專利名稱：肝再生增強因子基因轉(zhuǎn)染真核細胞的方法及應用的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及肝再生增強因子基因轉(zhuǎn)染真核細胞的方法，具體涉及人肝再生增強因 子轉(zhuǎn)染真核細胞的方法，以及含人工轉(zhuǎn)染人肝再生增強因子基因的真核細胞的應用，屬于 生物工程的生產(chǎn)方法。
背景技術：
肝再生增強因子(Augmenter of liver regeneration, ALR)也稱肝細胞生長素 (HPO)，1994年被鑒定并從大鼠肝刺激物質(zhì)(HSS)中純化得到，主要分布于肝臟、腎臟。ALR 是一種多肽調(diào)節(jié)因子，由125個氨基酸構成，相對分子量為15kDa，與含還原劑的SDS-PAGE 檢測結(jié)果一致。而從動物體內(nèi)提純的天然ALR，經(jīng)不含還原劑的SDS-PAGE分析，其分子 量約為30kDa，提示ALR在體內(nèi)可能存在同源二聚體結(jié)構。ALR定位于16號染色體的 pl3. 31-pl3. 32，該基因包括3個外顯子和2個內(nèi)含子。ALR是一種新型的細胞因子，與其他 的親肝細胞生長因子(如肝細胞生長因子干擾素-11等)在結(jié)構上無任何關系，但其編碼 區(qū)基因與酵母菌核基因(ERV1)有50%的同源性。HALR(人肝再生增強因子)的生物學活 性表現(xiàn)為在受到損傷的肝臟的修復過程中發(fā)揮重要的作用，保護肝臟，促進肝細胞再生，此 外ALR還參與多種與氧化還原有關的代謝活動。ALR能刺激肝細胞DNA合成，抑制肝NK細 胞活性，誘導肝線粒體基因表達，參與肝細胞再生，并具有免疫調(diào)控作用。目前有關ALR的 研究主要是其生物合成及其蛋白水平利用與開發(fā)的研究?；蜣D(zhuǎn)染技術是采用一定的方法和途徑將外源基因分子，如DNA、RNA等導入感受 態(tài)細胞，并表達目的基因，產(chǎn)生特定功能的蛋白質(zhì)分子。常用的表達系統(tǒng)主要分為兩類一 類是采用真核表達載體轉(zhuǎn)染DNA的瞬時表達系統(tǒng)或穩(wěn)定表達系統(tǒng)；一類是采用病毒載體的 表達系統(tǒng)。病毒載體雖然具有高轉(zhuǎn)染率，能夠持續(xù)、穩(wěn)定表達外源基因的特點，但由于病毒 載體需整合到轉(zhuǎn)染細胞的染色體中才能夠使外源基因得以表達，因此具有致癌、致畸的危 險，安全性較差。這一缺陷已成為限制病毒載體廣泛應用的主要原因。真核表達質(zhì)粒是一 種核酸，它不同于病原體，在自然狀態(tài)下沒有感染性，以附加體的形式存在于被轉(zhuǎn)染的靶細 胞的胞體內(nèi)，不被體外培養(yǎng)的細胞吸附，當細胞增殖時獨立的表達外源基因。它不需要整合 于轉(zhuǎn)染細胞的染色體內(nèi)，因而具有安全性高的優(yōu)點。生物人工肝(bioartificial liver, BAL)指應用生物材料肝細胞(人肝細胞、動 物肝細胞、人肝細胞系、基因轉(zhuǎn)化細胞等)構建體外灌流裝置替代衰竭的肝臟進行生物合 成及代謝的體外人工肝支持系統(tǒng)。生物反應器內(nèi)肝細胞要在生物反應器中大量培養(yǎng)生長、 保持活性并維持足夠長的時間是構建生物人工肝的關鍵，故生物型人工肝細胞的來源及相 關研究是該研究領域的熱點問題。因此，提供一種人肝再生增強因子轉(zhuǎn)染真核細胞的方法，構建含人工轉(zhuǎn)染人肝再 生增強因子基因的真核細胞株，具有重要的意義和實用價值。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供人肝再生增強因子基因轉(zhuǎn)染真核細胞的方法，以及構建的 含人工轉(zhuǎn)染人肝再生增強因子基因的真核細胞株的應用。為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采取以下技術方案一種人肝再生增強因子基因轉(zhuǎn)染真核細胞的方法，其步驟如下構建 pCDNA3. 1 (-)HALR質(zhì)粒，同時進行IfepG2的培養(yǎng)及篩選；pcDNA3. 1 (-)HALR質(zhì)粒轉(zhuǎn)染IfepG2 篩選后所得的肝腫瘤細胞系；然后對轉(zhuǎn)染的肝細胞系進行篩選，用有限稀釋法挑選生長迅 速的克隆，建立穩(wěn)定的肝細胞系。一種優(yōu)選技術方案，其特征在于所述的構建p⑶NA3. 1(_)HALR質(zhì)粒以后，還要進 行提取純化。一種優(yōu)選技術方案，其特征在于所述的構建PCDNA3. 1㈠HALR質(zhì)粒，包括如下步驟①相應抗生素的LB瓊脂平板的制備將含有1. 5%瓊脂的LB固體培養(yǎng)基加熱融 解，當培養(yǎng)基溫度降至40-60°C時，加入相應的抗生素(氨芐青霉素)至終濃度為100mg/l， 將25ml倒入直徑為90mm的培養(yǎng)皿中，室溫放置至凝固；②取待轉(zhuǎn)化的pcDNA3. 1 (-)HALR質(zhì)粒1 y 1，無菌水稀釋至100 u 1，冰上備用；③將步驟②的稀釋質(zhì)粒加到SO-lOOiU的感受態(tài)細胞DH5ci中并混勻，冰浴 20min,隨后室溫放置lOmin ；④加入400iU LB培養(yǎng)基，37°C，200rpm振蕩30min，加入步驟③的液體中，然后取 200 u 1鋪在步驟①制備好的含抗生素的LB瓊脂平板上；⑤將步驟④的平板置于室溫直至液體被吸收；⑥倒置平板，于37°C培養(yǎng)，12-16h后長出單克隆菌落。一種優(yōu)選技術方案，其特征在于所述的IfepG2的培養(yǎng)，包括如下步驟(1)從液氮中取出IfepG2細胞凍存管、迅速置于37°C水浴使細胞快速融化；(2) lOOOrpm離心凍存管lmin，棄上清凍存液；(3)向凍存管中加入1ml含10% FBS (胎牛血清)的DMEM培養(yǎng)液，輕輕吹打重懸 細胞；(4)將細胞重懸至預裝10ml含10%FBS的DMEM培養(yǎng)液的75cm2培養(yǎng)瓶中，置37°C， 5% C02，飽和濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，觀察生長狀態(tài)；(5)傳代取對數(shù)生長期H印G2細胞，倒掉DMEM培養(yǎng)液，用0. 02 % EDTA 2ml洗2 次；(6)0. 25%胰酶和0. 02% EDTA按1 1比例約2ml消化細胞l_3min，鏡下觀察細 胞圓縮偽足消失，加入約4ml含10% FBS的DMEM培養(yǎng)液終止消化。(7)輕輕吹打收集細胞，lOOOrpm離心lmin棄上清，以DMEM培養(yǎng)液重懸細胞，根據(jù) 細胞密度和實驗要求分種細胞。一種優(yōu)選技術方案，其特征在于所述的IfepG2的篩選，包括如下步驟(1)將H印G2懸液采用有限稀釋法稀釋至極低的細胞濃度；培養(yǎng)液為MEM培養(yǎng)液 (含10% FBSU00U/ml青霉素、100U/ml鏈霉素、2mmol/L谷氨酰胺等)，將細胞懸液加至96 孔培養(yǎng)板中，平均每孔0. 3ml，在倒置相差顯微鏡下觀察，約1個細胞/孔，再置于37°C，5% C02，飽和濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；；
(2)接種6h后，在倒置相差顯微鏡下觀察細胞的生長狀態(tài)，反復多次，篩選出幾株 生長旺盛的細胞克??；然后用含80mg/l濃度的利多卡因的上述培養(yǎng)液進行進一步篩選，保 留一株生長旺盛、形態(tài)保持良好的細胞系，進行大量培養(yǎng)，再進行胰酶、EDTA消化，傳代后作 進一步功能鑒定。一種優(yōu)選技術方案，其特征在于所述的pcDNA3. 1 (_) HALR質(zhì)粒轉(zhuǎn)染H印G2篩選后 所得的肝腫瘤細胞系，采用VigoFect轉(zhuǎn)染試劑盒進行轉(zhuǎn)染。一種優(yōu)選技術方案，其特征在于所述的pcDNA3. 1 (_) HALR質(zhì)粒轉(zhuǎn)染H印G2篩選后 所得的肝腫瘤細胞系，包括如下步驟(1)取3 ii g的pcDNA3. 1 (-)ALR質(zhì)粒，加入0. 9 %氯化鈉的鹽水至300 yl，靜置 15min ；(2)3 u 1的VigoFect轉(zhuǎn)染試劑，加入0.9%氯化鈉的鹽水至300 iil，靜置5min ；(3)將稀釋后VigoFect試劑緩慢加入步驟①所得質(zhì)粒溶液中，輕輕混勻，室溫靜 置 15min ；(4)將步驟(2)和步驟(3)所得溶液分別緩慢加入3ml細胞培養(yǎng)瓶中，37°C、5 % C02飽和濕度孵箱內(nèi)培養(yǎng)；將穩(wěn)定傳代的HepG2細胞貼壁生長在3ml細胞培養(yǎng)瓶中(37°C、 5% C02、飽和濕度，予含10% FBS的MEM液培養(yǎng)；轉(zhuǎn)染前24h將細胞按1 X 105個/孔濃度接 種于3ml培養(yǎng)瓶中，第二天細胞生長密度達70% ；轉(zhuǎn)染前l(fā)h更換新鮮的含F(xiàn)BS培養(yǎng)液；(5) 16_24h后用含10% FBS的新鮮MEM培養(yǎng)基給細胞換液繼續(xù)培養(yǎng)，24h后觀察細 胞的形態(tài)和活性變化。一種優(yōu)選技術方案，其特征在于所述的對轉(zhuǎn)染的肝細胞系進行篩選，為采用 G418進行篩選。一種優(yōu)選技術方案，其特征在于所述的對轉(zhuǎn)染的肝細胞系進行篩選，包括如下步 驟將轉(zhuǎn)染后的細胞，用含100 u g/L G418的培養(yǎng)液培養(yǎng)2周，然后再采用200 u g/L的G418 的培養(yǎng)液培養(yǎng)2周，最后用300 u g/L G418的培養(yǎng)液培養(yǎng)篩選，2個月后獲得高表達ALR的 肝細胞系。真核細胞系包括從HepG2細胞中篩選出來的具有較強利多卡因代謝的肝細胞系 等所有真核細胞。有益效果本發(fā)明的優(yōu)點在于肝再生增強因子(Augmenter of liver regeneration, ALR) 是一種熱穩(wěn)定、可促肝細胞增殖的細胞性因子，在體內(nèi)肝臟、腎臟等組織廣泛存在，本發(fā)明 的人肝再生增強因子基因轉(zhuǎn)染真核細胞的方法，具有作為生物人工肝構建的開發(fā)的巨大潛 力，可利用基因工程技術大量生產(chǎn)，降低成本，應用于生物人工肝研究與臨床，這一研究在 國內(nèi)外生物人工肝研究中未見報道。除此之外，轉(zhuǎn)染的肝細胞還可以促進肝細胞移植中移 植細胞的生長繁殖或有助于組織器官工程技術的發(fā)展等。下面通過附圖和具體實施方式
對本發(fā)明做進一步說明，但并不意味著對本發(fā)明保 護范圍的限制。


圖 1 是 pcDNA3. 1 (-) HALR 質(zhì)粒結(jié)構圖2是pcDNA3. 1㈠HALR質(zhì)粒的雙酶切后的電泳圖；圖3是轉(zhuǎn)染HALR基因前后細胞生長比較；圖4是轉(zhuǎn)染HALR基因細胞漿內(nèi)熒光圖；圖5為細胞生長曲線的變化。
具體實施例方式實施例具體實施方法通過構建質(zhì)粒p⑶NA3. 1 (-)HALR質(zhì)粒，轉(zhuǎn)染H印G2篩選后所得的肝 腫瘤細胞系，然后用G418進行篩選，用有限稀釋法挑選生長迅速的克隆，建立穩(wěn)定的肝細 胞系，觀察肝細胞活力與繁殖量。一、主要試劑的配置1、抗體稀釋液0. 1% TBST 10ml+0. 5g脫脂奶粉。2、MEM培養(yǎng)液使用前加入10% FBSU00U/ml青霉素、100U/ml鏈霉素、2mmol/L谷
氨酰胺等。3、電泳緩沖液-Tris-乙酸(TAE)貯存液(50 X) 242gTris堿+57. lml冰乙酸 +100ml 0. 5mol/LEDTA(pH8. 0)，去離子水定容至1000ml ；用49份去離子水加1份儲存液稀 釋成工作液(IX)。4,0. 8%瓊脂糖凝膠制備稱取0. 8g瓊脂糖溶解于1XTAE緩沖液100ml中，微波 爐加熱使其融化，冷卻至55°C時加入溴化乙錠EB至終濃度為0. 5 u g/ml。5、LB (Luria-Bertani)培養(yǎng)基配制900ml去離子水中溶解胰化蛋白胨10g，酵母 提取物5g，氯化鈉10g，搖動容器直至溶質(zhì)溶解，用5mol/L NaOH調(diào)pH至7. 0，用去離子水定 容至1000ml。高壓蒸汽滅菌20分鐘。6、0. 25%胰酶0. 25g胰蛋白酶粉劑溶于100ml D-Hank，s液中，0. 22 y m濾器過 濾除菌，-20°C保存，經(jīng)常使用的4°C保存，使用前加熱至37°C。7,0. 02% EDTA 0. 02gEDTA 粉劑溶于 100ml D-Hank，s 液中，0. 22 u m 濾器過濾除
菌，經(jīng)常使用的4°C保存。使用時用lmol/L NaOH調(diào)節(jié)PH值至8.0。8、鼠抗人ALR單克隆抗體為廣州孔祥平教授惠贈。9、熒光素標記羊抗鼠抗體為解放軍302醫(yī)院傳染病研究所研制。10、真核轉(zhuǎn)染試劑威格拉斯生物技術有限公司生產(chǎn)的高效真核轉(zhuǎn)染試劑 (vigofect)。二、H印G2的培養(yǎng)及篩選1、HepG2的復蘇及培養(yǎng)1)從液氮中取出IfepG2細胞凍存管、迅速置于37°C水浴使細胞迅速融化；2) lOOOrpm離心凍存管lmin，棄上清凍存液；3)向凍存管中加入lml含10% FBS的DMEM培養(yǎng)液，輕輕吹打重懸細胞；4)將細胞重懸至預裝10ml含10%FBS的DMEM培養(yǎng)液的75cm2培養(yǎng)瓶中，置37°C， 5% C02，飽和濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，觀察生長狀態(tài)；5)傳代取對數(shù)生長期H印G2細胞，倒掉DMEM培養(yǎng)液，用0. 02 % EDTA 2ml洗2 次；
6)0. 25%胰酶和0. 02% EDTA按1 1比例約2ml消化細胞l_3min，鏡下觀察細 胞圓縮偽足消失，加入約4ml含10% FBS的DMEM培養(yǎng)液終止消化；7)輕輕吹打收集細胞，lOOOrpm離心lmin棄上清，以DMEM培養(yǎng)液重懸細胞，根據(jù) 細胞密度和實驗要求分種細胞。2、IfepG2細胞的篩選(1)將H印G2懸液采用有限稀釋法稀釋至極低的細胞濃度；培養(yǎng)液為MEM培養(yǎng)液 (含10% FBSUOOU/ml青霉素、100U/ml鏈霉素、2mmol/L谷氨酰胺等)，將細胞懸液加至96 孔培養(yǎng)板中，平均每孔0. 3ml，在倒置相差顯微鏡下觀察，約1個細胞/孔，再置于37°C，5% C02，飽和濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。(2)接種6h后，在倒置相差顯微鏡下觀察細胞的生長狀態(tài)，反復多次，篩選出幾株 生長旺盛的細胞克隆；然后用含80mg/l濃度的利多卡因的上述培養(yǎng)液進行進一步篩選，保 留一株生長旺盛、形態(tài)保持良好的細胞系，進行大量培養(yǎng)，再進行胰酶、EDTA消化，傳代后作 進一步功能鑒定。三、pcDNA3.1(_)HALR 質(zhì)粒的鑒定1)質(zhì)粒的構建pcDNA3. 1 (-)HALR質(zhì)粒結(jié)構如圖1所示。2)轉(zhuǎn)化操作步驟①相應抗生素的LB瓊脂平板的制備將含有1. 5%瓊脂的LB固體培養(yǎng)基加熱融 解，當培養(yǎng)基溫度降至50°C左右時，加入相應的抗生素(氨芐青霉素)至終濃度為100mg/l 的，將25ml倒入直徑為90mm的培養(yǎng)皿中，室溫放置至凝固。②取待轉(zhuǎn)化的pcDNA3. 1 (-)HALR質(zhì)粒1 ii 1，無菌水稀釋至100 u 1，冰上備用。③將步驟②的稀釋質(zhì)粒加入到一管感受態(tài)細胞DH5 a (約80_100 u 1)中并混勻， 冰浴20min，隨后室溫放置lOmin。④加入400iU LB培養(yǎng)基，37°C，200rpm振蕩30min，加入步驟3的液體中，然后取 200 u 1鋪在步驟1制備好的含抗生素的LB瓊脂平板上。⑤將步驟4的平板置于室溫直至液體被吸收。⑥倒置平板，于37°C培養(yǎng)，12-16h后可長出單克隆菌落。3)質(zhì)粒的提取純化(北京博大泰克公司，去內(nèi)毒素小量質(zhì)粒提取試劑盒)(1)挑取生長獨立、大而圓的單克隆菌落接種到5ml LB培養(yǎng)基中，37°C，200rpm過 夜振蕩培養(yǎng)。(2) lOOOOrpm離心lmin收集過夜培養(yǎng)的菌液，棄去上清并吸除剩余的培養(yǎng)液。(3)加入250 ill細胞重懸液(Cell Resuspension Solution)旋渦震蕩以充分懸 浮細胞。(4)加入250 u 1細胞裂解液(Cell Lysis Solution)顛倒離心管4次以充分混 合，孵育至細胞懸浮液澄清，孵育時間不要超過5min。(5)加入10 ii 1堿性蛋白酶溶液(Alkaline Protease Solution)顛倒離心管4 次，室溫孵育5min。(6)加入350 u 1中和溶液(Neutralization Solution)并迅速顛倒離心管4次以 充分混合。(7)室溫將細胞裂解液以14000rpm速度離心lOmin。
(8)對于每一個樣品將一個離心柱插入一個2ml收集管中，將7步收集的澄清裂解 液轉(zhuǎn)移至離心柱中。(9)室溫以14000rpm速度離心上清液lmin，從收集管中取出離心管并棄去收集管 中的液體，將離心柱重新插入收集管中。(10)加入750 ill已用95%的酒精稀釋過的柱洗溶液(Wash Solution)，室溫以 14000rpm速度離心lmin，從收集管中取出離心管并棄去收集管中的液體，將離心柱重新插 入收集管中。(11)加入250 ill柱洗溶液重復清洗步驟，室溫以14000rpm速度離心2min。(12)將離心柱轉(zhuǎn)移至一個新的1.5ml消毒離心管中，加入100 ill無核酸酶的水以 洗脫質(zhì)粒DNA，室溫14000rpm速度離心lmin。(13)取出離心柱，將純化所得的質(zhì)粒DNA放于-20°C保存。測260/280值，測定質(zhì)粒的濃度。
4)質(zhì)粒的鑒定
(1)序列測定提取純化后質(zhì)粒進行酶切鑒定，鑒定與預期結(jié)果相符后將標本送北京華大生物技術公司進行序列測定。
HALR片段的序列分析
ATGCGGACGCAGCAGAAGCGGGACACCAAGTTTAGGGAGGACTGCCCGCCGGATCGCGAGGAACTGGGC
CGCCACAGCTGGGCTGTCCTCCACACCCTGGCCGCCTACTACCCCGACCTGCCCACCCCAGAACAGCAG
CAAGACATGGCCCAGTTCATACATTTATTTTCTAAGTTTTACCCCTGTGAGGAGTGTGCTGAAGACCTA
AGAAAAAGGCTGTGCAGGAACCACCCAGACACCCGCACCCGGGCATGCTTCACACAGTGGCTGTGCCAC
CTGCACAATGAAGTGAACCGCAAGCTGGGCAAGCCTGACTTCGACTGCTCAAAAGTGGATGAGCGCTGG
CGCGACGGCTGGAAGGATGGCTCCTGTGACTAG
序列測定結(jié)果和HALR序列完全相符，參見序列表。
(2)雙酶切鑒定
去離子水 15 Pi
10 X Buffer L 2 u 1
重組質(zhì)粒 liU 37°C酶切4h
Ecol I lu 1 0.8%瓊脂糖電泳分析鑒定
BamH I 1 u 1
雙酶切后的電泳圖如圖2所示，是pcDNA3. 1㈠HALR質(zhì)粒的雙酶切后的電泳圖，
含ALR載體質(zhì)粒經(jīng)Ecol 1和BamHl雙酶切后的0. 8%瓊脂糖電泳照片。圖2中1為未酶切 的質(zhì)粒；2為DNA Marke ；3為Ecol I單酶切；4為Ecol 1和BamHI雙酶切。結(jié)果說明經(jīng)雙 酶切后，成功從質(zhì)粒中切除片斷約378bp大小的片斷，與所需片斷相符。四、pcDNA3. 1(-)HALR質(zhì)粒的轉(zhuǎn)染及肝細胞系的篩選穩(wěn)定傳代的上述篩選出的H印G2細胞貼壁生長在3ml培養(yǎng)瓶中(37°C、5% C02、飽 和濕度)，培養(yǎng)液含10% FBS的DMEM液。按Vigofect轉(zhuǎn)染試劑盒操作要求，轉(zhuǎn)染前24h將細 胞按1 X 105個/孔濃度接種于3ml培養(yǎng)瓶中，第二天細胞生長密度達70 %。轉(zhuǎn)染前l(fā)h更換 新鮮的含F(xiàn)BS培養(yǎng)液。轉(zhuǎn)染共分3組，分別是質(zhì)粒pcDNA3. 1(-)HALR組、空載體pcDNA3. 1(_) 組和空白對照組。
轉(zhuǎn)染按照試劑盒說明操作，具體如下①取3iig的pcDNA3. 1 (-)HALR質(zhì)粒，加入0. 9 %氯化鈉的鹽水至300 yl，靜置 15min,②取3iil的VigoFect轉(zhuǎn)染試劑，加入0. 9%氯化鈉的鹽水至300iil，靜置5min，③將稀釋后VigoFect試劑緩慢加入步驟①所得質(zhì)粒溶液中，輕輕混勻，室溫靜置 15min，④將步驟②和步驟③所得溶液分別緩慢加入3ml細胞培養(yǎng)瓶中，空白對照組不加 質(zhì)粒。37°C、5% 0)2飽和濕度孵箱內(nèi)培養(yǎng)，⑤16-24h后用含10% FBS的新鮮MEM培養(yǎng)基給細胞換液繼續(xù)培養(yǎng)，24h后觀察細 胞的形態(tài)和活性變化。 上述轉(zhuǎn)化后的細胞，用含100、200、3001^/1的6418逐步(含1001^/1 G418 的培養(yǎng)液培養(yǎng)2周，然后再采用200 u g/L的G418的培養(yǎng)液培養(yǎng)2周，最后予300 u g/LG418 的培養(yǎng)液培養(yǎng))篩選，2個月后獲得能較高表達HALR的肝細胞系。圖3是轉(zhuǎn)染HALR基因前后細胞生長比較，經(jīng)篩選克隆后肝細胞系的形態(tài)見圖3中 左圖；轉(zhuǎn)染HALR后肝細胞系的形態(tài)見圖3中右圖。可見肝細胞形態(tài)保持穩(wěn)定，轉(zhuǎn)染HALR質(zhì) 粒的肝細胞胞漿中顆粒豐富，形態(tài)規(guī)則，生長旺盛。五、間接免疫熒光檢測ALR在真核細胞中的表達(1)首先將明確是能較高表達ALR的肝細胞系培養(yǎng)在玻片培養(yǎng)管中，48h后觀測細 胞的形態(tài)，如果細胞生長至70-80%，即可取出，放入-20度的丙酮中過夜固定。(2)取出肝細胞玻片，0.9%生理鹽水沖洗，加入按1 80濃度的鼠抗人ALR單克 隆抗體，37°C作用30min，然后用O.Olmol/L PH 7. 2的PBS洗兩次，lOmin后用吸水紙吸取 或吹風機吹干液體。(3)再滴加入熒光素標記羊抗鼠抗體(二抗)，同上步驟，37°C染色30min，生理鹽 水洗2次，甘油或中性樹膠封固，再熒光顯微鏡下觀察并照片，如圖4所示。圖4是轉(zhuǎn)染HALR 基因細胞漿內(nèi)熒光圖，可見細胞胞漿中可見大量發(fā)出熒光標志的物質(zhì)，即為轉(zhuǎn)染的人ALR， 細胞系表達人ALR較強，表明轉(zhuǎn)染成功。六、HALR轉(zhuǎn)染前后肝細胞系的生長與增殖測定①取單層培養(yǎng)的兩種肝細胞系(轉(zhuǎn)染前肝細胞系，轉(zhuǎn)染HALR的細胞系)。棄培養(yǎng) 液，D-Hanks液洗2次，消化并收集細胞(方法同傳代培養(yǎng))；②用紅細胞計數(shù)板計數(shù)(臺盼藍染色細胞活度> 90% )后，分別用普通細胞培養(yǎng) 液調(diào)整細胞密度為1 x 105個細胞/ml，以每孔200 u 1接種于7個96孔培養(yǎng)板中，每組6孔， 置入37°C、5% C02、飽和濕度孵箱內(nèi)培養(yǎng)。③每日分別用普通細胞培養(yǎng)液和換液。④于接種后第1-7天每天取出一塊培養(yǎng)板用MTT法測細胞的光吸收值(A45CI)。⑤具體方法每孔加5mg/ml MTT溶液20iil，37°C、5% C02、飽和濕度孵箱內(nèi)繼 續(xù)孵育4h后，小心吸棄孔內(nèi)上清液，D-Hanks液輕洗3次，每孔加入二甲亞砜150 yl，振 蕩lOmin使沉淀充分溶解后，選擇450nm波長，在酶聯(lián)免疫檢測儀上測定各孔的光吸收值
(A450)，⑥記錄結(jié)果，并以時間為橫軸、光吸收值為縱軸繪制細胞生長曲線，如圖5所示。轉(zhuǎn)染HALR質(zhì)粒的肝細胞生長較未轉(zhuǎn)染的肝細胞生長旺盛，生長速度明顯增快，在細胞培養(yǎng) 前4天尤為突出。第一天轉(zhuǎn)染與未轉(zhuǎn)染HALR質(zhì)粒的肝細胞的A450值分別為0. 224和0.314。 第二天轉(zhuǎn)染與未轉(zhuǎn)染HALR質(zhì)粒的肝細胞的A450值分別為0. 318和0. 409。有顯著性差別。七、利多卡因轉(zhuǎn)化實驗細胞單層培養(yǎng)72小時后，在培養(yǎng)液中加入80mg/L的利多卡因，繼續(xù)培養(yǎng)肝細胞24 小時，每8小時留取培養(yǎng)液標本用四級桿氣質(zhì)聯(lián)用儀Trance/DSQII檢測利多卡因濃度。利多卡因轉(zhuǎn)化實驗結(jié)果單層培養(yǎng)肝細胞72h后，在培養(yǎng)液中加入80mg/L的利多 卡因，8小時后利多卡因濃度平均56. 40mg/L, 16小時后濃度平均為31. 26mg/L, 24小時后濃 度平均為9. 26mg/L。采用有限稀釋法從人肝細胞系H印G2細胞中篩選出來的肝細胞系，生長比較旺 盛，而且由一定的利多卡因代謝功能，經(jīng)轉(zhuǎn)染人肝細胞再生增強因子后，再經(jīng)多濃度G418 篩選，細胞形態(tài)、功能保持良好，對其在生物人工肝研究和/或體外人ALR的生產(chǎn)有一定的 現(xiàn)實意義。本發(fā)明利用基因工程技術生產(chǎn)肝再生增強因子，然后轉(zhuǎn)染真核細胞，促進真核細 胞的生長繁殖，在作為生物人工肝生物反應器細胞生長促進劑或體內(nèi)肝細胞移植等領域具 有很大的應用前景。序列表<110>中國人民解放軍第三零二醫(yī)院<120>肝再生增強因子基因轉(zhuǎn)染真核細胞的方法及應用<130><160>1<170>PatentIn version 3. 3<210>1<211>378<212>DNA<213>HALR片段的核苷酸序列<400>1atgcggacgc agcagaagcg ggacaccaag tttagggagg actgcccgcc ggatcgcgag 60gaactgggcc gccacagctg ggctgtcctc cacaccctgg ccgcctacta ccccgacctg 120cccaccccag aacagcagca agacatggcc cagttcatac atttattttc taagttttac 180ccctgtgagg agtgtgctga agacctaaga aaaaggctgt gcaggaacca cccagacacc 240cgcacccggg catgcttcac acagtggctg tgccacctgc acaatgaagt gaaccgcaag 300ctgggcaagc ctgacttcga ctgctcaaaa gtggatgagc gctggcgcga cggctggaag 360gatggctcct gtgactag 378
權利要求
一種人肝再生增強因子基因轉(zhuǎn)染真核細胞的方法，其步驟如下構建pCDNA3.1(-)HALR質(zhì)粒；進行HepG2的培養(yǎng)及篩選，得肝細胞系；pcDNA3.1(-)HALR質(zhì)粒轉(zhuǎn)染HepG2篩選后所得的肝細胞系；然后對轉(zhuǎn)染的肝細胞系進行篩選；用有限稀釋法挑選生長迅速的克隆，建立穩(wěn)定的ALR肝細胞系。
2.根據(jù)權利要求1所述的人肝再生增強因子基因轉(zhuǎn)染真核細胞的方法，其特征在于 所述的構建P⑶NA3. 1 (-)HALR質(zhì)粒以后，還要進行提取純化。
3.根據(jù)權利要求1所述的人肝再生增強因子基因轉(zhuǎn)染真核細胞的方法，其特征在于 所述的構建P⑶NA3. 1 (-) HALR質(zhì)粒，包括如下步驟①相應抗生素的LB瓊脂平板的制備將含有1.5%瓊脂的LB固體培養(yǎng)基加熱融解，當 培養(yǎng)基溫度降至40-60°C時，加入相應的抗生素氨芐青霉素至終濃度為100mg/l，將25ml倒 入直徑為90mm的培養(yǎng)皿中，室溫放置至凝固；②取待轉(zhuǎn)化的pcDNA3.1(-)HALR質(zhì)粒1μ 1，無菌水稀釋至100 μ 1，冰上備用；③將步驟②的稀釋質(zhì)粒加到80-100μ 1的感受態(tài)細胞DH5 α中并混勻，冰浴20min，隨 后室溫放置IOmin ；④加入400μ 1 LB培養(yǎng)基，37 °C，200rpm振蕩30min，加入步驟③的液體中，然后取 200 μ 1鋪在步驟①制備好的含抗生素的LB瓊脂平板上；⑤將步驟④的平板置于室溫直至液體被吸收；⑥倒置平板，于37°C培養(yǎng)，12-16h后長出單克隆菌落。
4.根據(jù)權利要求1所述的人肝再生增強因子基因轉(zhuǎn)染真核細胞的方法，其特征在于 所述的轉(zhuǎn)染為采用VigoFect轉(zhuǎn)染試劑盒進行轉(zhuǎn)染。
5.根據(jù)權利要求1-4任一項所述的人肝再生增強因子基因轉(zhuǎn)染真核細胞的方法，其特 征在于所述的轉(zhuǎn)染的具體步驟如下(1)取3μ g的pcDNA3. 1㈠ALR質(zhì)粒，加入0.9%氯化鈉的鹽水至300 μ 1,靜置15min ；(2)3μ 1的VigoFect轉(zhuǎn)染試劑，加入0. 9%氯化鈉的鹽水至300 μ 1，靜置5min ；(3)將稀釋后VigoFect試劑緩慢加入步驟①所得質(zhì)粒溶液中，輕輕混勻，室溫靜置 15min ；(4)將步驟(2)和步驟(3)所得溶液分別緩慢加入3ml細胞培養(yǎng)瓶中，37°0、5%0)2飽 和濕度孵箱內(nèi)培養(yǎng)；將穩(wěn)定傳代的IfepG2細胞貼壁生長在3ml細胞培養(yǎng)瓶中37°C、5% CO2, 飽和濕度，予含10% FBS的MEM液培養(yǎng)；轉(zhuǎn)染前24h將細胞按1 X IO5個/孔濃度接種于3ml 培養(yǎng)瓶中，第二天細胞生長密度達70% ；轉(zhuǎn)染前Ih更換新鮮的含F(xiàn)BS培養(yǎng)液；(5)16-24h后用含10% FBS的新鮮MEM培養(yǎng)基給細胞換液繼續(xù)培養(yǎng)，24h后觀察細胞的 形態(tài)和活性變化。
6.根據(jù)權利要求1所述的人肝再生增強因子基因轉(zhuǎn)染真核細胞的方法，其特征在于 所述的對轉(zhuǎn)染的肝細胞系進行篩選，為采用G418進行篩選。
7.根據(jù)權利要求6所述的人肝再生增強因子基因轉(zhuǎn)染真核細胞的方法，其特征在于 所述的采用G418進行篩選的步驟如下將轉(zhuǎn)染后的細胞，用含100μ g/L G418的培養(yǎng)液培 養(yǎng)2周，然后再采用200 μ g/L的G418的培養(yǎng)液培養(yǎng)2周，最后用300μ g/LG418的培養(yǎng)液 培養(yǎng)篩選，2個月后獲得高表達ALR的肝細胞系。
8.根據(jù)權利要求1所述方法建立的含人工轉(zhuǎn)染人肝再生增強因子基因的真核細胞株在生物人工肝和體外人ALR的生產(chǎn)中的應用
全文摘要
本發(fā)明涉及一種人肝再生增強因子轉(zhuǎn)染真核細胞的方法，屬于生物工程的生產(chǎn)方法，包括構建pCDNA3.1(-)HALR質(zhì)粒，進行HepG2的培養(yǎng)及篩選；pcDNA3.1(-)HALR質(zhì)粒轉(zhuǎn)染HepG2篩選后所得的肝腫瘤細胞系；然后對轉(zhuǎn)染的肝細胞系進行篩選，用有限稀釋法挑選生長迅速的克隆，建立穩(wěn)定的肝細胞系。本發(fā)明的人肝再生增強因子轉(zhuǎn)染真核細胞的方法，具有作為生物人工肝構建的開發(fā)的巨大潛力，可利用基因工程技術大量生產(chǎn)，降低成本，應用于生物人工肝研究與臨床。除此之外，轉(zhuǎn)染的肝細胞還有可能促進肝細胞移植中移植細胞的生長繁殖或有助于組織器官工程技術的發(fā)展等。
文檔編號C12R1/91GK101845457SQ200910080850
公開日2010年9月29日 申請日期2009年3月24日 優(yōu)先權日2009年3月24日
發(fā)明者劉鴻凌, 游紹莉, 王業(yè)東, 王志杰, 胡燕, 貌盼勇, 辛紹杰 申請人:中國人民解放軍第三〇二醫(yī)院