離屯、（5000 X g，5min，4°C )后，將 粒料重新溶解于不含抗壞血酸的400ml lOmM憐酸鹽緩沖液(pH=7.0)。將此濃縮的蛋白質(zhì) 提取物用于測量PP0活性和蛋白質(zhì)含量，如Van Ranst等人所述W。為確定PP0活性，在加入 4-甲基兒茶酪20、30、40秒之后，在400皿處測定吸光度(A) dPPO活性表示為Δ A/min/mg蛋白 質(zhì)。將化lin-Ciocalteau試劑加入到具有銅和化K酒石酸鹽的蛋白質(zhì)提取物中，并在750nm 處測定吸光度來確定蛋白質(zhì)的含量，將其表示為g蛋白質(zhì)/升提取物。第二，將含有PP0的該 濃縮的蛋白質(zhì)提取物用于乳化亞麻巧油（富含亞油酸(C18:2n-6)和α-亞麻酸(C18:3n-3))。 用高速叫traturrax(T25 Basicjka Werke，詩道芬，德國）生成粗乳液，每升蛋白質(zhì)提取物 含20克亞麻巧油，其被放入微流化床器(microf luidizer) (Ml 10S，微流體公司，牛頓市，馬 薩諸塞州，美國）并且通過5次W生成具有小液滴尺寸的穩(wěn)定乳液。將超速分散的 (叫化aturraxed)乳液在1.8MPa壓縮空氣的氣壓下進(jìn)行處理，其對應(yīng)于25M化的液體壓力。 在處理期間，使乳液通過浸入冰水浴的熱交換器盤管從而冷卻。粒度分布是在制備后立即 使用配有300RF透鏡的Mastersizer S(馬爾文儀器，馬爾文，英國）檢測的。使用了自動(dòng)化樣 品分散單元MS-17(馬爾文儀器，馬爾文，英國）。將樣品加入到分散單元，直到達(dá)到10%至 15%的遮蔽水平為止。使用多分散模型對數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。由此，油的實(shí)折射率固定為 1.5295,而虛折射率被假定為0.1000。液滴尺寸是使用可用的軟件(馬爾文儀器，馬爾文，英 國）W體積加權(quán)平均直徑(d43) iSauter表面加權(quán)平均直徑(d32)，平均體積加權(quán)分布值D[v， 0.5]W及90%百分點(diǎn)的體積加權(quán)分布D[v，0.9]表征的。比表面積（WmVg油計(jì)）是基于 930kg/m3的假定油密度P從Sauter平均直徑計(jì)算得到的：SSA = 6/d32/p。最后，為了造成蛋白 質(zhì)-苯酪絡(luò)合，將10% (v/v)的蒸饋水中4-甲基兒茶酪溶液加入到乳液中，W達(dá)到9/1乳液/ 二酪溶液的濃度。測試乳液具有0、12.5、25或50mM 4-甲基兒茶酪的最終濃度。將乳液混合 物在室溫下振搖24小時(shí)，W允許PK)活性。將受保護(hù)的乳液儲(chǔ)存在冰箱中直到進(jìn)一步分析。
[0054] 進(jìn)行體外分批次溫育W評估對各種乳液中的PUFA針對瘤胃生物氨化的保護(hù)。因 此，將1ml乳液、250mg干草、20ml緩沖溶液(每升蒸饋水含有3.58g Na2冊化· 12出0，1.55g K此P〇4,0.124g MgCb.細(xì)2〇,8.74g 化肥〇3和Ig NH4HC03)W及5ml瘤胃流體加入到 125-ml 溫育瓶中。瘤胃液體是在早晨喂食前從Ξ只瘤胃造擾的羊中收集的，運(yùn)些羊分別自由采食 干草，可W自由飲水。羊造擾術(shù)是由比利時(shí)的農(nóng)業(yè)和漁業(yè)研究所（ILV0)的倫理委員會(huì)批準(zhǔn) 的化C 2009,114)。將來自Ξ只羊的瘤胃內(nèi)容物合并，并通過1mm孔徑的篩子在39°C下連續(xù) 的C〇2沖洗下過濾。將溫育瓶用C〇2徹底沖洗w獲得厭氧條件并且使用分批培養(yǎng)溫育箱 化dmund B恤ler GMBH，赫辛根，德國）在39°C下間斷振搖溫育2地。體外瘤胃溫育2地后，燒 瓶從溫育箱中取出，并放置在冰水中，W停止微生物活性。在氣體分析之后，測定pH 化anna Ins化uments，特姆塞，比利時(shí)）并將培養(yǎng)內(nèi)容物取樣用于揮發(fā)性脂肪酸(VFA)分析 。<11>未示出pH、氣體和VFA的結(jié)果，是因?yàn)椴煌膶?shí)驗(yàn)處理和對照處理之間沒有觀察到差 異，運(yùn)表明生物氨化的程度的變化不是由微生物活性的變化造成的。為了長鏈脂肪酸分析 (FA)，取5ml溫育液并冷凍干燥。每個(gè)處理將溫育重復(fù)Ξ次。
[0055] 通過堿催化接著酸催化的步驟將冷凍干燥的培養(yǎng)內(nèi)含物的脂肪酸甲基化。加入含 有0.2mg/ml十Ξ燒酸（Sigma，迪更，比利時(shí)）的甲苯（2ml)作為內(nèi)標(biāo)。使用Multi-tube Vortex(VX-2500，VWR International,魯議，比利時(shí)）將提取試管徹底滿旋（vortex),隨后 加入甲醇氨氧化鋼(2ml，0.5MNa0田容于甲醇）。將試管滿旋，在70°C下熱水浴溫育化，并在冰 浴中再次冷卻5min。在加入通過將10ml乙酷氯溶解在50ml冰冷的甲醇中制備的甲醇鹽酸 (3ml)后，將試管滿旋并在50°C下在空氣烘箱中溫育30min。在冰浴中冷卻5min，將己燒 (3ml)和用化肥化飽和的水溶液(4ml)加入，滿旋并離屯、（5min，1111 X g)。將含有甲基化的 脂肪酸的上清液使用化steur吸管取出，并用含有玻璃棉、硅膠和活性煤、用己燒預(yù)洗涂過 的柱過濾。將過濾的溶劑使用化蒸發(fā)，再溶解在己燒（1ml)中，并轉(zhuǎn)移到GC小瓶中隨后使用 氣相色譜分析。使用惠普6890氣相色譜儀（惠普，布魯塞爾，比利時(shí)）用溶膠凝膠-蠟柱(30m X 0.25mm X 0.25皿;SGE Anal}ftical Science,維多利亞州，澳大利亞），對脂肪酸進(jìn)行了 分析。升溫程序如下：150°C，2分鐘；3°C/分鐘增加至250°C ;注射器溫度:250°C ;檢測器溫度 280°C。對于該升溫程序，注射化L，其中分流/不分流比為50:1。基于它們的保留時(shí)間，相較 于外部標(biāo)準(zhǔn)（BR2和BR3，La;rodan Fine 化emicals AB，馬爾默，瑞典；Supelco37，Supelco Anal^ical，賓夕法尼亞州，美國；PUFA-3，Matreya UX，喜峽，賓夕法尼亞，美國），鑒定脂 肪酸的峰。C18: 3n-3的體外瘤胃生物氨化計(jì)算為[(18:3在總C18FA中的比例)0h-( 18:3在總 C18FA中的比例)24h]/(18:3在總C18FA中的比例)〇h。
[0056] 緝里
[0057] 在表1中列出了PP0活性，表示為加入二酪基質(zhì)后20s和40s之間吸光度的增加 （Δ A/min/mg蛋白質(zhì)）。馬鈴馨塊莖果皮與紅Ξ葉草相比表現(xiàn)出對4-甲基兒茶酪類似的PP0活 性。蘋果和茄子也顯示活性，但活性較小。圖1中表示了未添加二酪或4-甲基兒茶酪（12.5， 25，50mM)不同的PP0源乳液的體外瘤胃生物氨化。當(dāng)沒有二酪加入到該乳液時(shí)，觀察到80到 90%的正常生物氨化值。4-甲基兒茶酪量的增加大幅度減少了C18:化-3的生物氨化。馬鈴 馨塊莖皮提取物和紅Ξ葉草一樣導(dǎo)致相似的減少，但是，得到生物氨化的降低需要更少的 4-甲基兒茶酪的量。蘋果提取物在較高的4-甲基兒茶酪濃度下也可W得到生物氨化的減 少，但是比紅Ξ葉草或馬鈴馨塊莖皮的強(qiáng)度低。值得注意的是，茄子提取物沒有得到生物氨 化的減少，因此發(fā)現(xiàn)pro活性和生物氨化減少之間沒有相關(guān)性。
[0058] 表1:使用來自5種不同的植物來源的蛋白質(zhì)提取物制備的2% (w/v)的水包亞麻巧 油乳液的蛋白質(zhì)和乳液的特征，其用于在體外針對瘤胃生物氨化進(jìn)行保護(hù)。運(yùn)些乳液用或 不用具有不同濃度的4-甲基兒茶酪處理W生成蛋白質(zhì)結(jié)合的苯酪絡(luò)合物從而獲得瘤胃通 過產(chǎn)物
[0化9]
[0060] 0[4,3]，體積加權(quán)平均直徑;0[3,2]，表面加權(quán)平均直徑;0[乂，0.5]，50%中值體積 分布直徑，運(yùn)意味著50%的樣本顯示液滴的直徑是所提到的值W下;D[v，0.9] ,90%體積分 布直徑，運(yùn)意味著90%的樣本顯示液滴的直徑在所提到的值W下;SSA，比表面積(mVg油） [OOW] 實(shí)施例化
[0062]使用來自20種不同的植物來源的富含PP0的蛋白質(zhì)提取物W及四種不同濃度的4- 甲基兒茶酪作為二酪劑的水包亞麻巧油乳液針對瘤胃降解體外保護(hù) [006；3] 材料和方法
[0064] 乳液的制備和計(jì)算是與實(shí)施例1的情況可比的。再次執(zhí)行一個(gè)Ξ步驟工藝，其中將 油使用蛋白質(zhì)提取物乳化，隨后加入所合成的二酪W生成蛋白質(zhì)-苯酪絡(luò)合物從而獲得保 護(hù)。對20種不同的原料進(jìn)行篩查試驗(yàn):馬鈴馨塊莖皮(馬鈴馨(Solanum tuberosum L.))，渡 蘿皮和果肉（渡蘿（Ananas comosus化.）Me;r;r .))，蘋果皮（蘋果栽培品種Jonagold或 Jonagored(Malus domestica Mill cv.Jonagold or Jonagored))，蘋果果渣（蘋果栽培品 種Jonagold(Malus domestica Mill cv.Jonagold)或不同栽培品種的混合物）此處 Jonagold處理是無氧壓棒之后獲得的，朝鮮劑（洋劑（切nara scolymus L.))，香蕉皮（小果 野蕉（Musa acuminnate Colla)AAA組栽培品種Grand 化in(AAA group CV Grand Nain))， 花挪菜的葉、小花、芽廢棄物（=莖和葉）（花挪菜（1^"日331。3〇1日拘。日日1.(30醇日1'.13〇1：巧1：13 va;r.bot;rytis))，花挪菜的芽廢棄物（花挪菜（BrassicaoleraceaL.conva;r.Bo1:rパis var. cymosa))，北海郵（郵（Crangon crangon L.))，無氧壓棒獲得的梨果渣（梨（Pyrus communis L.cv Conference))，番茄葉和莖（番茄（Solanum lycopersicum L.))，渡菜葉 (渡菜（Spinacia oleracea L.))，比利時(shí)菊宦根皮（peel)和根皮層（cortex)(菊宦 (Cichorium intybus L.))和胡蘿h皮（胡蘿K〇au州s ca;ro1:a subsp sativus化offm.)Sch ubl&G.Ma;rtens))。
[0065] 蛋白質(zhì)提取物用于測量PPO活性和蛋白質(zhì)含量。為了確定PPO活性，在400皿測試加 入4-甲基兒茶酪10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60秒后的吸光度，如￥曰111?曰1131等人所 述(8)。通過測定在具有最高R2值的線性區(qū)域的斜率計(jì)算PP0活性，并表示為nkatal/mg蛋白 質(zhì)，由此使用標(biāo)準(zhǔn)釀系列來計(jì)算轉(zhuǎn)換因子W表示nkatal中吸光度的增加/分鐘。將化lin- Ciocalteau試劑加入到該蛋白質(zhì)提取物的具有或不具有銅的NaK酒石酸鹽，并且在750nm處 測量吸光度W確定該蛋白質(zhì)和蛋白質(zhì)結(jié)合苯酪含量，分別表示為g/升提取物和mg酪氨酸當(dāng) 量/mg蛋白質(zhì)，如由溫特斯等人所述。重復(fù)進(jìn)行Ξ次測試。
[0066] 最后，為了造成蛋白質(zhì)-苯酪絡(luò)合，將10% (v/v)的蒸饋水中4-甲基兒茶酪溶液加 入到乳液中，W達(dá)到9/1乳液/二酪溶液的濃度。測試乳液具有為0、10、20或40mM 4-甲基兒 茶酪的最終濃度。將乳液混合物在室溫下振搖24小時(shí)，W允許PP0的活性，隨后儲(chǔ)存在冰箱 中，并隨后溫育W測試針對瘤胃生物氨化的保護(hù)。
[0067] (：18:311-3的保護(hù)效率計(jì)算為[(18:311-3的生物氨化)未概戶-(18:311-3的生物氨 化)概謝]]/ (18: 3n-3的生物氨化)規(guī)戶。
[006引緝里
[0069] 蛋白質(zhì)提取物和所測試的乳液的乳液特征示于表2。在提取物中蛋白質(zhì)濃度最高 的為馬鈴馨塊莖皮和北海郵，其他植物蛋白質(zhì)源表現(xiàn)出低得多的蛋白質(zhì)濃度。在提取物中 蛋白質(zhì)結(jié)合苯酪含量特別高的是洋劑，反映在蛋白質(zhì)提取過程中的高絡(luò)合活性，與所有其 他其中蛋白質(zhì)結(jié)合的苯酪濃度普遍較低的蛋白質(zhì)來源相反。PP0活性表示為nkatal/mg蛋白 質(zhì)，在加入4-甲基兒茶酪作為二酪基質(zhì)之后，其中最高的是洋劑、番茄植物材料、梨果肉和 馬鈴馨塊莖皮。蘋果提取物表現(xiàn)出中等的PP0活性，而相比之下，所有其他蛋白質(zhì)來源則呈 現(xiàn)對4-甲基兒茶酪低至幾乎沒有PK)活性。乳液特征表明，發(fā)現(xiàn)通常小的液滴尺寸具有提高 的蛋白質(zhì)提取物中的蛋白質(zhì)含量。
[0070] 表3中列出在乳液中溫育24小時(shí)后C18:化-3的生物氨化百分比。在生物氨化和4- 甲基兒茶酪濃度之間觀察到明顯的趨勢:在水包亞麻巧油乳液中施加4-甲基兒茶酪濃度的 增加導(dǎo)致較小的生物氨化值。基質(zhì)濃度的增加最初反映為生物氨化的睹峭下降，但是，一旦 生物氨化達(dá)到低水平，施加高濃度的二酪也觀察不到進(jìn)一步的影響。圖2示出了對于最高施 加酪濃度(40mM 4-甲基兒茶酪)針對生物氨化的保護(hù)的百分?jǐn)?shù)。從該圖很清楚發(fā)現(xiàn)具有最 高保護(hù)潛能的為花挪菜小花和葉、渡菜葉和馬鈴馨塊莖皮。西蘭花和花挪菜廢物（=葉和 莖），洋劑和番茄植物廢物（=葉和莖)材料顯示中等保護(hù)值，但所有其他的蛋白質(zhì)源導(dǎo)致低 于10 %的保護(hù)水平。
[0071] 值得注意的是，在提取物的PP0活性和針對生物氨化保護(hù)的伴隨水平之間發(fā)現(xiàn)沒 有直接的聯(lián)系。運(yùn)是一個(gè)驚人的結(jié)果，因?yàn)榧僬f一直是高PP0活性是獲得高級別保護(hù)的先決 條件。運(yùn)在花挪菜和渡菜上體現(xiàn)的最好，其導(dǎo)致高水平的保護(hù)，但顯示低PK)活性。其他蛋白 質(zhì)來源，如胡蘿h和比利時(shí)菊宦根，顯示與花挪菜和渡菜類似的PP0活性，但是幾乎沒有引起 任何保護(hù)?？赡苷J(rèn)為PP0在提取物中存在對獲得保護(hù)是必要的，但在PP0活性或不同蛋白質(zhì) 來源的蛋白質(zhì)水平與針對瘤胃生物氨化的保護(hù)水平之間沒有聯(lián)系。
[0072] 表2:使用來自20種不同的植物來源的蛋白質(zhì)提取物制備的2 % (w/v)的水包亞麻 巧油乳液的蛋白質(zhì)和乳液的特征，其用于在體外針對抗瘤胃生物氨化進(jìn)行保護(hù)。運(yùn)些乳液 用或不用具有不同濃度的4-甲基兒茶酪處理W生成蛋白質(zhì)結(jié)合的苯酪絡(luò)合物從而獲得瘤 胃通過產(chǎn)物
[0073]
[0074]
[00巧]0[4,3]，體積加權(quán)平均直徑;0[3,2]，表面加權(quán)平均直徑;0[乂，0.5]，50%中值體積 分布直徑，運(yùn)意味著50%的樣本顯示液滴的直徑是所提到的值W下;D[v，0.9] ,90%體積分 布直徑，運(yùn)意味著90%的樣本顯示液滴的直徑在所提到的值W下；SSA，比表面積(mVg油）； N.A.，無法提供
[0076] 表3:使用來自不同來源的蛋白質(zhì)提取物在不同濃度4-甲基兒茶酪（0、10、20或 40mM)作為二酪劑的水包亞麻巧油乳液在體外溫育24小時(shí)后C18:化-3的瘤胃生物氨化（％ ) (N=3)
[0077]
[007引
[0079] SD，標(biāo)準(zhǔn)偏差；％生物氨化（BH)是由下列公式計(jì)算的：％BH=100*[(C18:3)oh- ((：18:3)2化）]/((：18:3)化其中(：18:3為溫育前（0小時(shí)）或溫育后（24小時(shí)）測得的(：18:3占總 C18脂肪酸的比率
[0080] 實(shí)施例2
[0081] 使用來自20種不同的植物來源的富含PPO的蛋白質(zhì)提取物W及四種不同濃度的4- 甲基兒茶酪作為二酪劑的水包亞麻巧油乳液針對瘤胃降解體外保護(hù)，其中加入額外的酪蛋 白作為乳化劑
[00劇材料和方法
[0083] 乳液的制備和計(jì)算是與實(shí)施例1的情況可比的。進(jìn)行組合設(shè)置，W評估油濃度、額 外的酪蛋白加入和不同二酪基質(zhì)濃度的組合效果。使用4x3x4因子設(shè)計(jì)來測試4種濃度的油 (10、20、30和40g亞麻巧油/升紅Ξ葉草蛋白質(zhì)提取物），3種蛋白質(zhì)濃度(0、1或2g額外酪蛋 白酸水解產(chǎn)物/升乳液）^及4種二酪濃度（^獲得具有0、12.5、25或5〇11114-甲基兒茶酪的 最終濃度的測試乳液）dC18 :化-3的保護(hù)效率計(jì)算為[(18: 3n-3的生物氨化)漸漲-(18:化-3 的生物氨化)側(cè)徹]/(18:化-3的生物氨化)漸期戶。
[0084] 使用SAS(SAS Ente;rp;rise Guide 5.1，SAS Institute Inc.，卡里，北卡羅來納 少H，美國）的MIX抓程序進(jìn)行了結(jié)果分析，使用SAS的化IN程序完成非線性回歸。在統(tǒng)計(jì)分析 之前，求出技術(shù)重復(fù)的平均值。因此，設(shè)計(jì)沒有允許所有相互作用的評估，但確實(shí)允許評估 相互作用的所有(n-1)方式(way)(測試的因子數(shù)為η)。因此，使用下面的模型:Yij=y+0i+ 門+Dk+0i X門+0i X Dk+門X Dk+ε i j，其中Oi為油濃度的影響（i = 10、20、30或40g/升紅Ξ葉 草蛋白質(zhì)提取物），門額外蛋白質(zhì)的影響（j = 〇、l或2g額外酪蛋白/升乳液），Dk為乳液中二 酪濃度的影響化=0、12.5、25或5011^4-甲基兒茶酪）。所有提及的差異指定在0.05顯著性 水平并使用化k巧多重比較測試評價(jià)最小二乘法之間的差異。
[0085] 緝里
[0086] 圖3給出了結(jié)果的概述。乳液中加入4-甲基兒茶酪導(dǎo)致瘤胃溫育24小時(shí)后C18:^- 3的生物氨化的降低，其中4-甲基兒茶酪的濃度的增加導(dǎo)致生物氨化的進(jìn)一步降低（p< 0.001)。當(dāng)在水包油乳化液中包含更多油時(shí)，PUFA被更廣泛地氨化(p<0.001)。值得注意的 是，伴隨更高的油濃度的此生物氨化的增加是在每個(gè)水平的4-甲基兒茶酪中出現(xiàn)的（p< 0.001)，但是在中等的二酪濃度出現(xiàn)生物氨化的最大顯著差異。保護(hù)更高量的油顯得更困 難，因?yàn)闉榱双@得降低生物氨化和伴隨增加的保護(hù)效率，需要更大量的4-甲基兒茶酪。而出 乎意料的是，對于酪蛋白（P<〇.001)也出現(xiàn)生物氨化的差異，與油濃度(P = 〇.372)無關(guān)，但 與二酪(p = 0.029)相關(guān)。加入Ig酪蛋白/升蛋白質(zhì)提取物沒有導(dǎo)致生物氨化的增加 (p = 0.947 )，然而，當(dāng)加入2g酪蛋白/升蛋白質(zhì)提取物時(shí)，觀察到了與沒有酪蛋白或1 g酪蛋白/升 相比雖然小但顯著的生物氨化的增加(P<〇.001)。因此，盡管乳液液滴尺寸減少，更多蛋白 質(zhì)導(dǎo)致更高水平的生物氨化(表4)。增加油濃度導(dǎo)致更大量的生物氨化，與乳液液滴尺寸的 增加和比表面積的減小相聯(lián)系。對于C18:化-6和C18:化-3分別為0.716和0.795最高保護(hù)效 率出現(xiàn)在最低油濃度(lOg油/升)和最高4-甲基兒茶酪濃度(50mM)。
[0087] 建議的是，PP0不得不存在于接近油界面處W誘導(dǎo)交聯(lián)。從運(yùn)個(gè)角度可W解釋保護(hù) 效率通過加入酪蛋白而減少。事實(shí)上，運(yùn)一觀察與最初預(yù)期的是相反的，因?yàn)樘砑永业鞍讖?而提供足夠的乳化劑來得到足夠小的液滴尺寸從而獲得穩(wěn)定的乳液。當(dāng)乳液通過微流化床 器時(shí)，乳化液滴尺寸減小，導(dǎo)致水包油表面積增加。顯然，運(yùn)種較大的表面積需要更多的乳 化劑，運(yùn)意味著不得不從連續(xù)相抽出更多的蛋白質(zhì)并且并入乳液的界面。事實(shí)上，在具有更 大的脂肪含量且因此具有增加的比表面積的乳制品乳液中，報(bào)道了所吸附的蛋白質(zhì)的分?jǐn)?shù) 的增加然而，無序的"軟"蛋白質(zhì)如酪蛋白，比球狀"硬"蛋白質(zhì)趨向于更容易地吸附到 乳液界面，因?yàn)檫\(yùn)些蛋白質(zhì)更快解折疊，導(dǎo)致界面張力的更快降低。在紅Ξ葉草提取物 中的酶如PPO與其他蛋白質(zhì)是典型的球狀蛋白質(zhì)。當(dāng)紅Ξ葉草"硬"球狀蛋白質(zhì)和如酪蛋白 的"軟"蛋白質(zhì)同時(shí)存在時(shí)，由于競爭吸附，酪蛋白與PPO相比可更高的程度并入界面 。<14>因此，酪蛋白對保護(hù)效率的運(yùn)種負(fù)面影響上可W表明為了形成保護(hù)，PPO實(shí)際上不得不 存在于油界面上。
[0088] 此外，不僅二酪和PP0的存在對于針對生物氨化進(jìn)行保護(hù)是重要的，而且二酪的量 也發(fā)揮作用，其中更大的二酪的量產(chǎn)生更好的瘤胃保護(hù)。運(yùn)可能是由于在界面上形成了更 致密的苯酪交聯(lián)蛋白質(zhì)層，導(dǎo)致更好地保護(hù)的乳液。所需的二酪的量很可能取決于乳液的 總界面面積，運(yùn)反映為比表面積(表4)。實(shí)際上，可能是因?yàn)槎业亩倘?，看來針對生物氨?保護(hù)更高量的油更加困難（圖3)。因此，在圖4中，在乳液中二酪基質(zhì)的量/單位乳液界面面 積(mmol 4-甲基兒茶酪/V)與保護(hù)效率數(shù)據(jù)相關(guān)。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)點(diǎn)呈對數(shù)增加，一旦每平方米 存在于乳液中的表面積上可在體系中存在的4-MC超過0.25mmol則達(dá)到平臺。運(yùn)表明，針對 生物氨化的保護(hù)效率可能是通過有效乳液包封導(dǎo)致的，因?yàn)楸Ｗo(hù)效率隨二酪基質(zhì)的量/單 位乳液界面面積的增加而增加。
[0089] 表4:使用紅Ξ葉草蛋白質(zhì)提取物制備的水包亞麻巧油乳液的蛋白質(zhì)和乳液的特 征，其用于在體外針對瘤胃生物氨化進(jìn)行保護(hù)。運(yùn)些乳液用或不用具有不同濃度的4-甲基 兒茶酪(〇、12.5、25或5〇11^)處理^生成蛋白質(zhì)結(jié)合的苯酪絡(luò)合物從而獲得瘤胃通過產(chǎn)物
[0090]

[0091] CAS，酪蛋白；D [4，3 ]，體積加權(quán)平均直徑;D[ 3，2 ]，表面加權(quán)平均直徑;D [ V，ο . 5 ]， 50%中值體積分布直徑，運(yùn)意味著50%的樣本顯示液滴的直徑是所提到的值W下；D[v， 0.9]，90%體積分布直徑，運(yùn)意味著90%的樣本顯示液滴的直徑在所提到的值W下;SSA，比 表面積(mVg油）
[0092] a油乳化的量，Wg/升蛋白質(zhì)提取物計(jì)
[0093] b額外酪蛋白的量，Wg/升蛋白質(zhì)提取物計(jì)，在乳化之前加入到乳液的連續(xù)相中
[0094] 實(shí)施例3
[00M]使用來自馬鈴馨塊莖皮的富含PPO的蛋白質(zhì)提取物W及4-甲基兒茶酪作為二酪劑 的水包亞麻巧油乳液針對瘤胃降解體外保護(hù)，其中使用或不使用牛血清白蛋白質(zhì) [00%] 材料和方法
[0097]為了評估作為附加乳化劑"軟"和"硬"的蛋白質(zhì)之間的區(qū)別，在當(dāng)前實(shí)驗(yàn)中使用牛 血清白蛋白質(zhì)作為"硬"蛋白質(zhì)的實(shí)例。從實(shí)施例2的發(fā)現(xiàn)，建議"軟"蛋白質(zhì)酪蛋白的加入將 "硬蛋白質(zhì)"PPO從油-水界面競爭掉(outcompete)，導(dǎo)致在加入4-甲基兒茶酪后生物氨化降 低的減少。將牛血清白蛋白質(zhì)(BSA)加入到含PP0的蛋白質(zhì)提取物來制備40.0 mg蛋白質(zhì)/g油 的10%的水包油乳液(與含有38mg蛋白質(zhì)/g油的對照相比）。對乳液的液滴尺寸的變化和受 保護(hù)的乳液的生物氨化在體外進(jìn)行了評估。如實(shí)施例1中所述制備乳液，不過使用轉(zhuǎn)子/定 子均化(而不是微流化床器)并且乳液含有10%而不是2%的油。
[009引緝里
[0099] BSA的加入顯著降低原始乳液的平均液滴尺寸(6對8μπι)，但與對照處理的差異在 保護(hù)反應(yīng)后消失(兩種乳液的平均液滴尺寸均為8μπι)。在瘤胃生物氨化的程度上沒有觀察 到差異，平均保護(hù)程度為71%。加入有限量的如牛血清白蛋白質(zhì)的硬蛋白質(zhì)沒有影響針對 瘤胃生物氨化的保護(hù)，運(yùn)表明相比于例如酪蛋白的"軟"蛋白質(zhì)在"硬"蛋白質(zhì)的情況下附加 乳化劑的惡化效應(yīng)是更少的。盡管如此，本實(shí)驗(yàn)更重要的發(fā)現(xiàn)是，含有10%的油液滴尺寸為 祉m的乳液的保護(hù)效率是71%。運(yùn)在大大高于基于實(shí)施例2所期待的結(jié)果，其中上的表 面加權(quán)平均直徑將保護(hù)效率降低至35% W下。與實(shí)施例2對比，將馬鈴馨塊莖皮代替紅Ξ葉 草用作PP0的來源。運(yùn)支持了 W下令人驚奇的發(fā)現(xiàn):對于針對瘤胃生物氨化保護(hù)多不飽和脂 肪酸的命運(yùn)來說PP0來源的差異性，所述命運(yùn)與PP0沒有關(guān)系(在本實(shí)施例中22化at/g油，運(yùn) 與實(shí)施例2中測得的活性水平是可比的）。
[0100] 實(shí)施例4
[0101] 使用來自紅Ξ葉草的富含PP0的蛋白質(zhì)提取物W及4-甲基兒茶酪作為二酪劑的水 包亞麻巧油乳液針對瘤胃降解體外保護(hù)，其中將在不同時(shí)間后停止交聯(lián)反應(yīng)
[?！?。材料和方法
[0103] 為了評估當(dāng)加入4-甲基兒茶酪(0或15mM)時(shí)需要多長時(shí)間來針對瘤胃生物氨化保 護(hù)乳液，考慮了時(shí)間序列。如此前在實(shí)施例1中所述生成1.5%(w/v)的乳液。然而，將乳液混 合物在室溫下振搖〇、〇.5、1、2、4、8或24小時(shí)，隨后加入4-己基間苯二酪(4-己基間苯二酪； 50%的乙醇溶液），并存儲(chǔ)在冰箱中，W獲得不同的保護(hù)水平。此前已經(jīng)證實(shí)4-己基間苯二 酪是PK)的有效抑制劑。乳液具有3ml 4-己基間苯二酪的最終濃度。
[0104]
[0105] 圖5所示的新鮮溫育的乳液的結(jié)果(表5)清楚地表明，當(dāng)加入4-甲基兒茶酪和PP0 抑制之間的時(shí)間增長時(shí)，降低了C18:化-6和C18:化-3的生物氨化。在最初的兩小時(shí)期間，沒 有發(fā)現(xiàn)生物氨化的減少，而4h后注意到生物氨化的明顯降低。更大的降低出現(xiàn)在8小時(shí)和24 小時(shí)后，運(yùn)表明當(dāng)允許在4-甲基兒茶酪加入后發(fā)生更長時(shí)間的PPO催化反應(yīng)時(shí)，引起針對BH 更高的保護(hù)。
[0106]表5:使用紅Ξ葉草蛋白質(zhì)提取物制備的水包亞麻巧油乳液的蛋白質(zhì)和乳液的特 征，其用于在體外對抗瘤胃生物氨化。運(yùn)些乳液用或不用4-甲基兒茶酪（15mM)處理W生成 蛋白質(zhì)結(jié)合的苯酪絡(luò)合物從而獲得瘤胃通過產(chǎn)物 「01071
[010引 0[4,3]，體積加權(quán)平均直徑;0[3,2]，表面加權(quán)平均直徑;0[乂，0.5]，50%中值體積 分布直徑，運(yùn)意味著50%的樣本顯示液滴的直徑是所提到的值W下;D[v，0.9] ,90%體積分 布直徑，運(yùn)意味著90%的樣本顯示液滴的直徑在所提到的值W下;SSA，比表面積(m2/g油）
[0109] 實(shí)施例5
[0110] 使用來自紅Ξ葉草的富含PP0的蛋白質(zhì)提取物W及4-甲基兒茶酪作為二酪劑的水 包魚油乳液針對瘤胃降解體外保護(hù)
[0111] 材料和方法
[0112] 乳液的制備和計(jì)算是與實(shí)施例1的情況可比的，但是，在運(yùn)種情況下使用2% (w/v) 魚油代替亞麻巧油。此外，加入〇、1或2g/L的酪蛋白作為額外的乳化劑。展示的結(jié)果是具有 運(yùn)Ξ種酪蛋白水平的乳液的平均。由于魚油特別富含如C20:5n-3和C22:6n-3的長鏈脂肪 酸，對于C20: 5n-3和C22: 6n-3分別生物氨化計(jì)算為：[(C20:5在總C20FA中的比例)0h-(C20:5 在總C20FA中的比例）24h]/(C20:5在總C20FA中的比例）Oh和[(C22:6在總C22FA中的比例）0h- (C22:6在總C22FA中的比例）24h]/(C22:6在總C22FA中的比例）〇h。
[0113] 結(jié)果
[0114] 圖6中的結(jié)果顯示，與實(shí)施例1類似，加入4-甲基兒茶酪導(dǎo)致C20: 5n-3和C22: 6n-3 的生物氨化降低。酪蛋白作為額外的乳化劑降低乳液的液滴尺寸并伴隨更大的比表面積 (表6)。不含4-甲基兒茶酪的乳液的生物氨化值與亞麻巧油乳液相比更低，運(yùn)對于C20:5n-3 和C22:6n-3在體外是常觀察到的，最顯著的原因是運(yùn)些長鏈PUFA對瘤胃代謝的毒性作用 為了比較的緣故，還使用只有2g酪蛋白/升作為乳化劑制成乳液，所W沒有4-甲基兒茶 酪或紅Ξ葉草蛋白質(zhì)提取物，但是運(yùn)導(dǎo)致了與不含4-甲基兒茶酪具有或不具紅Ξ葉草的乳 液相比生物氨化沒有差異。運(yùn)表明，要獲得生物氨化的降低，需要含有PP0的紅Ξ葉草蛋白 質(zhì)提取物和作為二酪基質(zhì)的4-甲基兒茶酪兩者。
[0115] 表6:使用紅Ξ葉草蛋白質(zhì)提取物制備的2% (w/v)水包魚油乳液的蛋白質(zhì)和乳液 的特征，其用于在體外對抗瘤胃生物氨化。運(yùn)些乳液用或不用4-甲基兒茶酪(20mM)處理W 生成蛋白質(zhì)結(jié)合的苯酪絡(luò)合物從而獲得瘤胃通過產(chǎn)物
[0116]
[0117] 0[4,3]，體積加權(quán)平均直徑;0[3,2]，表面加權(quán)平均直徑;0[乂，0.5]，50%中值體積 分布直徑，運(yùn)意味著50%的樣本顯示液滴的直徑是所提到的值W下;D[v，0.9] ,90%體積分 布直徑，運(yùn)意味著90%的樣本顯示液滴的直徑在所提到的值W下;SSA，比表面積(mVg油） [011引實(shí)施例6
[0119] 使用來自紅Ξ葉草的富含PP0的蛋白質(zhì)提取物W及不同來源的二酪劑的水包亞麻 巧油乳液針對瘤胃降解體外保護(hù)
[0120] 材料和方法
[0121] 在前面的例子中，使用合成的PP0基質(zhì)4-甲基兒茶酪。然而，4-甲基兒茶酪是相當(dāng) 昂貴的，并且更廣泛可提供的和天然的基質(zhì)可W是優(yōu)選的。由于運(yùn)些原因，對各種(二)酪類 基質(zhì)進(jìn)行篩選。目前，將在農(nóng)業(yè)和食品工業(yè)的側(cè)線物流中存在的鑒定的二酪用于篩選試驗(yàn)， 其中PP0活性是用分光光度計(jì)監(jiān)測的。類似地，該測定被施用于篩選食品工業(yè)中使用的(二） 酪類添加劑，例如香蘭素、乙基香蘭素、下香酪、沒食子酸丙醋化310)、叔下基氨釀化319)。 還使用其他合成二酪如咖啡酸或綠原酸。選擇對PP0表現(xiàn)高親和力的（二)酪(與4-甲基兒茶 酪相比)并且體外評估其產(chǎn)生受保護(hù)乳液的潛力，如實(shí)施例1中所述。
[0122] 實(shí)施例7
[0123] 使用來自紅Ξ葉草的富含PP0的蛋白質(zhì)提取物W及4-甲基兒茶酪作為二酪劑的水 包亞麻巧油乳液針對瘤胃降解體外保護(hù)，其中移除乳液的連續(xù)相
[0124] 材料和方法
[0125] 乳液的制備和計(jì)算是與實(shí)施例1的情況可比的:再次使用紅Ξ葉草蛋白質(zhì)制備2% (w/v)水包亞麻巧油乳液，并將4-甲基兒茶酪(0，12.5，25或50mM)加入其中W生成針對瘤胃 降解的保護(hù)。溫育前，將乳液膽存在冰箱中或洗涂:該假說是保護(hù)是在乳液的界面產(chǎn)生的， 使得脂肪酸在受保護(hù)的核屯、內(nèi)使得瘤胃微生物和酶不能進(jìn)入從而不被降解，但是，不能排 除連續(xù)相對保護(hù)的影響。釀不僅可W在界面產(chǎn)生，而且釀和所得聚合物還可W在連續(xù)相中 形成，因?yàn)椴皇撬械牡鞍踪|(zhì)(包括PP0)都是吸附在油-水界面上。因此，在加入4-甲基兒茶 酪生成保護(hù)之后，通過離屯、除去連續(xù)相，將保留的剩余液滴取出并且通過劇烈搖動(dòng)重新溶 在水中（基于此，我們稱之為"洗涂過的乳液"）。運(yùn)個(gè)過程被執(zhí)行兩次，W確保除去連續(xù)相中 幾乎所有的釀和聚合物。
[0126]
[0127]圖7示出本實(shí)施例的結(jié)果。在新鮮的和洗涂過的乳液之間沒有觀察到C18:化-3生 物氨化的差異(對于在亞麻巧油中的C18:化-6和其他主要的PUFA也有類似的結(jié)果）。僅加入 最低量的4-甲基兒茶酪已導(dǎo)致生物氨化急劇下降，運(yùn)意味著觀察到針對瘤胃分解的大的保 護(hù)。新鮮的和洗涂過的乳液顯示出類似的液滴尺寸分布曲線，運(yùn)意味著再溶解后乳液保持 穩(wěn)定，并且原始新鮮的與洗涂過的乳液可W相比較(結(jié)果未示出）。根據(jù)圖7"洗涂過的"乳液 在加入4-甲基兒茶酪后示出與原始"新鮮的"乳液類似的生物氨化曲線，運(yùn)意味著在受保護(hù) 的乳液的連續(xù)相可W除去而不降低保護(hù)效率。因此，"壓載""（ballast)連續(xù)相可W容易地 通過離屯、分離除去，W得到濃縮的濕產(chǎn)品。證實(shí)了 W下假說:除去含有釀和蛋白質(zhì)-苯酪聚 合物的連續(xù)相對保護(hù)水平?jīng)]有影響。運(yùn)支持了保護(hù)發(fā)生在油-水界面的假說。
[012引實(shí)施例8
[0129]使用來自馬鈴馨塊莖皮的富含PP0的蛋白質(zhì)提取物W及4-甲基兒茶酪作為二酪劑 的富共輛亞油酸的水包油乳液針對瘤胃降解體內(nèi)保護(hù) [0。0] 材料和方法
[0131] W順序使用泌乳中期的八頭奶牛(產(chǎn)奶的第100至220天，活重562至712千克，最小 日產(chǎn)奶量20至25公斤）來測試的脂肪酸在體內(nèi)的保護(hù)和向牛奶的轉(zhuǎn)移。測試了兩個(gè)補(bǔ)充劑 實(shí)驗(yàn):首先，施用根據(jù)實(shí)施例1制備的受保護(hù)的脂肪酸乳液(n = 4)。該產(chǎn)品包括來自馬鈴馨 塊莖皮的蛋白質(zhì)提取物，將其進(jìn)一步用于乳化可商購的順-9,反-11和反-10,順-12共輛業(yè) 油酸的Ξ酷基甘油醋混合物(11 Oc 12-化A) (Tonal in? TG80，BASF-AG，路德維希港，德國）并 通過加入4-甲基兒茶酪產(chǎn)生蛋白質(zhì)-苯酪絡(luò)合物從而避免瘤胃降解。如實(shí)施例1中所述在體 外進(jìn)行評估tl0cl2 CLA的瘤胃通過程度，隨后開始體內(nèi)試驗(yàn)。第二，測試含有相同的脂肪酸 的甲醋混合物的市售瘤胃保護(hù)的產(chǎn)品作為陽性對照化utrell Combi，BASF-AG，路德維希 港，德國）（n = 4)。母牛接受運(yùn)兩種補(bǔ)充劑中任一個(gè)，W每頭牛每天7克tl0cl2-CLA的量施 用。
[0132] 所述tl0cl2-CLA是乳脂合成的有效抑制劑^7)，即使劑量限制在每天給藥5至lOg， 但只有當(dāng)將它轉(zhuǎn)移到乳腺才行，而其需要在小腸吸收W及針對瘤胃生物氨化的保護(hù)。事實(shí) 上，我們組之前的實(shí)驗(yàn)使用未受保護(hù)的tl0cl2-CLA補(bǔ)充劑(在反-10,順-12CLA的95%體外 生物氨化，使用在此所述的相同體外步驟<W)，未抑制乳脂的濃度。因此，監(jiān)測簡單的特征， 即牛奶中的脂肪含量，提供了瘤胃保護(hù)、瘤胃后吸收和向乳腺轉(zhuǎn)移的總體概念。此外，牛奶 tl0cl2-CLA分泌的記錄使得可W計(jì)算從飲食到牛奶中的tl0cl2-CLA的傳遞效率。將后者與 非保護(hù)補(bǔ)充劑的轉(zhuǎn)移效率進(jìn)行比較，可W給出瘤胃保護(hù)和腸吸收效率。膳食反-10,順- 12共輛亞油酸向牛奶的轉(zhuǎn)移效率當(dāng)施用此未保護(hù)補(bǔ)充劑時(shí)為1.5% (Fievez等人，未發(fā)表的 結(jié)果）。與例如富含C18:化-3的補(bǔ)充劑相比，運(yùn)種脂肪酸補(bǔ)充劑的選擇使得奶牛實(shí)驗(yàn)中只需 要引入少量就會(huì)有顯著反應(yīng)，前者通常需要W10至20倍更高的倍率補(bǔ)充才能得到C18:化-3 富集的牛奶。
[0133] 實(shí)驗(yàn)期間包括六個(gè)星期。前Ξ周用作適應(yīng)期，其間母牛適應(yīng)由自由采食粗飼料 (60%玉米青膽和40%草青膽），豆巧，Covasoy(高百分比的瘤胃保護(hù)的蛋白質(zhì)）和濃縮物組 成的基礎(chǔ)飲食滿足個(gè)性化需求，在整個(gè)實(shí)驗(yàn)期間飼喂該基礎(chǔ)飲食。在第四周，將奶進(jìn)行取樣 作為對照，之后在第五周連續(xù)五天為牛提供所測試產(chǎn)品，隨后立即在第六周連續(xù)五天洗出 (wash-out)。表7中給出了實(shí)驗(yàn)周期的概述。乳脂含量是通過傅里葉變換紅外分析(FTIR德 爾塔儀器德拉赫滕，荷蘭)測定的并且脂肪酸是如化rjong等人所述測定的^9)。乳脂表示為 每天生產(chǎn)牛奶的總質(zhì)量的百分比并且tl0cl2-CLA為g/100克所測得的脂肪酸。
[0134] 表7:體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中不同周間的實(shí)驗(yàn)處理概述
[0135]
[0側(cè)
[0137] 圖8顯示了 tl0cl2-CLA在乳脂中的比例結(jié)果。對照周取樣的牛奶示出非常低可W 忽略不計(jì)的tl0cl2-CLA水平。一旦奶牛開始得到含有受保護(hù)的tl0cl2-CLA的補(bǔ)充劑，就能 在牛奶中檢測出在運(yùn)個(gè)特殊脂肪酸的增加：當(dāng)供給Lutrell Combi時(shí)，濃度增加直至約 0.045g/100克檢測的脂肪酸，相比當(dāng)供給受保護(hù)的PK)乳液時(shí)，濃度增加直至0.030g/100克 檢測的脂肪酸。在我們之前實(shí)驗(yàn)中，未保護(hù)的tl0cl2-CLA補(bǔ)充劑，導(dǎo)致后面的脂肪酸在牛奶 中濃度為O.OlOg/100克檢測的脂肪酸(18)。在目前的實(shí)驗(yàn)中，對于Lu化ell Combi觀察到與 PP0乳液相比牛奶中tl0cl2-CLA的增加更快。在洗出期間，tl0cl2-CLA的濃度降低到可W忽 略不計(jì)。運(yùn)些結(jié)果表明，與受保護(hù)的PP0乳液相比，補(bǔ)充Lutrell Combi導(dǎo)致牛奶中tl0cl2- CLA水平更高。然而，與在當(dāng)前的實(shí)驗(yàn)中未補(bǔ)充對照期間的比較W及與補(bǔ)充未保護(hù)tl0cl2- 化A補(bǔ)充劑的比較對于Lutrell Combi和PP0產(chǎn)物兩者都顯示了在乳中tl0cl2-CLA比較明顯 的增加。
[0138] 圖9中顯示了 tl0cl2-CLA向牛奶的轉(zhuǎn)移效率。每天每頭牛提供7克膳食tl0cl2- CLA，其中高達(dá)5%被轉(zhuǎn)移到牛奶中（圖8)。之前已報(bào)道了受保護(hù)的CLA產(chǎn)品類似的轉(zhuǎn)移效率 (2.9<^、5.7(21)、4.8<22哺9.3< 23>%)。在我們之前的實(shí)驗(yàn)中，未保護(hù)的110(：12-〇^\補(bǔ)充，導(dǎo) 致1.5%的轉(zhuǎn)移效率(i8)dLu化ell Combi的轉(zhuǎn)移效率表現(xiàn)為一旦補(bǔ)充tl0cl2-化A的轉(zhuǎn)移效 率快速增加，而對于PP0乳液觀察到更平緩的增加。在補(bǔ)充周期結(jié)束時(shí)，PP0乳液的轉(zhuǎn)移效率 為通過Lu化ell Combi獲得的那些的65%左右。對于在PP0乳液的情況下延遲增加的可能解 釋是PP0產(chǎn)品的不同批次之間的差異，其中在一周開始時(shí)提供的批次與一周結(jié)束時(shí)供給的 批次相比示出較低的體外保護(hù)效率(圖9底部顯示的圖）。
[0139] 如de Veth等人建議的(i7)，tl0cl2-CLA是乳脂合成的強(qiáng)效抑制劑，如果運(yùn)種脂肪 酸足夠量被轉(zhuǎn)移到乳腺的話。因此，在補(bǔ)充后的牛奶中tl0cl2-CLA轉(zhuǎn)移效率和濃度的增加 應(yīng)當(dāng)反映在乳脂含量上。圖10顯示了乳脂百分率結(jié)果。事實(shí)上，一旦補(bǔ)充對于Lutrell Combi和PPO產(chǎn)品都觀察到小而顯著下降。與圖9中呈現(xiàn)的延遲的轉(zhuǎn)移效率相似，與Lu化ell Combi相比，對于PP0產(chǎn)物觀察到乳脂百分率延遲的減少。在洗出期間，觀察到乳脂百分率平 緩增加至原來的水平。
[0140] 最后，能夠確認(rèn)，對于所要求保護(hù)的PP0產(chǎn)物W及陽性對照Lutrell Combi兩者，月旨 肪酸針對瘤胃分解、后瘤胃吸收受到保護(hù)并轉(zhuǎn)移到乳腺，運(yùn)是因?yàn)橛^察到乳脂中tl0cl2- CLA濃度的增加，導(dǎo)致乳脂的濃度降低。
[0141] 實(shí)施例9
[0142] 使用來自紅Ξ葉草的富含PP0的蛋白質(zhì)提取物W及4-甲基兒茶酪作為二酪劑的水 包亞麻巧油乳液針對膽存期間的氧化進(jìn)行保護(hù)
[01創(chuàng)材料和方法
[0144] 在該實(shí)施例中，對具有或不具有紅Ξ葉草W及具有或不具有4-甲基兒茶酪的乳液 進(jìn)行處理，W造成氧化。制備了兩種乳液:一方面一種具有紅Ξ葉草蛋白質(zhì)提取物和2mg/ml 酪蛋白（RC+CAS)的乳液W及另一方面一種僅含有2mg/ml酪蛋白（CAS)的乳液。每升乳化Ξ 十g的亞麻巧油。
[0145] 用SPME-GC/MS(固相微萃取-氣相色譜/質(zhì)譜法）測定不飽和脂肪酸的氧化過程中 形成的揮發(fā)組分。分析基于Jelena等人所述的方法。W將揮發(fā)物使用碳分子篩(carboxen)- 聚二甲基硅氧烷(CAR/PDMS)纖維(85皿厚）（5啡61(3〇,86116的11*6，賓夕法尼亞州，美國）從 乳液的頂空萃取。為此，將3g乳液放入10ml小瓶中，在加熱塊中在35°C下溫育45分鐘。使用 偶接到質(zhì)量選擇檢測器(Agilent model 5973，Agilent Technologies,迪更，比利時(shí)）的氣 相色譜儀(Agilent model 6890N)分析萃取的揮發(fā)物。將化合物在HP-5柱(30mX250皿)<化 m，5 %苯基甲基硅氧烷，Agi lent Technologies，迪更，比利時(shí)）上進(jìn)行解析，入口溫度280 °C。氨氣流為l.lml/min，升溫程序如下:40°C保持3分鐘；W8°C/min升高至280°C。在相同的 條件運(yùn)行正構(gòu)燒控來計(jì)算化合物的科法茲化ovats)指數(shù)化I)值?？蒞通過將質(zhì)譜與包含在 NIST05質(zhì)譜庫中的那些圖比較，并且通過將KI值與Jelen等人報(bào)道的那些值比較來鑒定化 合物。樣品分析兩遍，并且將所關(guān)注的主要揮發(fā)性氧化產(chǎn)物結(jié)果W任意面積單位 (AAUx1〇6)提供。
[0146] 使用SAS(SAS Ente;rp;rise Guide 5.1，SAS Institute Inc.，卡里，北卡羅來納 少Η，美國）的MIX抓程序分析所有結(jié)果。統(tǒng)計(jì)分析之前，將重復(fù)實(shí)驗(yàn)取平均值。因此，設(shè)計(jì)沒有 允許所有相互作用的評估，但確實(shí)允許評估所有(n-1)方式相互作用(其中η為所測試的因 子數(shù)）。使用了 W下統(tǒng)計(jì)模型:Yi j = y+Pi+D j+Sk+Pi X D j+Sk X D j+ε i j，其中Pi蛋白質(zhì)的影響 (i =紅Ξ葉草提取物，具有額外的酪蛋白（RC+CAS)或僅酪蛋白（CAS))，Dj乳液中二酪濃度 的影響（j = 0或20mM 4-甲基兒茶酪)和Sk儲(chǔ)存時(shí)間的影響化=1、2、4或6天）。相互作用影響 Pi X Sk被排除在模式外，因?yàn)樵撚绊懕蛔C明在每種情況下都不顯著。所有提及的差異指定 在0.05顯著性水平并使用化k巧多重比較測試評價(jià)最小二乘法之間的差異。
[0147] ^
[0148] SPME-GC/MS結(jié)果給出了形成的氧化產(chǎn)物的詳細(xì)圖像。暴露于氧化條件下1、2、4和6 天后乳液的SPME-GC/MS結(jié)果，與在不同存儲(chǔ)時(shí)間點(diǎn)的平均值一起，示出脂肪氧化的主要最 終產(chǎn)物的詳細(xì)圖像，在表8中給出。一般來說，一旦加入4-MC，RC+CAS乳液中所有的揮發(fā)性氧 化產(chǎn)物都明顯降低。與只含酪蛋白的乳液相比，具有RC提取物的乳液己醒值均相對更高。觀 察到CAS乳液和具有4-MC的CAS乳液之間的2-戊締醒和3，5-辛二締-2-酬有顯著差異，運(yùn)可 能暗示4-MC的抗氧化作用。值得注意的是，只有在后一種情況下，不具有紅立葉草提取物 時(shí)，檢測到3-甲基苯酪。值得注意的是，在含有4-甲基兒茶酪的RC+CAS乳液沒有發(fā)現(xiàn)該化合 物，但僅在含有4-甲基兒茶酪的乳液中發(fā)現(xiàn)。運(yùn)可能表明，4-甲基兒茶酪在紅Ξ葉草乳液消 失，最可能是由于通過PPO造成的蛋白質(zhì)-苯酪絡(luò)合物的形成。4-甲基兒茶酪不再W游離形 式呈現(xiàn)運(yùn)一事實(shí)，可能是4-甲基兒茶酪與其他分子如蛋白質(zhì)結(jié)合從而導(dǎo)致降低的氧化的證 據(jù)。
[0149] 表8:富含PUFA的乳液中的主要揮發(fā)性化合物（表示為任意面積單位*106)，用 SPME-GC/MS測量，通常在50°C下經(jīng)過1、2、4或6天增力日，但是當(dāng)加入4-甲基兒茶酪時(shí)降低。乳 液是用紅Ξ葉草蛋白質(zhì)提取物和2g/l的酪蛋白（RC+CAS)或僅用2g/l的酪蛋白（CAS)制成 的，存在或不存在20mmol 4-甲基兒茶酪并且含有30g/l的亞麻子油，在25M化下5次通過微 流化床器
[0150]
[0151]
[0152]
[0153] 4-MC，4-甲基兒茶酪;RC，紅Ξ葉草;CAS，酪蛋白；SEM，平均值的標(biāo)準(zhǔn)誤差;NS，p > 0.10時(shí)的非顯著
[0154] a，b，e，嗦示列中處理方法之間的差異為p《〇.〇5
[0K5] *如果雙方式(two-way)因子二酪X膽儲(chǔ)時(shí)間不顯著，將其從模型中省略
[0156] 實(shí)施例10
[0157] 使用來自馬鈴馨塊莖皮的富含PP0的蛋白質(zhì)提取物W及4-甲基兒茶酪作為二酪劑 的含有α-生育酪的水包油乳液的膽存期間針對攝食前氧化進(jìn)行保護(hù)
[015引材料和方法
[0159] 測試了含有α-生育酪(維生素 Ε)的乳液是否可W在儲(chǔ)存期間經(jīng)受攝食前氧化。因 此，如實(shí)施例1所述制備了含有1.8%的具有高濃度的反-10,順-9-共輛亞油酸作為Ξ酷基 甘油醋(Tonalin? TG80，BASF-AG，路德維希港，德國）的油和0.2%維生素 Ε(Τ3251，（ ± )-α- 生育酪的乳液，Sigma-Aldrich，迪更，比利時(shí)）的乳液。所制備的乳液的4-甲基兒茶酪的最 終濃度為0和20mM。為了誘導(dǎo)氧化，將乳液放在搖床在通風(fēng)烘箱中在50°C下約16h，隨后進(jìn)行 維生素 E分析。結(jié)果表示為yg維生素 E/ml乳液。
[0160] 1^
[0161] 結(jié)果列于表9中。無論是否存在4-甲基兒茶酪都觀察到了維生素 E的降低。然而，如 果4-甲基兒茶酪存在于乳液中，運(yùn)種減少相當(dāng)?shù)汀Ｍ瑫r(shí)，在運(yùn)些乳液中的脂肪酸也針對體外 瘤胃生物氨化受到保護(hù)(77.5%的保護(hù)效率）。另外，在沒有4-甲基兒茶酪的乳液中維生素 E 可W很容易地使用溫和的己燒萃取分離，而當(dāng)4-甲基兒茶酪存在的情況下就不一樣了，指 明維生素 E是確實(shí)存在于乳液內(nèi)（而不是在連續(xù)相中，如在不含4-甲基兒茶酪的乳液中那 樣）。總之，運(yùn)表明，維生素 E在用富含PP0馬鈴馨塊莖果皮生成的且用4-甲基兒茶酪處理的 乳液中針對膽存期間攝食前損傷受到保護(hù)。
[0162] 表9:對于含有1.8%的Tonalin? TG80油、0.2%的α生育酪和OmM 4-甲基兒茶酪的 乳液(使用馬鈴馨塊莖皮蛋白質(zhì)提取物制備)在50°C下誘導(dǎo)氧化16小時(shí)后觀察到α-生育酪 的氧化，但當(dāng)乳液中存在20mM 4-甲基兒茶酪時(shí)氧化減少(η = 2)
[0163]
[0164] 參考文獻(xiàn)
[01 化]1 .Scott TW，Cook LJ&Mills SC(1971)Protection of Dietary Polyunsaturated Fatty Acids Against Microbial Hydrogenation in 民uminants.Journal of the American Oil Chemists Society 48,358-&.
[0166] 2.Jenkins TC&Bridges WC(2007)Protection of fatty acids against ruminal biohydrogenation in cattle.Eur J Lipid Sci Techno1 109,778-89.
[0167] 3.Kitessa SM，加 lati SK，Simos GC，Ashes JR，Scott TW，F(xiàn)leck E&Wynn PC (2004)Supplementation of grazing dairy cows with rumen-protected tuna oil enriches milk fat with n-3 fatty acids without affecting milk production or sensory ch過r過cteristics.Br J Nutr 91，271一7.
[0168] 4.Sterk A'Vlaeminck B，van Vuuren AM'Hendriks WH&Dijkstra J(2012) Effects of feeding different linseed sources on omasal fatty acid flows and fatty acid profiles of plasma and milk fat in lactating dairy cows.J Dairy Sci 95,3149-65.
[0169] 5.Robinson PH.Swanepoel N,ShinzatoI&Juchem SO(2011)Productive responses of lactating dairy cattle to supplementing high levels of ruminally protected lysine using a rumen protection technology.Animal Feed Science and Technology 168,30-41.
[0170] 6.Dehkordi SK'Vlaeminck B'Hostens M'Opsomer G&Fievez V(2008)In vitro rumen biohydrogenation of trans-10，cis-12conjugated linoleic acid in a lipid- encapsulated(LE-CLA)supplement incorporated or not in a processing pellet.Commun Agric Appl Biol Sci 73,119-22.
[0171] 7.Van Ranst G,Lee MRF&Fievez V(2011)Red clover polyPhenol oxidase and lipid metabolism.Animal 5,512-21.
[0172] 8-Van Ranst G'Fievez V，De Riek J&Van Bockstaele E(2009)Influence of ensiling forages at different dry matters and silage additives on lipid metabolism and fatty acid composition.Anim Feed Sci Techno1 150,62-74.
[0173] 9.Jelen HH，Mildner-Szkudlarz S，Jasinska I&Wasowicz E(2007)A headspace-SPME-MS method for monitoring rapeseed oil autoxidation.J Am Oil Qiem Soc 84,509-17.
[0174] lO.Hassim HA，Lourenco M，Goel G，Vlaeminck B，Goh YM&Fievez V(2010) Effect of different inclusion levels of oil palm fronds on in vitro rumen fermentation pattern,fatty acid metabolism and apparent biohydrogenation of linoleic and linolenic acid.Anim Feed Sci Techno1 162,155-8.
[0175] 11.Castro-Montoya J，De Campeneere S，Van Ranst G&Fievez V(2012) Interactiohs between methane mitigation additives and basal substrates on in vitro methane and VFA production.Anim Feed Sci Techno1 176,47-60.
[0176] 12.Winters AL&Minchin FR(2005)Modification of the LowiT assay to measure proteins and phenols in covalently bound complexes.Analytical Biochemistry 346,43-8.
[0177] 13.Tomas A，Paquet D，Courthaudon JL&Lorient D(1994)Effect of Fat and Protein Contents on Droplet Size 過nd Surface Protein Coverage in Dairy Emulsions.Journal of Dairy Science 77,413-7.
[0178] 14.Dickinson E(1999)Adsorbed protein layers at fluid interfaces： inter過ctions，structure 過nd surf過ce rheology.Colloids Surf，B 15,161-76.
[01"79] 15.Arias E，Gonzalez J，Peiro JM，0ria R&Lopez-Buesa P(2007)Browning prevention by ascorbic acid and 4-hexylresorcinol：Different mechanisms of action on polyphenol oxidase in the presence and in the absence of substrates.J Food Sci 72,464-70.
[0180] 16.Maia MRG，Chaudha巧 LC，F(xiàn)igueres L&Wallace RJ(2007)Metabolism of polyunsaturated fatty acids and their toxicity to the microflora of the rumen.Anton Leeuw Int J G 91,303-14.
[0181] 17.de Veth MJ，Gulati SK，Luchini ND&Bauman DE(2005)Comparison of calcium salts and formaldehyde-protected conjugated linoleic acid in inducing milk fat depression.Journal of Dairy Science 88,1685-93.
[0182] 18.Dehkordi，S.K.，Vlaeminck，B.，Hostens，M.，0psomer，G.&Fievez，V.2008. In vitro rumen biohydrogenation of trans-lO，cis-12conjugated linoleic acid in a 1 ipid-encapsulated(LE-CLA)supplement incorporated or not in a processing pellet.Communications in Agricultural and Applied Biological Sciences,73(1), 119-123.
[0183] 19.Jorjong S，van Knegsel ATM，Verwaeren J，Lahoz MV，Bruckmaier RM，De Baets B，Kemp B&Fievez V(2014)Milk fatty acids as possible biomarkers to early diagnose elevated concentrations of blood plasma nonesterified fatty acids in dairy cows.Journal of Dairy Science 97,7054-64.
[0184] 20.de Veth，M.J.，van Straalen，W.，Koch，W.，Keller，T.，Hayler，R.，Pfeiffer， A.-M.,2005.Effect of CLA dose on milk production in early lactation dairy cows.J.Daiiy Sci.88，Suppl.1,220·
[0185] 21 · Cast地eda-Guti自rrez，E.，de Veth'M. J.，Lock，A.L.，Dwyer，D. A. 'Mui^phy， K.D.，Bauman，D.E.，2007.Effect of supplementation with calcium salts of fish oil on n-3fatty acids in milk fat.J.Dairy Sci.90,4149-4156.
[0186] 22 · Schwarz，F(xiàn) · J ·，Lierman，T ·，M替冰姊J ·，Pfeiffer，A ·-M.，Jahreis，G ·， 2009.Performance.metabolic parameters and fatty acid composition of milk fat due to dietary CLA and rumen protected fat of dairy cows.Book of abstracts No.15of the 60th annual meeting of the European Association for Animal Production，24_27August 2009'Barcelona，Spain，351·
[0187] 23.Moallem，U.，Lehrer，H.，Zachut，M.，Livhitz，L.，and Yacoby， S.2010.Production performance and pattern of milk fat depression of high- yielding dairy cows supplemented with encapsulated linoleic acid.Animal 4， 641-652.
[0188] 24.Pastsart U，De Boever M，Claeys E&De Smet S(2013)Effect of muscle and post-mortem rate of pH and temperature fall on antioxidant enzyme activities in beef.Meat Science 93,681-6.
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種保護(hù)親脂性營養(yǎng)物免于瘤胃降解的方法，所述方法包括： -制備乳化蛋白質(zhì)的溶液，其中所述蛋白質(zhì)的一部分具有多酚氧化酶活性， -將所述親脂性營養(yǎng)物加入至所述乳化蛋白質(zhì)的溶液， -將所述親脂性營養(yǎng)物在所述蛋白質(zhì)的溶液中乳化，以獲得穩(wěn)定的水包油乳液，以及 -在分子氧的存在下將一定量的二酚加入至所述乳液， 其中所述乳化蛋白質(zhì)提取自選自以下物種的清單的植物或其部分：馬鈴薯（Solanum tuberosum)、番前（Solanum lycopersicum)、洋薊（Cynara scolymus)、菠菜（Spinacia 〇16瓜〇6&)和蕓苔屬(1^^88；[〇&)物種。2. 根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中在獲得所述穩(wěn)定的水包油乳液之前將所述二酚加入。3. 根據(jù)權(quán)利要求1-2的方法，其中所述植物或其部分為馬鈴薯塊莖皮，番茄植物莖和/ 或葉，花椰菜莖、葉和小花以及菠菜葉。4. 根據(jù)權(quán)利要求1-3的方法，其中所述親脂性營養(yǎng)物為油或者為脂溶性維生素。5. 根據(jù)權(quán)利要求4的方法，其中所述油是包含多不飽和脂肪酸的油，或者其中所述維生 素是維生素 A、維生素 D或維生素 E。6. 根據(jù)權(quán)利要求5的方法，其中所述包含多不飽和脂肪酸的油是亞麻籽油、魚油或包含 含有共輒亞油酸的甘油酯的油。7. 根據(jù)權(quán)利要求1-6的方法，其中所述二酚是4-甲基兒茶酚。8. 根據(jù)權(quán)利要求1-7的方法，其中所述二酚的量最少為0.25mmol/m2在所述水包油乳液 內(nèi)的液滴的界面表面積。9. 根據(jù)權(quán)利要求1-8的方法，所述方法保護(hù)親脂性營養(yǎng)物免于由于氧化導(dǎo)致的變質(zhì)。10. 根據(jù)權(quán)利要求1-9的方法，其中不應(yīng)當(dāng)用酪蛋白或者任何其他當(dāng)吸附至油水界面時(shí) 與多酚氧化酶競爭的蛋白質(zhì)補(bǔ)充所述乳化蛋白質(zhì)的溶液。11. 一種乳液，所述乳液包含可根據(jù)權(quán)利要求1-10的方法獲得的由二酚保護(hù)的親脂性 營養(yǎng)物。12. -種飼料，所述飼料包含根據(jù)權(quán)利要求11的乳液。13. 根據(jù)權(quán)利要求11的乳液或根據(jù)權(quán)利要求12的飼料的用途，用于當(dāng)與未用所述乳液 或飼料喂食的動(dòng)物中得到的量相比時(shí)，增加在反芻動(dòng)物或反芻動(dòng)物產(chǎn)品中的親脂性營養(yǎng)物 的總量。
【文檔編號】A23K20/174GK106028830SQ201480075985
【公開日】2016年10月12日
【申請日】2014年12月18日
【發(fā)明人】費(fèi)爾勒·菲耶韋, 弗雷德里克·加德耶涅, 海斯·范蘭斯特
【申請人】根特大學(xué)