專利名稱：Ii型膠原蛋白口服胃溶制劑的制作方法
類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎屬于免疫性疾病，已證明病人關(guān)節(jié)炎軟骨中的Ⅱ型膠原蛋白是免疫系統(tǒng)針對(duì)的致病性抗原之一。病人體內(nèi)可以測(cè)出抗Ⅱ型膠原蛋白的抗體存在。隨著口服免疫耐受治療自身性免疫疾病的進(jìn)展，國(guó)內(nèi)外應(yīng)用口服低劑量的Ⅱ型膠原蛋白來(lái)治療類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎已初見效果?？诜鞍踪|(zhì)引起機(jī)體對(duì)該種蛋白質(zhì)的一種免疫低反應(yīng)狀態(tài)稱為口服耐受(mucosaltolerance,MT)?？诜褪軐儆谡衬つ褪艿囊环N。大多數(shù)食物中含有可溶性抗原，與腸道粘膜接觸的過(guò)程中并不發(fā)生過(guò)敏反應(yīng)，主要有以下兩種原因(1)腸道內(nèi)活性抗原誘導(dǎo)腸壁局部產(chǎn)生分泌型IgA，引起免疫排斥。(2)抗原引起MT。MT影響免疫反應(yīng)的多個(gè)方面，如IgM、IgG、IgE抗體反應(yīng)的抑制，淋巴細(xì)胞增殖、遲發(fā)性過(guò)敏反應(yīng)等細(xì)胞介導(dǎo)免疫反應(yīng)的抑制?？诜褪艿漠a(chǎn)生和維持是一個(gè)非常復(fù)雜的過(guò)程，其基本機(jī)制包括克隆清除、失能和主動(dòng)抑制，口服抗原是其中的決定性因素。
不同動(dòng)物來(lái)源的Ⅱ型膠原蛋白在治療上顯示出相當(dāng)大的差異。國(guó)內(nèi)外已有較多文獻(xiàn)報(bào)道，用雞CⅡ治療RA，對(duì)患者的關(guān)節(jié)腫脹數(shù)和指數(shù)、關(guān)節(jié)壓痛數(shù)和指數(shù)、15米行走時(shí)間和血清學(xué)指標(biāo)的改善程度明顯優(yōu)于牛CⅡ，即雞CⅡ的臨床療效觀察結(jié)果較牛CⅡ具有明顯的優(yōu)勢(shì)。
由于雞軟骨來(lái)源的Ⅱ型膠原蛋白與人軟骨中的Ⅱ型膠原蛋白差異最小，有抗原同源性。經(jīng)過(guò)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，牛Ⅱ型膠原蛋白雖在分子量、純度和被Ⅱ型膠原蛋白酶酶解等方面與雞Ⅱ型膠原蛋白一致，但其氨基酸組成與雞Ⅱ型膠原蛋白比較有明顯不同，牛Ⅱ型膠原蛋白不與抗人Ⅱ型膠原蛋白單抗結(jié)合，提示牛Ⅱ型膠原蛋白與人Ⅱ型膠原蛋白的免疫原性有一定差異。而雞Ⅱ型膠原蛋白可與抗人Ⅱ型膠原蛋白單抗結(jié)合，說(shuō)明雞和人Ⅱ型膠原蛋白有相同和相似的免疫原性。雖然兩者的來(lái)源不同，但同屬Ⅱ型膠原蛋白，都具有明確的藥效作用，并已明確雞Ⅱ型膠原蛋白的藥效作用優(yōu)于牛Ⅱ型膠原蛋白。
本專利中使用的雞Ⅱ型膠原蛋白，是由以下制備工藝而得。首先，將雞劍突軟骨粉碎、蛋白酶消化、雜質(zhì)硫酸軟骨素的除去、Ⅱ型膠原蛋白的精純化、降解成份的除去。以上方法制備的雞Ⅱ型膠原蛋白純度在95％，硫酸軟骨素含量低于3％的水平。中試放大制備工藝主要針對(duì)Ⅱ型膠原蛋白得率的工業(yè)化流程，確定了適合于每次十公斤到數(shù)十公斤軟骨的提取方法。中試生產(chǎn)工藝和制劑工藝操作方便，無(wú)特殊設(shè)備要求，成本低，工業(yè)化生產(chǎn)放大容易，操作人員無(wú)需特殊技能培訓(xùn)。此工藝與國(guó)內(nèi)外文獻(xiàn)報(bào)道方法比較，有較大的改進(jìn)。如省除了DEAE纖維素純化的步驟，用非揮發(fā)性酸代替乙酸，用酶法除去軟骨膜，改用口服凍干粉為口服胃溶制劑等。
由于Ⅱ型膠原蛋白只能溶于酸性溶液，再加上在水溶液中不穩(wěn)定性，在Ⅱ性膠原蛋白的藥物制劑方面一直是較難解決的問(wèn)題。國(guó)內(nèi)外的資料顯示，在進(jìn)行Ⅱ型膠原蛋白的制劑方面，主要采用純化的Ⅱ型膠原蛋白先凍干成粉劑，服用時(shí)用0.01-0.1M乙酸溶液溶解后再口服。此種劑型保證了Ⅱ型膠原蛋白的穩(wěn)定性，但給病人的服用帶來(lái)了極大的不便，如需配置專門的乙酸溶液，乙酸有較強(qiáng)的刺激性和不良口感等。同時(shí)凍干制劑的成本很高，保存和運(yùn)輸不方便。根據(jù)在純化制備Ⅱ型膠原蛋白過(guò)程中的蛋白酶解特性，即用胰蛋白酶除去硫酸軟骨素，用胃蛋白酶媒介釋放Ⅱ型膠原蛋白。因此將Ⅱ型膠原蛋白制成胃溶制劑，在胃酸溶液中達(dá)到完全溶解后，不會(huì)被胃蛋白酶和胰蛋白酶消化。本專利的創(chuàng)新之處在于將Ⅱ型膠原蛋白用非揮發(fā)性酸(符合藥典要求)調(diào)節(jié)pH值，進(jìn)行凍干成凍干粉狀半成品，能在普通水溶液和人工胃液中迅速溶解。為了增加其保護(hù)作用在凍干時(shí)按比例加入相應(yīng)的賦形保護(hù)劑，如甘露醇或明膠等。此種凍干半成品具有良好的溶解性和穩(wěn)定性，可與相應(yīng)的胃溶制劑輔料(淀粉類、糖類、纖維素類等)混合，經(jīng)加工制成膠囊、微?；蚱胀ㄆ瑒?、包衣片劑等劑型。本專利發(fā)明的Ⅱ型膠原蛋白胃溶制劑，經(jīng)動(dòng)物藥效學(xué)證明有良好的治療效果。
動(dòng)物藥效學(xué)實(shí)驗(yàn)證明雞Ⅱ型膠原蛋白胃溶制劑給藥后對(duì)大鼠棉球肉芽腫、原發(fā)性和繼發(fā)性關(guān)節(jié)炎出現(xiàn)后其足爪腫脹體積、多發(fā)性關(guān)節(jié)炎的評(píng)分具有顯著的治療作用。同時(shí)，致炎后升高了的L3T4+/Lyt-2+T淋巴細(xì)胞亞型比值有所降低；血清抗Ⅱ型膠原抗體水平出現(xiàn)下降趨勢(shì)，脾淋巴細(xì)胞增殖反應(yīng)有進(jìn)一步抑制作用，提示脾臟Thl細(xì)胞功能有抑制；口服胃溶制劑雞Ⅱ型膠原蛋白可明顯抑制動(dòng)物佐劑型關(guān)節(jié)炎的腹腔巨噬細(xì)胞(PMφ)白細(xì)胞介素-1(IL-1)和腫瘤壞死因子(TNF-α)活性。
實(shí)例說(shuō)明1．雞Ⅱ型膠原蛋白的提取工藝從食品加工廠購(gòu)回經(jīng)檢疫的美國(guó)AA雞劍突軟骨-20℃保存不超過(guò)半年→解凍去硬骨和肉組織→0.6M乙酸溶液中每升加入400mg胃蛋白酶攪伴48小時(shí)除去殘余的肉和軟骨膜→粉碎軟骨塊成直徑小于2mm的粉狀物→在0.05MTris(PH8.0)溶液中每升加入0.2克胰蛋白酶4℃消化24小時(shí)去除雜質(zhì)→沉淀用0.5M乙酸懸浮后每升加入10克胃蛋白酶(PH2.5)4℃中攪伴消化48小時(shí)→酶解軟骨離心保留上清，加入NaCl至終濃度2M后4℃放置2小時(shí)→沉淀再用0.5M乙酸溶解后進(jìn)行透析(對(duì)0.02M Na2HPO4溶液)至透析袋中出現(xiàn)白色沉淀→離心收集沉淀即半成品。半成品能溶解于0.1M乙酸溶液，最終Ⅱ型膠原蛋白濃度大于1.5mg/ml。經(jīng)多種指標(biāo)檢測(cè)，半成品雞膠原蛋白Ⅱ型純度可達(dá)到95％，硫酸軟骨素含量低于3％，無(wú)降解片段存在，無(wú)殘留胃蛋白酶和胰蛋白酶活性。2．雞Ⅱ型膠原蛋白口服胃溶膠囊的制備成品口服制劑是半成品溶液加入賦形劑以及用非揮發(fā)性酸的凍干，Ⅱ型膠原蛋白∶甘露醇∶酒石酸的比例為1∶40∶9，可很好地凍干成白色粉末狀。凍干后半成品在水溶液和人工胃液中溶解良好。由于膠原蛋白Ⅱ型經(jīng)口服后主要由腸粘膜吸收，在制備過(guò)程中加入了大量的胃蛋白酶和胰蛋白酶消化，再加上Ⅱ型膠原蛋白在酸性條件下溶解性好，口服后能迅速在胃液中溶解，且不被其消化酶破壞。口服胃溶膠囊劑型是將半成品凍干粉與乳糖按1∶19混合后，每顆4號(hào)膠囊裝量125毫克，其中含有125微克的雞Ⅱ型膠原蛋白。成品膠囊經(jīng)水份測(cè)定以及HPLC含量和純度測(cè)定，溶出度和崩解度測(cè)定，均符合膠囊劑型的標(biāo)準(zhǔn)。按每次用10公斤AA雞劍突軟骨進(jìn)行以上工藝的制備，可得每公斤1.4克的雞Ⅱ型膠原蛋白的半成品，制成口服胃溶膠囊(0.125mg/顆)的總顆數(shù)為12000顆左右。3．雞Ⅱ型膠原蛋白胃溶膠囊對(duì)動(dòng)物關(guān)節(jié)炎模型的治療和預(yù)防作用3．1 灌胃雞Ⅱ型膠原蛋白5、25、50μg/Kg/d(微克/千克/天)對(duì)大鼠棉球肉芽腫均有明顯的抑制作用。
3．2 預(yù)防給藥對(duì)大鼠佐劑性關(guān)節(jié)炎(AA)有顯著抑制作用。5μg/Kg/d劑量組和50μg/Kg/d劑量組均能明顯抑制AA大鼠原發(fā)和繼發(fā)性足爪腫脹，其中5μg/Kg/d劑量組最佳，病理學(xué)檢查支持此結(jié)果。對(duì)AA大鼠腹腔巨噬細(xì)胞(PMφ)白細(xì)胞介素-1(IL-1)和腫瘤壞死因子(TNF-α)活性有顯著抑制作用(均有P＜0.01)。
3．3 造模前5天到制模后第16天灌胃雞Ⅱ型膠原蛋白預(yù)防治療給藥，對(duì)小鼠Ⅱ型膠原蛋白性關(guān)節(jié)炎(CIA)有明顯的治療作用。其中5μg/Kg/d劑量組評(píng)分有顯著減輕(P＜0.01),50μg/Kg/d劑量組有一定改善(P＜0.05)。同時(shí)發(fā)現(xiàn)CIA模型小鼠升高了的L3T4+/Lyt-2+T淋巴細(xì)胞亞型比值有所降低，5μg/Kg/d劑量組最為明顯。同時(shí)可使各劑量組血清抗Ⅱ型膠原抗體水平出現(xiàn)下降趨勢(shì)，也以5μg/Kg/d劑量組顯著(P＜0.01)。
權(quán)利要求
1．Ⅱ型膠原蛋白加入甘露醇和酒石酸后凍干，再與α-乳糖混均，裝胃溶膠囊而成Ⅱ型膠原蛋白的口服胃溶膠囊制劑。
2．條款1中的Ⅱ型膠原蛋白凍干配方為Ⅱ型膠原蛋白∶甘露醇∶酒石酸的比例=1∶40∶9。
3．條款1中的α-乳糖混均比例為半成品凍干粉α-乳糖=1∶19。
4．條款1，中的胃溶膠囊可用片劑代替。
5．條款2中的甘露醇用白蛋白、明膠等其它賦形劑和/或保護(hù)劑替代同樣適用，酒石酸也可用其它非揮發(fā)性的酸性物質(zhì)代替。
6．條款3中的α-乳糖可用其它輔料代替，如淀粉類的淀粉、羧甲基淀粉鈉、預(yù)膠化淀粉，糖類的蔗糖粉、葡萄糖、甘露醇、山梨醇，纖維素類的微晶纖維素、甲基纖維素、羧甲基纖維素鹽、乙基纖維素、羧丙基甲基纖維素、低取代羧丙基纖維素等。
7．條款1中的Ⅱ型膠原蛋白主要指雞軟骨來(lái)源的Ⅱ型膠原蛋白，牛或豬等哺乳動(dòng)物來(lái)源的Ⅱ型膠原蛋白同樣適用。
8．條款1中的劑型具有治療和預(yù)防類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎或強(qiáng)直性關(guān)節(jié)炎的藥物價(jià)值。
全文摘要
關(guān)節(jié)軟骨的Ⅱ型膠原蛋白是類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的主要致病抗原,通過(guò)口服Ⅱ型膠原蛋白由腸道粘膜產(chǎn)生免疫耐受,可以有效地預(yù)防和治療類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎或強(qiáng)直性關(guān)節(jié)炎。本發(fā)明采用將Ⅱ型膠原蛋白制備成口服胃溶制劑,能更好地被腸粘膜吸收和利用,達(dá)到臨床上治療和預(yù)防的效果。
文檔編號(hào)A61K38/39GK1303714SQ00100269
公開日2001年7月18日 申請(qǐng)日期2000年1月13日 優(yōu)先權(quán)日2000年1月13日
發(fā)明者范開, 王立兵, 黃洪濤, 田峰 申請(qǐng)人:重慶多泰制藥有限公司