專利名稱：具有抗腫瘤活性的兩個新阿撲菲－芐基異喹啉化合物的制作方法
技術(shù)領域：
本發(fā)明屬于一類具有抗腫瘤活性的阿撲菲-芐基異喹啉生物堿化合物。
阿撲菲-芐基異喹啉化合物對多種腫瘤細胞具有較強的抑制作用。美國于1975年開始對唐松草堿(thalicarpine)進行了I期臨床試驗，在最大耐藥量(1400mg/m2)和靜脈給藥(1100mg/m2)時，均出現(xiàn)臂痛、中樞神經(jīng)系統(tǒng)抑制、惡心、嘔吐、血壓升高或降低竇性心率不齊，并伴有心電圖改變等副作用。1980年開始對其進行II期臨床試驗，出現(xiàn)更多的副作用，并最終導致抗腫瘤臨床試驗的中止。90年代，對唐松草堿等阿樸菲-芐基異喹啉新生物堿的尋找和抗腫瘤篩選仍在繼續(xù)，Chen.G等發(fā)現(xiàn)唐松草堿對那些對順鉑具抗藥性的大鼠卵巢腫瘤細胞作用強于親本細胞，提示唐松草堿可代替順鉑治療那些對順鉑抗藥并伴有體溫過高的惡性腫瘤，同時還對唐松草堿與多種抗腫瘤藥的協(xié)同作用和作用機制進行了比較系統(tǒng)的研究。Todorov DK等發(fā)現(xiàn)唐松草堿對兩種人類神經(jīng)膠質(zhì)瘤細胞具有增殖作用。Wu YW等從爪哇唐松草(Tjavanicum)中分出的成分thaifarajine對五種腫瘤細胞具有抑制作用。Lin L-Z等從大葉唐松草(T.faberi Ulbr.)中分出多種生物堿對P-388等腫瘤細胞均有較強細胞毒作用。到目前為止，從植物界中分離得到的阿樸菲-芐基異喹啉二聚體生物堿大約有80多個，它們主要分布于唐松草屬，蓮葉桐屬和部分小檗屬植物中，許多這類成分對腫瘤細胞具有明顯抑制作用。但是本發(fā)明所涉及的兩個具抗腫瘤活性的新化合物，迄今為止，尚未發(fā)現(xiàn)有專利或文獻報道。
本發(fā)明之目的在于充分利用我國豐富的含有阿樸菲-芐基異喹啉生物堿類的植物資源，深入進行研究開發(fā)，尋找具有新化學結(jié)構(gòu)，抗腫瘤活性強，且毒副作用小的這類化合物，以期為臨床提供新型抗腫瘤藥物。
本發(fā)明的技術(shù)方案依此包含如下步驟以狹序唐松草(Tatriptex Finet et Gagnep)地上部分(11.5Kg)為原料(見圖1)，經(jīng)用95％乙醇回流提取兩次，每次兩小時；藥渣再用70％乙醇回流兩次，每次兩小時，合并兩次提取液后，回收溶劑，得浸膏，用5％的醋酸溶解，酸水混懸液，用NH4OH堿化，PH9-10，過濾，得濾出物A-1(27g)堿水混懸液用乙醚萃取4次，乙醚萃取液減壓回收溶劑后，得浸膏A-2(64.5g)。合并A-1和A-2，用氯仿溶解，不溶物棄去，氯仿液用5％NaOH水溶液萃取4次，氯仿層回收溶劑后，得浸膏B(82.5g)；堿水層用NH4Cl飽和，用乙醚萃取，得到乙醚萃取液，回收溶劑后，得到浸膏C(9g)。
B部分用硅膠柱層析，以氯仿-甲醇系統(tǒng)洗脫，每份100ml，共收集210份，其中72-119份(9.8g)，再次用硅膠柱層析，以氯仿-甲醇系統(tǒng)洗脫，每份50ml，共收集60份，其中19-20份得到一白色無定形粉末，TLC檢查為單一斑點，為化合物I(60mg)。
C部分用硅膠H柱層析，以氯仿-甲醇系統(tǒng)洗脫，得到105份，其中40-43份再次用硅膠柱層析，以醋酸乙酯-甲醇系統(tǒng)洗脫，得到30份，其中15-29份，得到一白色無定形粉末，TLC檢查為單一斑點，為化合物II(110mg)。
化合物I，白色無定型粉末，mp 83-85℃，Dragendorff試劑反應陽性，UV光譜(MeOH)nm202，222(sh)，280，304，(見圖2)與已知的thalifaberine類化合物相同，確定該化合物的結(jié)構(gòu)骨架為thalifaberibe型阿樸菲-芐基異喹啉生物堿。IR光譜(見圖3)顯示3440cm-1羥基吸收。高分辯質(zhì)譜測定分子量為m/z 682.3314，確定其分子式為C40H46O8N2(計算值為682.3327)，F(xiàn)AB-MS(見圖4)中除給出m/z 683(M++1)的碎片外，基峰為m/z 206，根據(jù)該類化合物的質(zhì)譜裂解規(guī)律，說明芐基異喹啉一側(cè)的異喹啉環(huán)有兩個OCH3。1H-NMR(CDCl3)(見圖5)δ2.29，2.52ppm兩個單峰甲基信號，為氮甲基信號，δ3.56，3.78，3.79，3.82，3.91，3.98ppm有六個甲氧基信號，δ6.02-7.81ppm有七個芳氫信號，其中δ6.76(2H，d.J＝8.6Hz)和δ6.96(2H，d.J＝8.6Hz)為AA’BB’系統(tǒng)，可以歸結(jié)為芐基異喹啉部分與氧橋相連的苯環(huán)上的四個對稱的芳氫，δ7.81(1H，s)為此類化合物的11位氫的特征信號。13C-NMR譜(見表1)在低場區(qū)(135-157ppm)顯示苯環(huán)上有九個氧取代碳信號，除甲氧基和氧橋外，推測應有一個羥基，從質(zhì)譜的m/z 369碎片推測羥基在阿樸菲一側(cè)，NOE實驗(見圖6)顯示當分別照射δ3.91和3.78ppm信號時，δ7.81ppm峰均有增益，照射δ7.81ppm信號時，δ3.91和3.78ppm信號均有增益，確定δ3.78和3.91ppm峰分別位于阿樸菲一側(cè)的1和10位碳信號，照射δ3.82ppm信號時，δ6.53ppm信號有明顯增益，確定δ3.82ppm信號為6’位的甲氧基，δ6.53ppm信號為5’位氫信號，同時確定δ3.56的甲氧基和δ6.01ppm的芳氫應分別是7’和8’位的信號，當照射δ3.95ppm信號時，δ3.78和3.79ppm信號有增益，確定δ3.95ppm信號為2位的甲氧基，δ3.79ppm信號為3位的甲氧基，羥基應連接于9位。HMBC譜(見圖7)δ2.29和2.52ppm兩個氮甲基信號分別與δ52.8和46.2ppm有遠程相關(guān)，確定兩個氮甲基分別為6和2’位。這就進一步驗證上述推測是合理的。最終確定化合物I為1.2.3.10.6’.7’-六甲氧基-9-羥基新的thalifaberine型阿樸菲-芐基異喹啉生物堿，其結(jié)構(gòu)如式I所示，命名為thaliatriplexine。其CD譜與同類型已知化合物(S，S)thalifaberine相同，從而確定該化合物6和1`位手性碳為S，S構(gòu)型。
化合物II，黃色粒狀結(jié)晶(丙酮)，mp 205-207℃，Dragendorff試劑反應陽性，UV(見圖8)與已知的thalifaberine類化合物相同，確定其結(jié)構(gòu)骨架為thalifaberine型生物堿，高分辨FAB-MS(見圖9)測定分子量為m/z 638.3059(實驗值)，確定其分子式為C38H42O7N2(計算值為638.3065)，F(xiàn)AB-MS中除m/z 639(M++1)外，基峰為m/z 192，根據(jù)此類型化合物的質(zhì)譜裂解規(guī)律，說明芐基異喹啉一側(cè)的異喹啉環(huán)取代基有一個羥基和一個甲氧基。1H-NMR(CDC3)(見圖10)δ2.30，和2.48ppm為兩個氮甲基信號，δ3.68，3.78，3.87和3.95ppm
I R1＝R2＝OCH3II R1＝H，R2＝OH顯示四個甲氧基，δ6.04-8.01ppm顯示八個芳環(huán)氫信號，其中δ6.76(2H，d.J＝8.6Hz)和6.96ppm(2H，d.J＝8.6Hz)，兩組峰為AA’BB’系統(tǒng)，是芐基異喹啉部分與氧橋相連的苯環(huán)上的四個對稱芳氫。δ8.01ppm(1H，s)為此類化合物的11位氫的特征信號。13C-NMR譜(見表1)在低場區(qū)(δ135-157ppm)顯示苯環(huán)上有八個氧取代碳信號，除甲氧基、氧橋及芐基異喹啉一側(cè)的羥基外，推測阿樸菲一側(cè)也有一羥基。NOE實驗(見圖11)當分別照射δ3.95和3.68ppm峰時，δ8.01ppm有增益，照射δ8.01ppm時，δ3.95和3.68ppm峰有增益，說明δ3.95和3.68ppm分別為10位和1位的甲氧基，照射δ3.87ppm峰時，δ6.58ppm的信號有明顯增益，照射δ3.58ppm信號時，δ3.87ppm峰有增益，說明δ3.87ppm信號為2位的甲氧基，δ3.58的信號為3位的氫，照射δ3.78ppm峰時，δ6.50ppm的信號有增益，照射δ6.50ppm信號時，δ3.78ppm峰有增益，從而確定δ3.78ppm為6’位的甲氧基，δ6.50的信號為5’位氫，綜合分析并結(jié)合FAB-MS，確定兩個羥基應分別在9位和7’位，最后推定化合物II的結(jié)構(gòu)為1.2.10.6’-四甲氧基-9.7’-二羥基新的thalifaberine型阿樸菲-芐基異喹啉生物堿，其結(jié)構(gòu)如式II所示。其CD譜與同類已知化合物(S，S)-thalifaberine相同，確定1’和6位手性碳為S，S構(gòu)型，命名為thaliatriplextine表1化合物I和II的13C-NMR數(shù)據(jù)C I IIC I II1 150.0145.1 1’ 64.9 64.91a 124.0124.0 1’a127.0 128.81b 128.0129.5 3’ 46.2 46.72 146.2144.5 4’ 22.7 27.33 150.0110.8 4’a124.3 126.83a 150.0122.0 5’ 111.1 114.04 21.0 25.2 6’ 147.0 144.05 52.8 53.1 7’ 147.0 145.76a 62.2 61.9 8’ 111.0 111.07 24.0 28.8 9’ 133.6 133.47a 122.5122.9 10’ 132.0 130.88 138.8138.8 11’ 115.0 115.09 137.8138.3 12’ 157.0 156.510 146.3143.5 13’ 115.0 115.011 108.2108.6 14’ 132.0 130.811a 124.0124.0 α40.5 40.5N-CH343.5 43.4 N-CH342.6 42.41-OCH361.6 55.8 6’-OCH356.4 60.22-OCH361.9 55.9 7’-OCH356.4 ----3-OCH361.6 ----10-OCH355.8 56.3經(jīng)藥理學研究，化合物I和II均具有較強的體外抗腫瘤活性。
體外藥效學試驗方法將瘤細胞培養(yǎng)在含10％小牛血清及100U/ml Pemcillin(青霉素)及100μg/ml的Streptomycin(鏈霉素)的RPMI 1640培養(yǎng)基中放入含5％CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。用MTT(3-(4.5-dimethylthiazol-2-yl)-2.5-diphenyl tetrazolium bromide)法測定有關(guān)化合物對人口腔癌細胞株(KB細胞)，人卵巢癌細胞株(A2780)，人大腸癌細胞株(HCT-8)，及小鼠淋巴細胞白血病細胞株(P-388)的殺傷作用。其殺傷效果以瘤細胞增殖抑制的半數(shù)抑制濃度(IC50，即50％Inhibition Concentration)表示，具體方法如下收集生長良好的腫瘤細胞，用含10％小牛血清的RPMI1640培養(yǎng)基配制成1×104/ml細胞懸液，于96孔培養(yǎng)板內(nèi)，每孔接種100μl(含1000個腫瘤細胞)，置37℃，5％CO2溫箱內(nèi)培養(yǎng)24小時，給藥組加入含有不同濃度藥物的RPMI1640培養(yǎng)基，每孔100μl，設4-5個濃度，每孔3個平行孔，對照組加入含有等體積溶劑的1640培養(yǎng)基，每孔100μl，置37℃，5％CO2溫箱內(nèi)培養(yǎng)4天。棄去培養(yǎng)液，每孔加入MTT溶液100μl(0.4mg/ml，用RPMI 1640配制)，37℃孵育4小時。棄去上清液，每孔加入DMSO 150μl，溶解Fomazan顆粒，輕度震蕩后，用BIO-RAD 550型酶標儀，在播長540nm條件下測定OD值。
結(jié)果計算以藥物的不同濃度及對細胞的抑制率作圖咳得到劑量反應曲線，從中求出半數(shù)抑制濃度(IC50)。
實驗結(jié)果化合物I在體外對上述瘤細胞生長抑制的IC50分別為2.65，2.34，2.81及0.7μg/ml；化合物II在體外對上述瘤細胞生長抑制的IC50分別為2.78，2.46及2.77μg/ml(P388細胞未測).詳見表2。
表2體外對癌細胞生長的半數(shù)抑制濃度(IC50)IC50(μg/ml)樣品 KB A2780HCT-8P-388I 2.65 2.34 2.81 0.7II 2.78 2.46 2.77 未測結(jié)果表明化合物I和II對上述瘤株有明顯作用。
本發(fā)明的優(yōu)點與積極效果是，所得到的兩個新化合物I和II由于對有關(guān)的人癌細胞株具明顯的體外抑制作用，從而可以充分利用我國豐富的含阿樸菲-芐基異喹啉生物堿類的植物資源，大量提取制備，以便深入進行藥理、臨床研究，為開發(fā)療效好且毒副作用小的新型抗腫瘤藥創(chuàng)造條件。


圖1新阿樸菲-芐基異喹啉生物堿化合物I和II的制備流程；圖2化合物I的UV光譜；圖3化合物I的IR光譜；圖4化合物I的FAB-MS譜；圖5化合物I的1H-NMR譜；圖6化合物I的NOE差譜；圖7化合物I的HMBC譜；圖8化合物II的UV光譜；圖9化合物II的FAB-MS譜；圖10.化合物II的1H-NMR譜；圖11化合物II的NOE差譜。
權(quán)利要求
1.具有抗腫瘤活性的兩個新阿樸菲-芐基異喹啉化合物，其特征是(1).化合物的結(jié)構(gòu)如下式所示
式中R1為H或OCH3R2為OH或OCH3(2).化合物的制備依次包含以下步驟取狹序唐松草地上部分為原料，乙醇回流提取，得浸膏，經(jīng)醋酸溶解，NH4OH堿化，過濾，得濾出物A-1，經(jīng)乙醚萃取得浸膏A-2，合并A-1和A-2，經(jīng)氯仿溶解，棄去不溶物，NaOH水溶液萃取氯仿液，得浸膏B，用NH4Cl飽和堿水層，乙醚萃取，得浸膏C，再經(jīng)硅膠柱或硅膠H柱反復層析，最終得到所要的化合物。(3).以體外培養(yǎng)腫瘤細胞增殖抑制的半數(shù)抑制濃度(IC50)作為指標，采用MTT法測定化合物對人體口腔癌細胞株(KB細胞)、人卵巢癌細胞株(A2780)、人大腸癌細胞株(HCT-8)及小鼠淋巴白血病細胞株(P-388)的殺傷作用。
2.按照權(quán)利要求1所述的新阿樸菲-芐基異喹啉化合物，其特征是當結(jié)構(gòu)中R1＝R2＝OCH3時，為1.2.3.10.6’.7’-六甲氧基-9-羥基新的阿樸菲-芐基異喹啉生物堿化合物I，其分子式為C40H46O8N2，分子量為682.3327(計算值)，系白色無定型粉末狀；當R1＝H，R2＝OH時，為1.2.10.6’-四甲氧基-9.7’-二羥基新的阿樸菲-芐基異喹啉生物堿化合物II，分子式為C38H42O7N2，分子量為638.3065(計算值)，系黃色粒狀結(jié)晶。
全文摘要
本發(fā)明涉及一類具抗腫瘤活性的新阿樸菲—芐基異喹啉化合物,是以狹序唐松草地上部分為原料,用特定溶劑提取處理,分別得到B和C兩部分,兩將這兩部分用硅膠或硅膠H柱層析,以特定溶劑系統(tǒng)洗脫,經(jīng)TLC檢查,得到單一純凈的化合物,用光譜分析的方法證明其化學結(jié)構(gòu),為兩個新化合物,分別命名為Thaliatraplextine和Thaliatraplexine,經(jīng)藥效學試驗表明,該兩個化合物對有關(guān)人癌及小鼠癌細胞株具有明顯抑制作用。
文檔編號A61P35/00GK1267670SQ0010329
公開日2000年9月27日 申請日期2000年3月23日 優(yōu)先權(quán)日2000年3月23日
發(fā)明者肖培根, 高光躍, 楊峻山, 韓銳, 陳四保 申請人:肖培根, 高光躍, 楊峻山, 韓銳, 陳四保