專利名稱：具抗腫瘤活性的馬氏珠母貝全臟器糖蛋白、糖胺聚糖及其提取工藝的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及從馬氏珠母貝全臟器提取的糖蛋白、糖胺聚糖，及其提取工藝，上述糖蛋白、糖胺聚糖化合物具有抗腫瘤、抗凝等活性，可作為抗腫瘤藥的醫(yī)藥組合物。
惡性腫瘤嚴(yán)重危害人類的健康，而抗癌化療藥都呈現(xiàn)出一定的毒性。從動、植物中提取一些具有抗腫瘤活性的天然化合物，用于生產(chǎn)高效低毒的抗腫瘤藥物是抗腫瘤藥物研究的一個方向。珍珠為名貴中藥，有報道珍珠層粉對小鼠肉瘤S-180有抑制作用，作為育成珍珠和珍珠層的母體—珠母貝全臟器，是否也含有相同或相似作用的糖蛋白、糖胺聚糖化合物，未有研究報道。本研究組已證實(shí)馬氏珠母貝全臟器的提取物具有顯著的抗癌作用，其單獨(dú)應(yīng)用有顯著抑制腫瘤細(xì)胞的增殖作用，與其它化療藥合用可顯著增敏化療藥的抑瘤作用，同時對抗其抑制免疫的不良反應(yīng)。
本發(fā)明的目的在于從馬氏珠母貝全臟器提取一種或數(shù)種具有抗癌活性的天然化合物，確定其化學(xué)本質(zhì)及結(jié)構(gòu)特征，了解其理化特性，為臨床醫(yī)學(xué)提供一種新的抗腫瘤藥物。
本發(fā)明涉及從馬氏珠母貝全臟器提取的糖蛋白、糖胺聚糖二類化合物。這二類化合物是從馬氏珠母貝全臟器提取，純化后經(jīng)化學(xué)組成測定、氣相色譜分析 紅外光譜分析、高效液相色譜分析鑒定證實(shí)其化學(xué)本質(zhì)及結(jié)構(gòu)特征的。
本研究組從馬氏珠母貝全臟器提取糖蛋白、糖胺聚糖的工藝為馬氏珠母貝全臟器凍融、鹽溶、有機(jī)溶劑沉淀或用等體積丙酮浸泡脫脂，濾除丙酮液后烘干粉碎，用胃酶、胰酶或胰酶、枯草桿菌中性蛋白酶酶解，滅酶后用硅藻土、活性碳(2∶3)脫色，經(jīng)有機(jī)溶劑(丙酮、乙醇、醋酸乙酯)沉淀后干燥成粉末；上述粉末用1.0％活性碳及0.5％硅藻土脫色，pH2.0及pH7.0除雜蛋白及透析脫鹽，透析液用60％乙醇-乙酸鈉沉淀及5％CTAB沉淀所得級分再經(jīng)60％乙醇-乙酸鈉沉淀及5％CTAB絡(luò)合，得一系列化合物。主要級分經(jīng)化學(xué)組成測定氨基己糖含量為52.5％，其中氨基半乳糖含量為34.3％，己糖醛酸含量為7.3％；經(jīng)醋酸纖維素薄膜電泳顯示為單一區(qū)帶，Rf在0.3～0.4之間；經(jīng)抗腫瘤試驗(yàn)結(jié)果顯示對體內(nèi)S-180肉瘤和艾氏腹水癌有顯著增敏陽性對照藥的抑瘤作用，抑瘤率分別達(dá)61.96％與46.3％；對體外培養(yǎng)HL-60細(xì)胞有一定的殺傷作用；同時，抗凝血實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示提取物有一定的抗凝作用，抗凝效果為肝素的二百分之一。
上述兩種化合物作為醫(yī)藥組合物，特別是抗腫瘤的藥理活性，是通過下述實(shí)驗(yàn)證實(shí)的。
實(shí)施例一1、材料與方法馬氏珠母貝全臟器糖胺聚糖由權(quán)利要求書所述工藝提取而得。
臺盼蘭、5-Fu、替加氟。
KM小鼠由廣東醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)單位中心提供，普通級，體重20±2g，雌雄各半。
移殖性腫瘤S180肉瘤和艾氏腹水癌(EAC)由中山醫(yī)科大學(xué)腫瘤研究中心提供，廣東醫(yī)學(xué)院藥理教研室腫瘤研究小組常規(guī)傳代培養(yǎng)。
無菌條件下，兩次實(shí)驗(yàn)分別抽取S180和艾氏腹水癌(EAC)腹水液，用N.S以1∶1稀釋(臺盼蘭染色計數(shù)為8.0×106個/ml和6.5×106個/ml)，無菌接種(每鼠0.2ml)于KM小鼠右腋下。接種后次日隨機(jī)分成生理鹽水組、陽性對照組(5-FU或替加氟)、低劑量受試藥組(馬氏珠母貝全臟器糖胺聚糖)、高劑量受試藥組(馬氏珠母貝全臟器糖胺聚糖)、及陽性對照藥與受試藥合用組共五組。每組小鼠分別灌胃給藥(0.1ml/10g體重)，連續(xù)10天，第11天處死，稱體重，解剖取肉瘤稱重。
2、實(shí)驗(yàn)結(jié)果馬氏珠母貝全臟器糖胺聚糖對S180肉瘤和艾氏腹水癌(EAC)的抑瘤作用見表1、2。
表1.馬氏珠母貝全臟器糖胺聚糖對S180的抑瘤作用組別劑量 動物數(shù)體重瘤重 抑瘤(mg/kg) 給藥前給藥后率(％)(1)N.S對照組1321.6±2.5 30.6±4.70.92±0.4(2)5-FU 25 1022.3±2.4 27.9±3.40.60±0.4334.5*(3)馬氏珠母貝全 50 1121.3±2.7 29.1±4.50.86±0.366.5臟器糖胺聚糖(4)馬氏珠母貝全 2001222.0±2.5 28.3±3.70.79±0.4714.1臟器糖胺聚糖(5)(2)+(3) 1222.2±2.7 26.6±1.80.35±0.1661.96**P＜0.05**P＜0.001表2.馬氏珠母貝全臟器糖胺聚糖對艾氏腹水癌(EAC)的抑瘤作用組別 劑量 動物數(shù)體重瘤重 抑瘤(mg/kg) 給藥前 給藥后 率(％)(1)N.S對照組 1024.6±2.2 30.7±4.1 2.12±1.16(2)替加氟5 1024.3±2.7 32.8±6.8 1.58±0.8925.6(3)馬氏珠母貝全 5 1024.8±3.2 29.6±2.9 1.60±0.7724.5臟器糖胺聚糖(4)馬氏珠母貝全 101025.9±1.8 31.1±3.5 1.89±0.5710.1臟器糖胺聚糖(5)(2)+(3) 1024.3±3.0 29.1±4.8 1.14±0.7046.3**P＜0.05實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明馬氏珠母貝全臟器糖胺聚糖(50mg/kg)對S180肉瘤雖然抑瘤作用較弱(抑瘤率6.5％)，但可顯著增敏陽性對照藥5-FU(25mg/kg，抑瘤率達(dá)34.5％，P＜0.05)的抑瘤作用，抑瘤率達(dá)61.9％(P＜0.001)；馬氏珠母貝全臟器糖胺聚糖(5mg/kg)對艾氏腹水癌(EAC)有抑瘤作用，抑瘤率達(dá)24.5％，而且與陽性對照藥替加氟(5mg/kg，抑瘤率達(dá)25.6％，P＜0.05)有協(xié)同作用，抑瘤率達(dá)46.3％(P＜0.01)。且兩次實(shí)驗(yàn)前后各組小鼠體重變化與生理鹽水對照組無顯著差異，說明實(shí)驗(yàn)結(jié)果可靠。3、結(jié)論馬氏珠母貝全臟器糖胺聚糖對體內(nèi)S180肉瘤和艾氏腹水癌(EAC)有顯著增敏陽性對照藥的抑瘤作用，抑瘤率分別達(dá)61.9％和46.3％。
實(shí)施例二1、材料與方法馬氏珠母貝全臟器糖胺聚糖由權(quán)利要求書所述工藝提取而得。
HL-60細(xì)胞由中山醫(yī)科大學(xué)腫瘤研究中心提供，廣東醫(yī)學(xué)院藥理教研室腫瘤研究小組常規(guī)傳代培養(yǎng)。
于24孔培養(yǎng)板內(nèi)，接種HL-60細(xì)胞懸液，接種細(xì)胞數(shù)為5.0×104個/ml，每組設(shè)3個平行孔，分別加入不同濃度的5-FU及馬氏珠母貝全臟器糖胺聚糖，空白組加入等量的培養(yǎng)基，置于37℃、5％CO2孵化箱培養(yǎng)24h，用臺盼蘭染色計數(shù)活細(xì)胞。試驗(yàn)結(jié)果重復(fù)兩次。
2、實(shí)驗(yàn)結(jié)果馬氏珠母貝全臟器糖胺聚糖對HL-60細(xì)胞的殺傷作用見表3。表3、馬氏珠母貝全臟器糖胺聚糖對HL-60細(xì)胞的殺傷作用組別劑量例數(shù) 成活細(xì)胞數(shù) 殺傷率(％)IC50(1)N.S對照組 培養(yǎng)基97.06(2)5-FU0.001 94.67±2.133.85(3)馬氏珠母貝全臟器1.0 94.33+1.7 38.671.72糖胺聚糖(4)馬氏珠母貝全臟器0.1 95.25±2.125.64糖胺聚糖(成活細(xì)胞數(shù)為×104個/ml)
實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明馬氏珠母貝全臟器糖胺聚糖(1.0mg/ml，0.1mg/ml)在用藥24h時對HL-60細(xì)胞的殺傷率分別為38.7％和25.6％，IC50為1.72mg/ml。5-FU(0.01mg/ml)對HL-60細(xì)胞的殺傷率為33.85％，實(shí)驗(yàn)結(jié)果可靠。提示馬氏珠母貝全臟器糖胺聚糖對體外培養(yǎng)HL-60細(xì)胞具有一定的殺傷作用。
3、結(jié)論馬氏珠母貝全臟器糖胺聚糖劑量為1.0mg/ml及0.1mg/ml時對體外培養(yǎng)HL-60細(xì)胞殺傷率分別達(dá)38.7％和25.6％。
實(shí)施例三用前述方法對馬氏珠母貝全臟器糖蛋白進(jìn)行研究，也初步證明這種化合物有類似的抗腫瘤活性。
實(shí)施例四用馬氏珠母貝全臟器糖胺聚糖、糖蛋白進(jìn)行了其它藥理學(xué)方面的研究，初步證明其有一定的抗凝作用，抗凝效果為肝素的二百分之一；也有對抗抗癌化療藥物抑制免疫的副作用的作用。
權(quán)利要求
1.一種具有抗腫瘤及抗凝等醫(yī)藥作用的醫(yī)藥組合物，其特征在于該組合物含有馬氏珠母貝(Pinctada martensi(Dunker))全臟器的提取物。
2.如權(quán)利要求1所述的醫(yī)藥組合物，其特征在于其中馬氏珠母貝全臟器提取物的化學(xué)本質(zhì)是馬氏珠母貝所含的糖蛋白、糖胺聚糖。
3.如權(quán)利要求1所述的醫(yī)藥組合物所含的馬氏珠母貝全臟器提取物，其特征是提取工藝以馬氏珠母貝全臟器為原料，經(jīng)凍融或鹽溶、有機(jī)溶劑(丙酮、乙醇、醋酸乙酯)沉淀得馬氏珠母貝全臟器糖蛋白；經(jīng)胃蛋白酶、胰蛋白酶、枯草桿菌中性蛋白酶水解，經(jīng)脫色、有機(jī)溶劑沉淀后用吸附、等電點(diǎn)沉淀、透析、醇沉、CTAB沉淀等法除雜，粗提物再經(jīng)醇沉、CTAB絡(luò)合法純化，得馬氏珠母貝全臟器糖胺聚糖制品。
4.如權(quán)利要求3所述的提取工藝，其特征在于原料是馬氏珠母貝(Pinctada martensi(Dunker))全臟器。
5.如權(quán)利要求3所述的提取工藝，其特征在于提取所得的馬氏珠母貝全臟器糖蛋白、糖胺聚糖具抗腫瘤活性及抗凝等藥理活性。
6.如權(quán)利要求3所述的提取工藝，其特征是按此工藝提取所得的一系列化合物中有若干級分具有抗腫瘤活性。
7.如權(quán)利要求3所述的提取工藝，其特征在于水解所用酶是胃蛋白酶、胰蛋白酶、枯草桿菌中性蛋白酶。
8.如權(quán)利要求3所述的提取工藝，其特征在于凍融、鹽溶或酶解后用有機(jī)溶劑(丙酮、乙醇、醋酸乙酯)沉淀，然后用1.0％活性碳及0.5％硅藻土吸附，PH2.0及PH7.0等電點(diǎn)除蛋白及透析脫鹽，透析液用60％乙醇-乙酸鈉沉淀及5％CTAB沉淀，所得級分再經(jīng)60％乙醇-乙酸鈉沉淀及5％CTAB絡(luò)合，得一系列化合物。
9.如權(quán)利要求3所述的提取工藝，其特征在于純化中CTAB絡(luò)合法中用1.0ml Nacl解離。
全文摘要
具抗腫瘤活性的馬氏珠母貝全臟器糖蛋白、糖胺聚糖及其提取工藝。本發(fā)明公開了從馬氏珠母貝全臟器提取的糖蛋白、糖胺聚糖化合物作為醫(yī)藥組合物的用途。含馬氏珠母貝全臟器提取的糖蛋白、糖胺聚糖的醫(yī)藥組合物具有十分顯著的抑制腫瘤作用,及抗凝和對抗化療的免疫抑制等醫(yī)藥作用,研究表明由馬氏珠母貝全臟器提取的這兩類化合物是一種新型的有醫(yī)療作用的化合物。本發(fā)明公開了提取馬氏珠母貝全臟器糖蛋白、糖胺聚糖的提取工藝。
文檔編號A61K35/56GK1321469SQ0010519
公開日2001年11月14日 申請日期2000年4月30日 優(yōu)先權(quán)日2000年4月30日
發(fā)明者吳紅棉, 陳方, 雷曉凌, 吳鐵, 洪鵬志 申請人:湛江海洋大學(xué), 廣東醫(yī)學(xué)院醫(yī)藥科技開發(fā)中心