一種蜜柚柚皮多糖的分級提取方法及其產(chǎn)物和產(chǎn)物的應用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明一種蜜柚柚皮多糖的分級提取方法及其產(chǎn)物和產(chǎn)物的應用提供一種蜜柚柚皮煙草保潤劑制備方法，以蜜柚果皮為材料，采用高速剪切乳化結(jié)合復合酶二次破壁方法提取柚皮多糖，有機溶劑變溫滲透沉淀制備不同溶劑分級的柚皮多糖，并采用凝膠色譜研究了分級多糖分子量分布差異。不同分級的多糖分子量測定表明：不同溶劑分級的多糖分子量有顯著差異，其中a粗多糖的峰①的重均分子量為24100Da，b粗多糖的峰①的重均分子量為11700Da，c粗多糖的峰①的重均分子量為2130Da。表明乙醇濃度越低，沉淀多糖的分子量越大。柚皮多糖的最優(yōu)保潤濃度為1.5g/100Ml,當選擇不同溶劑時，柚皮多糖的保潤效果有所差別，其中水溶的柚皮多糖的保潤性明顯高于醇溶的柚皮多糖，總體來說均高于目前使用的保潤劑，如丙二醇。
【專利說明】一種蜜柚柚皮多糖的分級提取方法及其產(chǎn)物和產(chǎn)物的應用
【技術領域】
[0001]本發(fā)明涉及多糖提取領域，更具體地，涉及一種蜜柚柚皮多糖的提取分級方法及其產(chǎn)物應用。
【背景技術】
[0002]柚子屬于蕓香科柑橘，是大眾化的水果之一，廣東梅縣柚子是廣東省“三高”農(nóng)業(yè)戰(zhàn)略龍頭產(chǎn)品，目前梅州金柚的栽培已近百年歷史，全市總面積40萬畝，產(chǎn)量30萬噸以上，全省金柚產(chǎn)量高達40萬噸，是全國最大的金柚商品生產(chǎn)基地。1995年被國家首批百家中國特產(chǎn)之鄉(xiāng)組委會命名為“金柚之鄉(xiāng)”。目前全市總面積30萬畝，產(chǎn)量30萬噸以上，是全國最大的金柚商品生產(chǎn)基地。1995年被國家首批百家中國特產(chǎn)之鄉(xiāng)組委會命名為“金柚之鄉(xiāng)”。農(nóng)民種植水果增產(chǎn)不增收，大大挫傷了農(nóng)民的積極性。李時珍的《本草綱目》中指出:“柚，功能消食，解酒毒，去腸胃中惡氣，長發(fā)滋燥，療妊婦不思食口淡”。柚皮占整個柚子的43%~48%，含有多種對人體健康有益的非營養(yǎng)性生理活性成分，如黃酮類化合物、活性多糖、類檸檬苦素、香精油、天然色素、膳食纖維等，這些成分高于柚果實。目前多糖提取方法主要有水浸提法、酸堿提取法、微波提取法等，傳統(tǒng)高溫提取法工藝周期較長，而且能耗大、效率低；酸堿提取易破壞環(huán)多糖的立體結(jié)構和活性；微波法省時但效率不高；超聲波法雖然效率較高，但噪音較大，儀器價格昂貴。
[0003]目前食品行業(yè)生產(chǎn)中使用的保潤劑主要是多元醇類化合物，如丙二醇、甘油、木糖醇和山梨醇等。這些保潤劑均靠其吸濕性而對載體產(chǎn)生保潤作用，其保潤效果并不理想。多糖分子中存在大量羥基 和羧基等基團，可與水分子形成氫鍵，并相互交聯(lián)形成網(wǎng)狀結(jié)構，起到很好的保水作用。其次多糖具有良好的成膜性能，可在食品表面形成一層均勻的薄膜，減少食品表面的水分蒸發(fā)而完成保潤作用。柚皮具有抑菌、抗氧化且具有止咳、化痰、理氣、抗炎、止癢等功效。
[0004]高剪切分散乳化(Highshear dispersing emulsifier, HSDE)技術是一種新型納米、微米和均質(zhì)化技術。物料在多層轉(zhuǎn)子和定子之間的間隙內(nèi)高速運動，可形成高切線和高頻機械效應，形成較強動能，使物料產(chǎn)生擠壓、摩擦、剪切等多種受力，最終使物料充分混合、攪拌、細化達到理想要求。近年來，該技術已成為天然產(chǎn)物有效成分提取中一種重要方法。HSDE結(jié)合復合酶二次破壁技術應用于柚皮多糖的提取未見報道。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明的目的之一在于提供一種適合柚皮提取分級的方法。
[0006]首先提供一種蜜柚柚皮多糖的分級提取方法，包括以下幾步，
51.取柚皮，根據(jù)柚皮重量，加入纖維素酶0.5-5.0%和果膠酶1.0-3.5%，在45-60°C下,加入水,所述的水和柚皮的重量比為10-35:1，高剪切分散乳化機10000r/min下處理2-20min，酶解1-2.5小時，得酶解液，
52.取SI所得的酶解液，加入乙醇使得溶液中乙醇的濃度為45~55%，溫度25°C_4°C變溫醇析，離心，離心得沉淀物一和上清液一，所得的沉淀物一為a粗多糖，
S3.取步驟S2所得的上清液一逐步加入乙醇使得溶液中乙醇的濃度為65~75%，250C -4°C變溫醇析，離心，離心得沉淀物二和上清液二，所得的沉淀物二為b粗多糖，
S4.取步驟S2所得的上清液二加入乙醇使得溶液中乙醇的濃度為85、5%，250C_4°C變溫醇析，離心，離心得沉淀物三和上清液三，所得的沉淀物三為c粗多糖。
[0007]優(yōu)選方案為，所述的纖維素酶用量為1.5%,果膠酶用量為1.5%,所述的酶解時間為120min，水和柚皮的重量比為1:25，酶解的溫度為50°C。
[0008]所述的蜜柚優(yōu)選梅州金柚。
[0009]更進一步的提供一種蜜柚柚皮a粗多糖，經(jīng)Waters凝膠滲透色譜分析得，所述的a粗多糖的峰①的重均分子量為24100Da,數(shù)均分子量為21300Da,峰位分子量為28540 Da,分子量分布寬度為1.13。
[0010]所述的a粗多糖的峰②的重均分子量為2180Da，數(shù)均分子量為2060Da，峰位分子量為2650 Da,分子量分布寬度為1.06。
[0011]更進一步的提供一種蜜柚柚皮b粗多糖，經(jīng)Waters凝膠滲透色譜分析得，所述的b粗多糖的峰①的重均分子量為11700Da,數(shù)均分子量為11200Da,峰位分子量為13540Da,分子量分布寬度為1.04。
[0012]所述的b粗多糖的峰②的重均分子量為1920Da，數(shù)均分子量為2030Da，峰位分子量為2390 Da，分子量分布寬度為1.05。
[0013]更進一步的提供一種蜜柚柚皮c粗多糖,其特征在于,經(jīng)Waters凝膠滲透色譜分析得，所述的c粗多糖的峰①的重均分子量為2130Da,數(shù)均分子量為1890Da,峰位分子量為2540Da，分子量分布寬度為1.12。
[0014]上述的制備方法獲得的a粗多糖、b粗多糖或c粗多糖在保潤方面的應用。
[0015]上述的制備方法獲得的a粗多糖、b粗多糖或c粗多糖在煙草保潤方面的應用。具體的應用方法為，將a粗多糖、b粗多糖或c粗多糖的水溶液噴加于煙草表面。
[0016]本發(fā)明的優(yōu)點如下:
本發(fā)明利用嶺南特色水果柚子皮止咳、化痰、理氣、抗炎等功能特性，著重研究柚皮多糖的提取工藝和不同溶劑分級多糖的分子量差異，以期探索出一種高效的柚子多糖提取工藝，詮釋不同分子量多糖功效機理，為食品添加劑開發(fā)和藥品原料開發(fā)奠定理論基礎，此研究也是大力發(fā)展水果加工，保持農(nóng)村經(jīng)濟的持續(xù)健康發(fā)展、促進農(nóng)民收入增加的主要措施之一 O
[0017]乙醇通過降低多糖水溶液的介電常數(shù)，增加溶質(zhì)分子的靜電作用力，多糖發(fā)生聚合析出，另外乙醇減少多糖與水的作用，使多糖脫水而相互聚集沉淀。由表2可知，一定濃度的乙醇對應沉淀一定量的多糖，采用高速剪切乳化結(jié)合復合酶二次破壁方法提取，不同濃度有機溶劑變溫滲透沉淀制備多糖，不同級份多糖含量有差異，柚皮多糖提取率為10.398/10(^，其3粗多糖中的多糖為5.6 g/100g柚粉，b粗多糖中的多糖為1.9 g/100g柚粉，c粗多糖中的多糖為1.8 g/100g柚粉。然而現(xiàn)有技術采用水提醇沉淀法提取了柚皮多糖，純化后其平均收率為6.92%;采用石油醚回流脫脂，熱水提取沙田柚柚皮多糖的方法，測得柚皮水溶性多糖含量是7.28%。
[0018]本發(fā)明的提供的a、b和c粗多糖在煙草保潤上有很好的功用，保潤的效果好。【專利附圖】

【附圖說明】
[0019]圖1為液料比對酶法提取柚皮多糖得率的影響。
[0020]圖2為酶用量對酶法提取柚皮多糖得率的影響。
[0021]圖3為酶解時間對復合酶提取柚皮多糖得率的影響。
[0022]圖4為酶解溫度對復合酶提取柚皮多糖得率的影響。
[0023]圖5為a粗多糖分子量色譜圖。
[0024]圖6為b粗多糖分子量色譜圖。
[0025]圖7為c粗多糖分子量色譜圖。
[0026]圖8為不同分級的柚皮多糖在醇溶條件下自身水分散失率變化。
[0027]圖9為不同分級的柚皮多糖在水溶條件下自身水分散失率變化。
[0028]圖10為不同濃度的柚皮多糖對載體煙葉保潤性的影響。
[0029]圖11為不同溶劑對柚皮a粗多糖保潤性的影響。
[0030]圖12為不同溶劑對柚皮b粗多糖保潤性的影響。
[0031]圖13為不同溶劑對柚皮c粗多糖保潤性的影響。
【具體實施方式】
[0032]下面結(jié)合附圖和具體實施例進一步詳細說明本發(fā)明。除非特別說明，本發(fā)明采用的試劑、設備和方法為本【技術領域】常規(guī)市購的試劑、設備和常規(guī)使用的方法。
[0033]實施例1
51.取柚皮，根據(jù)柚皮重量，加入纖維素酶1.5%和果膠酶1.5%，在50°C下，加入水，所述的水和柚皮的重量比為25:1，高剪切分散乳化機10000r/min下處理lOmin，酶解1.5小時，得酶解液，取一部分酶解液，浸提，得到多糖含量為9.49%
52.取SI所得的酶解液，加入乙醇使得溶液中乙醇的濃度為45~55%，溫度25°C_4°C變溫醇析，離心，離心得沉淀物一和上清液一，所得的沉淀物一為a粗多糖的得率為13.12%，a粗多糖中多糖的純度為42.2%，純化后a多糖得率為5.6%，
53.取步驟S2所得的上清液一加入乙醇使得溶液中乙醇的濃度為65~75%，溫度250C -4°C變溫醇析，離心，離心得沉淀物二和上清液二，所得的沉淀物二為b粗多糖的得率為4.38%，b粗多糖中多糖的純度為42.8%，純化后b多糖得率為1.9%，
54.取步驟S2所得的上清液二加入乙醇使得溶液中乙醇的濃度為85~95%，溫度250C -4°C變溫醇析，離心，離心得沉淀物三和上清液三，所得的沉淀物三為c粗多糖的得率為3.20%, c粗多糖中多糖的純度為56.2%，純化后c多糖得率為1.8%。
[0034]實施例2料液比、酶量、酶解時間和酶解溫度對提取的影響。
[0035]一、材料
蜜柚采自梅州柚子園，選擇同品種、大小、果色均勻、成熟度基本一致，無機械損傷、無病蟲侵染等蜜柚作為試驗材料。將果皮切成薄片后在恒溫干燥箱進行烘干，粉碎機將其磨成粉末備用。試劑為分析純葡萄糖，無水乙醇，丙二醇，5%苯酚，濃硫酸，去離子水，氯仿，正丁醇，活性炭等均購于廣州一馬生物科技有限公司。果膠酶:天津酶制劑廠；纖維素酶:上海伯奧生物科技有限公司。
[0036]二、儀器DU-730型紫外可見分光光度計(日本島津分析儀器廠)；恒溫水浴鍋(廣東環(huán)凱微生物科技有限公司);電熱恒溫培養(yǎng)箱(上海索譜儀器有限公司);旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器RE-52AA (上海亞榮生化儀器廠)；凝膠滲透色譜(美國Waters公司)；
二、實驗方法
(O復合酶提取制備柚皮多糖條件優(yōu)化 ①液料比對多糖得率的影響
準確稱量30g柚粉，纖維素酶和果膠酶的酶均在添加量1%、溫度45°C、pH6.5，液料比分別按10:1、15: 1,25: 1,30: 1,35:1處理，高剪切分散乳化機10000r/min下處理IOmin混勻,恒溫酶解,反應結(jié)束后，將其置于100°C水浴中IOmin使酶滅活,冷卻至室溫,離心，在上清液中加入無水乙醇至最終濃度為80%，4°C靜置過夜，置于4000r/min離心機中離心20min,收集沉淀。測定沉淀物多糖含量及計算得率。
[0037]②酶解時間對多糖得率的影響
準確稱量30g柚粉，纖維素酶和果膠酶的酶均在添加量1%、溫度45°C、pH6.5，酶解時間分別按 30、60、90、120、150、180m i η 處理，同上。
[0038]③酶解溫度對多糖得率的影響
纖維素酶和果膠酶的酶均在添加量1%，液料比、酶解時間和PH按照確定的最佳值，酶解溫度分別按40、45、50、55、60、65°C處理，同上。
[0039]④酶添加量對多糖得率的影響
酶解時間、液料比、酶解溫度和PH按照確定的最佳值，酶添加量分別按0.5%、1%、
1.5%、2%、2.5% 和 3% 處理，同上。
[0040]⑤復合酶法正交試驗
根據(jù)單因素試驗結(jié)果，用正交試驗對影響提取的因素:酶解時間、復合酶添加量、液料比及酶解溫度進行條件優(yōu)化。
[0041](2)柚皮多糖的提取分級制備
有機溶劑沉淀分級法---------------參照史軍花等方法
按照優(yōu)化工藝條件提取多糖，在200mL的柚皮提取濃縮液中，加入無水乙醇400mL和去離子水200mL，配制成乙醇濃度為50%的混合液。將混合液于溫度25°C _4°C變溫醇析。將醇析后的混合液，在4000 r/min離心機下，進行沉淀分離，用燒杯分別收集沉淀物和柚皮澄清液，沉淀物即50%的乙醇沉淀的柚皮粗多糖，編號為a粗多糖。如上述方法，分別采用70%,90%的乙醇繼續(xù)醇沉柚皮澄清液，分別得到b粗多糖、c粗多糖。將a粗多糖、b粗多糖、c粗多糖冷凍干燥備用。
[0042]3.多糖含糖量的測定采用苯酚-硫酸法[8]
多糖得率(%)=[多糖質(zhì)量(g) /原料質(zhì)量(g) ] X 100%
4.多糖分子量測定采用Waters凝膠滲透色譜(。
[0043](3)結(jié)果與分析
1、液料比對酶法提取柚皮多糖得率的影響
不同的液料比會影響到提取溶劑對活性物質(zhì)的溶解情況。復合酶提取料液比對多糖得率的影響如圖1所示。由圖1可知，多糖得率隨液料比的增加而逐漸升高，20:1時達到最大，之后繼續(xù)增大液料比，多糖得率平緩到30:1，隨后下降。有這樣的趨勢可能是因為液料比過低，活性物質(zhì)不能充分溶解，影響到提取率。隨著液料比的過多增加，稀釋了體系使酶濃度降低，酶與底物的結(jié)合不充分，多糖得率下降?？紤]到成本，選擇15: 1-25:1為柚皮多糖提取的最適液料比。
[0044]2、復合酶量對酶法提取柚皮多糖得率的影響
每種酶在反應體系中的加入量對多糖的得率有很大影響，酶用量對多糖得率的影響見圖2。由圖2可見，隨著酶用量的增加，酶與底物接觸機會增加，多糖得率隨之升高。當酶量大于1.5%時，多糖得率下降，原因可能是酶的種類不同，活性中心結(jié)構不同，空間結(jié)構不同，由于當酶濃度升高到一定程度，酶分子過于飽和，一部分沒有機會與底物結(jié)合，酶解速度降低，因此，酶用量范圍果膠酶和纖維素酶為f 2%較理想。
[0045]3、酶解時間對酶法提取柚皮多糖得率的影響
浸提時間影響到溶劑與不同細胞位置活性物質(zhì)的接觸，并將其溶解提取出來。浸提時間越長，溶劑能夠充分滲透到柚皮細胞組織的各個部位，與活性物質(zhì)充分接觸溶解，從而提高產(chǎn)率。由圖3可知，當酶解時間為90min時，多糖的提取率最大，超過120min，多糖提取率反而下降。因此，選擇60-120min為柚皮多糖提取的最適酶解時間。
[0046]4、酶解溫度對酶法提取柚皮多糖得率的影響
酶解溫度對復合酶提取柚皮多糖得率的影響如圖4所示，由圖4可知，隨著溫度的升高多糖提取率也升高，兩種酶最適溫度不同，果膠酶50°C~55°C、纖維素酶45°C時得率達至最大，因為隨著溫度升高，分子運動速度加快，滲透、擴散、溶解速度加快，同時，高溫可以引起細胞膜結(jié)構的變化，弱化或破壞了細胞壁的完整性，使多糖易于從柚皮的外層細胞轉(zhuǎn)移到溶劑中。繼續(xù)升高溫度，酶蛋白開始變性，酶活力減弱直至完全喪失，反應速度亦逐漸降低，多糖得率隨之下降。綜合考慮，選擇45-50°C最適酶解溫度。
[0047]5、正交試驗優(yōu)化復合酶提取柚皮多糖工藝
正交試驗結(jié)果由表1可知，影響柚皮多糖得率的各因素主次次序為由表1可知:按極差的大小順序是B>C>A>D，B為主要因素，C次之，A再次之，D是次要因素。由極差分析各因素的最佳試驗組合為A2B3C3D2,實際組合為A1B2C2D2,浸提得率為9.49%。，通過驗證，確定最佳組合為A2B3C3D2，即酶用量1.5%、酶解時間120 min、料液比1: 25、酶解溫度50°C，浸提得率為10.39%。
[0048]表1正交試驗結(jié)果
【權利要求】
1.一種蜜柚柚皮多糖的提取分級方法，其特征在于，包括以下幾步， S1.取柚皮，根據(jù)柚皮重量，加入纖維素酶0.5-5.0%和果膠酶1.0-3.5%，在45-60°C下,加入水,所述的水和柚皮的重量比為10-35:1，高剪切分散乳化機10000r/min下處理2-20min，酶解1-2.5小時，得酶解液， S2.取SI所得的酶解液，加入乙醇使得溶液中乙醇的濃度為45~55%，溫度25°C_4°C變溫醇析，離心，離心得沉淀物一和上清液一，所得的沉淀物一為a粗多糖， S3.取步驟S2所得的上清液一逐步加入乙醇使得溶液中乙醇的濃度為65~75%，250C -4°C變溫醇析，離心，離心得沉淀物二和上清液二，所得的沉淀物二為b粗多糖， S4.取步驟S2所得的上清液二加入乙醇使得溶液中乙醇的濃度為85、5%，250C_4°C變溫醇析，離心，離心得沉淀物三和上清液三，所得的沉淀物三為c粗多糖。
2.根據(jù)權利要求1所述的提取分級方法，其特征在于，所述的纖維素酶用量為0.5-5.0%，果膠酶用量為1.0-3.5%，所述的酶解時間為1-2.5小時，水和柚皮的重量比為10~35:1，酶解的溫度為45-60°C。
3.根據(jù)權利要求1所述的提取分級方法，其特征在于，所述的蜜柚為梅州金柚、沙田柚。
4.一種蜜柚柚皮a粗多糖,其特征在于,經(jīng)Waters凝膠滲透色譜分析得,所述的a粗多糖的峰①的重均分子量為24100Da,數(shù)均分子量為21300Da,峰位分子量為28540 Da,分子量分布寬度為1.13。
5.根據(jù)權利要求4所述的蜜柚柚皮a粗多糖，其特征在于，所述的a粗多糖的峰②的重均分子量為2180Da,數(shù)均分子量為2060Da,峰位分子量為2650 Da,分子量分布寬度為1.06。
6.—種蜜柚柚皮b粗多糖,其特征在于,經(jīng)Waters凝膠滲透色譜分析得,所述的b粗多糖的峰①的重均分子量為11700Da,數(shù)均分子量為11200Da,峰位分子量為13540Da,分子量分布寬度為1.04。
7.根據(jù)權利要求6所述的蜜柚柚皮b粗多糖，其特征在于，所述的b多糖的峰②的重均分子量為1920Da,數(shù)均分子量為2030Da,峰位分子量為2390 Da,分子量分布寬度為1.05。
8.—種蜜柚柚皮c粗多糖,其特征在于,經(jīng)Waters凝膠滲透色譜分析得,所述的c多糖的峰①的重均分子量為2130Da,數(shù)均分子量為1890Da,峰位分子量為2540Da,分子量分布寬度為1.12。
9.一種根據(jù)權利要求1所述的制備方法獲得的a粗多糖、b粗多糖或c粗多糖在保潤方面的應用。
10.一種根據(jù)權利要求1所述的制備方法獲得的a粗多糖、b粗多糖或c粗多糖在煙草保潤方面的應用。
【文檔編號】A24B15/40GK103509132SQ201310449231
【公開日】2014年1月15日 申請日期:2013年9月27日 優(yōu)先權日:2013年9月27日
【發(fā)明者】馮志斌, 陶紅, 郭文, 卓浩廉 申請人:廣東中煙工業(yè)有限責任公司