專利名稱：一種徑向流耦合超濾分離制備銅藻多糖的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種徑向流耦合超濾分離制備銅藻多糖的方法及其應(yīng)用。
ニ背景技術(shù)：
銅藻俗稱“丁香屋”(中國南麂島)，隸屬于馬尾藻屬。銅藻是北太平洋西部特有的暖溫帶性海藻，不連續(xù)分布在我國沿海，是提取褐藻膠的重要原料，因富含有益的生源要素而被廣泛應(yīng)用到醫(yī)藥、食品、飼料和有機肥料方面。研究表明銅藻藻體含褐藻酸、褐藻淀粉、甘露醇及多種氨基酸、多糖、蛋白質(zhì)、維生素等。銅藻具有消痰軟堅、清熱利水的功效。近年來，國內(nèi)外專家對于銅藻的研究主要集中在銅藻養(yǎng)殖和生物學(xué)研究，對于銅藻多糖的研究較少，有研究表明銅藻多糖添加到煙絲中后能夠使煙氣柔和、細膩和生津感，煙氣干 燥感下降，并且對卷煙風(fēng)格特征無影響，因此銅藻多糖的開發(fā)和用途是ー個有待于進一歩研究的新課題。多糖的分離純化的研究使得多糖這一高分子聚合物在生命科學(xué)領(lǐng)域的研究有重大發(fā)展，傳統(tǒng)的多糖分離純化采用軸向流色譜分離，該技術(shù)的不足之處在于分離純化步驟復(fù)雜，所需時間較長；而用徑向流純化多糖雖然處理量大，處理時間短，但是純化效果較低，如蛋白質(zhì)的一般脫除率在80%左右；利用超濾技術(shù)純化多糖，不同的超濾膜的純化效率不同，但純化效率較高的蛋白質(zhì)脫除率也僅80%左右，達不到煙草添加劑所需要求。而利用徑向流耦合超濾的方法不僅在分離純化效果上與軸向相當(dāng)，可達到95%以上甚至99%，且該方法又繼承了處理速度快、處理量大優(yōu)點，是ー種新型的適用于エ廠化的多糖分離純化方法。

發(fā)明內(nèi)容
發(fā)明的目的g在提供一種銅藻多糖分離純化的方法，即采用徑向流色譜和超濾的分離純化方法，該方法相比傳統(tǒng)軸向的分離柱具有分離速度快、處理量的優(yōu)勢，相比単獨利用徑向流或超濾在分離效果上有一定提高，并且從銅藻中分離得到銅藻多糖的三個組分分子量IOKD以下，分子量IOKD到100KD，分子量100KD以上，其中分子量IOKD以下、分子量IOKD到100KD的組分在提高卷煙的質(zhì)量、保潤性，降低吸食刺激性方面相比另ー個組分和粗提液有一定的提尚。本發(fā)明采用的技術(shù)方案是一種徑向流耦合超濾分離制備銅藻多糖的方法，所述方法包括以下步驟(I)將銅藻洗浄、干燥粉碎得銅藻粉末，加入質(zhì)量為銅藻粉末質(zhì)量50-60倍的水，在400-500W的超聲條件下提取20-30min，提取液經(jīng)離心分離和抽濾后，取濾液濃縮并冷凍干燥，得銅藻粗多糖；(2)將步驟(I)得到的銅藻粗多糖加水配制得到5 10mg/ml濃度的銅藻粗提液，加入裝填有弱堿性陰離子交換樹脂的徑向流色譜柱中，用純水洗脫，徑向流色譜的條件為上樣流速/柱高為l_2ml/ (min cm),洗脫速度/柱高為8_12ml/ (min cm),柱體積/上樣量為2-5mL/mL，洗脫30min-40min，收集得到洗脫液；(3)將步驟⑵得到的洗脫液通過IOKD的超濾膜，膜壓カ控制在0 30psi，收集濾過液A，濃縮、冷凍干燥得到分子量IOKD以下的銅藻多糖組分A，將截留液A再通過100KD的超濾膜，膜壓カ控制在0 30psi，收集濾過液B，濃縮、冷凍干燥得到分子量為IOKD到100KD的銅藻多糖組分B，將截留液B濃縮、冷凍干燥得到100KD以上的銅藻多糖組分C。所述步驟(2)中，所述弱堿性陰離子交換樹脂為A103S、A105或A100，優(yōu)選A103S。所述步驟⑴中，所述銅藻粉末的目數(shù)為20-100目。
所述步驟(I)中，所述干燥是在55 65°C下烘干。所述步驟(I)中，提取液經(jīng)離心分離和抽濾，是將提取液在10000r/min高速離心，所得上清液經(jīng)抽濾，得到濾液。本發(fā)明還提供按上述方法制備得到的分子量IOKD以下的銅藻多糖組分A或分子量IOKD到100KD的銅藻多糖組分B。所述的銅藻多糖組分A或銅藻多糖組分B可應(yīng)用在卷煙中，在提高卷煙的質(zhì)量、保潤性，降低吸食刺激性方面相比另ー個組分分子量100KD以上和粗提液以及經(jīng)過徑向流色譜純化的洗脫液都有一定的提高。具體的，所述應(yīng)用的方法為將銅藻多糖組分A或銅藻多糖組分B按保潤有效成分(即其中含有的多糖類成分含量)為煙絲質(zhì)量的萬分之ニ，溶解在蒸餾水中噴灑到煙絲上，然后制備成卷煙，其中每25g煙絲所噴灑的溶液體積保持在3-5ml之間。本發(fā)明利用徑向流色譜去除蛋白質(zhì)純化銅藻粗多糖，然后利用超濾將純化得到銅藻多糖分離得到三個組分，分別為IOKD以下、IOKD到100KD和100KD以上，并且通過超濾步驟進一歩脫除蛋白質(zhì)。將分離純化得到的銅藻多糖提取液作為煙用料液加入到卷煙煙絲上，在燃吸卷煙時可產(chǎn)生特有的化學(xué)成分，明顯改善或提高卷煙的質(zhì)量品質(zhì)，相比粗提取液添加到煙絲上減少一定的吸食時的刺激性，生津感、ロ感改善更加明顯。本發(fā)明生產(chǎn)成本低，無污染，分離純化速度快，效果好，適合エ廠化生產(chǎn)，并且在一定程度上改善了我國卷煙產(chǎn)品煙氣干燥的缺點，具有實際生產(chǎn)意義和價值。本發(fā)明的優(yōu)點和產(chǎn)生的有益效果本發(fā)明的特點是分離純化步驟相對傳統(tǒng)軸向柱，分離時間短，處理量大，相比単獨使用徑向流或超濾在分離效果上有提高，且所需分離介質(zhì)成本低，并且適用于大規(guī)模エ業(yè)化生產(chǎn)；分子量IOKD以下和分子量IOKD到100KD在提高卷煙的質(zhì)量、保潤性，降低吸食刺激性方面有一定作用，具有良好的應(yīng)用前景。
四

圖I實施例I制得的多糖組分A、多糖組分B、多糖組分C、洗脫液、銅藻粗提液的蛋白質(zhì)含量對比圖，以銅藻粗提液中的蛋白質(zhì)含量為100%。圖2實施例2制得的多糖組分A、多糖組分B、多糖組分C、洗脫液、銅藻粗提液的蛋白質(zhì)含量對比圖，以銅藻粗提液中的蛋白質(zhì)含量為100%。
五具體實施例方式下面以具體實施例來對本發(fā)明方法做進ー步說明，但本發(fā)明的保護范圍不限于此。實施例I取新鮮的銅藻，洗凈后陰干，隨后放入烘箱中60°C下烘干，粉碎至20-100目，在400W的超聲條件下加50g的銅藻粉末和3L蒸懼水提取30min,提取液經(jīng)10000r/min高速離心，上清液抽濾后，取濾液濃縮并冷凍干燥得到7. 12g銅藻粗多糖。取銅藻粗多糖0. 5g配制得到濃度為5mg/ml銅藻粗提液100ml，利用徑向流色譜法脫除粗提液中的蛋白質(zhì)，所用徑向流色譜為美國S印ragen公司的型號SUPERFL0-250C0LUMN的徑向流色譜柱，其柱體積為250ml、內(nèi)徑I. 5cm和外徑7. 8cm，柱高5cm，裝填有A103S填料。徑向流色譜的條件為上樣流速5ml/min,上樣濃度為5mg/ml,純水洗脫,洗脫速度40ml/min,上樣量為IOOml,洗脫30min，收集得到洗脫液2600ml。將上述洗脫液通過IOKD的超濾膜，膜壓カ控制在0 30psi，收集濾過液并濃縮冷凍干燥得到分子量IOKD以下的多糖組分A152mg，將截留液再通過100KD的超濾膜，膜壓カ控制在0 30psi，收集濾過液并濃縮冷凍干燥得到分子量為IOKD到100KD的多糖組分B14mg，所得截留液濃縮并冷凍干燥得到100KD以上的多糖組分 C156mg。分子量IOKD以下的多糖組分A :淡黃色組分，易溶于水，不溶于こ醇等有機溶剤，水溶液為淡黃色透明粘稠狀液體，茚三酮反應(yīng)顏色無明顯變化，紫外光譜分析在260nm處無吸收，說明幾乎無蛋白質(zhì)。分子量IOKD到100KD的多糖組分B :淡紫色組分，易溶于水，不溶于こ醇等有機溶齊U，水溶液為淡無色透明粘稠狀液體，茚三酮反應(yīng)顏色無明顯變化，紫外光譜分析在260nm處無吸收，說明幾乎無蛋白質(zhì)。分子量100KD以上的多糖組分C :淡紫色組分，易溶于水，不溶于こ醇等有機溶剤，水溶液為淡紫色透明粘稠狀液體，茚三酮反應(yīng)顏色呈現(xiàn)藍紫色，紫外光譜分析在260nm處有吸收，說明存在少量蛋白質(zhì)。將上述三種組分、銅藻粗提液以及經(jīng)過徑向流色譜柱的洗脫液用Folin-酚法檢測其中蛋白質(zhì)含量，其中以銅藻粗提液中的蛋白質(zhì)含量為100%，其他各組分和洗脫液中所含蛋白質(zhì)與銅藻粗提液的比值所得結(jié)果如圖I所示。將上述三種組分、銅藻粗提液以及經(jīng)過徑向流色譜柱的洗脫液加入卷煙中進行評定，具體采用以下方法將各銅藻提取液按保潤有效成分(即其中多糖類含量)為煙絲質(zhì)量的萬分之ニ溶解在蒸餾水中噴灑到煙絲上，每25g煙絲所噴灑的溶液體積保持在3-5ml之間。在溫度22 °C ± I °C、相対濕度60 % ± 2 %的恒溫恒濕箱中平衡48h，經(jīng)專業(yè)人員進行感官評定得出結(jié)果。所得結(jié)果如下表I。表I:評吸提取液評吸結(jié)果
銅藻粗提液煙氣較柔和、細膩和生津感，煙氣干燥感下降，對卷煙
風(fēng)格特征無影響。
多糖組分A生津感、圓潤感増加，煙氣細膩柔和，干燥感下降，
刺激性較粗提液和洗脫液下降。
多糖組分B 生津感，細膩柔和度都有改善，刺激性下降。
多糖組分C 圓潤度，細膩柔和度略有提升，但刺激性較大。
洗脫液生津感細膩感提升，刺激感較粗提液下降。實施例2取新鮮的銅藻，洗凈后陰干，隨后放入烘箱中65°C下烘干，粉碎至20-100目，在500W的超聲條件下加50g的銅藻粉末和2. 5L蒸餾水提取20min，提取液經(jīng)10000r/min高速離心，上清液抽濾后，取濾液濃縮并冷凍干燥得到7. 28g銅藻粗多糖。取銅藻粗多糖0. 3g配制得到濃度為6mg/ml銅藻粗提液50ml，利用徑向流色譜法脫除粗提液中的蛋白質(zhì)，所用徑向流色譜為美國S印ragen公司的型號SUPERFL0-250C0LUMN的徑向流色譜柱，其柱體積為250ml、內(nèi)徑I. 5cm和外徑7. 8cm，柱高5cm，裝填有A103S填料(填料是什么？)。徑向流色譜的條件為上樣流速6ml/min,上樣濃度為6mg/ml,純水洗脫,洗脫速度50ml/min,上樣量為50ml，洗脫40min，收集得到洗脫液。將上述洗脫液通過IOKD的超濾膜，膜壓カ控制在0 30psi，收集濾過液并濃縮冷凍干燥得到分子量IOKD以下的多糖組分A85mg，將截留液再通過100KD的超濾膜，膜壓カ控制在0 30psi，收集濾過液并濃縮冷凍干燥得到分子量為IOKD到100KD的多糖組分B9mg，所得截留液濃縮并冷凍干燥得到100KD以上的多糖組分 C89mg。分子量IOKD以下的多糖組分A :淡黃色組分，易溶于水，不溶于こ醇等有機溶剤，水溶液為淡黃色透明粘稠狀液體，茚三酮反應(yīng)顏色無明顯變化，紫外光譜分析在260nm處無吸收，說明幾乎無蛋白質(zhì)。分子量IOKD到100KD的多糖組分B :淡紫色組分，易溶于水，不溶于こ醇等有機溶齊U，水溶液為淡無色透明粘稠狀液體，茚三酮反應(yīng)顏色無明顯變化，紫外光譜分析在260nm處無吸收，說明幾乎無蛋白質(zhì)。分子量100KD以上的多糖組分C :淡紫色組分，易溶于水，不溶于こ醇等有機溶剤，水溶液為淡紫色透明粘稠狀液體，茚三酮反應(yīng)顏色呈現(xiàn)藍紫色，紫外光譜分析在260nm處有吸收，說明存在少量蛋白質(zhì)。將上述三種組分、銅藻粗提液以及經(jīng)過徑向流色譜柱的洗脫液用Folin-酚法檢測其中蛋白質(zhì)含量，其中以銅藻粗提液中的蛋白質(zhì)含量為100%，其他各組分和洗脫液中所含蛋白質(zhì)與銅藻粗提液的比值所得結(jié)果如圖2所示。將上述三種組分、銅藻粗提液以及經(jīng)過徑向流色譜柱的洗脫液加入卷煙中進行評定，所用方法如實施例1，所得結(jié)果如下表2。表2
權(quán)利要求
1.一種徑向流耦合超濾分離制備銅藻多糖的方法，其特征在于所述方法包括以下步驟 (1)將銅藻洗浄、干燥粉碎得銅藻粉末，加入質(zhì)量為銅藻粉末質(zhì)量50-60倍的水，在400-500W的超聲條件下提取20-30min，提取液經(jīng)離心分離和抽濾后，取濾液濃縮并冷凍干燥，得銅藻粗多糖； (2)將步驟(I)得到的銅藻粗多糖加水配制得到5 10mg/ml濃度的銅藻粗提液，加入裝填有弱堿性陰離子交換樹脂的徑向流色譜柱中，用純水洗脫，徑向流色譜的條件為上樣流速/柱高為l_2ml/ (min cm)，洗脫速度/柱高為8_12ml/ (min cm)，柱體積/上樣量為2-5mL/mL,洗脫30min-40min,收集得到洗脫液； (3)將步驟(2)得到的洗脫液通過IOKD的超濾膜，膜壓カ控制在0 30psi，收集濾過液A，濃縮、冷凍干燥得到分子量IOKD以下的銅藻多糖組分A，將截留液A再通過100KD的超 濾膜，膜壓カ控制在0 30psi，收集濾過液B，濃縮、冷凍干燥得到分子量為IOKD 100KD的銅藻多糖組分B，將截留液B濃縮、冷凍干燥得到分子量為100KD以上的銅藻多糖組分C。
2.如權(quán)利要求I所述的方法，其特征在于所述弱堿性陰離子交換樹脂為A103S、A105或A100,。
3.如權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于所述弱堿性陰離子交換樹脂為A103S。
4.如權(quán)利要求I所述的方法，其特征在于所述步驟(I)中，所述銅藻粉末的細度為20-100 目。
5.如權(quán)利要求I所述的方法，其特征在于所述步驟(I)中，所述銅藻洗浄后干燥是在55 65°C下供干。
6.如權(quán)利要求I所述的方法，其特征在于所述步驟(I)中，提取液經(jīng)離心分離和抽濾，是將提取液在lOOOOr/min高速離心，所得上清液經(jīng)抽濾，得到濾液。
7.如權(quán)利要求I 6之一的方法制備得到的銅藻多糖組分A或銅藻多糖組分B。
8.如權(quán)利要求6所述的銅藻多糖組分A或銅藻多糖組分B在卷煙中的應(yīng)用。
9.如權(quán)利要求8所述的應(yīng)用，其特征在于所述應(yīng)用的方法為取銅藻多糖組分A或銅藻多糖組分B，按其中含有的多糖類成分含量為煙絲質(zhì)量的萬分之ニ，溶解在蒸餾水中噴灑到煙絲上，然后制備成卷煙，其中每25g煙絲所噴灑的溶液體積保持在3-5ml之間。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種徑向流耦合超濾分離制備銅藻多糖的方法，利用徑向流色譜去除蛋白質(zhì)純化銅藻粗多糖，然后利用超濾將純化得到銅藻多糖分離得到三個組分，分別為10KD以下、10KD到100KD和100KD以上，并且通過超濾步驟進一步脫除蛋白質(zhì)。將分離純化得到的銅藻多糖提取液作為煙用料液加入到卷煙煙絲上，在燃吸卷煙時可產(chǎn)生特有的化學(xué)成分，明顯改善或提高卷煙的質(zhì)量品質(zhì)，相比粗提取液添加到煙絲上減少一定的吸食時的刺激性，生津感、口感改善更加明顯。本發(fā)明生產(chǎn)成本低，無污染，分離純化速度快，效果好，適合工廠化生產(chǎn)，并且在一定程度上改善了我國卷煙產(chǎn)品煙氣干燥的缺點，具有實際生產(chǎn)意義和價值。
文檔編號A24B3/12GK102649823SQ20121013355
公開日2012年8月29日 申請日期2012年4月28日 優(yōu)先權(quán)日2012年4月28日
發(fā)明者葉超凡, 孫培龍, 楊君, 邵平 申請人:浙江工業(yè)大學(xué)