專利名稱：通過(guò)三官能雙特異性抗體破壞表達(dá)低至中等水平的腫瘤相關(guān)靶抗原的腫瘤細(xì)胞的制作方法
通過(guò)三官能雙特異性抗體破壞表達(dá)低至中等水平的腫瘤相關(guān)靶抗原的腫瘤細(xì)胞本申請(qǐng)是申請(qǐng)日為2007年2月15日、標(biāo)題為“通過(guò)三官能雙特異性抗體破壞表達(dá)低至中等水平的腫瘤相關(guān)靶抗原的腫瘤細(xì)胞”的中國(guó)專利申請(qǐng)N0.200780012777.8的分案申請(qǐng)。本發(fā)明涉及三官能雙特異性抗體用于制備預(yù)防和治療腫瘤疾病的藥物組合物的應(yīng)用。在免疫治療過(guò)程中通過(guò)單特異性單克隆抗體治療腫瘤中的一個(gè)迄今尚未解決的問(wèn)題是對(duì)具有低至中等表達(dá)水平的腫瘤靶抗原的腫瘤細(xì)胞破壞的功效不足性。一個(gè)具體的實(shí)例是對(duì)具有低至中等表達(dá)水平的靶抗原Her2/neU的乳腺癌的治療；另一個(gè)具體的實(shí)例是對(duì)具有低表達(dá)水平的CD20腫瘤抗原的非霍奇金淋巴瘤和慢性淋巴白血病的治療。轉(zhuǎn)移性乳腺癌是幾乎總是致死性的疾病。從轉(zhuǎn)移的第一次表現(xiàn)起的平均存活時(shí)間在17到20個(gè)月范圍內(nèi)。許多內(nèi)分泌、細(xì)胞毒性和生物學(xué)試劑已經(jīng)表現(xiàn)出減輕的功效，但是不存在一致的護(hù)理標(biāo)準(zhǔn)，并且治療通常引起實(shí)質(zhì)上的副作用。表皮生長(zhǎng)因子(EGF)家族成員Her2/neu在大約25-30%的乳腺癌患者的腫瘤標(biāo)本中過(guò)量表達(dá)，并且其歸因于更具攻擊性的腫瘤生長(zhǎng)和更壞的預(yù)后。EGF 受體家族包括 4 個(gè)成員:EGFR(ERBBl)，Her2/neu(ERBB2)，ERBB3 和 ERBB4。EGFR和Her2/neu已被作為治療靶點(diǎn)進(jìn)行集中研究。靶向EGFR和Her2/neu的其余的細(xì)胞結(jié)構(gòu)域的抗體以及抑制細(xì)胞內(nèi)受體信號(hào)傳導(dǎo)的小分子化合物已經(jīng)用于臨床應(yīng)用，并且已經(jīng)表現(xiàn)出臨床功效。然而，它們 的抗腫瘤作用通常不如臨床前研究預(yù)測(cè)的那樣強(qiáng)，并且優(yōu)選與化學(xué)治療結(jié)合。Herceptin 是廣泛用于乳腺癌治療的公認(rèn)的單克隆抗體；然而，Herceptin 只
可以成功地用于在他們的腫瘤細(xì)胞上具有至少2+/FISH+(其通過(guò)所謂的HercepTest 和陽(yáng)性FISH-分析驗(yàn)證)或3+的靶抗原Her2/neu表達(dá)水平的患者。一些研究已經(jīng)表明，為了獲得統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著的存活，具有Her2/neU的額外基因擴(kuò)增(通過(guò)陽(yáng)性FISH檢測(cè)反映)的靶抗原Her2/neu的相對(duì)高的表達(dá)密度是必需的。臨床前體外實(shí)驗(yàn)還表明Herceptin 對(duì)腫瘤細(xì)胞的有效破壞只在腫瘤細(xì)胞表達(dá)高水平的靶抗原Her2/neu時(shí)是明顯的。這些限制是只有大約25-30 %的患有在他們的腫瘤上表達(dá)高水平的Her2/neu(用Dako HercepTest得分2+/FISH+或3+)的轉(zhuǎn)移性乳腺癌的患者可以有效地使用Herceptin 進(jìn)行治療的原因。在Perez和同事的研究中，使用免疫組織化學(xué)(IHC)評(píng)估，35%的乳腺癌患者得分為 Her21+, 14%為 2+,和 13%為 3+(Perez EA 等:Her2testingin patients with breastcancer:poor correlation between weak positivity byimmunohistochemistry andgene amplification by fluorescence in situhybridization(在患有乳腺癌的患者中的Her2檢測(cè):通過(guò)免疫組織化學(xué)的弱陽(yáng)性和通過(guò)原位雜交熒光的基因擴(kuò)增之間的弱相關(guān)性).Mayo ClinProc (Mayo 臨床進(jìn)展)2002 ；77:148-154)。Kiewe, P.等:“Phase I trial of the trifunctional anti~Her2 xant1-CD3antibody ertumaxomab in metastatic breast cancer (三官倉(cāng)泛抗_Her2x抗_CD3抗體ertumaxomab在轉(zhuǎn)移性乳腺癌中的I期試驗(yàn))” ;Journal ofClinical Oncology (臨床腫瘤學(xué)雜志)，第23卷，編號(hào)16S，2005年6月I日(ASC0摘要2205-06-01)描述了靶向Her2/neU和CD3的完整雙特異性單克隆抗體的應(yīng)用。這種抗體用于治療轉(zhuǎn)移性乳腺癌的I期試驗(yàn)中。為了研究通過(guò)這種抗-Herf/neu x抗-⑶3抗體引起的任何副作用，和為了加快招募必要數(shù)目的17名患者，檢測(cè)了具有HercepTest 得分1+(25% ),2+(12,5% )和3+(62,5% )的患者。在這一初步的結(jié)果分析中在15名可評(píng)價(jià)的患者中有4名觀察到抗腫瘤反應(yīng)。然而，落入HercepTest 得分1+內(nèi)的這些患者沒(méi)有一名表現(xiàn)出抗腫瘤反應(yīng)。完全沒(méi)有給出關(guān)于這些反應(yīng)者的Her2/neU表達(dá)狀態(tài)的信息。另外，在這種I期研究的設(shè)計(jì)時(shí)，只有ertumaxomab消除表達(dá)高水平(3+得分)的Her2/neu的細(xì)胞系(例如，Sk-Br-3)的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)是可用的。如同在所有典型的I期試驗(yàn)中，Kiewe等的I期試驗(yàn)設(shè)計(jì)成研究所述三官能抗體ertumaxomab的安全性和耐受性。在這一試驗(yàn)中的次級(jí)變量是抗腫瘤活性和不同免疫學(xué)參數(shù)的測(cè)量。為了加快對(duì)本研究的患者招募，關(guān)于在患者腫瘤細(xì)胞上的Her2/neu的表達(dá)不加以限制。這是可能的，原因在于本研究的主要目的是安全性和耐受性，而Her2/neU在腫瘤細(xì)胞上的表達(dá)水平完全不重要。 三官能抗體抗_HER2x抗-Q)3ertumaxomnab似乎只在與得分2+和3+ —致的過(guò)表達(dá)Her2/neu的患者中有效的發(fā)現(xiàn)完全不令人吃驚，也如同使用如Herceptin 的抗體進(jìn)行的其它研究表現(xiàn)出只對(duì)以中等(2+/FISH+)到高水平(3+)表達(dá)Her2/neu的患者有效。例如，Gatzemeier等，Anals of Oncology (腫瘤學(xué)分析)15:19-27, 2004 提供了如曲妥單抗的抗體的確只對(duì)在3+或2+/FISH+之內(nèi)的Her2/neu表達(dá)的患者提供臨床益處的證據(jù)。類似地，Micromet公司(Micromet, Inc.)于2006年10月2日公布了關(guān)于使用adecatumumab的2次II期試驗(yàn)的數(shù)據(jù)，所述adecatumumab是一種針對(duì)乳腺癌和前列腺癌中的表皮細(xì)胞黏附分子EpCAM的抗體。只有在他們的腫瘤組織上表達(dá)高水平的EpCAM的患者表現(xiàn)出進(jìn)展時(shí)間的顯著延長(zhǎng)，而具有低EpCAM表達(dá)的患者沒(méi)有表現(xiàn)出顯著的受益。強(qiáng)調(diào)的是adecatumumab可以為患有高度過(guò)量表達(dá)的EpCAM的乳腺癌的患者提供治療選擇。對(duì)于具有低EpCAM過(guò)量表達(dá)的患者完全沒(méi)有發(fā)現(xiàn)有效性。非霍奇金淋巴瘤(NHL)和慢性淋巴白血病(CLL)是最普遍的惡性病之一。在美國(guó)NHL是第五最常見(jiàn)的惡性病，年發(fā)病率為18-20/100，000個(gè)體。直到20世紀(jì)90年代中期，NHL的發(fā)病率每年增加5-10%1,但是從那時(shí)起保持恒定。2CLL是西方國(guó)家中最常見(jiàn)的白血病，年發(fā)病率為3-4/100，000個(gè)體。除了在使用抗-CD20單克隆抗體利妥昔單抗(特別與化學(xué)治療結(jié)合)的B-細(xì)胞淋巴瘤治療中的有希望的結(jié)果之外，患者最終復(fù)發(fā)。9’35因此，存在對(duì)于進(jìn)一步的治療選擇的需求。目前，除了在正式批準(zhǔn)單克隆抗體如利妥昔單抗和alemtuzumab后獲得的治療中的主要改進(jìn)的事實(shí)之外，無(wú)痛性NHL和CLL都是不可治愈的疾病。μ盡管抗體單一治療尚未高度成功，特別在CLL中，單克隆抗體與標(biāo)準(zhǔn)化學(xué)治療方案的結(jié)合顯著改善了患者的結(jié)果。7’8然而，患者最終復(fù)發(fā)，9并且新的治療策略經(jīng)歷令人失望的尋找。許多新藥候選諸如完全人源化的抗-⑶20抗體或靶向其它抗原(例如，⑶19，⑶22，⑶23，⑶80或HLA-DR)的抗體目前正處于集中的研究中。lcl’n除了尋找新的靶點(diǎn)，提高抗體治療的另一途徑是開(kāi)發(fā)雙特異性抗體。已經(jīng)開(kāi)發(fā)和檢測(cè)了許多雙特異性形式，例如，在細(xì)胞雜交瘤(quadroma)細(xì)胞中產(chǎn)生的全長(zhǎng)抗體,化學(xué)交聯(lián)的F(ab)2片段，單鏈抗體，12和雙抗體。13已經(jīng)檢測(cè)了這些抗體中的一些用于治療人淋巴瘤。然而，除了有希望的體外功效之外，這些分子僅表現(xiàn)出有限的臨床益處。14_16針對(duì)B-細(xì)胞-特異性抗原如⑶19或⑶20的雙特異性抗體在最近10-15年內(nèi)已經(jīng)處于廣泛的研究中，但是迄今為止獲得只表現(xiàn)出中等反應(yīng)的有限的臨床數(shù)據(jù)14’36’37。此外，復(fù)雜的和效率低的制備過(guò)程使其難以生產(chǎn)充足量的抗體用于臨床應(yīng)用。雙特異性抗體(bsAb)是通過(guò)重新定向針對(duì)腫瘤細(xì)胞的效應(yīng)細(xì)胞而進(jìn)行例如惡性細(xì)胞的免疫學(xué)治療的工具。然而，bsAbs正常僅重新定向和激活單一種類的效應(yīng)細(xì)胞，SP，T-細(xì)胞，NK-細(xì)胞，F(xiàn)e Y RI+，或Fca RI+細(xì)胞，因此限制了它們的功效。已經(jīng)描述了所有這些現(xiàn)有技術(shù)抗體只在腫瘤-相關(guān)抗原以中等至高水平在所述腫瘤細(xì)胞表面上表達(dá)時(shí)有效地治療腫瘤。增強(qiáng)抗體的免疫學(xué)效應(yīng)子功能反映了一種提高基于抗體的癌癥治療功效的途徑。本作者已經(jīng)描述了具有提高的效應(yīng)子功能的三官能雙特異性抗體，例如，在Zeidler，等.(18), Riesenberg 等.(22), Ruf&Lindhofer (20)或 Heiss 等.(21)的公布中描述，所述三官能雙特異性抗體不僅用其兩個(gè)結(jié)合臂識(shí)別腫瘤細(xì)胞和T淋巴細(xì)胞，而且通過(guò)它們的Fe區(qū)域結(jié)合Fe Y -受體陽(yáng)性佐細(xì)胞。然而，這些抗體到目前為止也沒(méi)有已知有效用于治療以低水平表達(dá)腫瘤-相關(guān)抗原如Her2/neu或⑶20的腫瘤細(xì) 胞。上文關(guān)于Her2/neu，EpCAM和⑶20解釋的限制也對(duì)其它腫瘤-相關(guān)的抗原如，例如，G250，⑶3，⑶2，蛋白聚糖，MHC II，EGF-R和CEA有效。總結(jié)而言，到本發(fā)明的優(yōu)先權(quán)日期之前可用的所有實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)只提供了對(duì)具有腫瘤抗原的中等至高過(guò)量表達(dá)的患者顯著有益的證據(jù)。因此，存在對(duì)于提高這樣的抗體的抗腫瘤活性的需求，所述抗體還可以殺死，例如，Her2/neu低表達(dá)腫瘤細(xì)胞(使用Dako HercepTest 得分例如為1+)或以至多500，000腫瘤-相關(guān)抗原/腫瘤細(xì)胞的中等水平表達(dá)Her2/neu并且使用Dako HercepTest 得分為2+但是FISH陰性，或⑶20低表達(dá)腫瘤細(xì)胞，或以某種水平并且在涵蓋約1，000-350, 000，特別地5，000-150，000腫瘤相關(guān)抗原/腫瘤細(xì)胞的范圍內(nèi)表達(dá)上文詳細(xì)描述的腫瘤相關(guān)抗原中的一種或多種，特別是⑶20和EpCAM的這樣的腫瘤細(xì)胞。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)上述問(wèn)題由從具有下述特征的三官能雙特異性抗體選擇的促進(jìn)不同種類的免疫細(xì)胞的協(xié)作的抗體而解決:(a)結(jié)合T細(xì)胞；(b)結(jié)合在腫瘤細(xì)胞上的至少一種腫瘤-相關(guān)抗原，所述抗原選自由Her2/neu,CD20，EpCAM, G250,⑶3，⑶2，蛋白聚糖，MHC II，EGF-R 和 CEA 組成的組；(c)通過(guò)它們的Fe-部分結(jié)合Fe Y -受體I型和/或III型陽(yáng)性細(xì)胞；所述抗體用于制備用來(lái)預(yù)防和治療腫瘤疾病的藥物組合物，其中在所述腫瘤疾病中，所述腫瘤-相關(guān)抗原在所述腫瘤細(xì)胞上以下述量表達(dá):.對(duì)于Her2/neu,以約5，000-約150，000腫瘤-相關(guān)抗原/腫瘤細(xì)胞的量，或
.在檢測(cè)為FISH陰性的腫瘤細(xì)胞中，對(duì)于Her2/neu，以約至多500，000腫瘤-相關(guān)抗原/腫瘤細(xì)胞的量，或.對(duì)于⑶20，以約1,000-約350，000腫瘤-相關(guān)抗原/腫瘤細(xì)胞的量，或.對(duì)于 EpCAM, G250，蛋白聚糖，GD2, GD3, MHC II，EGF-R 和 CEA,以約 I, 000-約350，000，優(yōu)選地至多約300，000腫瘤-相關(guān)抗原/腫瘤細(xì)胞的量。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，所有所述的腫瘤抗原都以約5，000到約150，000腫
瘤-相關(guān)抗原/腫瘤細(xì)胞的量在腫瘤細(xì)胞上表達(dá)。本發(fā)明還提供關(guān)于預(yù)防和治療腫瘤疾病而治療人或動(dòng)物的方法，其通過(guò)將包含人或動(dòng)物的腫瘤細(xì)胞的機(jī)體或含有所述腫瘤細(xì)胞的這些機(jī)體的部分的與藥學(xué)有效量的三官能雙特異性抗體接觸，所述三官能雙特異性抗體具有下述特征:(a)結(jié)合T細(xì)胞；(b)結(jié)合在腫瘤細(xì)胞上的至少一種腫瘤-相關(guān)抗原，所述抗原選自由Her2/neu,CD20，EpCAM, G250,⑶3，⑶2，蛋白聚糖，MHC II，EGF-R 和 CEA 組成的組；(c)通過(guò)它們的Fe-部分結(jié)合Fe Y-受體I型和/或III型陽(yáng)性細(xì)胞；其中所述腫瘤-相關(guān)抗原在所述腫瘤細(xì)胞上以下述量表達(dá): 對(duì)于Her2/neu,以約5，000-約150，000腫瘤-相關(guān)抗原/腫瘤細(xì)胞的量,或.在檢測(cè)為FISH陰性的腫瘤細(xì)胞中，對(duì)于Her2/neu，以約至多500，000腫瘤-相
關(guān)抗原/腫瘤細(xì)胞的量，或.對(duì)于⑶20，以約1，000-約350，000腫瘤-相關(guān)抗原/腫瘤細(xì)胞的量，或.對(duì)于 EpCAM, G250，蛋白聚糖，GD2, GD3, MHC II，EGF-R 和 CEA,以約 I, 000-約350，000，優(yōu)選地至多約300，000腫瘤-相關(guān)抗原/腫瘤細(xì)胞的量。所述將所述三官能雙特異性抗體與患者的腫瘤細(xì)胞接觸是通過(guò)將所述三官能雙特異性抗體以任何可接受的劑型如下文所述口服或者腸胃外施用到人或動(dòng)物體內(nèi)而進(jìn)行。假定要治療包括免疫系統(tǒng)細(xì)胞的腫瘤疾病如白血病或淋巴瘤，所述接觸還可以離體進(jìn)行。參考見(jiàn)例如US 7，018，632或US 5，985，276，其通過(guò)引用完全結(jié)合于此。將含有自體腫瘤細(xì)胞的物質(zhì)用本文所述的三官能雙特異性抗體溫育，持續(xù)10分鐘到10小時(shí)期間的短期溫育，優(yōu)選地達(dá)到5小時(shí)，或還如關(guān)于短期溫育所述的時(shí)間期間的長(zhǎng)期溫育，以致所述自體腫 瘤細(xì)胞負(fù)載它們的抗體。隨后，加入患者的血細(xì)胞，優(yōu)選外周血的單核細(xì)胞(PBMC)，然后將這一混合物溫育長(zhǎng)時(shí)間，諸如I到14天。備選地，將所述自體腫瘤細(xì)胞直接與所述三官能雙特異性抗體和與患者的血細(xì)胞，優(yōu)選外周血單核細(xì)胞接觸。以這種方式，已經(jīng)離體實(shí)現(xiàn)了針對(duì)所述腫瘤的許多免疫細(xì)胞的“激活”。后來(lái)，將這些細(xì)胞重新輸注到患者中。長(zhǎng)期的溫育還導(dǎo)致抗體的內(nèi)在化和降解。如上述，上文引用的美國(guó)專利充分描述了這些方法；然而，專家完全沒(méi)有提供成功的合理預(yù)期，所述成功是指治療包括關(guān)于上述腫瘤-相關(guān)抗原具有約5，000到約150，000腫瘤-相關(guān)抗原/腫瘤細(xì)胞的表達(dá)的腫瘤細(xì)胞的腫瘤疾病也可以是可行的。所述方法可以以同種異源或自體形式無(wú)需另外健康供體PBMCs而實(shí)施。顯著地，腫瘤細(xì)胞，特別是B細(xì)胞的耗盡不依賴于用細(xì)胞因子(例如，IL-2，GM-SCF)對(duì)效應(yīng)細(xì)胞的任何預(yù)先或共激活，這是本領(lǐng)域所述的其它雙特異性或單特異性抗體的典型的缺點(diǎn)。本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案在從屬權(quán)利要求以及在下述描述和附上的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)、附圖和表格中描述。本發(fā)明人可以令人吃驚地表明已經(jīng)在本領(lǐng)域描述過(guò)的三官能雙特異性抗體可以有效地用于靶向在腫瘤細(xì)胞上的特別選擇的腫瘤-相關(guān)靶抗原，所述腫瘤-相關(guān)靶抗原以只是低到中等的水平在所述腫瘤細(xì)胞上表達(dá)。特別優(yōu)選的是Her2/neu，EpCAM和CD20腫瘤-相關(guān)抗原作為靶抗原。所述腫瘤-相關(guān)抗原以不同水平在腫瘤細(xì)胞上表達(dá)，其取決于在所述腫瘤細(xì)胞上表達(dá)的腫瘤-相關(guān)抗原的類型，和在Her2/neU情形中所述腫瘤抗原是否得到擴(kuò)增。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，在Her2/neu的情形中，如果它們的腫瘤以約5000到約150，000腫瘤-相關(guān)抗原/腫瘤細(xì)胞的量在腫瘤細(xì)胞上表達(dá)Her2/neu,那么患者可以成功地用所述三官能雙特異性抗體進(jìn)行治療。這些患者將依據(jù)DAKO HercepTest 得分為I+。將1+的上限歸類為對(duì)應(yīng)于約100，000或110，000也可是正確的。最重要地，得分必須歸類為與“中等表達(dá)”相反的“低表達(dá)”。還已經(jīng)發(fā)現(xiàn)表達(dá)達(dá)到500，000分子的Her2/neu腫瘤-相關(guān)抗原/腫瘤細(xì)胞并且其依據(jù)DAKO HercepTest 歸類為2+的患者可以成功地進(jìn)行治療，即使他們歸類為FISH陰性。迄今為止，只有那些患者可以被成功地治療，所述患者具有依據(jù)DAKO HercepTest 得分為2+的Her2/neu值，表達(dá)達(dá)到500，000Her2/neu腫瘤抗原/腫瘤細(xì)胞卻是FISH陽(yáng)性的。具有2+的Her2/neu值的FISH陰性患者不能被成功地治療。在患有表達(dá)⑶20的腫瘤的患者中，已經(jīng)吃驚地發(fā)現(xiàn)他們可以被成功地治療，即使⑶20的表達(dá)是以約1000到約350，000腫瘤-相關(guān)抗原/腫瘤細(xì)胞的量。另外，具有以約1000到約350，000腫瘤-相關(guān)抗原/腫瘤細(xì)胞的量表達(dá)EpCAM，G250，蛋白聚糖，⑶2，⑶3，MHC II，EGF-R和CEA的患者 可以成功地用本文所述的三官能雙特異性抗體進(jìn)行治療。在Her2/neu的情形中，所述腫瘤-相關(guān)抗原在腫瘤細(xì)胞上表達(dá)，優(yōu)選地以至少約10，000,約20，000,約50，000或約80，000腫瘤-相關(guān)抗原/腫瘤細(xì)胞的量，并且優(yōu)選地以約110，000，約120，000或約130，000腫瘤-相關(guān)抗原/腫瘤細(xì)胞的最大值進(jìn)行表達(dá)。對(duì)于具有用DAKO HercepTest 得分為2+的Her2/neu值(中等表達(dá))的患者，腫瘤-相關(guān)抗原在所述腫瘤細(xì)胞上的優(yōu)選的表達(dá)是以至多500，000或至多450，000，400，000，350，000，或 300，000 的量，并且具有約 100，000，大于約 110，000，大于約 150，000，約200，000,或約250，000的下限而進(jìn)行。在具有CD20腫瘤抗原表達(dá)的腫瘤細(xì)胞中，每個(gè)腫瘤細(xì)胞CD20分子的數(shù)目在約1000到約350,000范圍內(nèi)而不同，優(yōu)選地至多約310，00或300，000，這取決于B細(xì)胞惡性的類型和在體內(nèi)的位點(diǎn)。每個(gè)腫瘤細(xì)胞CD20分子的數(shù)目可以特別地從約5000，約10，000，約 50，000，到約 100，000，150，000，200，000，250，000，達(dá)到 300，000 而不同。這種情形對(duì)于在權(quán)利要求1中列出的所有其它腫瘤抗原EpCAM，G250，蛋白聚糖，⑶2，⑶3，MHC II，EGF-R和CEA是類似的。應(yīng)該注意到，在來(lái)源于單一確定的腫瘤實(shí)體的不同腫瘤細(xì)胞上，腫瘤-相關(guān)抗原的表達(dá)水平可以在下限和上限表達(dá)值之間的范圍內(nèi)。必須理解，所有這些附圖是平均值，其取決于惡性的類型，患者的類型，腫瘤的發(fā)展等。很重要地注意到，本發(fā)明人所選擇的腫瘤-相關(guān)靶抗原僅以低到中等表達(dá)水平永久并且穩(wěn)定地在所述腫瘤細(xì)胞上表達(dá)。然而，其它類型的可誘導(dǎo)的抗原，如熱激蛋白和MIC分子MIC A和MIC B，其都在熱激啟動(dòng)子元件的控制之下，在生命過(guò)程中在誘導(dǎo)之后以增加的水平進(jìn)行表達(dá)，腫瘤-相關(guān)抗原如Her2/neu和CD20的表達(dá)速率通常是恒定的和穩(wěn)定的。由本發(fā)明人選擇的腫瘤-相關(guān)抗原與特定的腫瘤相關(guān)或者對(duì)特定的腫瘤特異。EpCAM典型地與腺癌相關(guān)，Her2/neu與乳腺癌相關(guān)而且與結(jié)腸、肺、胃、胰腺和卵巢癌相關(guān)，CD20與B細(xì)胞淋巴瘤如非霍奇金淋巴瘤或慢性淋巴白血病相關(guān)，G250與腎癌相關(guān)，蛋白聚糖、⑶3和⑶2與黑素瘤相關(guān)，MHC II與B細(xì)胞淋巴瘤相關(guān)，并且EGF-R和CEA與上皮腫瘤相關(guān)。用于本發(fā)明的三官能雙特異性抗體(簡(jiǎn)寫為trAb)完全是已知的。例如，參考見(jiàn)US-6, 551，592，其內(nèi)容通過(guò)引用完全結(jié)合于此。同樣對(duì)于DE-A-19649223和DE-A-19710495也是真實(shí)的，其也通過(guò)引用與它們相對(duì)應(yīng)的美國(guó)專利文獻(xiàn)一起結(jié)合于此。用于本發(fā)明的抗體可以以任何可接受的劑型如膠囊、片劑、水性混懸液、溶液等而口服施用。所述抗體及其衍生物還可以腸胃外施用。這通過(guò)下述施用途徑:皮下、靜脈內(nèi)、腹膜內(nèi)、肌內(nèi)、關(guān)節(jié)內(nèi)、滑膜內(nèi)、胸骨內(nèi)、鼻內(nèi)、局部、鞘內(nèi)、肝內(nèi)、腫瘤內(nèi)、損傷內(nèi)、和顱內(nèi)注射或輸注技術(shù)進(jìn)行。通常，所述抗體將提供為靜脈內(nèi)注射或輸注。本發(fā)明的抗體可以單獨(dú)或與藥用載體一起施用，藥用載體包括可接受的佐劑、載體(vehicles)和賦形劑(excipients)。所有這些是本領(lǐng)域的技術(shù)人員所熟悉的。有效劑量將取決于許多因素，并且它很好地處于熟練醫(yī)師的能力范圍內(nèi)，以按照不同的參數(shù)如體重、治療目的、最高耐受劑量、所用的具體制劑、施用途徑、患者的反應(yīng)等而調(diào)整給與給定的患者的劑量。依據(jù)本發(fā)明所用的trAbs優(yōu)選地以每次輸注約5_約1000 μ g,更優(yōu)選地約10-約300μ g，約10-約100μ g，或約10-約50μ g的量進(jìn)行施用。最佳的量可以由熟練的技術(shù)人員通過(guò)實(shí)驗(yàn)方法確定。更優(yōu)選地，所述三官能抗體以約0.05-約15 μ g/kg,更優(yōu)選地約
0.5-5 μ g/kg和約0.5-2 μ g/kg體重的量使用。施用的次數(shù)可以由醫(yī)師依據(jù)患者的需要，特別是疾病的嚴(yán)重性，患者的反應(yīng)，所用的劑量和本領(lǐng)域已知的其它各種因素而選擇。優(yōu)選地，選擇的所述三官能抗體為抗-⑶3X抗-腫瘤-相關(guān)抗原抗體和/或抗-CD4X抗-腫瘤-相關(guān)抗原抗體和/或抗-CD5X抗-腫瘤-相關(guān)抗原抗體和/或抗-CD6X抗-腫瘤-相關(guān)抗原抗體和/或抗-⑶8抗-腫瘤-相關(guān)抗原抗體和/或抗-⑶2X抗-腫瘤-相關(guān)抗原抗體和/或抗-CD28X抗-腫瘤-相關(guān)抗原抗體和/或抗-CD44X抗-腫瘤-相關(guān)抗原抗體，其中特別優(yōu)選使用抗-CD3x抗-腫瘤-相關(guān)抗原抗體。特別優(yōu)選作為所述抗-腫瘤-相關(guān)抗原的是Her2/neu, EpCAM或⑶20抗原,特別優(yōu)選地與所述三官能抗體的抗-⑶3結(jié)合臂組合。通過(guò)使用本發(fā)明的三官能抗體,通過(guò)所述trAb的Fe-部分與Fe-受體陽(yáng)性細(xì)胞的結(jié)合而激活所述Fe-受體陽(yáng)性細(xì)胞。因此，細(xì)胞因子和/或共刺激性抗原的表達(dá)得到起始或增加。然后，通過(guò)所述共刺激性抗原和/或細(xì)胞因子將T細(xì)胞生理激活所需要的至少第二次激活信號(hào)轉(zhuǎn)移到所述T細(xì)胞中。這種激活通過(guò)激活標(biāo)記的上調(diào)、腫瘤細(xì)胞的殺死和通過(guò)T細(xì)胞的增殖而指示。通過(guò)trAb激活所述Fe受 體-陽(yáng)性細(xì)胞分別取決于抗體重鏈片段的亞類或亞類的組合。如體外實(shí)驗(yàn)所證明，例如，小鼠_IgG2a/大鼠IgG2b亞類組合的trAbs能夠結(jié)合,并且同時(shí)激活，F(xiàn)e受體-陽(yáng)性細(xì)胞，分別導(dǎo)致共刺激性抗原如⑶40、⑶80或⑶86在這些細(xì)胞表面上的上調(diào)或新形成(表達(dá))，而小鼠IgGl/大鼠IgG2b亞類組合的雙特異性抗體能夠結(jié)合 Fe 受體陽(yáng)性細(xì)胞((I)Haagen 等，J.1mmunology (免疫學(xué)雜志)，1995,154:1852-1860)，但是明顯地不能將這些細(xì)胞激活到相當(dāng)?shù)某潭?(2)Gast等,Cancer Immunol.1mmunother.(癌癥免疫學(xué)免疫治療)，1995，40:390)。因此，在所述trAbFc-區(qū)的小鼠IgG2a/大鼠IgG2b同種型組合是特別優(yōu)選的。然而，這對(duì)于在本描述中引用的所有其它同種型組合也是如此，以致它們可以用于本發(fā)明的其它優(yōu)選的實(shí)施方案中。盡管trAb用一個(gè)結(jié)合臂(例如，抗-CD3)同時(shí)結(jié)合并且激活T細(xì)胞，來(lái)自與所述trAb的Fe部分結(jié)合的Fe受體-陽(yáng)性細(xì)胞結(jié)合的共刺激性信號(hào)可以轉(zhuǎn)移到T細(xì)胞，即，僅是通過(guò)trAb的一個(gè)結(jié)合臂的T細(xì)胞激活和來(lái)自Fe受體-陽(yáng)性細(xì)胞的共刺激性信號(hào)同時(shí)轉(zhuǎn)移到T細(xì)胞的組合導(dǎo)致有效的T細(xì)胞激活。在誘導(dǎo)抗-腫瘤免疫性中的另一個(gè)重要方面是已經(jīng)被所述trAb靶向的佐細(xì)胞(單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、NK細(xì)胞或樹(shù)突細(xì)胞)對(duì)腫瘤成分的可能的吞噬作用、加工和呈遞。通過(guò)抗原呈遞的這種經(jīng)典機(jī)制，腫瘤-特異性⑶4-以及⑶8-陽(yáng)性細(xì)胞都可以生成。此外，在T/B細(xì)胞協(xié)作的情形中，腫瘤特異的CD4細(xì)胞在體液免疫反應(yīng)的誘導(dǎo)中起重要作用。三官能雙特異性抗體能夠用一個(gè)結(jié)合臂結(jié)合T細(xì)胞的T細(xì)胞受體復(fù)合物，并且用第二結(jié)合臂結(jié)合在所述腫瘤細(xì)胞上的所述腫瘤-相關(guān)抗原。由此，它們激活T細(xì)胞，其通過(guò)釋放細(xì)胞因子或通過(guò)細(xì)胞程序性死亡-介導(dǎo)的機(jī)制而破壞腫瘤細(xì)胞。此外，似乎存在這樣的可能性，即，在通過(guò)三官能抗體激活的情形中，通過(guò)它們的受體識(shí)別腫瘤特異性抗原的T細(xì)胞可以被重新激活，由此導(dǎo)致長(zhǎng) 期持續(xù)的抗腫瘤免疫性。在這方面特別重要的是所述三官能雙特異性抗體的完整的Fe部分調(diào)控與佐細(xì)胞如單核細(xì)胞/巨噬細(xì)胞和樹(shù)突細(xì)胞的結(jié)合，并且引起它們自我發(fā)展細(xì)胞毒性和/或伴隨著將重要的共刺激性信號(hào)轉(zhuǎn)移到T細(xì)胞。明顯地，以這種方式，可以誘導(dǎo)針對(duì)目前尚是未知的腫瘤特異性肽的T細(xì)胞反應(yīng)。通過(guò)以trAbs和與所述trAb的Fe部分結(jié)合的佐細(xì)胞對(duì)這樣的T細(xì)胞的同時(shí)共刺激將具有可能的無(wú)反應(yīng)性的腫瘤特異性T細(xì)胞重新定向于腫瘤細(xì)胞，可以消除腫瘤特異性細(xì)胞毒性T細(xì)胞(CTLs)的無(wú)反應(yīng)性狀態(tài)，即，在患者中存在的針對(duì)所述腫瘤的預(yù)先存在的T細(xì)胞耐受性可以通過(guò)trAbs的方式消除，并且因此，除了對(duì)腫瘤細(xì)胞的直接破壞之外，可以誘導(dǎo)長(zhǎng)期持續(xù)的抗腫瘤免疫性。優(yōu)選地，依據(jù)本發(fā)明所用的抗體能夠重新激活存于無(wú)反應(yīng)性狀態(tài)的腫瘤特異性T細(xì)胞。此外，它們能夠誘導(dǎo)腫瘤-反應(yīng)性成分-結(jié)合抗體，并且因此誘導(dǎo)體液免疫反應(yīng)。與T細(xì)胞的結(jié)合優(yōu)選地通過(guò)⑶3，⑶2，⑶4，⑶5，⑶6，⑶8，⑶28，和/或⑶44發(fā)生。Fe受體-陽(yáng)性細(xì)胞具有至少一個(gè)Fe Y受體I或III?？梢砸罁?jù)本發(fā)明使用的抗體能夠結(jié)合單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、樹(shù)突細(xì)胞、“天然殺傷”細(xì)胞(NK細(xì)胞)和/或激活的嗜中性粒細(xì)胞，其是Fe Y受體I和/或II1-陽(yáng)性的細(xì)胞。可以依據(jù)本發(fā)明使用的抗體導(dǎo)致作為共刺激性抗原的⑶40，⑶80，⑶86，ICAM-1,和/或LFA-3的表達(dá)的起始或增加，或/和Fe受體-陽(yáng)性細(xì)胞對(duì)細(xì)胞因子的分泌。優(yōu)選地，所述細(xì)胞因子是 IL-1，IL-2，IL-4，IL-6，IL-8，IL-12，IFN-Y 和 / 或 TNF-α。優(yōu)選地，與T細(xì)胞的結(jié)合通過(guò)所述T細(xì)胞的T細(xì)胞受體復(fù)合物而發(fā)生。優(yōu)選地，所述三官能雙特異性抗體是異源完整的大鼠/小鼠雙特異性抗體。通過(guò)可以依據(jù)本發(fā)明使用的trAbs的方式，針對(duì)所述腫瘤細(xì)胞，T細(xì)胞被激活并且重新定向。優(yōu)選的有效的異源三官能雙特異性抗體選自下述同種型組合中的一種或多種:大鼠-1gG2b/小鼠-1gG2a大鼠-1gG2b/小鼠-1gG2b，大鼠-1gG2b/小鼠-1gG3 ；大鼠-1gG2b/人-1gGl,大鼠-1gG2b/人 _IgG2，大鼠_IgG2b/人IgG3 [東方人同種異型G3m(st)=結(jié)合蛋白質(zhì)A],大鼠-1gG2b/人-1gG4 ；

大鼠-1gG2b/大鼠-1gG2c ；小鼠_IgG2a/人-1gG3 [白種人同種異型G3m(b+g)=不與蛋白質(zhì)A結(jié)合，在下文顯示為*]小鼠-1gG2a/小鼠-[VH-CH1，VL-CL]-人-1gGl-[鉸合部]人 _IgG3* [CH2-CH3]小鼠-1gG2a/大鼠-[VH-CH1，VL-CL]-人-1gGl-[鉸合部]-人 _IgG3*_ [CH2-CH3]小鼠-1gG2a/人-[VH-CH1，VL-CL]-人-1gGl-[鉸合部]-人 _IgG3*.[CH2-CH3]小鼠-[VH-CHl，VL-CL]-人-1gGl/大鼠-[VH-CHl, VL-CL]人-1gGl-[鉸合部]-人-1gG3*-[CH2-CH3]小鼠-[VH-CHl，VL-CL]-人 _IgG4/ 大鼠-[VH-CH1， VL-CL]-人 _IgG4_[鉸合部]-人_IgG4[CH2的N-端區(qū)域]-人-1gG3*[CH2的C-端區(qū)域:>aa位置251]-人-1gG3*[CH3]大鼠-1gG2b/小鼠-[VH-CH1，VL-CL]-人-1gGl-[鉸合部-CH2-CH3]大鼠-1gG2b/小鼠-[VH-CH1，VL-CL]-人 _IgG2_ [鉸合部-CH2-CH3]大鼠-1gG2b/小鼠-[VH-CH1，VL-CL]-人 _IgG3_[鉸合部-CH2-CH3，東方人同種異型]大鼠-1gG2b/ 小鼠-[VH-CH1，VL-CL]-人 _IgG4_[鉸合部-CH2-CH3]人-1gGl/人-[VH-CH1，VL-CL]-人-1gGl-[鉸合部]人 _IgG3*_[CH2-CH3]人-1gGl/大鼠-[VH-CH1，VL-CL]-人-1gGl-[鉸合部]-人_IgG4[CH2 的 N-端區(qū)域]-人-1gG3*[CH2 的 C-端區(qū)域:>aa 位置 251]-人 _IgG3*[CH3]人-1gGl/小鼠-[VH-CH1，VL-CL]-人-1gGl-[鉸合部]-人 _IgG4[CH2 的 N-端區(qū)域]-人-1gG3*[CH2 的 C-端區(qū)域:>aa 位置 251]-人 _IgG3*[CH3]人-1gGl/大鼠-[VH-CH1，VL-CL]-人-1gGl-[鉸合部]-人_IgG2[CH2 的 N-端區(qū)域]-人-1gG3*[CH2 的 C-端區(qū)域:>aa 位置 251]-人 _IgG3*[CH3]人-1gGl/小鼠-[VH-CH1，VL-CL]-人-1gGl-[鉸合部]-人 _IgG2[CH2 的 N-端區(qū)域]-人-1gG3*[CH2 的 C-端區(qū)域:>aa 位置 251]-人 _IgG3*[CH3]人-1gGl/大鼠-[VH-CH1，VL-CL]-人-1gGl-[鉸合部]-人 _IgG3*_[CH2-CH3]人-1gGl/小鼠-[VH-CHl，VL-CL]-人-1gGl-[鉸合部]-人-1gG3*-[CH2_CH3]人-1gG2/人-[VH-CH1，VL-CL]-人 _IgG2_ [鉸合部]-人 _IgG3*_ [CH2-CH3]人-1gG4/人-[VH-CH1，VL-CL]-人 _IgG4_[鉸合部]-人-1gG3*-[CH2_CH3]人-1gG4/人-[VH-CHl，VL-CLj-A _IgG4_[鉸合部]-人 _IgG4[CH2 的 N-端區(qū)域]-人-1gG3*[CH2 的 C-端區(qū)域:>aa 位置 251]-人 _IgG3*[CH3]
小鼠-1gG2b/大鼠-[VH-CH1，VL-CL]_ 人 _IgGl_[鉸合部]-人-1gG3*-[CH2CH3]小鼠-1gG2b/人-[VH-CH1，VL-CL]-人 _IgGl_[鉸合部]-人 _IgG3* [CH2-CH3]小鼠-1gG2b/小鼠-[VH-CHl，VL-CL]-人-1gGl-[鉸合部]-人 _IgG3* -[CH2-CH3]小鼠-[VH-CHl，VL-CL]-人_IgG4/ 大鼠-[VH-CHl, VL-CL]-人 _IgG4_[鉸合部]-人-1gG4-[CH2]_ 人-1gG3 * -[CH3]人-1gGl/大鼠-[VH-CH1，VL-CL]_ 人-1gGl-[鉸合部]-人-1gG4- [CH2]-人-1gG3*_ [CH3]人-1gGl/小鼠-[VH-CH1，VL-CL]_ 人-1gGl-[鉸合部]-人-1gG4- [CH2]-人-1gG3*_ [CH3]人-1gG 4 / 人- [VH-CHl，V L - C L ]-人-1 g G 4 -[鉸合部]-人-1gG4- [CH2]-人-1gG3*_ [CH3]優(yōu)選地，依據(jù)本發(fā)明有用的抗體是單克隆的、嵌合的、重組的、合成的、半合成的或化學(xué)修飾的完整抗體，其具有例如Fv、Fab、scFv、或F(ab)2片段。優(yōu)選地，使用人源的抗體或其衍生物或片段，或者被修飾成適用于人的那些(所謂的“人源化抗體”)(參見(jiàn)例如，Shalaby等，J.Exp.Med.(實(shí)驗(yàn)醫(yī)學(xué)雜志)175(1992)，217 ；Mocikat 等，Transplantation (移植)57 (1994)，405)。上文提及的不同類型抗體和抗體片段的制備是熟練的技術(shù)人員公知的。單克隆抗體，優(yōu)選地哺乳動(dòng)物來(lái)源，例如，人、大鼠、小鼠、兔或山羊的單克隆抗體的制備可以使用常規(guī)方法進(jìn)行，如例如在K6hl er und Milstein (Nature (自然)256(1975), 495),在 Harlow 和Lane (Antibodies, ALaboratory Manual (1988)(抗體，實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)(1988)), Cold SpringHarbor (冷泉港))或在 Galfr6 (Meth.Enzymol.(酶學(xué)方法)73 (1981)，3)或在 DE 19531346中所述的那些方法。通過(guò)依據(jù)熟練的技術(shù)人員已知的技術(shù)的重組DNA技術(shù)的方式制備抗體也是可能的(參見(jiàn)，Kurucz 等，J.1mmunol.(免疫學(xué)雜志)154 (1995)，4576 ;Ho I linger 等，Proc.Natl.Acad.Sc1.USA (美國(guó)國(guó)家科學(xué)院學(xué)報(bào))90 (1993)，6444)。具有兩種不同的特異性的抗體，即所謂的雙特異性抗體的制備可以一方面利用重組DNA技術(shù)進(jìn)行，另一方面還可以通過(guò)所謂的雜交雜交瘤融合技術(shù)進(jìn)行(參見(jiàn)例如，Milstein等，Nature (自然)305 (1983)，537)。這種技術(shù)包括將每種產(chǎn)生具有一種需要的特異性的抗體的雜交瘤細(xì)胞系融合，和鑒定并且分離產(chǎn)生具有兩種特異性的抗體的重組細(xì)胞系。使用權(quán)利要求1中定義的三官能雙特異性抗體解決了本發(fā)明潛在的問(wèn)題。在下文中，更詳細(xì)地描述表現(xiàn)出兩種特異性的抗體的制備。落入本發(fā)明中的三官能雙特異性抗體屬于現(xiàn)有技術(shù)，并且描述這樣的制備方法的參考文獻(xiàn)通過(guò)引用完全結(jié)合于此。三官能雙特異性抗體由兩個(gè)抗體半分子組成(每個(gè)具有H和L免疫球蛋白鏈)，其每個(gè)抗體半分子表現(xiàn)出特異性，并且具有如同行使公知的效應(yīng)子功能的正?？贵w的Fe部分。它們優(yōu)選地使用細(xì)胞雜交瘤技術(shù)制備。這種制備方法在DE-A-44 19 399中示例。為了完全公開(kāi)，這一文獻(xiàn)通過(guò)引用完全結(jié)合，并且結(jié)合其關(guān)于雙特異性抗體的定義。應(yīng)該理解，還有其它的制備方法是有用的，只要它們形成依據(jù)本發(fā)明所需要的按照上述定義的三官能雙特異性抗體。trAb與Fcy-RI的結(jié)合表現(xiàn)出關(guān)于最佳抗腫瘤功效的兩種實(shí)質(zhì)性的優(yōu)點(diǎn):(I)Fc Y-R1-陽(yáng)性細(xì)胞具有通過(guò)ADCC消除腫瘤細(xì)胞的能力，并且因此能夠通過(guò)所述trAbs協(xié)同地有助于細(xì)胞毒性T細(xì)胞針對(duì)所述腫瘤細(xì)胞的抗腫瘤效果。(2) Fe Y R1-陽(yáng)性細(xì)胞(諸如單核細(xì)胞/巨噬細(xì)胞/樹(shù)突細(xì)胞)能夠提供與T細(xì)胞的抗原呈遞相似的重要的共刺激性信號(hào)，并且由此防止T細(xì)胞無(wú)反應(yīng)性。此外，由于trAb-介導(dǎo)的T細(xì)胞與佐細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞的相互作用，甚至具有識(shí)別腫瘤-特異性肽(通過(guò)在所述腫瘤細(xì)胞上的MHC抗原呈遞)的T細(xì)胞受體的T細(xì)胞可以被刺激成需要的副產(chǎn)物。在這種情形(constellation)中，對(duì)于正確激活T細(xì)胞所必需的共-刺激將由所述佐細(xì)胞(諸如單核細(xì)胞)提供。因此，除了直接的T細(xì)胞受體-不依賴型trAb-介導(dǎo)的腫瘤破壞，本發(fā)明的抗體還應(yīng)該能夠激活并生成腫瘤-特異的T細(xì)胞，其在trAb降解后繼續(xù)在患者內(nèi)巡視(patrol)。這意味著，與基因-治療方法(例如，通過(guò)將共-刺激性抗原如B-7結(jié)合到腫瘤細(xì)胞中)相似，患者的腫瘤耐受性可以被三官能雙特異性抗體消除。下述實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)表明本文所述的trAbs可以令人吃驚地高度有效地用于破壞只具有低到中等表達(dá)水平的祀抗原，特別優(yōu)選Her2/neu和CD20祀抗原的腫瘤細(xì)胞。發(fā)現(xiàn)關(guān)于高有效性的原因在于前述的所述三官能抗體的作用模式。所述作用模式顯著不同于單特異性抗體。用于本發(fā)明的三官能抗體能夠通過(guò)它們的抗-T細(xì)胞結(jié)合臂和它們的Fe部分靶向并且同時(shí)激活不同類型的免疫細(xì)胞。這些免疫細(xì)胞的典型的實(shí)例是T淋巴細(xì)胞和具有Fe Y -受體I型(CD64)和III型(CD16)的佐細(xì)胞。當(dāng)所述第一結(jié)合臂結(jié)合在腫瘤細(xì)胞上的靶抗原如Her2/neu或⑶20時(shí)，所述第二結(jié)合臂結(jié)合例如在T淋巴細(xì)胞上的⑶3 (圖4)。關(guān)于怎樣定量腫瘤抗原表達(dá)水平的方法是本領(lǐng)域已知的。例如，免疫細(xì)胞化學(xué)方法，如例如，ELISA檢測(cè)、定量流式細(xì)胞術(shù)、組織染色方法和細(xì)胞離心涂片器(cytospin)分析。關(guān)于在腫瘤細(xì)胞上的腫瘤-相關(guān)靶抗原的表達(dá)的定量確定方法的典型的實(shí)例是免疫組織化學(xué)方法，如由丹麥Glostrup DAKO開(kāi)發(fā)的HercepTest ，H:允許定量確定Her2/neu在腫瘤組織上的表達(dá)水平。參考見(jiàn)由DAKO關(guān)于DAKO細(xì)胞瘤自動(dòng)染色編號(hào)K5207 (CytomationAutostainer Code ηο.Κ5207),第一版,所述的HercepTest ，其由通過(guò)引用完全結(jié)合于此的公布號(hào) 111781-001 和 K5207/EFG/A0S/13.10.04 鑒定。對(duì)于 Her2/neu，提供了一種評(píng)估系統(tǒng)，其包括4個(gè)步驟，0，I+, 2+，3+，是指在腫瘤細(xì)胞表面上的表達(dá)的靶抗原的近似數(shù)目。依據(jù)這一系統(tǒng)，將在靶細(xì)胞表面上具有低于20，000Her2/neu分子的表達(dá)的細(xì)胞分類為陰性的；將具有大于約20, 000并且至多約100，000-110,000(至多最大值150, 000)分子的表達(dá)的細(xì)胞分類為1+(低表達(dá))，具有至多約500，000分子的表達(dá)的細(xì)胞分類為2+(中等表達(dá))，并且將具有在約2.000，000到10.000，000分子的表達(dá)的細(xì)胞分類為3+(高表達(dá))。依據(jù)本發(fā)明，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)針對(duì)Her2/neU的三官能雙特異性抗體可以用于治療患有依據(jù)HercepTest 分類為Her2/neu 1+和2+(如果后者另外檢測(cè)為FISH陰性)的腫瘤細(xì)胞的患者。所謂的FISH檢測(cè)是本領(lǐng)域公知的?！癋ISH”意指“原位熒光雜交”，并且是可以用來(lái)檢測(cè)和定位特異的DNA序列在染色體上的存在或不存在的細(xì)胞遺傳學(xué)技術(shù)。該方法本身在本領(lǐng)域內(nèi)是充分確定和公知的。參考見(jiàn)，例如，Laudadio J, Quigley DI, Tubbs R,Wolff DJ.HER2testing:a rev iew ofdetection methodologies and their clinicalperformance (HER2檢測(cè):檢測(cè)方法和它們的臨床表現(xiàn)的綜述)，其通過(guò)參考完全結(jié)合于此。FISH陰性檢測(cè)結(jié)果意指Herf/neu基因未得到擴(kuò)增；Her2/neU基因的數(shù)目是在正常的生理范圍內(nèi)。然而，在15到20%的所有的乳房癌中，Her2/neu基因得到擴(kuò)增。這種擴(kuò)增的檢測(cè)已經(jīng)被確定為對(duì)于乳腺癌治療是至關(guān)重要的。在所述Her2/neU基因得到擴(kuò)增的情形中，F(xiàn)ISH分析將是陽(yáng)性的，并且例如在用曲妥單抗治療的那些案例中可能是成功的。另一方面，過(guò)量表達(dá)Her2/neU但是FISH陰性的患者不能使用如曲妥單抗的抗體進(jìn)行有效的治療。因此，具 有達(dá)到500，000的Her2/neu表達(dá)但是FISH陰性的患者也可以用本文所述的三官能雙特異性抗體成功地治療不得不被視為是乳腺癌治療中的重要的進(jìn)步。許多小組還研究⑶20在B細(xì)胞惡性病上的表達(dá)。Ginaldi等，(J.Clin.Pathol.(臨床病理學(xué)雜志)，51:364,1998)通過(guò)使用Quantum簡(jiǎn)單細(xì)胞微珠試劑盒(Quantum Simply Cellularrnicrobeadskit, Sigma (西格瑪)，圣路易斯,密蘇里州，美國(guó))而評(píng)估⑶20在不同B細(xì)胞惡性病上的表達(dá)。他們發(fā)現(xiàn)，例如，對(duì)于B-CLL，平均值為65，000⑶20分子/白血病細(xì)胞，并且對(duì)于套細(xì)胞(mantel cell)淋巴瘤，為123，000⑶20分子/細(xì)胞。在多毛細(xì)胞白血病的情形中，該研究確定平均值為312，000CD20分子/細(xì)胞。Huh等，(Am J Clin Pathol (美國(guó)臨床病理學(xué)雜志)116 =437,2001)使用比較方法進(jìn)一步研究了對(duì)于B細(xì)胞惡性病CD20在不同位點(diǎn)如外周血和骨髓的不同的表達(dá)。此處，在骨髓標(biāo)本中，每個(gè)細(xì)胞的⑶20分子的數(shù)目在B-CLL中(平均4，067 ;范圍222-46，395)是最低的，在濾泡淋巴瘤中(平均22，240 ;范圍3，689-39，643)、套細(xì)胞淋巴瘤中(平均29,770 ;范圍2,785-97,727)較高，并且在多毛細(xì)胞白血病中(平均31,563 ;范圍
1,607-72, 540)中最高。相反，在外周血中，⑶20分子數(shù)目/細(xì)胞通常對(duì)于例如B-CLL更高，其中平均數(shù)是9，051，在563-31，507范圍內(nèi)。綜上，在B細(xì)胞惡性病的情形中，⑶20分子數(shù)目/細(xì)胞從約1000到300，000而不同，取決于B細(xì)胞惡性病的類型以及在機(jī)體內(nèi)的位點(diǎn)，并且達(dá)到約350，000的最大值。在下述實(shí)施例中，并且參考所包含的附圖和圖表，更詳細(xì)地描述本發(fā)明。第一個(gè)實(shí)施例關(guān)于商標(biāo)為Rexoimm (INN-名為ertumaxomab)的可獲得的三官能抗體和被Rexomui/靶向的腫瘤-相關(guān)抗原Her2/neu舉例說(shuō)明本發(fā)明。第二個(gè)實(shí)施例針對(duì)命名為Β 20的三官能雙特異性抗體(也叫作FBTA05)，其通過(guò)⑶3結(jié)合T細(xì)胞，并且識(shí)別⑶20為腫瘤抗原。這些實(shí)施例提供了令人信服的證據(jù)證明本發(fā)明可以關(guān)于在權(quán)利要求1和貫穿本說(shuō)明書中具體描述的所有其它腫瘤-相關(guān)抗原而使用。所有這些腫瘤-相關(guān)抗原可以以這樣低的數(shù)量存在于腫瘤細(xì)胞的表面上，以致它們幾乎不能通過(guò)常規(guī)所用的基于抗體的免疫治療而進(jìn)行治療。本發(fā)明的附圖和圖表聯(lián)系實(shí)施例1和2解釋如下。

圖1:A_F，細(xì)胞系Lox，HCT-8和SKBR3的Her2/neu表達(dá)模式譜，其通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)測(cè)量具有不同的抗Her2抗體。圖2a:Her2+3SKBR-3細(xì)胞的殺傷:使用微小轉(zhuǎn)移檢測(cè)系統(tǒng)進(jìn)行的繪圖分析；*與表3相對(duì)應(yīng)的數(shù)目圖2b:Her2+lHCT-8細(xì)胞的殺傷:使用微小轉(zhuǎn)移檢測(cè)系統(tǒng)進(jìn)行的繪圖分析；*與表3相對(duì)應(yīng)的數(shù)目圖2c:陰性Her2LoX細(xì)胞的殺傷:使用微小轉(zhuǎn)移檢測(cè)系統(tǒng)進(jìn)行的繪圖分析；*與表3相對(duì)應(yīng)的數(shù)目圖2d:Her2+lHCT-8細(xì)胞的殺傷；供體2作為MDS工作流程的實(shí)例的繪圖結(jié)果；*與表3相對(duì)應(yīng)的數(shù)目 圖3:使用細(xì)胞因子珠點(diǎn)陣系統(tǒng)(CBA)測(cè)量24小時(shí)后在產(chǎn)克隆測(cè)定上清液中的細(xì)胞因子分泌。圖4:假定的三細(xì)胞復(fù)合物。三官能抗體能夠通過(guò)不同的免疫學(xué)機(jī)制加速對(duì)腫瘤細(xì)胞的識(shí)別和破壞。Bei der Auflistung der Zytokine im Bildsollte man nochIFN- Yaufnehmen注釋:ADCC，抗體依賴性細(xì)胞的細(xì)胞毒性；DC，樹(shù)突細(xì)胞；NK，天然殺傷細(xì)胞；DC-CK1，樹(shù)突細(xì)胞細(xì)胞因子I ;IL，白介素；LFA，白細(xì)胞功能相關(guān)抗原；TNF_a，腫瘤壞死因子 a ;CD，分化簇(摘自 Ruf 和 Lindhofer，2001)圖5.Bi20的純化。(A)陽(yáng)離子交換層析(CIEX)。將母體小鼠抗體(峰I)在HR10/10高效SP-瓊脂糖柱上與三官能抗體(峰2)分開(kāi)。(B)Bi20三官能抗體純化的等電聚焦(IEF)。母體大鼠抗體(26II6)在蛋白質(zhì)A親和層析(AC Β 20)后去除，并且母體小鼠抗體(TPAlO)通過(guò)CIEX(CIEX Pl Β 20)與三官能抗體分開(kāi)。純化的Bi20在陽(yáng)離子交換層析的峰2(CIEX P2 Β 20)中發(fā)現(xiàn)。圖6.Β 20特異性結(jié)合效應(yīng)細(xì)胞。將190ng Β 20與5x IO5個(gè)靶細(xì)胞溫育，并且通過(guò)FACS分析測(cè)量結(jié)合。Ramos細(xì)胞(A)用作⑶20臂的靶細(xì)胞，并且THP-1細(xì)胞⑶用于Fe部分。對(duì)于競(jìng)爭(zhēng)測(cè)定，將細(xì)胞與利妥昔單抗(RU)在指定抗體過(guò)量的情況下預(yù)先溫育30分鐘。圖7.在效應(yīng)細(xì)胞存在下，Bi20調(diào)控有效的B細(xì)胞消耗。(A)將lxl06/ml PBMCs和 2x 105/ml 腫瘤細(xì)胞(Raji, Mecl)用 50ng/ml 的 Bi20, catumaxomab (Catum),利妥昔單抗，或母體抗體TPAlO和26II6溫育。在第3天通過(guò)單核細(xì)胞、B細(xì)胞和T細(xì)胞的錐蟲(chóng)藍(lán)排除計(jì)數(shù)和FACS分析而確定B細(xì)胞的清除。將在沒(méi)有抗體的測(cè)定(陰性)中的絕對(duì)的B細(xì)胞數(shù)目設(shè)定為 100%。(B)Ix 106/ml PBMCs 和 2x 105/ml Raji 細(xì)胞用增加量(0.5_250ng/ml)的Bi20溫育。在第1、2和3天，通過(guò)錐蟲(chóng)藍(lán)排除和FACS分析確定絕對(duì)的B細(xì)胞計(jì)數(shù)，并且計(jì)算B細(xì)胞消耗的百分?jǐn)?shù)。圖8.Β 20 調(diào)控 T 細(xì)胞的激活。(A) Ix 106/ml PBMCs 和 2x 105/ml Raji 腫瘤細(xì)胞用50ng/ml的Bi20, catumaxomab (Catum),利妥昔單抗,或母體抗體TPAlO和26II6溫育3天。⑶25在⑶4+和⑶8+細(xì)胞上表達(dá)的MFI通過(guò)FACS分析確定。(B)PBMC和Raji細(xì)胞用增加量(0.5-250ng/ml)的Β 20溫育。在第1、2和3天測(cè)量CD25在CD4+T細(xì)胞上表達(dá)的MFI。圖9.Bi20誘導(dǎo)T細(xì)胞的增殖。Ix 106/ml PBMCs和2x 105/ml Raji細(xì)胞用濃度為50ng/ml的Bi20, catumaxomab (Catum),利妥昔單抗,或母體抗體TPAlO和26II6溫育3天。T細(xì)胞數(shù)目通過(guò)錐蟲(chóng)藍(lán)排除計(jì)數(shù)和使用抗-⑶5/4和抗-⑶5/8抗體的FACS分析確定。圖10.Bi20_ 介導(dǎo)的單核細(xì)胞的激活。(A)Ix 106/ml PBMCs 和 2xl05/ml Raji 腫瘤細(xì)胞用50ng/ml的Bi20, catumaxomab (Catum),或利妥昔單抗溫育I天。⑶14+單核細(xì)胞表達(dá)CD25 的 MFI 通過(guò) FACS 分析確定。(B)Ix 106/ml PBMCs 和 Ix 105/ml THP-1 細(xì)胞用 50ng/ml的 Bi20, catumaxomab (Catum)，利妥昔單抗(Rit)，TPA10,或 26II6 溫育 I 天。CD33+THP-1細(xì)胞的激活通過(guò)⑶25或⑶40的表達(dá)而確定。圖11.在健康的供體效應(yīng)細(xì)胞的存在下，Β 20誘導(dǎo)CLL B細(xì)胞的消耗。(A)Ix 106/ml PBMCs 和 2x 105/ml CLL 腫瘤細(xì)胞用 5，50，或 250ng/mlBi20，250ng/mlcatumaxomab (Catum),或250ng/ml利妥昔單抗(Rit)溫育3天。在第3天通過(guò)單核細(xì)胞、B細(xì)胞和T細(xì)胞的錐蟲(chóng)藍(lán)排除計(jì)數(shù)和FACS分析而確定B細(xì)胞的清除。將在沒(méi)有抗體的測(cè)定(陰性)中的絕對(duì)B細(xì)胞的數(shù)量設(shè)定為100%。MV =CLL-1到CLL-9的平均值。(B)⑶20在CLL患者樣品(1-14)，細(xì)胞系(Raji，Mec-1)，和一名健康供體(PBMC)中的表達(dá)的縱覽。MFI =平均熒光密度。表1:所用抗體及它們相對(duì)應(yīng)的檢測(cè)抗體的特征* TRION Pharma,慕尼黑，$Roche, #Micromet,慕尼黑表2:所用細(xì)胞系及它們的Her2/neu得分*:依據(jù)Ross等，分子和細(xì)胞蛋白質(zhì)組學(xué)(Molecular andCelIularProteomics)3:379-398,2004表3:產(chǎn)克隆測(cè)定樣品Ab =抗體，μ g =微克，ng =納克表4:Bi20調(diào)控的細(xì)胞因子分泌。Ix 106/ml PBMCs和2x 105/ml腫瘤細(xì)胞(Raji，Ramos, MecI, Granta, D0HH-2)用 50ng/ml Bi20, catumaxomab (Catum),利妥昔單抗，或母體抗體TPAlO和26II6溫育3天。收集上清液，并且用CBA測(cè)定和FACS分析測(cè)量細(xì)胞因子的分泌。表5:Bi20在體外以自體形式調(diào)控的CLL B細(xì)胞的消除。B和T細(xì)胞的百分?jǐn)?shù)、⑶20在B細(xì)胞上的表達(dá)(MFI)、和E:T比例在CLL PBMC制備后和溫育之前立即確定。在第
0、3、6和9天，將CLL細(xì)胞用指定量的Bi20或利妥昔單抗溫育。取決于患者樣品，如顯不在第3天和第10天之間確定B細(xì)胞的清除。B細(xì)胞的清除表示為消耗的％ B細(xì)胞。T細(xì)胞激活:⑶25在⑶4+和⑶8+T細(xì)胞上的表達(dá)上調(diào)至少5倍(++)。效應(yīng)器/靶點(diǎn)比例(E:T)定義為單核細(xì)胞、NK細(xì)胞和T細(xì)胞的數(shù)目相對(duì)于B細(xì)胞的數(shù)目。(10%的B細(xì)胞清除標(biāo)定為陰性(neg)。實(shí)施例1實(shí)施例1涉及Her2/neu結(jié)合三官能雙特異性抗體關(guān)于其用于治療在HercepTest 中具有得分1+的患者的能力的特征。施細(xì)胞系和抗體Rexomun (由Trion Pharma,慕尼黑生產(chǎn))是一種三官能抗體,其用一個(gè)結(jié)合臂祀向腫瘤-相關(guān)抗原Her2/neu,并且用另一個(gè)臂結(jié)合T細(xì)胞上的⑶3分子。此外，Rexomunu以其有效的Fe區(qū)域結(jié)合FcyRI和FcyRIII陽(yáng)性細(xì)胞(例如，巨噬細(xì)胞、NK細(xì)胞、樹(shù)突細(xì)胞)，所述Fe區(qū)域由小鼠IgG2a和大鼠IgG2b同種型組成。單克隆抗體2502A (Trion Pharma, 慕尼黑)對(duì)Her2/neu特異，并且是包含在RexomunR中的一種母體抗體。26II6 (Trion Pharma，慕尼黑)對(duì)⑶3特異，并且是包含在Rexoimm'u中的另一種母體抗體。520C9(ATCC HB-8696)是識(shí)別Her2/neu受體的另一種單克隆抗體。曲妥單抗是從鼠源抗Her2/neu抗體Mab 4D5開(kāi)發(fā)的一種人源化抗Her2單克隆抗體(58)。表I顯示所用的抗體及它們相對(duì)應(yīng)的檢測(cè)抗體的特征。SKBR3 (ATCC H TB-30)是通過(guò) IHC 檢測(cè)具有強(qiáng) Her2/neu 過(guò)表達(dá)(HercepTestΦ得分+3)的乳腺癌細(xì)胞系(58.HCT-8 (ATCC CCL-244)是結(jié)腸癌細(xì)胞系，和Lox是黑素瘤細(xì)胞系(表2)。Her2/neu 得分HCT-8 細(xì)胞的 Her2/neu 狀態(tài)使用 HercepTest 試劑盒(DAKO, Glostrup,丹麥)通
過(guò)IHC評(píng)估，并且由慕尼黑LMU的病理學(xué)研究所按照供應(yīng)商的手冊(cè)進(jìn)行。FACS 分析FACS分析用5xl05靶細(xì) 胞(SKBR3，HCT-8或Lox)進(jìn)行。將細(xì)胞用IOOng單克隆抗體或IOOng三官能抗體Rexomun 在4°c溫育45分鐘。然后，將樣品用不含Mg2+和Ca2+的磷酸緩沖鹽(PBS) (PAN Biotec, Aidenbach)洗漆,并且用相對(duì)應(yīng)的檢測(cè)抗體(Dianova^R堡)(表I)在4°C溫育45分鐘。在用PBS的另一次洗滌步驟后，將細(xì)胞重懸在含有0.01 μ g/ml溴化乙錠(西格瑪，慕尼黑)的PBS中?？贵w結(jié)合的量通過(guò)在疊加柱狀圖中的平均熒光強(qiáng)度進(jìn)行分析。只具有抗人檢測(cè)抗體的樣品或用26116(抗CD3)及其相對(duì)應(yīng)的檢測(cè)抗體(同種型對(duì)照)溫育的樣品作為陰性對(duì)照。所有的FACS分析都在FACSCalibur (BectonDickinson,海德?tīng)柋?上進(jìn)行，并且用CellQuest Pro或WinMDI 2.8分析。產(chǎn)克隆測(cè)定抗體介導(dǎo)的腫瘤清除用關(guān)于未刺激的效應(yīng)細(xì)胞的長(zhǎng)期產(chǎn)克隆測(cè)定進(jìn)行研究。因此，將IO6PBMC摻加入5%的靶細(xì)胞(SKBR3，HCT-8或Lox)，并且接種在24孔平板(Greiner)中。將抗體以在表3所示的不同濃度和組合加入。單獨(dú)的靶細(xì)胞的樣品和由靶細(xì)胞和效應(yīng)細(xì)胞的混合物組成而沒(méi)有添加任何抗體的樣品作為對(duì)照。將樣品在37°C /5% CO2中溫育，并且每3天用RPMI 1640，L-谷氨酰胺和10% FCS培養(yǎng)。在溫育8天后，將細(xì)胞從24孔平板中收集起來(lái)，用PBS w/o Mg2VCa2+洗滌，并且通過(guò)錐蟲(chóng)藍(lán)用死細(xì)胞排除在Neubauer細(xì)胞室中計(jì)數(shù)。然后將活細(xì)胞離心在細(xì)胞離心涂片器載玻片(Menzel)上，濃度為每載玻片2，5xIO5個(gè)細(xì)胞。將細(xì)胞離心涂片器樣品干燥過(guò)夜，然后進(jìn)行免疫細(xì)胞化學(xué)。實(shí)驗(yàn)使用來(lái)自3名不同供體的PBMC重復(fù)3次。免疫細(xì)胞化學(xué)將在細(xì)胞離心涂片器載玻片上的非特異性結(jié)合特征用10%的人血清飽和。將SKBR3和HCT-8細(xì)胞用1.5yg/載玻片的抗細(xì)胞角蛋白(Cytokeratine) 8，18，19抗體(A45B-B3，小鼠IgGl，Micromet，慕尼黑)染色，Lox細(xì)胞用1.5 μ g/載玻片的抗EGFR抗體(小鼠IgG2a,由慕尼黑的Htun博士饋贈(zèng))染色。用于細(xì)胞角蛋白染色的抗-小鼠IgGlAlexaFluor 477 (FITC)抗體(Molecular probes (分子探針),Eugene)或用于 EGFR 染色的抗-小鼠 IgG2aAlexa Fluor 477 (FITC)抗體(Molecular probes (分子探針)，Eugene)以1.5 μ g/載玻片用作檢測(cè)抗體。將細(xì)胞離心涂片器載玻片在微小轉(zhuǎn)移檢測(cè)系統(tǒng)(MDS，Applied Imaging(應(yīng)用成像))中使用計(jì)數(shù)FITC標(biāo)記細(xì)胞的計(jì)算機(jī)化成像分析進(jìn)行分析。結(jié)腸癌細(xì)胞系HCT-8表現(xiàn)出+lHer2/neu表達(dá)為了找到具有+1的Her2/neu表達(dá)的細(xì)胞系，在不同細(xì)胞系上研究Her2/neu的表達(dá)水平。因此，使用單克隆Her2/neu抗體2502A，520C9,曲妥單抗和三官能抗體Rexomunu進(jìn)行FACS分析。單克隆抗CD3抗體26II6作為模擬對(duì)照。圖1A-F顯示所用的抗體在SKBR3，HCT-8或Lox細(xì)胞上的結(jié)合模式。由于對(duì)照作為僅具有不同檢測(cè)抗體的流式細(xì)胞術(shù)樣品(圖1A)，同種型對(duì)照是具有其相對(duì)應(yīng)的檢測(cè)抗體的26II6 (抗CD3)(圖1B)。黑素瘤細(xì)胞系Lox----如預(yù)計(jì)----沒(méi)有表現(xiàn)出Her2/neu受體的表達(dá)(圖1C-F),
而SKBR3細(xì)胞用單克隆抗體520C9(圖1C)，2502A(圖1D)和曲妥單抗(圖1E)針對(duì)Her2/neu濃重染色。Rex0immu染色SKBR3細(xì)胞至較低的程度，可能是由于其一個(gè)結(jié)合臂的性質(zhì)(圖1F)。與SKBR3細(xì)胞相比，使用所有所用的Her2抗體，HCT-8細(xì)胞具有顯著更弱的Her2/neu受體表達(dá)(圖1C-F)，進(jìn)一步證明這些細(xì)胞的評(píng)估。HCT-8細(xì)胞的Her2/neu表達(dá)另外使用DAKO HercepTestli進(jìn)行分析。該檢測(cè)由病理學(xué)研究所(慕尼黑TU)進(jìn)行。在進(jìn)行的DAKO檢測(cè)中，結(jié)腸癌細(xì)胞系HCT-8表現(xiàn)出+1的Her2/neu表達(dá)，這證實(shí)了 FACS分析的結(jié)果。表2顯示所用的細(xì)胞系、它們的Her2/neu得分以及用于確定Her2/neu表達(dá)的方法的總結(jié)。Rexomun 能夠在體外殺死 Her2/neu+3 和 Her2/neu+l 細(xì)胞系Rexomun I! 時(shí)召集并且激活不同類型的免疫細(xì)胞到腫瘤位點(diǎn)的能力導(dǎo)致這樣的假說(shuō)，即，Rexomun^還可能能夠清除Her2/neu(l+)低表達(dá)的腫瘤細(xì)胞。因此，建立了長(zhǎng)期的細(xì)胞毒性測(cè)定(產(chǎn)克隆測(cè)定)。將3名健康供體的PBMC與表達(dá) Her2/neu+3 的細(xì)胞系 SKBR-3、Her2/neu_ 陰性 Lox 細(xì)胞系或表達(dá) Her2/neu+l 的 HCT-8細(xì)胞系共溫育8天。如在表3所示加入不同抗體濃度的曲妥單抗(100 μ g/ml-1 μ g/ml)或.Rexomun. (100ng/ml-lng/ml)。在8天后通過(guò)收集所述細(xì)胞,將它們轉(zhuǎn)移到細(xì)胞離心涂片器載玻片上，并且用抗CK 8，18，19抗體(SKBR-3和HCT-8)或抗EGFR-抗體(Lox)和相對(duì)應(yīng)的Alexa-Fluor FITC抗體進(jìn)行細(xì)胞染色，而評(píng)價(jià)腫瘤細(xì)胞的殺傷。然后將染色的細(xì)胞離心涂片器載玻片在微小轉(zhuǎn)移檢測(cè)系統(tǒng)(MDS, AppliedImaging(應(yīng)用成像)，英國(guó))上使用載玻片掃描程序通過(guò)計(jì)算機(jī)化的圖像分析進(jìn)行評(píng)估。在本研究中，將三官能抗體Rexomun (抗Her2/neu x抗⑶3)與人源化抗Her2/neu單克隆抗體曲妥單抗 在其抑制表達(dá)低Her2/neu的腫瘤細(xì)胞系HCT-8的腫瘤細(xì)胞(HercepTest得分:+1)生長(zhǎng)的能力上進(jìn)行比較。在細(xì)胞系SKBR3 (+3Hercep 得分)，HCT-8 (+IHercep 得分)和 Lox (Her2/neu 陰性)上的Her2/neu表達(dá)通過(guò)FACS分析測(cè)量,而HCT-8細(xì)胞還通過(guò)HercepTest 檢測(cè)。使用針對(duì)Her2/neu的不同抗體的FACS分析表明在SKBR3細(xì)胞上的強(qiáng)Her2表達(dá)，在HCT-8細(xì)胞上的較弱表達(dá)，和在Lox細(xì)胞上沒(méi)有Her2/neu表達(dá)。這些結(jié)果對(duì)應(yīng)HCT-8細(xì)胞的+1的
HercepTest'81得分。與所述單克隆抗體的二價(jià)結(jié)合相比，由于Kexomun 的單價(jià)結(jié)合(圖1，A-F)，所述三官能抗體Rexomun 的平均熒光值比所述單克隆抗體的值略低。為了檢測(cè)Rexomun'!和Trastuzumab 抑制表達(dá)低的Her2/neu的細(xì)胞系HCT-8的生長(zhǎng)的能力，進(jìn)行了產(chǎn)克隆測(cè)定。在培養(yǎng)8天后，將細(xì)胞從培養(yǎng)皿中收集起來(lái)，離心到細(xì)胞離心涂片器載玻片上，并且對(duì)于腫瘤 細(xì)胞進(jìn)行染色。在MDS中細(xì)胞離心涂片器染色后，所有不添加抗體的對(duì)照樣品(12，500腫瘤細(xì)胞/24孔平板)(圖2a-c，樣品Al，BI，Cl)對(duì)于細(xì)胞系SKBR3，HCT-8和Lox都表現(xiàn)出腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)。具有250000PBMC無(wú)摻加的腫瘤細(xì)胞或加入的抗體的載玻片完全沒(méi)有表現(xiàn)出一一如預(yù)計(jì)一一腫瘤細(xì)胞(圖2a-c，樣品A2，B2，C2)。腫瘤生長(zhǎng)在同種異型對(duì)照中也是明顯可見(jiàn)的，其中PBMC與5 %的SKBR3，HCT-8或Lox細(xì)胞混合而不添加任何抗體(圖2a-c，樣品A3，B3, C3)。Her2+3細(xì)胞系SKBR-3的腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)如預(yù)計(jì)通過(guò)加入100 μ g，50 μ g，10 μ g和lyg Trastuzumab 而被抑制(圖2a,樣品A4-A8)。此夕卜，Rexomuii'81還能夠通過(guò)只加入100ng，50ng，10ng或Ing而抑制腫瘤生長(zhǎng)。如在樣品A9-A12 (圖2a)中所示，腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)比使用Tra st UZii in ab 得到更有效地抑制。Her2/neu陰性細(xì)胞系Lox的腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)既沒(méi)有通過(guò)加入不同量的Trastuzumab丨!也沒(méi)有被Rexomun1!抑制，這表明腫瘤細(xì)胞清除的特異性是由Her2/neu受體的存在而推動(dòng)的(圖2c，樣品C4-C12)。顯著地，結(jié)腸癌細(xì)胞系HCT-8 (Her2/neu得分+1)的生長(zhǎng)沒(méi)有被不同量的(100 μ g-1 μ g) Trastuzumab "(圖 2b,樣品 B4-B8)所抑制，其與使用 Her2/neu+l 乳房癌細(xì)胞系MCF-7的先前的發(fā)現(xiàn)相對(duì)應(yīng)(5)。由于MCF-7細(xì)胞(ATCC HTB-22)表現(xiàn)出對(duì)TNF-α的生長(zhǎng)抑制，所以這些細(xì)胞不能用于廣克隆測(cè)定，因?yàn)閞exomuti 如二官能抗體removab1<}(抗EpCAM X抗CD3)由于其激活特性促進(jìn)TNF-α的分泌(59)。然而Rexomun 能夠以低至IOOng, 50ng和IOng/孔的濃度破壞+lHer2/neu細(xì)胞系HCT-8 (四Zh樣品B9-B11)。Ing的Rexomunκ沒(méi)有成功地抑制HCT-8細(xì)胞的腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)(圖2b，樣品B12)。圖2d顯示使用HCT-8細(xì)胞作為靶點(diǎn)的供體2的產(chǎn)克隆測(cè)定的原始MDS數(shù)據(jù)圖?？傊琑exomun 不僅是用于具有+3或+2過(guò)量表達(dá)/基因擴(kuò)增的乳房癌患者，而且是用于具有低Her2/neU表達(dá)水平的患者的治療選擇。實(shí)施例2這里我們描述Bi20的生產(chǎn)和功能特征，特別是其用于治療僅以低水平表達(dá)腫瘤抗原⑶20的患者的治療的能力，所述Bi20是一種針對(duì)人⑶3和人⑶20的新三官能雙特異性抗體。⑶20是一種35-kDa的非糖基化的磷蛋白，其已被提議作用為鈣通道，在B細(xì)胞分化中起作用。24然而，它的準(zhǔn)確的功能仍然未知，原因在于CD20-缺陷型小鼠表現(xiàn)出正常的B細(xì)胞發(fā)育并且還是表型正常的。25出于下述原因選擇CD20作為定向免疫治療的靶點(diǎn):(i)它專門在正常和惡性B細(xì)胞上表達(dá)，而不在血液前體細(xì)胞或在其它人組織中的細(xì)胞上表達(dá)，26(ii)它在大部分B細(xì)胞淋巴瘤細(xì)胞上表達(dá)，27和(iii)當(dāng)抗體結(jié)合時(shí)它沒(méi)有被排出(shed)或分泌。28’29此外，⑶20作為腫瘤治療靶點(diǎn)的適合性已經(jīng)得到了利妥昔單抗的成功應(yīng)用，特別與常規(guī)化學(xué)治療結(jié)合的成功應(yīng)用的臨床驗(yàn)證。在我們目前的研究中，我們?cè)敿?xì)分析了 Bi20的體外特征，表明這種trAb有效殺傷人B細(xì)胞腫瘤細(xì)胞以及來(lái)源自僅表達(dá)低水平的CD20的CLL患者的細(xì)胞。對(duì)于腫瘤細(xì)胞的清除，不需要效應(yīng)細(xì)胞的預(yù)先激活，其伴隨著典型的Thl細(xì)胞因子模式和T細(xì)胞與單核細(xì)胞的強(qiáng)激活。作為臨床應(yīng)用重要的先決條件， Bi20可以以有效量容易地純化和生產(chǎn)。因此，這種trAb可以為目前為止難以治愈的NHL和CLL患者提供新的治療選擇。材料和方法
抗體和試劑將產(chǎn)生⑶20-特異性的單克隆IgG2a抗體的小鼠細(xì)胞系TPAlO與26II6融合，這導(dǎo)致產(chǎn)生Bi20(FBTA05)的細(xì)胞雜交瘤細(xì)胞系TPBs05，所述26II6為一種大鼠細(xì)胞系，其分泌0)3-特異性的IgG2b抗體。Catumaxomab (Removab )用作三官能對(duì)照抗體，由26II6-來(lái)
源的⑶3-特異性臂和抗EpCAM特異性組成。利妥昔單抗(Mabtheral嵌合抗-⑶20抗體，獲自羅氏(Roche)(巴塞爾，瑞士)?？?⑶20抗體及相對(duì)應(yīng)的同種型獲自BeckmanCoulter Immunotech(Krefeld,德國(guó))。用于FACS分析的所有其它抗體購(gòu)自BD生物科學(xué)(BD Biosciences)(海德?tīng)柋?德國(guó))。碘化丙錠獲自西格瑪化學(xué)(Sigma Chemicals)(Deisenhofen,德國(guó))。細(xì)胞系和PBMC制備CLL 細(xì)胞系 Mecl 由 Michael Hallek 博士饋贈(zèng)(GSF,慕尼黑，德國(guó))。Burkitt’ s淋巴瘤(BL)細(xì)胞系Ramos獲自ATCC(美國(guó))。BL細(xì)胞系Raji，NHL細(xì)胞系D0HH-2和Granta,以及AML細(xì)胞系THP-1購(gòu)自DSMZ (Braunschweig,德國(guó))。細(xì)胞生長(zhǎng)在補(bǔ)充了10%熱滅活的FCS、非必需氨基酸、丙酮酸鈉和L-谷氨酸(PAN-Biotech)的RPM1-1640培養(yǎng)基(PAN-Biotech，Aidenbach,德國(guó))中。人外周血單核細(xì)胞(PBMCs)通過(guò)使用PANCOLL(PAN-Biotech)進(jìn)行密度梯度離心而分離自健康供體的肝素化的血液。在告知同意后獲得來(lái)自CLL患者的外周血樣品。CLL的診斷是基于標(biāo)準(zhǔn)的臨床和實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)。在純化后，CLL細(xì)胞立即使用或者冰凍保存?zhèn)溆?。將CLL細(xì)胞在補(bǔ)充了 10% FCS的MDM(PANBiotech)中培育。對(duì)于以自體形式的測(cè)定，只使用新鮮制備的CLL細(xì)胞。Bi20的生成和純化Bi20應(yīng)用細(xì)胞雜交瘤技術(shù)產(chǎn)生。3°對(duì)于與靶細(xì)胞結(jié)合的trAb，通過(guò)FACS分析檢測(cè)細(xì)胞雜交瘤細(xì)胞的上清液。將產(chǎn)生trAb的細(xì)胞亞克隆幾次，以增加抗體生產(chǎn)的穩(wěn)定性，并且建立主細(xì)胞庫(kù)。TrAbs通過(guò)使用ΑΚΤΑ純化器100 (Amersham Biosciences (安瑪西亞生物科學(xué))，烏普薩拉，瑞典)如所述31用蛋白質(zhì)A親和和離子交換層析從所述細(xì)胞雜交瘤細(xì)胞培養(yǎng)物上清液中純化。等電聚焦將抗體樣品點(diǎn)樣到pH 7-llIsoGel-瓊脂糖-1EF(Cambrex生物科學(xué)(Cambrex BioScience), Rockland,美國(guó))上，并且在1500V, 50mA,和25W分離75分鐘?？贵w同種型通過(guò)用考馬斯亮藍(lán)(西格瑪-奧德里奇公司(Sigma-Aldrich Inc.),密蘇里州，美國(guó))染色而顯現(xiàn)，并且對(duì)凝膠進(jìn)行掃描用于分析。FACS 分析抗體與靶細(xì)胞的結(jié)合，效應(yīng)細(xì)胞的激活，相對(duì)CD20表達(dá)和細(xì)胞亞型組成使用裝配有488-nm氬氣激光的FACS calibur (BD生物科學(xué)(BD Biosciences)，海德?tīng)柋ぃ聡?guó))通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)而進(jìn)行分析。數(shù)據(jù)使用Cellquest軟件(BD生物科學(xué))分析。為了分析抗體結(jié)合，將5x IO5細(xì)胞(Ramos，Jurkat，或THP-1)用指定濃度的Bi20在4°C溫育30分鐘，用補(bǔ)充了 2%熱滅活FCS的PBS洗漆，并且用FITC-標(biāo)記的小鼠抗-大鼠IgG檢測(cè)抗體(Ramos)或FITC-標(biāo)記的大鼠抗-小鼠抗體(Jurkat，THP-1)在4°C溫育30分鐘。為了表征Bi20的激活特性，將Ix 106/ml PBMCs和2x 105/ml人腫瘤細(xì)胞用指定濃度的抗體在RPMI培養(yǎng)基中在37°C溫育1、2和3天。對(duì)細(xì)胞進(jìn)行收集、洗滌并且用針對(duì)CD25和CD69的FITC-或PE-標(biāo)記的檢測(cè)抗體在4°C溫育30分鐘。細(xì)胞亞型組成通過(guò)將3x IO6PBMCs用下述抗-⑶抗體混合物(FITC/PE/APC):14/19/5，4/8/5，4/8/25，45/3/5，和 16/56/5 進(jìn)行染色而確定。B細(xì)胞消耗測(cè)定Bi20_介導(dǎo)的B細(xì)胞消耗使用生物測(cè)定進(jìn)行確定。將獲自健康供體的PBMCs(lx106/ml)補(bǔ)充 2x 105/ml 的指定的腫瘤細(xì)胞(Raji, Ramos, Mecl, D0HH-2,或 Granta)或 CLL患者細(xì)胞(效應(yīng)器-與-靶點(diǎn)比例5: I)，并且在指定濃度的不同抗體的存在下在Iml的總體積中進(jìn)行溫育。在第1、2和3天，對(duì)細(xì)胞進(jìn)行收集和洗滌，并且使用PE-綴合的抗-CD19檢測(cè)抗體通過(guò)FACS分析而分析存活的B細(xì)胞的百分?jǐn)?shù)。存活細(xì)胞的總數(shù)通過(guò)錐蟲(chóng)藍(lán)排除計(jì)數(shù)而確定。為了檢驗(yàn)在自體CLL樣品中抗體-介導(dǎo)的B細(xì)胞消耗，將從CLL患者分離的PBMCs以2x IO6細(xì)胞/ml的密度接種，并且在第0、3和6天以指定的濃度加入抗體。在指定的時(shí)間點(diǎn)進(jìn)行FACS測(cè)量和錐蟲(chóng)藍(lán)排除計(jì)數(shù)。細(xì)胞因子的測(cè)量Bi20_誘導(dǎo)的細(xì)胞因子釋放在與用于所述B細(xì)胞消耗實(shí)驗(yàn)相同的條件下確定。將來(lái)自健康供體的腫瘤B細(xì)胞系和PBMCS用50ng/ml的指定抗體溫育。3天后，收集上清液。細(xì)胞因子用人Thl/Th2細(xì)胞計(jì)數(shù)珠點(diǎn)陣(CBA，BD生物科學(xué)，海德?tīng)柋?，德?guó))測(cè)量，其允許同時(shí)分析IFN-Y，TNF- a , IL-2, IL- 4, IL-6，和IL-10。數(shù)據(jù)獲得和分析按照供應(yīng)商的流程進(jìn)行。結(jié)果Β 20的產(chǎn)生和純化trAb Bi20在細(xì)胞雜交瘤細(xì)胞中產(chǎn)生，并且通過(guò)蛋白質(zhì)A親和層析捕獲。母體大鼠抗體不與蛋白質(zhì)A結(jié)合，并且因此不存在于洗脫物中。然后，雜質(zhì)如母體小鼠抗體通過(guò)陽(yáng)離子交換層析(CIEX)去除(圖5A)。小鼠抗體在148mM NaCl處洗脫下來(lái)(圖5A，峰I)，而trAbs在320mM NaCl處洗脫。純化的trAbs的等電聚焦表現(xiàn)出具有 8.65-8.15pl范圍的不同的條帶模式。TrAbs只在CIEX分離的峰2發(fā)現(xiàn)。沒(méi)有檢測(cè)到污染的母體抗體。Bi20的結(jié)合特異性為了證明Bi20的三官能性質(zhì)，我們檢驗(yàn)了其與特異的靶細(xì)胞的結(jié)合。我們使用⑶20+Burkitt’s淋巴瘤細(xì)胞系Ramos來(lái)證實(shí)⑶20-結(jié)合臂的官能性,⑶3+T-細(xì)胞系Jurkat用于⑶3-結(jié)合臂，并且單核細(xì)胞系THP-1用來(lái)驗(yàn)證Fe Y-RI結(jié)合(圖6)。為了證實(shí)Bi20與CD20的結(jié)合，用利妥昔單抗進(jìn)行競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合測(cè)定。Bi20在Ramos細(xì)胞上的結(jié)合可以通過(guò)將所述細(xì)胞與21倍過(guò)量的利妥昔單抗預(yù)先溫育而完全封閉(圖6A)。類似地，Β 20與THP-1細(xì)胞的結(jié)合可以被利妥昔單抗競(jìng)爭(zhēng)掉(圖6B)。Β 20與Jurkat細(xì)胞上的⑶3的結(jié)合與Bi20與Ramos細(xì)胞上的⑶20的結(jié)合相當(dāng)(數(shù)據(jù)未顯示)。由于Bi20的⑶3-結(jié)合臂與在充分表征的trAbs catumaxomab和ertumaxomab中相對(duì)應(yīng)的臂相同，所以沒(méi)有進(jìn)行關(guān)于⑶3-結(jié)合臂的特異性的進(jìn)一步分析。概言之，這些數(shù)據(jù)證實(shí)Bi20的三價(jià)結(jié)合模式和結(jié)合的特異性。Bi20調(diào)控B細(xì)胞消除為了研究Bi20對(duì)B細(xì)胞殺傷的作用，我們開(kāi)發(fā)了基于FACS的生物測(cè)定。將不含任何預(yù)刺激或共刺激的新鮮制備的PBMCs與腫瘤B細(xì)胞以5: I的比例和50ng/ml的指定的抗體混合，并且溫育3天。收集細(xì)胞，并且亞群的組成通過(guò)FACS分析確定。進(jìn)行錐蟲(chóng)藍(lán)排除計(jì)數(shù)以獲得絕對(duì)細(xì)胞數(shù)。使用CD20+Burkitt’ s淋巴瘤細(xì)胞系Raii作為靶細(xì)胞，用50ng/ml的Bi20觀察有效的B細(xì)胞清除(圖7)。作為對(duì)照，我們使用不結(jié)合B細(xì)胞(數(shù)據(jù)未顯示)的trAbcatumaxomab (抗-EpCAM x 抗-CD3)，和母體抗體 26116 (抗-CD3)和 TPAlO (抗-CD20)。Catumaxomab (Catum)以及母體抗體的組合誘導(dǎo)一些B細(xì)胞的清除,可能是由于細(xì)胞因子諸如IFN-Y和TNF-α的釋放(表4)，表明Bi20的抗腫瘤活性確實(shí)由其三官能形式引起。在這些實(shí)驗(yàn)條件下(低抗體濃度和E: T比例)，利妥昔單抗只調(diào)控B細(xì)胞數(shù)目的較少的減少。使用CLL細(xì)胞系Mecl獲得了相當(dāng)?shù)臄?shù)據(jù)，其具有比Raii細(xì)胞低2.5倍的⑶20表達(dá)(MFI 179相對(duì)428，數(shù)據(jù)未顯示)。這些結(jié)果鼓勵(lì)我們更詳細(xì)地分析Bi20_調(diào)控的B細(xì)胞消耗。時(shí)間動(dòng)力學(xué)分析表明Raji細(xì)胞只在24小時(shí)后消耗(圖7B)，此時(shí)在低至0.5ng/ml的抗體濃度消除了至少35%的B細(xì)胞。在250ng/ml和50ng/ml的Bi20濃度，分別在第2天和第3天觀察到完全的B細(xì)胞消除。使用Mecl細(xì)胞發(fā)現(xiàn)相當(dāng)?shù)慕Y(jié)果(數(shù)據(jù)未顯示)。此外，我們研究了代表其它淋巴瘤實(shí)體的B細(xì)胞系是否可以被有效地殺傷。當(dāng)將D0HH-2 (濾泡淋巴瘤)，Granta (套細(xì)胞淋巴瘤)，或Ramos(Burkitt’s淋巴瘤)用作祀細(xì)胞時(shí),檢測(cè)到有效的B細(xì)胞消耗(數(shù)據(jù)未顯示)OΒ 20不依賴于同時(shí)發(fā)生的B細(xì)胞結(jié)合調(diào)控T細(xì)胞的激活與先前描述的雙特異性抗-淋巴瘤抗體相反，其只在用例如抗-CD28抗體預(yù)先刺激后表現(xiàn)出B細(xì)胞毒性，32對(duì)于Bi20誘導(dǎo)的有效的B細(xì)胞裂解，T細(xì)胞或單核細(xì)胞的預(yù)先激活不是必需的。因此，我們?cè)儐?wèn)在Bi20結(jié)合時(shí)效應(yīng)細(xì)胞是否可以被激活。將PBMCs和Raii細(xì)胞用指定的抗體溫育，并且通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)測(cè)量在⑶4+和⑶8+T細(xì)胞上的激活標(biāo)記⑶25的上調(diào)(圖8A)。Β 20和catumaxomab誘導(dǎo)在⑶4+和⑶8+T細(xì)胞上的⑶25的顯著的上調(diào)，表明所述trAb與CD3和 CD20的同時(shí)結(jié)合對(duì)于T細(xì)胞激活不是必需的。使用母體抗體26II6 (抗-CD3)和TPAlO (抗-CD20)的組合也觀察到CD25的上調(diào)。如預(yù)測(cè)，利妥昔單抗沒(méi)有誘導(dǎo)任何T細(xì)胞激活(圖8A)。如在圖SB中所示，T細(xì)胞激活依賴于溫育時(shí)間和抗體濃度，對(duì)于最高的Bi20濃度(250ng/ml)在第2天觀察到最大的⑶25表達(dá)。其它激活標(biāo)記如⑶69也被上調(diào)，盡管只上調(diào)更低的程度和持續(xù)更短的時(shí)間階段(數(shù)據(jù)未顯示)。Bi20誘導(dǎo)T細(xì)胞增殖除了 T細(xì)胞激活外，我們確定由不同抗體誘導(dǎo)的CD4+和CD8+T細(xì)胞數(shù)目的增加(圖9)。與⑶4+亞型相比較，用Bi20溫育導(dǎo)致⑶8+亞型的T細(xì)胞的優(yōu)先增殖(145%相對(duì)85%的T細(xì)胞擴(kuò)增)，將CD4+: 0)8+比例由1.8: I改變到1.3: I。Catumaxomab和母體抗體也誘導(dǎo)T細(xì)胞增殖，但是到比Bi20更低的程度。如預(yù)測(cè)，利妥昔單抗不刺激T細(xì)胞增殖。顯著地，除了所述抗體外不需要任何刺激劑來(lái)誘導(dǎo)增殖。單核細(xì)胞的激活依賴于同時(shí)的T細(xì)胞結(jié)合但不依賴于同時(shí)的B細(xì)胞結(jié)合然后，我們闡釋Fe Y -RI/III+細(xì)胞諸如單核細(xì)胞/巨噬細(xì)胞是否也可以被Bi20激活的問(wèn)題。將PBMCs和Raji細(xì)胞在不同抗體的存在下溫育，并且測(cè)量CD14+細(xì)胞的激活。如在圖6A中所示，trAbs Β 20和catumaxomab誘導(dǎo)在⑶14+單核細(xì)胞/巨噬細(xì)胞上的⑶25的上調(diào)，表明同時(shí)的B細(xì)胞結(jié)合對(duì)于單核細(xì)胞的激活不是必需的。相反，利妥昔單抗，其通過(guò)它的Fe區(qū)域結(jié)合B細(xì)胞和單核細(xì)胞/巨噬細(xì)胞而不是T細(xì)胞，不誘導(dǎo)CD14+佐細(xì)胞的激活。從這些結(jié)果我們推論對(duì)于佐細(xì)胞的激活T細(xì)胞的結(jié)合(engagement)是必需的。我們?cè)诓淮嬖趷盒訠細(xì)胞時(shí)使用略微不同的系統(tǒng)證實(shí)了這一結(jié)果。將PBMCs和THP-1細(xì)胞在不同抗體的存在下溫育，并且通過(guò)⑶25和⑶40表達(dá)監(jiān)測(cè)⑶33+THP-1細(xì)胞的激活(圖10B)。所有同時(shí)結(jié)合THP-1細(xì)胞和T細(xì)胞的抗體(Β 20, TPBsOl, 26II6)激活THP-1細(xì)胞。相反，當(dāng)使用結(jié)合THP-1和B細(xì)胞而不結(jié)合T細(xì)胞的抗體(TPA10，利妥昔單抗)時(shí)，沒(méi)有觀察到激活。不存在PBMCs時(shí)，THP-1細(xì)胞不被任何抗體激活(數(shù)據(jù)未顯示)，表明在我們的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)中，T細(xì)胞和單核細(xì)胞的同時(shí)結(jié)合對(duì)于單核細(xì)胞的激活是絕對(duì)的先決條件。Β 20誘導(dǎo)Th-1樣細(xì)胞因子模式由于細(xì)胞因子釋放是在治療使用單克隆抗體之后發(fā)生的一種免疫反應(yīng)，33我們研究了由Bi20誘導(dǎo)的細(xì)胞因子模式。將PBMCs與不同的腫瘤細(xì)胞(Raji，Ramos, D0HH-2,Granta,或Mec I)和50ng/ml的抗體溫育。在3天后，收集上清液，并且分析IFN-Y ,TNF- α，IL-2, IL-4, IL-6，和 IL-10 的量(表 4)。Bi20誘導(dǎo)高水平的IL-6，其也在用其它抗體溫育后以顯著的更低水平檢測(cè)到。在Β 20或catumaxomab處理后檢測(cè)到TNF- α，但是在用利妥昔單抗或母體抗體溫育后沒(méi)有檢測(cè)到TNF-α。IL-2表達(dá)的強(qiáng)增 加可以僅在用Bi20溫育后檢測(cè)到，這證實(shí)使用trAbs的更早的研究，其表明IL-2僅在所有三種結(jié)合配偶體(腫瘤細(xì)胞、T細(xì)胞和佐細(xì)胞)都存在時(shí)才釋放。18IL-4，Th2世代的標(biāo)記，只是被微量地分泌，而IFN-Y，一種Thl-特異性細(xì)胞因子被強(qiáng)烈產(chǎn)生。有趣的是，IL-10，其可以作用為抑制性的細(xì)胞因子，也被釋放，表明免疫學(xué)的逆反應(yīng)。使用所有細(xì)胞系(Raji，Ramos，Mec 1，D0HH-2，Granta ;表4)獲得相似的結(jié)果。Β 20調(diào)控來(lái)源于CLL患者的B細(xì)胞的清除然后我們研究了 Bi20_介導(dǎo)的B細(xì)胞消耗是否可以通過(guò)使用來(lái)源于CLL患者的細(xì)胞而證實(shí)。將來(lái)自9名不同供體的細(xì)胞與來(lái)自健康供體的PBMCs和Bi20 (5，50，或250ng/ml)或?qū)φ湛贵w溫育，如在圖11中所示。增加濃度的Bi20導(dǎo)致CLL B細(xì)胞的提高的清除(至多99% )。利妥昔單抗還誘導(dǎo)顯著的B細(xì)胞消耗，但是即使在250ng/ml的濃度，幾乎一半的B細(xì)胞是存活的。這表明，至少在我們的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)中，對(duì)于來(lái)自CLL患者的原代腫瘤細(xì)胞的清除，trAb Β 20比利妥昔單抗更加有效得多。在這種情形中，與先前使用B細(xì)胞系的實(shí)驗(yàn)相比較，由catumaxomab介導(dǎo)的非特異性B細(xì)胞消耗基本上是減少的(圖7和11)。顯著地，甚至在檢測(cè)表達(dá)很低水平的⑶20的CLL B細(xì)胞(CLL 2，3，和4 ;圖1lA和B)時(shí)，幾乎所有的B細(xì)胞都被Bi20清除(分別為99%，93%，和98% )。相反，使用來(lái)自相同患者組的細(xì)胞，利妥昔單抗表現(xiàn)出更低的功效或沒(méi)有功效(分別為76 %，79 %，和I % )。然后，我們闡釋Bi20能否在不添加來(lái)自健康供體的效應(yīng)細(xì)胞的自體模式中誘導(dǎo)CLL B細(xì)胞的殺傷的關(guān)鍵問(wèn)題。因此，我們將來(lái)源于CLL患者的PBMCs用Bi20和對(duì)照抗體溫育。由于不利的E: T比例和已知的CLL中的T細(xì)胞無(wú)反應(yīng)性，將細(xì)胞溫育至少6天(除了患者CLL 10之外)，并且每三天加入抗體。B細(xì)胞消耗和T細(xì)胞激活的分析在第6天和第10天之間進(jìn)行，在患者CLL 10的情形中例外(在第3天)。如在表2中所總結(jié)，在分析的7份患者樣品中的3份中檢測(cè)到有效的B細(xì)胞消耗(>85%)0在一份樣品(患者CLL 13)中，觀察到65%的腫瘤B細(xì)胞消耗。有趣地，甚至在很低的⑶20表達(dá)水平也觀察到B細(xì)胞消耗(患者CLL 11，12和13，圖11B)，證實(shí)在同種異型形式中獲得的結(jié)果(圖1lA和B)。使用相同濃度的利妥昔單抗的對(duì)照實(shí)驗(yàn)沒(méi)有表現(xiàn)出或者表現(xiàn)出很低的CLL B細(xì)胞的減少。有效的B細(xì)胞消耗似乎取決于效應(yīng)器-與-靶點(diǎn)的比例(E: T)。具有最佳反應(yīng)的患者樣品(CLL 10，11，和12)也具有最高的效應(yīng)細(xì)胞百分?jǐn)?shù)。特別地，具有最有利的E: T比例的樣品(3.5: 1，來(lái)源于患者CLL 10)只在3天后表現(xiàn)出有效的B細(xì)胞消除。CLL T細(xì)胞已知是無(wú)反應(yīng)性的，特別是⑶4亞型。34令人吃驚地，當(dāng)我們?cè)跍赜A段結(jié)束時(shí)通過(guò)⑶25的上調(diào)而分析⑶4+和⑶8+T細(xì)胞亞型的激活時(shí)，我們發(fā)現(xiàn)在6份患者樣品中有5份已經(jīng)發(fā)生了⑶4+和⑶8+亞型的有效激活(表2)。當(dāng)將樣品用利妥昔單抗處理時(shí)沒(méi)有觀察到激活(數(shù)據(jù)未顯示)。這些結(jié)果表明，至少在體外，Bi20可以克服CLL樣品中的T細(xì)胞無(wú)反應(yīng)性，甚至在腫瘤細(xì)胞的存在下。盡管在用抗-C D20單克隆抗體利妥昔單抗治療B細(xì)胞淋巴瘤(特別與化學(xué)治療結(jié)合)中取得有希望的結(jié)果，患者最終復(fù)發(fā)。9’35因此，存在對(duì)于進(jìn)一步的治療選擇的需求。一種改進(jìn)可以是使用雙特異性抗體，其將效應(yīng)細(xì)胞諸如T細(xì)胞重新定向至腫瘤細(xì)胞。在最近的10-15年內(nèi)，針對(duì)B細(xì)胞-特異性抗原諸如⑶19或⑶20的雙特異性抗體一直處在廣泛的研究中，但是迄今為止只有表現(xiàn)出中等反應(yīng)的有限的臨床數(shù)據(jù)14’36’37是可用的。此外，復(fù)雜和效率低的制備過(guò)程使得很難生產(chǎn)充足量的抗體用于臨床應(yīng)用。這里我們描述了 Bi20的產(chǎn)生和生產(chǎn)，Bi20是一種針對(duì)⑶20和⑶3的新的三官能雙特異性抗體。特別地，由于物種-限制的重鏈/輕鏈配對(duì)，小鼠IgG2a和大鼠IgG2b的同種型組合以及本文所述的其它三官能雙特異性抗體的應(yīng)用能夠產(chǎn)生正確配對(duì)的雙特異性抗體的高產(chǎn)量生產(chǎn)。30這些trAbs特征在于同時(shí)結(jié)合腫瘤細(xì)胞、T細(xì)胞和Fe Y RI/ΙΙΓ-佐細(xì)胞，因此增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞的清除。17’18表明Bi20在體外B細(xì)胞清除中非常有效，不需要任何共同刺激。B細(xì)胞消耗測(cè)定證明，甚至在低如0.5ng/ml的抗體濃度，在24小時(shí)后可以清除幾乎70%的Raji腫瘤B細(xì)胞，在3天后具有完全的腫瘤細(xì)胞清除。使用代表其它NHL實(shí)體的B細(xì)胞系(Mecl，Granta，或D0HH-2)，獲得了相似的結(jié)果，表明腫瘤細(xì)胞的清除不限于這種惡性病的特定的亞組。此外，盡管存在增加的細(xì)胞程序性死亡抗性和低⑶20表達(dá)水平，其是CLL B細(xì)胞的特征嚴(yán)’38’39來(lái)源于CLL患者的B細(xì)胞也被有效地殺死(圖1lA和B，表5)。同樣地，對(duì)于有效的CLL B細(xì)胞清除，T細(xì)胞的預(yù)先激活或共同激活不是必需的，這與已經(jīng)描述的其它雙特異性抗體相反。例如，雙特異性小鼠抗體Bis20(小鼠IgGl⑶20x小鼠IgG2b⑶3)以在我們的實(shí)驗(yàn)中所用的相同E: T比例誘導(dǎo)幾乎60%的B細(xì)胞消耗，但是具有10倍更高的抗體濃度，預(yù)先激活的T細(xì)胞和更短的溫育時(shí)間。40在使用抗-CD20x抗-CD3抗體的另一研究中，僅在將PBLs用IL-2預(yù)先刺激時(shí)，可以獲得腫瘤細(xì)胞(Raji)的裂解。甚至在IOOOng/ml的雙抗體濃度和20:1的E: T比例，只有約35%的細(xì)胞被裂解。41此外，關(guān)于抗-⑶3x抗-⑶19雙抗體，Cochlovius與同事表明，在1-2.5 μ g/ml的抗體濃度，對(duì)于有效的B細(xì)胞裂解，預(yù)先激活的PBLs和通過(guò)CD28對(duì)T細(xì)胞的共同刺激是必需的。在7份患者樣品中的4份中，Bi20誘導(dǎo)有效的腫瘤細(xì)胞殺傷，甚至在不添加健康供體PBMCs的自體形式中也是如此。顯著地，與利妥昔單抗相反，Bi20-介導(dǎo)的B細(xì)胞消耗甚至在CLL腫瘤細(xì)胞的非常低的⑶20表達(dá)水平的存在下也是有效的，其對(duì)于自體以及同種異型形式也是真實(shí)的(表5和圖11)。這一發(fā)現(xiàn)與CLL研究的臨床數(shù)據(jù)一致，其中利妥昔單抗只表現(xiàn)出作為單一治療的有限的功效，這可能是由于CLL腫瘤細(xì)胞的低⑶20表達(dá)。3’43與一些其它的雙特異性抗體相反，44’45Bi20有效地激活⑶4+和⑶8+T-細(xì)胞亞型，甚至在不存在任何共同刺激性分子如抗-CD28抗體或IL-2時(shí)。結(jié)果，我們檢測(cè)到高的INF- Y水平，其已知是由被刺激的T細(xì)胞釋放的，并且其是Thl-型應(yīng)答的指征。46T細(xì)胞的激活還伴隨著兩種T細(xì)胞亞型的增殖。

不僅使用健康供體的T細(xì)胞，而且使用來(lái)自B-CLL患者的T細(xì)胞，觀察到T細(xì)胞的激活(表5)。這些T細(xì)胞通常特征在于無(wú)反應(yīng)性，可能是由于低的CD28和T細(xì)胞受體表達(dá)造成的。47’48在我們的實(shí)驗(yàn)中，甚至在沒(méi)有觀察到基本的CLL B細(xì)胞消耗的那些樣品中檢測(cè)到⑶4+和⑶8+T-細(xì)胞亞型的激活。在一些樣品(CLL-2，-4，-14)中的有限的B細(xì)胞消耗可能是由于短的溫育時(shí)間，其受到B-CLL細(xì)胞在體外的有限的存活能力的限制。最近使用單鏈CD19x CD3雙特異性抗體描述了基于不依賴于共激活劑的T細(xì)胞激活的可比較的B細(xì)胞消耗，進(jìn)一步證實(shí)所述雙特異性抗體形式的功效。49’5°因此，我們的結(jié)果表明Bi20可能不僅在體外而且在體內(nèi)克服CLL T細(xì)胞無(wú)反應(yīng)性的潛力。除了 T細(xì)胞之外，Β 20還結(jié)合并且激活Fe Y -RI+細(xì)胞。激活取決于Bi20與T細(xì)胞的同時(shí)結(jié)合，這是因?yàn)槟[瘤靶細(xì)胞和Fe Y-RI+細(xì)胞的結(jié)合對(duì)于激活是不充分的，如使用母體抗體TPAlO所示(圖1OA和B)。trAbs的Fe區(qū)域的重要性得到我們最近的觀察的支持，即，在免疫活性小鼠B細(xì)胞淋巴瘤模型中，長(zhǎng)期持續(xù)的抗腫瘤免疫性的誘導(dǎo)取決于所述trAb的功能Fe部分。在這些實(shí)驗(yàn)中，trAb的F (ab)2片段的使用顯著減少了這些小鼠的存活。2°這一結(jié)果與最近的公布一致51，其表明，在體外和在小鼠模型中，與單一的雙抗體相比較，抗-⑶19x抗-Fe Y RIII和抗-⑶19x抗-⑶3的雙抗體組合表現(xiàn)出更高的抗腫瘤活性，盡管在這兩種情形中，通過(guò)抗-⑶28抗體對(duì)T細(xì)胞的另外的共同刺激是必需的。這些結(jié)果表明，由Bi20介導(dǎo)的T細(xì)胞和Fe Y -R+效應(yīng)細(xì)胞的同時(shí)結(jié)合和激活比與腫瘤細(xì)胞和T細(xì)胞單獨(dú)的結(jié)合允許更有效的腫瘤細(xì)胞殺傷。綜上所述，我們的結(jié)果表明，trAb Bi20是腫瘤B細(xì)胞消耗的有效的誘導(dǎo)劑，其不依賴于任何預(yù)先激活或共同激活，甚至在腫瘤細(xì)胞的CD20表達(dá)非常低時(shí)有效。T細(xì)胞和輔助免疫細(xì)胞的同時(shí)激活以及它們重新定向于腫瘤細(xì)胞不僅在體外而且在體內(nèi)克服了關(guān)于CLL所述的T細(xì)胞無(wú)反應(yīng)性。因此，本文所述的三官能雙特異性抗體提供了新的治療選擇，以治療先前難以治愈的患者中的非霍奇金淋巴瘤和CLL，其中CD20的表達(dá)如本發(fā)明所述那樣低。參考文獻(xiàn)1.Greiner TC,Medeiros Li, Jaffe ES.Non-Hodgkin，s lymphoma(非霍奇金淋巴瘤).Cancer (癌癥).1995 ；75:370-380.
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權(quán)利要求
1.官能雙特異性抗體用于制備用來(lái)預(yù)防和治療腫瘤疾病的藥物組合物的應(yīng)用，所述三官能雙特異性抗體具有下述性質(zhì): (a)通過(guò)⑶3結(jié)合T細(xì)胞； (b)結(jié)合在腫瘤細(xì)胞上的腫瘤相關(guān)抗原EpCAM;和(c)通過(guò)它們的Fe-部分結(jié)合FeY -受體I型或III型陽(yáng)性細(xì)胞，或它們的組合； 所述腫瘤疾病的特征在于腫瘤相關(guān)抗原EpCAM的表達(dá)，其中所述腫瘤-相關(guān)抗原EpCAM在所述腫瘤細(xì)胞上以1，000-350，000腫瘤-相關(guān)抗原/腫瘤細(xì)胞的量表達(dá)， 其中所述三官能抗體為抗CD3X抗-腫瘤-相關(guān)抗原抗體， 其中所述抗體導(dǎo)致細(xì)胞因子和/或共刺激性抗原的表達(dá)的起始或增加，并且 其中所述三官能抗體在其Fe-區(qū)域選自下述同種型組合的組的至少一個(gè)成員: 大鼠-1gG2b/小鼠-1gG2a， 大鼠-1gG2b/小鼠-1gG2b， 大鼠-1gG2b/人-1gGl， 大鼠-1gG2b/人-1gG2。
2.照權(quán)利要求1的應(yīng)用，其中所述腫瘤抗原以至少5，000,20,000,50, 000或80，000腫瘤抗原/腫瘤細(xì)胞并且最大值為300，000，150，000，110，000或100，000腫瘤抗原/腫瘤細(xì)胞的量在所述腫瘤細(xì)胞上表達(dá)。
3.照權(quán)利要求1的應(yīng)用，其中所述三官能抗體選自異源雙特異性抗體。
4.照權(quán)利要求3的應(yīng)用，其中所述抗體是異源大鼠/小鼠雙特異性抗體。
5.照權(quán)利要求1的應(yīng)用，其中所述三官能抗體以0.05-15 μ g/kg體重的量施用。
6.照權(quán)利要求1的應(yīng)用，其中所述抗體具有同種型組合大鼠_IgG2b/小鼠-1gG2a。
全文摘要
本發(fā)明描述了三官能雙特異性抗體用于制備用來(lái)預(yù)防和治療腫瘤疾病的藥物組合物的應(yīng)用。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)所述三官能雙特異性抗體結(jié)合選自下列各項(xiàng)的腫瘤-相關(guān)抗原Her2/neu，D20，EpCAM，G250，蛋白聚糖，GD3，GD2，MHC II，EGF-R和CEA，其中所述腫瘤相關(guān)抗原在只具有低到中等表達(dá)水平的所述腫瘤細(xì)胞上表達(dá)。
文檔編號(hào)C07K16/28GK103083665SQ20131001119
公開(kāi)日2013年5月8日 申請(qǐng)日期2007年2月15日 優(yōu)先權(quán)日2006年2月15日
發(fā)明者霍斯特·林德霍費(fèi)爾 申請(qǐng)人:傳恩制藥有限責(zé)任公司