一株從煙末濃縮液分離的枯草芽孢桿菌sm及其在造紙法再造煙葉中的應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及造紙法再造煙葉生產(chǎn)領(lǐng)域，尤其涉及一株從煙末濃縮液分離的增香菌及其應(yīng)用。本發(fā)明所述的枯草芽孢桿菌SM（BacillussubtilisstrainSM）是從杭州利群環(huán)保紙業(yè)公司提供的煙末濃縮液中篩選得到，通過GC-MS檢測(cè)分析、聞香和感官評(píng)吸結(jié)果顯示，枯草芽孢桿菌SM通過增加煙末濃縮液的香氣量，可提升再造煙葉制品的香氣，并可減輕雜氣和降低刺激性，在造紙法再造煙葉生產(chǎn)工藝上具有廣泛的工業(yè)化應(yīng)用前景。
【專利說明】一株從煙末濃縮液分離的枯草芽孢桿菌SM及其在造紙法再造煙葉中的應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及造紙法再造煙葉生產(chǎn)領(lǐng)域，尤其涉及一株從煙末濃縮液分離的增香菌及其應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002]目前國內(nèi)造紙法再造煙葉生產(chǎn)工藝的流程是:將煙末和煙梗中的水溶性物質(zhì)用水萃取，同時(shí)分離纖維和不溶物。固液分離后，固體部分打漿抄造制成紙基，液體部分浸取濃縮成濃縮液，再噴涂或浸潤(rùn)到紙基上，最后干燥加香，制成再造煙葉，并回用于卷煙廠。從而使得廢次煙草及傳統(tǒng)煙草加工過程中煙末等廢棄物得到充分利用。
[0003]造紙法再造煙葉雖然是煙草廢棄物綜合利用的一種新工藝，但在很大程度上只是原材料的物理重組過程，煙葉原料的內(nèi)在質(zhì)量缺陷(如雜氣重、香氣量不足等)無法有效改善，影響了再造煙葉在成品卷煙中的使用。而在其工藝環(huán)節(jié)水提液(母液或濃縮液)中的微生物，可能對(duì)再造煙葉的品質(zhì)有重要影響，因此對(duì)這些微生物的培養(yǎng)和功能分析就顯得十分必要，特別是從再造煙葉工藝的濃縮液(煙末或煙梗)中分離出具有一定功能的微生物。目前利用微生物來提升造紙法再造煙葉工藝中煙末濃縮液及其再造煙葉制品的香氣未見相關(guān)報(bào)道。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]為了解決上述的技術(shù)問題，本發(fā)明的一個(gè)目的的是提供枯草芽孢桿菌SM{Bacillus subtil is strain D,該菌株是從造紙法再造煙葉生產(chǎn)工藝線的煙末濃縮液中分離篩選得到，并可應(yīng)用于提升煙末濃縮液的香氣。本發(fā)明的另外一個(gè)目的是提供上述的菌株在造紙法再造煙葉制品增香中的應(yīng)用。
[0005]為了實(shí)現(xiàn)上述的第一個(gè)目`的，本發(fā)明采用了以下的技術(shù)方案:
枯草芽抱桿菌SM (.Bacillus subtil is strain SM),該枯草芽抱桿菌SM保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心(CCTCC)，保藏日期:2013年9月25日，保藏編號(hào):CCTCC NO: M2013443。
[0006]為了實(shí)現(xiàn)上述的第二個(gè)目的，本發(fā)明采用了以下的技術(shù)方案:
上述的枯草芽孢桿菌SM的用途，該用途用于煙末濃縮液的增香。作為優(yōu)選，該用途為在煙末濃縮液中添加10%體積百分比的枯草芽孢桿菌SM，36~38°C醇化3~10天。
[0007]本發(fā)明要求保護(hù)的產(chǎn)品如下:
一種煙末濃縮液，該煙末濃縮液中添加上述的枯草芽孢桿菌SM。作為優(yōu)選，該煙末濃縮液中添加10%體積百分比的枯草芽孢桿菌SM，36~38°C醇化3~10天。
[0008]一種再造煙葉制品，該再造煙葉制品涂布有上述的煙末濃縮液。
[0009]一種卷煙制品，該卷煙制品采用上述的再造煙葉制品。
[0010]本發(fā)明所述的枯草芽抱桿菌SM {Bacillus subtil is strain SM)是從杭州利群環(huán)保紙業(yè)公司提供的煙末濃縮液中篩選得到，通過GC-MS檢測(cè)分析、聞香和感官評(píng)吸結(jié)果顯示，枯草芽孢桿菌SM通過增加煙末濃縮液的香氣量，可提升再造煙葉制品的香氣，并可減輕雜氣和降低刺激性，在造紙法再造煙葉生產(chǎn)工藝上具有廣泛的工業(yè)化應(yīng)用前景。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0011]圖1為枯草芽孢桿菌SM (.Bacillus subtil is strain 5￥)菌株的革蘭氏染色圖。
[0012]圖2為枯 草芽抱桿菌SM (.Bacillus subtil is strain 530菌株的電鏡觀察圖。
[0013]圖3為枯草芽孢桿菌SM {Bacillus subtil is strain 5￥)菌株的系統(tǒng)進(jìn)化樹分析圖。
[0014]圖4為對(duì)照樣品和10%的增香菌煙末濃縮液樣品的總離子流比較圖。
[0015]微生物保藏聲明
枯草芽孢桿菌SM (,Bacillus subtil is strain 5￥)，該菌株保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心(CCTCC)，地址:中國.武漢.武漢大學(xué)，保藏日期:2013年9月25日，保藏編號(hào):CCTCC NO: M 2013443。
【具體實(shí)施方式】
[0016]材料與方法
造紙法再造煙葉生產(chǎn)工藝中的煙末濃縮液，由杭州利群環(huán)保紙業(yè)公司提供 1.1樣品富集培養(yǎng):
配制LB液體培養(yǎng)，取2mL樣品分別接種到裝有IOOmL的LB培養(yǎng)基的三角瓶中，將三角瓶在30°C的搖床中培養(yǎng)，2-3天，待其培養(yǎng)液呈現(xiàn)明顯的渾濁。
[0017]由于樣品中菌體量是很少的，我們先對(duì)樣品中的菌體進(jìn)行富集培養(yǎng)。注:LB培養(yǎng)基配方:蛋白胨10g/L，酵母提取物5g/L，NaCl 10g/L，蒸餾水1000mL ;LB固體培養(yǎng)基:在LB液體培養(yǎng)基中每升加入15-20g瓊脂粉，調(diào)pH至7.0。
[0018]樣品中可培養(yǎng)微生物的分離:
將富集培養(yǎng)完成后的菌液用涂布平板法在R2A培養(yǎng)基平板上進(jìn)行均勻涂布，再在30°C恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3-5天，待平板上長(zhǎng)出單菌落。(若富集培養(yǎng)后菌液濃度過高，需要分別做稀釋10倍，100倍，1000倍后的涂布平板；使用的平板規(guī)格:90mm)
R2A培養(yǎng)基:IL培養(yǎng)基中:酵母提取物0.5g，蛋白胨0.5g，葡萄糖0.5g淀粉0.5g，K2HPO4
0.3g，丙酮酸納0.3g，MgSO4 0.05g,瓊脂15g (加瓊脂前調(diào)pH為7.2)，Iml的微量元素溶液和IOml維生素溶液(注:維生素采用過濾除菌，并且在超凈臺(tái)中最后加入到培養(yǎng)基中。)。
[0019]功能菌的篩選和分離:
將涂布平板上長(zhǎng)出的單菌落轉(zhuǎn)接到篩選平板，采用平板劃線法進(jìn)行單菌落轉(zhuǎn)接，轉(zhuǎn)接好后，將平板置于30°C恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3-5天；將篩選平板上篩選到的目的菌，在篩選平板上進(jìn)行多次轉(zhuǎn)接純化，直至整個(gè)平板上為單一菌種。
[0020]培養(yǎng)基(基本無機(jī)鹽培養(yǎng)基)=Na2HPO45.57 g/L, KH2PO4 2.44 g/L, K2SO4 I g/L, MgCl2.6H2 O 0.2 g/L, MnCl2.4H2 0 0.0004g/L, FeCl3.6H2 0 0.001 g/L, CaCl2
0.001g/L，尼古丁(含量根據(jù)需要添加)，pH=7.0。
[0021]功能菌的搖瓶發(fā)酵試驗(yàn):將純化出的目的菌，從平板上挑取單菌落接種到液體篩選培養(yǎng)基中，將搖瓶置于30°C的搖床中培養(yǎng)2-3天，觀察其生長(zhǎng)狀況。
[0022]菌種鑒定和保藏:
分別取固體培養(yǎng)基菌落進(jìn)行形態(tài)和生理生化試驗(yàn)。對(duì)分離得到的菌株進(jìn)行革蘭氏染色、拍照，并進(jìn)行電鏡拍照.生理生化實(shí)驗(yàn)參照文獻(xiàn)(東秀珠，2001)進(jìn)行。
16S rDNA序列和系統(tǒng)發(fā)育分析用水煮法提取細(xì)菌總DNA，采用細(xì)菌16S rDNA的通用引物(上海英駿生物技術(shù)有限公司合成，其正向引物序列:5’ -AGAGT13〃GATCCTGGCTCAG-3’，反向引物序列為:反向引物序列為:5’ -CGGCTACCTTGTFACGACTI’C-3’ (ffeisburg, 1991))進(jìn)行16S rDNA的PCR擴(kuò)增.PCR產(chǎn)物的純化和測(cè)序由上海英俊公司完成.測(cè)序結(jié)果利用BlastGenBank基因庫中進(jìn)行同源性比較和鑒定，將16S rDNA序列和與其同源性高的序列用 DNASTARver.7.1.0 中的 multiple sequence alignment software CLUSTAL W 分析，并用Megalign構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。
[0023]結(jié)果與討論
2.1 SM菌株鑒定:
經(jīng)形態(tài)學(xué)分析(圖1，圖2)，該菌為革蘭氏陽性，有芽孢；
生理生化試驗(yàn)顯示，該菌接觸酶實(shí)驗(yàn)陽性，V-P實(shí)驗(yàn)陽性；水解淀粉陽性，硝酸鹽還原陰性，檸檬酸鹽利用 陽性，丙酸鹽利用陰性，5°C生長(zhǎng)，55°C不生長(zhǎng)。
[0024]菌株16S rDNA測(cè)序分析結(jié)果如seqN0.1所示，經(jīng)BLAST比對(duì)和系統(tǒng)進(jìn)化樹分析(圖3),該菌屬于枯草芽孢桿菌{Bacillus subtil is保藏于武漢大學(xué)菌種保藏中心(保藏號(hào):CCTCC NO: M 2013443)。
[0025]檢測(cè)分析結(jié)果
取空白對(duì)照樣品、10%的增香菌樣品各Iml分別于50ml三角瓶中，先加入5ml甲醇搖勻，再加入3ml的二氯甲烷，超聲lOmin。分別取混濁液4ml于離心管中。離心lOmin，取上清液進(jìn)GC-MS分析。對(duì)照樣品、10%的增香菌樣品的兩張譜圖疊加結(jié)果如圖4所示。
[0026]采用面積歸一化得到空白對(duì)照樣品和10%的增香菌樣品檢測(cè)到的不同組分各自百分含量，經(jīng)分析比較，含量明顯增加的致香化合物有:5_羥甲基-2-糠醛、巨豆三烯酮、3-羥基-B-大馬酮、η-棕櫚酸、(Ζ，Ζ，Ζ)-9，12，15-十八碳三烯酸甲酯、菜油甾醇、豆甾醇
坐寸ο
[0027]感官評(píng)吸結(jié)果
利用前期在煙末濃縮液中分離得到的菌種SM，經(jīng)過擴(kuò)培，添加回新鮮濃縮液，醇化后，涂布，卷制成樣品。
[0028]濃縮液中添加10%菌種SM，37°C醇化5天后，10%的增香菌樣品同空白對(duì)照樣相t匕，在聞香方面:香氣量略有增加且聞香較特殊；卷制成再造煙葉制品進(jìn)行感官評(píng)價(jià):煙支整體煙氣有所改善，香氣略有增加，雜氣稍有減輕，特別是口腔的毛刺感、粗糙感微有降低。
【權(quán)利要求】
1.枯草芽抱桿菌SM(.Bacillus subtil is strain SM),該枯草芽抱桿菌SM保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心(CCTCC)，保藏日期:2013年9月25日，保藏編號(hào):CCTCC NO: M2013443。
2.權(quán)利要求1所述的枯草芽孢桿菌SM的用途，該菌株通過增加煙末濃縮液的香氣量，可提升再造煙葉制品的香氣，并可減輕雜氣和降低刺激性。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的枯草芽孢桿菌SM的用途，其特征在于:該用途為在煙末濃縮液中添加10%體積百分比的枯草芽孢桿菌SM，36~38°C醇化3~10天。
4.一種煙末濃縮液，其特征在于:該煙末濃縮液中添加權(quán)利要求1所述的枯草芽孢桿菌SM。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的一種煙末濃縮液，其特征在于:該煙末濃縮液中添加10%體積百分比的枯草芽孢桿菌SM，36~38°C醇化3~10天。
6.一種再造煙葉制品，其特征在于:該再造煙葉制品涂布有權(quán)利要求4或5所述的煙末濃縮液。
7.一種卷煙制品，其特征在于:該卷煙制品采用權(quán)利要求6所述的再造煙葉制品。
【文檔編號(hào)】A24B3/14GK103725632SQ201310692860
【公開日】2014年4月16日 申請(qǐng)日期:2013年12月17日 優(yōu)先權(quán)日:2013年12月17日
【發(fā)明者】舒明, 許式強(qiáng), 高陽, 袁凱龍, 史春云, 周國俊, 周強(qiáng), 陶豐, 唐恒杰, 焦洋, 何厚龍, 鐘衛(wèi)鴻 申請(qǐng)人:浙江中煙工業(yè)有限責(zé)任公司