一種具有抗氧化活性的大竹蟶多肽?鈣螯合物的制備方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種具有抗氧化活性的大竹蟶多肽?鈣螯合物的制備方法，包括以下步驟：1）大竹蟶樣品處理；2）大竹蟶組織勻漿液酶解；3）大竹蟶多肽與氯化鈣進(jìn)行螯合反應(yīng)；4）大竹蟶多肽鈣螯合反應(yīng)液的醇析。本發(fā)明可提高大竹蟶產(chǎn)業(yè)的商品附加值，制得的大竹蟶多肽鈣螯合物，通過巴比妥酸法證明具有明顯的抗氧化活性，在食品、醫(yī)藥領(lǐng)域具有巨大的應(yīng)用前景。
【專利說明】
一種具有抗氧化活性的大竹蟶多肽-鈣螯合物的制備方法
技術(shù)領(lǐng)域
[0001]本發(fā)明涉及海產(chǎn)品深加工技術(shù)領(lǐng)域，特別是涉及一種具有抗氧化活性的大竹蟶多肽-鈣螯合物的制備方法。
【背景技術(shù)】
[0002]鈣離子是機(jī)體內(nèi)各項(xiàng)生命活動(dòng)不可缺少的一種物質(zhì)。它對(duì)于維持生物細(xì)胞膜兩側(cè)的生物電位，維持正常的神經(jīng)傳導(dǎo)功能，維持正常的肌肉伸縮及舒張功能以及神經(jīng)肌肉傳導(dǎo)功能等都具有非常重要的作用，
[0003]由于我國的膳食結(jié)構(gòu)以植食性為主，難以攝入足夠的易被人體吸收的鈣，而含鈣量較多的奶和奶制品的攝入量較少，致使中國人普遍缺鈣，是全球居民缺鈣的首要國家。許多在售的鈣制劑，主要有無機(jī)鈣和有機(jī)鈣，無機(jī)鈣制劑含鈣量高但人體對(duì)其吸收難，營養(yǎng)價(jià)值利用率不高且易在腎臟內(nèi)沉積，當(dāng)今市場上銷售較好的有機(jī)鈣在人體內(nèi)溶解性較好吸收率高但也有一定的毒副作用，如檸檬酸鈣易導(dǎo)致頭痛和便秘，醋酸鈣易引起腹瀉，葡萄糖鈣能導(dǎo)致尚血壓等。
[0004]大竹蟶廣泛生長于我國沿海各省份，是一種大規(guī)模養(yǎng)殖的海產(chǎn)品。目前大竹蟶的產(chǎn)業(yè)鏈比較短，大多數(shù)產(chǎn)品直接應(yīng)用于餐飲行業(yè)，對(duì)其深加工有助于增長產(chǎn)業(yè)鏈，提高商品增加值。大竹蟶肉嫩而肥，蛋白質(zhì)含量高，是制備多肽鈣螯合物的一種理想蛋白源。
[0005]目前對(duì)多肽鈣金屬螯合物的研究主要集中于制備工藝方面，但在螯合反應(yīng)結(jié)束后多肽鈣螯合物的分離部分都有很大缺陷。例如，(I)申請(qǐng)公布號(hào)CN102429236A，申請(qǐng)公布日2012.05.02的中國專利公開了一種豬骨膠原多肽鈣螯合物補(bǔ)鈣劑的制備方法；(2)申請(qǐng)公布號(hào)0附0287612^，申請(qǐng)公布日2013.01.16的中國專利公開了一種海洋骨膠原肽鈣螯合物生物補(bǔ)鈣劑的制備方法。這兩專利在多肽鈣螯合產(chǎn)物分離部分都直接用一次乙醇進(jìn)行醇析，然后得到的沉淀就認(rèn)為是多肽鈣螯合物。這其中有不足之處:(I)只進(jìn)行一次醇析，沉淀中難免會(huì)殘留有部分未反應(yīng)的鈣離子離子；(2)由于多肽與鈣離子螯合過程中，鈣離子與大竹蟶多肽以外的物質(zhì)很容易形成不溶于水的沉淀，反應(yīng)液直接醇析時(shí)這些沉淀會(huì)混入多肽鈣產(chǎn)物中，造成產(chǎn)物純度下降。另外，多肽鈣螯合物除了具有補(bǔ)鈣的功效外，還具有一些生物活性，對(duì)于多肽鈣的螯合物的生物活性研究較少，以上發(fā)明專利均為對(duì)制備的多肽鈣螯合物的抗氧化活性進(jìn)行研究。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]發(fā)明目的:本發(fā)明的所要解決的技術(shù)問題是提供了一種具有抗氧化活性的大竹蟶多肽-鈣螯合物的制備方法。
[0007]技術(shù)方案:為了解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明提供了一種具有抗氧化活性的大竹蟶多肽-鈣螯合物的制備方法，包括以下步驟:
[0008]I)大竹蟶樣品處理:大竹蟶去殼后剔除雜物后稱重，然后與去離子水按5?1: l(w/V)混合，用組織勻漿器將大竹蟶組織研磨勻漿得到大竹蟶組織勻漿液；
[0009]2)大竹蟶組織勻漿液酶解:在40?50°C的恒溫水浴中調(diào)節(jié)大竹蟶組織勻漿液的pH，在大竹蟶組織勻漿液中加I?2%大竹蟶組織勻漿液重量的復(fù)合酶進(jìn)行酶解，在沸水中滅酶5?10分鐘，離心，取離心上清液冷凍干燥，制得大竹蟶多肽凍干粉粗品；
[0010]3)大竹蟶多肽與氯化鈣進(jìn)行螯合反應(yīng):將大竹蟶多肽凍干粉粗品配制成10?30mg/ml的大竹経多肽溶液，在30?50 °C的恒溫水浴中調(diào)節(jié)大竹経多肽溶液pH，加入無水氯化鈣后攪拌反應(yīng)30?60分鐘得到反應(yīng)液；
[0011]4)大竹蟶多肽鈣螯合反應(yīng)液的醇析:螯合反應(yīng)結(jié)束后對(duì)反應(yīng)液進(jìn)行處理，加入乙醇進(jìn)行醇析，離心后取沉淀，反復(fù)經(jīng)過3?5次醇析，用鈣試劑檢測上清液鈣離子，待無顏色反應(yīng)后進(jìn)行冷凍干燥制得大竹蟶多肽-鈣螯合物。
[0012]上述方法中，上述步驟2)調(diào)節(jié)大竹蟶組織勻漿液的pH為6.0?8.0，酶解時(shí)間為5?8小時(shí)。酶解過程中適當(dāng)?shù)拿附鈖H和酶解時(shí)間有利于多肽產(chǎn)率的提高，進(jìn)而提升多肽鈣產(chǎn)品的得率。
[0013]上述方法中，上述步驟2)中加入復(fù)合酶為質(zhì)量比為1:1?2:1的木瓜蛋白酶和風(fēng)味蛋白酶。復(fù)合酶解法比單一酶解法制得的多肽更加高效。
[0014]上述方法中，上述步驟3)調(diào)節(jié)大竹蟶多肽溶液的pH為4?8，加入氯化鈣中的鈣離子與大竹蟶多肽的質(zhì)量比為4:1?1:1。適合的反應(yīng)體系pH和鈣離子與多肽的質(zhì)量比有助于提升螯合反應(yīng)多肽鈣產(chǎn)物的得率。
[0015]上述方法中，上述步驟4)中對(duì)反應(yīng)液的處理為5000?1000rpm離心處理。醇析前對(duì)反應(yīng)液進(jìn)行離心處理，可將反應(yīng)過程中的不溶于水的副產(chǎn)物沉淀去除，增大樣品的純度。
[0016]上述方法中，上述步驟4)中所述的加入乙醇的體積最終占總醇析體系體積的70%?90%。適合的乙醇溶液含量能夠更有效洗滌去除多肽鈣產(chǎn)物中的游離鈣離子。
[0017]本發(fā)明復(fù)合酶解制得的大竹蟶多肽和其螯合鈣離子后制備的多肽鈣螯合物具有明顯的抗氧化活性，值得注意的是多肽鈣螯合物的抗氧化活性比多肽有了明顯的提升。
[0018]有益效果:與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)為:
[0019](I)在大竹蟶組織酶解過程中，采用了一定比例的木瓜蛋白酶和風(fēng)味蛋白酶混合而成的復(fù)合酶，并且對(duì)酶解時(shí)間和酶解體系PH的工藝條件進(jìn)行了優(yōu)化，從而提高大竹蟶多肽的得率。
[0020](2)在大竹蟶多肽與鈣離子的反應(yīng)過程中，優(yōu)化反應(yīng)pH和鈣離子與多肽的質(zhì)量比工藝條件，從而提高了反應(yīng)的螯合率和多肽鈣螯合物的得率，最大反應(yīng)螯合率可達(dá)43.1%,多肽鈣螯合物得率可達(dá)32.5%。
[0021](3)對(duì)大竹蟶多肽與鈣離子的螯合反應(yīng)液進(jìn)行離心，以及采用適當(dāng)比例的乙醇溶液對(duì)多肽鈣產(chǎn)物進(jìn)行醇析和洗滌可以提高多肽鈣產(chǎn)品的分離效率及多肽鈣產(chǎn)品的純度。
[0022](4)制備出的大竹蟶多肽以及多肽鈣螯合物都具有明顯的抗氧化活性，其中多肽鈣螯合物的抗氧化相比多肽有明顯提升，大竹蟶多肽鈣螯合物的抗氧化活性可達(dá)α-生育酚的 73.5%。
【具體實(shí)施方式】
[0023]本發(fā)明主要通過巴比妥酸法檢測各種多肽及其鈣螯合物的抗氧化活性，利用EDTA絡(luò)合滴定法檢測螯合反應(yīng)的螯合率。下面通過具體實(shí)施例，對(duì)本發(fā)明的技術(shù)方案作進(jìn)一步的具體說明。
[0024]實(shí)施例1
[0025]I)大竹蟶樣品處理:將大竹蟶清洗干凈，去殼后剔除雜物，將大竹蟶的肉體組織淋去多余水分后稱取125g，然后與去離子水按4: l(w/v)混合，用組織勻漿器將大竹蟶組織研磨勻漿得到大竹蟶組織勻漿液；
[0026]2)大竹蟶組織勻漿液酶解:在45°C的恒溫水浴中調(diào)節(jié)勻漿液的pH至6.0，在勻漿液中加I %大竹蟶組織重量的復(fù)合酶進(jìn)行酶解，復(fù)合酶由質(zhì)量比為I: I的木瓜蛋白酶和風(fēng)味蛋白酶組成。酶解5小時(shí)后在沸水中滅酶10分鐘，5000rpm離心后取上清液冷凍干燥，制得大竹経多肽凍干粉粗品，稱取多肽凍干粉重量；
[0027]3)大竹蟶多肽與氯化鈣進(jìn)行螯合反應(yīng):將大竹蟶多肽凍干粉粗品配制成10mg/ml的大竹蟶多肽溶液，在30 °C的恒溫水浴中將50ml濃度為I Omg/ml的大竹蟶多肽溶液調(diào)pH至7.5，加入0.18g的無水氯化鈣(多肽與鈣離子的質(zhì)量比為1:1)，在恒溫磁力攪拌裝置中攪拌反應(yīng)40分鐘；
[0028]4)大竹蟶多肽鈣螯合反應(yīng)液的醇析:螯合結(jié)束后將反應(yīng)液在5000rpm下離心，取上清液，在上清液中加入占總醇析體系總體積70 %的無水乙醇進(jìn)行醇析，5000rpm下離心后取沉淀，用鈣試劑檢測上清液中鈣離子，反復(fù)經(jīng)過5次醇析，待無顏色反應(yīng)后進(jìn)行冷凍干燥，干燥完畢后稱重；
[0029]5)用EDTA絡(luò)合滴定法和巴比妥酸法分別測定多肽螯合物的螯合率和抗氧化活性。測得本實(shí)施例中一種多肽對(duì)鈣離子螯合率達(dá)43.1%，制備的多肽鈣螯合物得率達(dá)32.5%，50mg大竹蟶多肽鈣螯合物的抗氧化活性相當(dāng)于50yLa-生育酚的73.5%。
[0030]實(shí)施例2
[0031](I)大竹蟶樣品處理:將大竹蟶清洗干凈，去殼后剔除雜物，將大竹蟶的肉體組織淋去多余水分后稱取98g，然后與去離子水按3: l(w/v)混合，用組織勻漿器將大竹蟶組織研磨勻漿得到大竹蟶組織勻漿液。
[0032](2)大竹蟶組織勻漿液酶解:在50°C的恒溫水浴中調(diào)節(jié)大竹蟶組織勻漿液的pH至8.0，在勻漿液中加1%大竹蟶組織重量的復(fù)合酶進(jìn)行酶解，復(fù)合酶由質(zhì)量比為1:1的木瓜蛋白酶和風(fēng)味蛋白酶組成。酶解5小時(shí)后在沸水中滅酶10分鐘，5000rpm離心后取上清液冷凍干燥，制得大竹経多肽凍干粉粗品，稱取多肽凍干粉重量。
[0033](3)大竹蟶多肽與氯化鈣進(jìn)行螯合反應(yīng):將大竹蟶多肽凍干粉粗品配制成30mg/ml的大竹蟶多肽溶液，在50°C的恒溫水浴中將50ml濃度為30mg/ml的大竹蟶多肽溶液調(diào)pH至6.0，加入1.62g的無水氯化鈣(多肽與鈣離子的質(zhì)量比為1:3)，在恒溫磁力攪拌裝置中攪拌反應(yīng)50分鐘。
[0034](4)大竹蟶多肽鈣螯合反應(yīng)液的醇析:螯合結(jié)束后將反應(yīng)液在5000rpm下離心，取上清液，在上清液中加入占總醇析體系總體積90%的無水乙醇進(jìn)行醇析，5000rpm下離心后取沉淀，用鈣試劑檢測上清液中鈣離子，反復(fù)經(jīng)過3次醇析，待無顏色反應(yīng)后進(jìn)行冷凍干燥，干燥完畢后稱重。
[0035](5)用EDTA絡(luò)合滴定法和巴比妥酸法分別測定多肽螯合物的螯合率和抗氧化活性。測得本實(shí)施例中一種多肽對(duì)鈣離子螯合率達(dá)29.3%，制備的多肽鈣螯合物得率達(dá)22.7%, 50mg大竹蟶多肽鈣螯合物的抗氧化活性相當(dāng)于50yLa-生育酚的68.9 %。
[0036]實(shí)施例3
[0037](I)大竹蟶樣品處理:將大竹蟶清洗干凈，去殼后剔除雜物，將大竹蟶的肉體組織淋去多余水分后稱取156g，然后與去離子水按1: l(w/v)混合，用組織勻漿器將大竹蟶組織研磨勻漿得到大竹蟶組織勻漿液。
[0038](2)大竹蟶組織勻漿液酶解:在40°C的恒溫水浴中調(diào)節(jié)大竹蟶組織勻漿液的pH至7.0，在勻漿液中加2%大竹蟶組織重量的木瓜蛋白酶進(jìn)行酶解，酶解7小時(shí)后在沸水中滅酶10分鐘，5000rpm離心后取離心上清液冷凍干燥，制得大竹蟶多肽凍干粉粗品，稱取多肽凍干粉重量。
[0039](3)大竹蟶多肽與氯化鈣進(jìn)行螯合反應(yīng):將多肽凍干粉配制成20mg/ml的大竹蟶多肽溶液，在50°C的恒溫水浴中取50ml濃度為20mg/ml的大竹蟶多肽溶液調(diào)pH至5.0，加入
0.72g無水氯化鈣(多肽與鈣離子的質(zhì)量比為1: 2)，在恒溫磁力攪拌裝置中攪拌反應(yīng)60分鐘。
[0040](4)大竹蟶多肽鈣螯合反應(yīng)液的醇析:螯合結(jié)束后將反應(yīng)液在5000rpm下離心，取上清液，在上清液中加入占總醇析體系總體積80%的無水乙醇進(jìn)行醇析，5000rpm下離心后取沉淀，用鈣試劑檢測上清液中鈣離子，反復(fù)經(jīng)過5次醇析，待無顏色反應(yīng)后進(jìn)行冷凍干燥，干燥完畢后稱重。
[0041](5)用EDTA絡(luò)合滴定法和巴比妥酸法分別測定多肽螯合物的螯合率和抗氧化活性。測得本實(shí)施例中一種多肽對(duì)鈣離子螯合率達(dá)35.2%，制備的多肽鈣螯合物得率達(dá)26.5%，5011^大竹蟶多肽鈣螯合物的抗氧化活性相當(dāng)于5(^1^-生育酚的70.2%。
[0042]實(shí)施例4
[0043](I)大竹蟶樣品處理:將大竹蟶清洗干凈，去殼后剔除雜物，將大竹蟶的肉體組織淋去多余水分后稱取103g，然后與去離子水按2: l(w/v)混合，用組織勻漿器將大竹蟶組織研磨勻漿得到大竹蟶組織勻漿液。
[0044](2)大竹蟶組織勻漿液酶解:在45°C的恒溫水浴中調(diào)節(jié)大竹蟶組織勻漿液的pH至6.0，在勻漿液中加1.5%大竹蟶組織重量的復(fù)合酶進(jìn)行酶解，在沸水中滅酶5分鐘，離心，取尚心上清液冷凍干燥，制得大竹経多肽凍干粉粗品，稱取多肽凍干粉重量。
[0045](3)大竹蟶多肽與氯化鈣進(jìn)行螯合反應(yīng):將大竹蟶多肽凍干粉粗品配制成20mg/ml的大竹蟶多肽溶液，在30°C的恒溫水浴中將50ml濃度為20mg/ml的大竹蟶多肽溶液調(diào)pH至7.5，加入0.18g的無水氯化鈣(多肽與鈣離子的質(zhì)量比為1:1)，在恒溫磁力攪拌裝置中攪拌反應(yīng)40分鐘。
[0046](4)大竹蟶多肽鈣螯合反應(yīng)液的醇析:螯合結(jié)束后往反應(yīng)液加入占總醇析體系總體積85%的無水乙醇進(jìn)行醇析，7500rpm下離心后取沉淀，冷凍干燥后稱重。
[0047](5)用EDTA絡(luò)合滴定法和巴比妥酸法分別測定多肽螯合物的螯合率和抗氧化活性。測得本實(shí)施例中一種多肽對(duì)鈣離子螯合率達(dá)21.7 %，制備的多肽鈣螯合物得率達(dá)14.5%，50mg大竹蟶多肽鈣螯合物的抗氧化活性相當(dāng)于50yLa-生育酚的65.9%。
[0048]實(shí)施例5
[0049]I)大竹蟶樣品處理:將大竹蟶清洗干凈，去殼后剔除雜物，將大竹蟶的肉體組織淋去多余水分后稱取125g，然后與去離子水按5: l(w/v)混合，用組織勻漿器將大竹蟶組織研磨勻漿得到大竹蟶組織勻漿液；
[0050]2)大竹蟶組織勻漿液酶解:在45°C的恒溫水浴中調(diào)節(jié)大竹蟶組織勻漿液的pH至8.0，在勻漿液中加1%大竹蟶組織重量的復(fù)合酶進(jìn)行酶解，復(fù)合酶由質(zhì)量比為2:1的木瓜蛋白酶和風(fēng)味蛋白酶組成。酶解8小時(shí)后在沸水中滅酶7分鐘，5000rpm離心后取上清液冷凍干燥，制得大竹経多肽凍干粉粗品，稱取多肽凍干粉重量；
[0051]3)大竹蟶多肽與氯化鈣進(jìn)行螯合反應(yīng):將大竹蟶多肽凍干粉粗品配制成15mg/ml的大竹蟶多肽溶液，在40 0C的恒溫水浴中將50ml濃度為15mg/ml的大竹蟶多肽溶液調(diào)pH至4，加入0.18g的無水氯化鈣(多肽與鈣離子的質(zhì)量比為1:4)，在恒溫磁力攪拌裝置中攪拌反應(yīng)30分鐘；
[0052]4)大竹蟶多肽鈣螯合反應(yīng)液的醇析:螯合結(jié)束后將反應(yīng)液在1000rpm下離心，取上清液，在上清液中加入占總醇析體系總體積70%的無水乙醇進(jìn)行醇析，5000rpm下離心后取沉淀，用鈣試劑檢測上清液中鈣離子，反復(fù)經(jīng)過5次醇析，待無顏色反應(yīng)后進(jìn)行冷凍干燥，干燥完畢后稱重；
[0053]5)用EDTA絡(luò)合滴定法和巴比妥酸法分別測定多肽螯合物的螯合率和抗氧化活性。測得本實(shí)施例中一種多肽對(duì)鈣離子螯合率達(dá)42.7%，制備的多肽鈣螯合物得率達(dá)32.6%，50mg大竹蟶多肽鈣螯合物的抗氧化活性相當(dāng)于50yLa-生育酚的73.7%。
[0054]關(guān)于本發(fā)明實(shí)施例1?5中的螯合率和多肽鈣得率的測定方法如下:
[0055]移取5ml多肽螯合鈣反應(yīng)液與50ml容量瓶中，加去離子水定容至50ml。從容量瓶中移取1ml試液于錐形瓶中，加入50ml的去離子水，用0.02mol/L的EDTA標(biāo)準(zhǔn)液滴定鈣離子的總量。
[0056]移取5ml多肽螯合鈣反應(yīng)液于小燒杯中，在水浴中濃縮近干。加入50ml的無水乙醇，充分?jǐn)嚢瑁?000rpm下離心1min，將沉淀用去離子水轉(zhuǎn)移至50ml容量瓶中，加去離子水定容至50ml。用上步的同樣方法進(jìn)行EDTA滴定，測定螯合態(tài)|丐離子的量。
[0057]大竹蟶多肽鈣螯合率=(V1/V0)X100%
[0058]式中，Vl為滴定螯合態(tài)鈣離子所消耗的EDTA溶液體積，V2為滴定總鈣離子所消耗的EDTA溶液體積。
[0059]多肽鈣得率的測定:
[0060]大竹蟶多肽鈣得率=(W2/W1)X100%
[0061]式中，W1為反應(yīng)物的總重量，W2為反應(yīng)生成的多肽鈣螯合物的重量。
[0062 ]多肽鈣螯合物抗氧化活性測定方法
[0063]TBA溶液包括水0.8ml、8.1 % SDS 0.2ml和20 %的醋酸1.5ml。向體積為30ml的試管中加入亞油酸樣品0.2ml，隨后再加10毫升99%的乙醇和10毫升0.5mol/L PBS(PH=7.0),在該混合溶液中分別加入各樣品50mg，純化水定容至體積25ml，做好標(biāo)記并整理好放入40°(:冰箱培養(yǎng)72h左右。接著用氫氧化鈉和之前已配制好的濃度為0.8%的TBA溶液(TBA可用氫氧化鈉溶液溶解)共同調(diào)節(jié)混合液的酸堿度，使其PH達(dá)到3.5左右。最后再向其中加入具有強(qiáng)氧化性的亞油酸樣品溶液，室溫下培養(yǎng)半小時(shí)，然后再用100°C沸水給其加熱Ih左右，調(diào)節(jié)722可見分光光度計(jì)的波長至535nm，測定混合液在此波長下的吸光度。結(jié)果用該混合液對(duì)亞油酸標(biāo)準(zhǔn)品的氧化抑制率來表示，并以a-生育酚標(biāo)準(zhǔn)品的抗氧化效果作為參照對(duì)象，通過計(jì)算判斷大竹蟶源多肽金屬鈣螯合物的抗氧化活性的大小。平行做三次抗氧化實(shí)驗(yàn)，取平均值。
[0064]抗氧化活性(%) = (A-B)/(A-C) X 100
[0065]式中，A表示加入50μ1純化水+0.2ml亞油酸混合液的吸光度;B表示加入50mg大竹蟶多肽螯合鈣物樣品+0.2ml亞油酸混合液的吸光度;C表示加入50μ1α-生育酚標(biāo)品+0.2ml亞油酸混合液的吸光度。
【主權(quán)項(xiàng)】
1.一種具有抗氧化活性的大竹蟶多肽-鈣螯合物的制備方法，其特征在于，包括以下步驟: 1)大竹蟶樣品處理:大竹蟶去殼后剔除雜物后稱重，然后與去離子水按5?1:l(w/v)混合，用組織勻漿器將大竹蟶組織研磨勻漿得到大竹蟶組織勻漿液； 2)大竹蟶組織勻漿液酶解:在40?50°C的恒溫水浴中調(diào)節(jié)大竹蟶組織勻漿液的pH，在大竹蟶組織勻漿液中加I?2%大竹蟶組織勻漿液重量的復(fù)合酶進(jìn)行酶解，在沸水中滅酶5?10分鐘，離心，取離心上清液冷凍干燥，制得大竹蟶多肽凍干粉粗品； 3)大竹蟶多肽與氯化鈣進(jìn)行螯合反應(yīng):將大竹蟶多肽凍干粉粗品配制成10?30mg/ml的大竹蟶多肽溶液，在30?50°C的恒溫水浴中調(diào)節(jié)大竹蟶多肽溶液pH，加入無水氯化鈣后攪拌反應(yīng)30?60分鐘得到反應(yīng)液； 4)大竹蟶多肽鈣螯合反應(yīng)液的醇析:螯合反應(yīng)結(jié)束后對(duì)反應(yīng)液進(jìn)行處理，加入乙醇進(jìn)行醇析，離心后取沉淀，反復(fù)經(jīng)過3?5次醇析，用鈣試劑檢測上清液鈣離子，待無顏色反應(yīng)后進(jìn)行冷凍干燥制得大竹蟶多肽-鈣螯合物。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的具有抗氧化活性的大竹蟶多肽-鈣螯合物的制備方法，其特征在于，所述步驟2)調(diào)節(jié)大竹蟶組織勻漿液的pH為6.0?8.0，酶解時(shí)間為5?8小時(shí)。3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的具有抗氧化活性的大竹蟶多肽-鈣螯合物的制備方法，其特征在于，所述步驟2)中加入復(fù)合酶為質(zhì)量比為1:1?2:1的木瓜蛋白酶和風(fēng)味蛋白酶。4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的具有抗氧化活性的大竹蟶多肽-鈣螯合物的制備方法，其特征在于，所述步驟3)調(diào)節(jié)大竹蟶多肽溶液的pH為4?8，加入氯化鈣中的鈣離子與大竹蟶多肽的質(zhì)量比為4:1?1:1ο5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的具有抗氧化活性的大竹蟶多肽-鈣螯合物的制備方法，其特征在于，所述步驟4)中對(duì)反應(yīng)液的處理為5000 rpm?10000 rpm離心處理。6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的具有抗氧化活性的大竹蟶多肽-鈣螯合物的制備方法，其特征在于，所述步驟4)中所述的加入乙醇的體積最終占總醇析體系體積的70%?90%。
【文檔編號(hào)】A23L29/00GK106072081SQ201610460169
【公開日】2016年11月9日
【申請(qǐng)日】2016年6月23日
【發(fā)明人】韓曜平, 陳媛媛, 王夢(mèng)婭, 錢文舉, 胡沁瑩, 周宇, 王夢(mèng)璠
【申請(qǐng)人】常熟理工學(xué)院