專利名稱：殺菌/通透性增強(qiáng)蛋白質(zhì)功能區(qū)生物活性肽的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于用于治療人體細(xì)菌感染和內(nèi)毒素血癥的活性多肽分子，具體涉及殺菌/通透性增強(qiáng)蛋白質(zhì)(BPI)功能區(qū)生物活性肽--BPI變構(gòu)肽。
革蘭氏陰性(G-)細(xì)菌引起的膿毒癥是導(dǎo)致臨床病人死亡的重要原因之一，其中存在于G-細(xì)菌外膜的脂多糖(內(nèi)毒素，LPS)起著重要的作用。針對G-菌的治療主要是采用抗生素來殺滅細(xì)菌。但是抗生素在殺滅細(xì)菌的同時(shí)導(dǎo)致內(nèi)毒素的大量釋放，其結(jié)果往往是病人死于嚴(yán)重的內(nèi)毒素血癥，這一直是臨床亟待解決的難題。
目前已有一些或具有中和內(nèi)毒素能力或具有殺菌作用的多肽分子，如從鱟血細(xì)胞提取的抗內(nèi)毒素因子(LALF)，從多粘菌中提取的多粘菌素B1。和LALF一樣，多粘菌素的類似物由于缺乏脂肪酸基因，雖然可以和LPS結(jié)合但無殺菌能力。又如Cecropins和magainins是兩種具有殺菌功能的肽類化合物，此類肽的氨基酸長度多在20-40之間，殺菌能力最強(qiáng)的Cecropin是Cecropin A，但它們的中和內(nèi)毒素作用卻不強(qiáng)。為此尋找一種既能殺滅細(xì)菌又能中和細(xì)菌死亡后釋放的內(nèi)毒素的活性多肽分子，將是一項(xiàng)非常有意義的工作。
人體存在許多抵御外來微生物侵襲的防御機(jī)制，其中白細(xì)胞是一重要環(huán)節(jié)，殺菌/通透性增強(qiáng)蛋白(Bactericidal/permeability-increasing protein,BPI)就是從哺乳類動(dòng)物白細(xì)胞嗜天青顆粒中分離出的蛋白質(zhì)。人源BPI已由weiss(Weiss J.et al.1987.Blood 69:652)在1987年利用酸抽提及親合層分析分離成功，其分子量為55KD，其cDNA及氨基酸序列已由Gray(Gray PW.Et al.1989.J.Bio.Chem.264:9505)證實(shí)。研究結(jié)果表明其具有強(qiáng)大而廣譜的殺滅G-細(xì)菌及中和內(nèi)毒素的能力。
BPI特異殺滅G-細(xì)菌的機(jī)制可能與帶正電的BPI與帶負(fù)電脂多糖相互吸引，細(xì)菌表面電位發(fā)生變化，從而導(dǎo)致細(xì)菌外膜通透性的改變有關(guān)。同時(shí)，BPI還具有中和LPS毒性的能力，因此BPI可應(yīng)用于治療由G-細(xì)胞引起的感染性疾病，包括菌血癥、內(nèi)毒素血癥、膿毒癥等。不僅全序列的BPI具有殺菌和中和內(nèi)毒素的能力，而且N末端的199個(gè)氨基酸(rBPI23)也具有完整BPI的全部生物學(xué)功能，不過C末端僅有輕微或無殺菌能力(Ooi CE.et al.1991 J.Exp.Med.174:649)。但是rBPI23在對細(xì)菌感染和LPS血癥的治療時(shí)，需要絕對的量才能達(dá)到殺滅細(xì)菌和中和LPS的目的，存在用量較大、成本較高等問題。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道(J5 Study Group.1992J.Infect Dis.165:695,Ziegler EJ.et al.1991 New Eng J.Med.324:429),BPI功能區(qū)主要由三大部分組成，①BPI 17-45氨基酸序列，②BPI 65-99氨基酸序列，③BPI 142-169氨基酸序列，也就是說BPI殺菌和中和LPS的生物活性區(qū)域分別存在于這三個(gè)氨基酸序列的區(qū)域內(nèi)。因此尋找出更小的既能殺滅細(xì)菌又能中和內(nèi)毒素的BPI功能區(qū)結(jié)構(gòu)，以及在此基礎(chǔ)上尋找新的殺菌和中和LPS活性更強(qiáng)、生產(chǎn)成本更低的多肽分子，并能產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)以滿足臨床治療的需要，是一個(gè)十分重要的研究課題。
本發(fā)明是申請人的、申請?zhí)枮?9105075.4的發(fā)明的延續(xù)，其目的在于利用現(xiàn)今公知的合成方法提供可穩(wěn)定重復(fù)生產(chǎn)的，包括全部或部分BPI生物功能如殺菌、中和內(nèi)毒素活性的、新的小分子量多肽分子--BPI變構(gòu)肽。
本發(fā)明主要通過在BPI功能區(qū)的一個(gè)位點(diǎn)置換不同的氨基酸，或在2個(gè)以上不同位置置換同一氨基酸或不同氨基酸，以得到具有BPI同樣功能的活性短肽--線性的BPI功能區(qū)片段變構(gòu)體。
上述本發(fā)明所定義的這種BPI變構(gòu)肽，具有以下特征(一)SEQ ID NO:5(BPI F)(1)序列特征(A)長度13氨基酸(B)類型氨基酸(C)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(2)分子類型肽(3)序列描述SEQ ID NO:5N’--YCA/LQK/RFI/LKM/C--C’或Tyr Cys Ala Leu Gln Lys Arg Phe Ile Leu Lys MetCys(二)SEQ ID NO:6(BPI G)的資料
(1)序列特征(A)長度14氨基酸(B)類型氨基酸(C)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(2)分子類型肽(3)序列描述SEQ ID NO:6N’--KSK/VGF/LQL/LFH/KK--C’或Lys Ser Lys Val Gly Phe Leu Gln Leu Leu Phe His LysLys(三)SEQ ID NO:7(BPI H)的資料(1)序列特征(A)長度14氨基酸(B)類型氨基酸(C)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(2)分子類型肽(3)序列描述SEQ ID NO:7N’--KGK/GV/FLQ/IQL/FHK--C’或Lys Gly Lys Gly Val Phe Leu Gln Ile Gln Leu PheHis Lys(四)SEQ ID NO:8(BPI I)的資料(1)序列特征(A)長度24氨基酸
(B)類型氨基酸(C)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(2)分子類型肽(3)序列描述SEQ ID NO:8N’--KSK/VGF/LIQ/LFH/KKL/RGS/LTK/LKG--C’或Lys Ser Lys Val Gly Phe Leu Ile Gln Leu Phe HisLys Lys Leu Arg Gly ser Leu Thr Lys Leu Lys Gly。
本發(fā)明所提供的BPI變構(gòu)肽，可按Merrifield等(MerrifieldRB.1963 J Am Chem Soc.85:2149)報(bào)告的公知的合成方法合成，這是一種眾所周知的固相化學(xué)合成技術(shù)，氨基酸為Fmoc保護(hù)的氨基酸，合成用樹脂為PEG-PS樹脂。合成時(shí)按多肽順序由C端逐個(gè)向N端延伸，縮合劑為DCCI，加85％HOBT/DIEA以活化氨基酸的羧基，每輪循環(huán)用Piperidine-DMF1∶4除去Fmoc。本發(fā)明物是在PE公司的Pioneer多肽自動(dòng)合成儀上進(jìn)行合成，根據(jù)給定的BPI變構(gòu)肽氨基酸序列，多肽自動(dòng)合成儀能自動(dòng)完成各種反應(yīng)程序而得到所需的BPI變構(gòu)肽片段，最后用三氟醋酸法將多肽從樹脂上切割并除去所有的保護(hù)基團(tuán)，合成得到的多肽須經(jīng)過BioCAD系統(tǒng)分離純化純化柱 POROS R1 20或POROS R2 20反相柱，4.6mm×100mm流動(dòng)相A 0.1％三氟醋酸(TFA)流動(dòng)相B 100％乙晴/0.1％TFA10 to 100％流動(dòng)相B線性梯度洗脫檢測波長220nm
流速5.0ml／min.
主峰面積占整個(gè)峰面積的比例為純度。再經(jīng)Sephadex G-25脫鹽，樣品冷凍干燥后經(jīng)質(zhì)譜鑒定、N端氨基酸序列分析測定分子量并確認(rèn)其氨基酸序列。
實(shí)施例BPI H的制備采用Pioneer多肽自動(dòng)合成儀進(jìn)行合成，具體步驟為 (輸入BPI H氨基酸序列)-- (85％HATU/DIEA) (Lys-PEG-PS 5g，柱25x25mm)-- (活化氨基酸1min，氨基酸脫保護(hù)(Piperidine-DMF1:4)8 min)-- (20min)-- (15min，每步效率大于98％，時(shí)間45min) (TFA∶H2O=95∶5),40min (2.6g，得率96％)上述所得到的粗肽溶液，在以下純化條件下進(jìn)行純化純化柱POROS R1 20反相柱，4.6mm×100mm流動(dòng)相A0.1％三氟醋酸(TFA)流動(dòng)相B100％乙晴/0.1％TFA10 to 100％流動(dòng)相B線性梯度洗脫檢測波長220nm流速5.0ml/min.
收集主峰溶液，再經(jīng)Sephadex G-25脫鹽，溶液冷凍干躁，得到1.9g純度為86.53％(HPLC百分面積)的BPI H變構(gòu)肽。經(jīng)質(zhì)譜鑒定、N端氨基酸序列分析測定分子量并確認(rèn)其氨基酸序列；同樣，采用與上述合成BPI H變構(gòu)肽相同的設(shè)備、工藝條件及相近的原料，合成得到的BPI F、BPI G及BPI I變構(gòu)肽，經(jīng)質(zhì)譜鑒定、N端氨基酸序列分析測定分子量并確認(rèn)其氨基酸序列，其結(jié)果如表1所示表1 BPI變構(gòu)肽質(zhì)譜、N末端氨基酸序列分析結(jié)果
這些短肽--BPI變構(gòu)肽，及其2個(gè)或3個(gè)相同或不同的肽相連成的肽，或這些肽作為稀釋劑、佐劑及載體，都具有殺滅G-、G+及真菌和中和LPS□的多種功效，可用于細(xì)菌性感染疾病的治療，包括對傳統(tǒng)抗生素耐藥的細(xì)菌性感染的治療，也可應(yīng)用于治療內(nèi)毒素血癥。
本發(fā)明的BPI變構(gòu)肽的問世，由于其分子量小，治療劑量小，成本低，而且可通過化學(xué)合成法合成，因而可實(shí)現(xiàn)工業(yè)化生產(chǎn)。BPI變構(gòu)肽生物活性檢測1．中和內(nèi)毒素活性

圖1是本發(fā)明的BPI變構(gòu)肽中和LPS能力的測試圖。多粘菌素B為陽性對照。將各種BPI變構(gòu)肽與內(nèi)毒素0111B4混勻，37℃孵育30分鐘，間斷搖晃，然后加入pH8.0磷酸鹽緩沖液(PBS)，使內(nèi)毒素終濃度為200pg/ml，最后采用基質(zhì)顯色法鱟試劑盒檢測內(nèi)毒素含量。結(jié)果見圖1，說明BPI變構(gòu)肽在體外均有中和LPS的作用，其中以BPIF的活性最高。
2．抑制腫瘤壞死因子(TNF)的產(chǎn)生人單核細(xì)胞株(THP-1)受內(nèi)毒素刺激后可釋放TNF，且有劑量依賴關(guān)系，中和內(nèi)毒素后，TNF必將減少，TNF的量可采用ELISA法檢測(試劑盒由Roch公司提供)。
圖2是本發(fā)明的BPI變構(gòu)肽抑制腫瘤壞死因子能力的測試圖。將THP-1培養(yǎng)于RPMI1640中，細(xì)胞懸液離心后用新鮮RPMI1640配成1×105/ml，接種于96孔培養(yǎng)板，加入大腸桿菌0111B4內(nèi)毒素5ng/ml,37℃培養(yǎng)6小時(shí)，每孔中分別加入BPI變構(gòu)肽0.1ug/ml至100ug/ml，離心，取上清，測TNF含量，結(jié)果表明BPI在濃度為0.1ug/ml即產(chǎn)生明顯的抑制TNF產(chǎn)生的作用。
3．殺菌活性檢測圖3是本發(fā)明的BPI變構(gòu)肽殺菌活性的測試圖。檢測細(xì)菌為大腸桿菌J5,0111B4，先將細(xì)菌復(fù)蘇于普通瓊脂平板，挑取單個(gè)菌落接種于5ml M-H肉湯，37℃,3-4h至細(xì)菌生長于對數(shù)期。1000rpm/min離心5分鐘，棄上清，沉淀用5mlPBS沖洗，離心后用M-H肉湯稀釋至2×106cfu/ml加入BPI變構(gòu)肽，按200μg/ml倍比稀釋至每管，37℃振蕩孵育20小時(shí)，于590nm處讀取吸光度。另取50ul菌液于血晾脂平板上，過夜培養(yǎng)計(jì)數(shù)，結(jié)果說明幾種BPI變構(gòu)肽在體外有殺菌作用，BPI F效果最好。
4．對小鼠內(nèi)毒素血癥的治療作用小鼠尾靜脈注射大腸桿菌0111B4內(nèi)毒素，LD90為20mg/kg。然后迅速同途徑注射不同劑量BPI變構(gòu)肽(劑量為1mg/kg或5mg/kg體重)，用地塞米松為陽性對照，生理鹽水為空白對照，觀察7天后動(dòng)物死亡率。結(jié)果見表2。
表2 BPI變構(gòu)肽對小鼠內(nèi)毒素血癥模型的保護(hù)作用
結(jié)論BPI變構(gòu)肽對LPS(20mg/kg體重)攻擊的小鼠有明顯的保護(hù)作用。
5．對小鼠腹膜炎的保護(hù)作用小鼠腹腔注入活大腸桿菌0111B4,1×107cfu/ml 0.5ml，隨即注入1ml BPI變構(gòu)肽(劑量為1或5mg/kg體重)，以多粘菌素B為陽性對照，生理鹽水為空白對照，觀察動(dòng)物7天后的死亡率，結(jié)果見表3。
表3 BPI變構(gòu)肽對小鼠腹膜炎的保護(hù)作用
結(jié)論BPI變構(gòu)肽對產(chǎn)生腹膜炎的小鼠有較強(qiáng)的保護(hù)作用。
權(quán)利要求
1．一種由BPI功能區(qū)氨基酸序列經(jīng)置換而來的活性多肽分子--BPI變構(gòu)肽(BPI-F)，其特征在于其(1)序列特征(A)長度13氨基酸(B)類型氨基酸(C)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(2)分子類型肽(3)序列描述SEQ ID NO:5F.N’--YCA/LQK/RFI/LKM/C--C’。
2．一種由BPI功能區(qū)氨基酸序列經(jīng)置換而來的活性多肽分子--BPI變構(gòu)肽(BPI-G)，其特征在于其(1)序列特征(A)長度14氨基酸(B)類型氨基酸(C)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(2)分子類型肽(3)序列描述SEQ ID NO:6G.N’-KSK/VGF/LQL/LFH/KK--C’。
3．一種由BPI功能區(qū)氨基酸序列經(jīng)置換而來的活性多肽分子--BPI變構(gòu)肽(BPI-H)，其特征在于其(1)序列特征(A)長度14氨基酸(B)類型氨基酸(C)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(2)分子類型肽(3)序列描述SEQ ID NO:7H.N’-KGK/GV/FLQ/IQL/FHK--C’。
4．一種由BPI功能區(qū)氨基酸序列經(jīng)置換而來的活性多肽分子--BPI變構(gòu)肽(BPI-I)，其特征在于其(1)序列特征(A)長度24氨基酸(B)類型氨基酸(C)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(2)分子類型肽(3)序列描述SEQ ID NO:8I.N’--KSK/VGF/LIQ/LFH/KKL/RGS/LTK/LKG--C’。
5．如權(quán)利要求1,2,3或4所述的BPI變構(gòu)肽及其2個(gè)或3個(gè)相同或不同的肽相連成的肽，其特征在于用于治療G-細(xì)菌感染或內(nèi)毒素血癥。
6．如權(quán)利要求1,2,3或4所述的BPI變構(gòu)肽及其2個(gè)或3個(gè)相同或不同的肽相連成的肽作為稀釋劑、佐劑及載體，其特征在于用于治療G-細(xì)菌感染或內(nèi)毒素血癥。
全文摘要
一種由BPI功能區(qū)氨基酸序列經(jīng)置換而來的、其氨基酸序列為:F.N’——YCA/LQK/RFI/LKM/C－－C’,G.N’——KSK/VGF/LQL/LFH/KK－－C’,H.N’－－KGK/GV/FLQ/IQL/FHK－－C’,I.N’－－KSK/VGF/LIQ/LFH/KKL/RGS/LTK/LKG－－C’的活性多肽分子及其2個(gè)或3個(gè)相同或不同的肽相連成的肽,或其作為稀釋劑、佐劑及載體,用于治療G－細(xì)菌感染或內(nèi)毒素血癥,治療劑量小,成本低,而且可通過化學(xué)合成法合成,因而可實(shí)現(xiàn)工業(yè)化生產(chǎn)。
文檔編號(hào)A61P31/00GK1306965SQ0010174
公開日2001年8月8日 申請日期2000年1月21日 優(yōu)先權(quán)日2000年1月21日
發(fā)明者姚志勇, 曾少貴, 沈福泉 申請人:深圳市翰宇生物工程有限公司