專利名稱：新型生理活性物質的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及對動物或動物組織給予內·外應激物，在由活化組織提取出的物質中加入硅酸鹽，或提取使之達到高硅酸含量，得到的高活性新型生理活性物質。
生物體應對內外環(huán)境的變化，將生物體的物理、化學狀態(tài)調節(jié)或維持在某一穩(wěn)定的生理條件內，以維持個體的生命。為了維持調節(jié)生物體的上述內穩(wěn)態(tài)，時常在生物體內產生各種物質，同時在病毒、細菌等侵入時或出現(xiàn)腫瘤細胞時，對這些內、外侵襲的抵抗物質也一同在體內產生。
但是，任何原因都可造成生體機能失去平衡，如果變成慢性，就將出現(xiàn)所謂病態(tài)的各種疾病。疾病的理想治療方法是使保持生物體內穩(wěn)態(tài)的機能活化或對其進行調節(jié)，使紊亂的生體機能的病態(tài)失調恢復到正常狀態(tài)。眾所周知生體機能的維持或正?；貏e是通過細胞表面的各種受體或鈉、鉀、鈣等離子通道進行的。已知隨著年齡的增加，哺乳動物細胞中DNA的損傷修復能力降低，體內產生自由基促進老化、膠原病或癌變，另外膠原是廣泛存在于皮膚、血管、軟骨、眼球、腎臟等處的非細胞物質，隨著年齡的增加膠原出現(xiàn)交聯(lián)，失去彈性，變硬。
在抗原抗體反應中，由身體構成細胞中的肥大細胞放出的組胺是造成過敏反應的原因，通過抑制該肥大細胞的破裂，有望使異常病態(tài)緩和，趨于正?；?br> 本發(fā)明人著眼于調節(jié)、修復病態(tài)時產生的伴有生物體細胞機能缺陷的神經系統(tǒng)、內分泌系統(tǒng)失常的生物體內穩(wěn)態(tài)維持機制，對于生物體內特別是在對生物體內、外應激反應的抵抗期生物體內產生的物質，即生物體組織活化時產生的、提高生物體自然治愈能力、使身體機能正?；奈镔|進行了悉心的研究，發(fā)現(xiàn)了具有更高活性的新型生理活性物質，從而完成了本發(fā)明。
本發(fā)明涉及給各種動物或動物組織接種作為應激物的病毒或腫瘤細胞，使組織活化后，從這些活化組織中提取生理活性物質，向其中添加可溶性硅酸鹽，或提取該生理活性物質使之達到高硅酸含量，得到的高活性新型生理活性物質，具有組胺游離抑制作用以及透明質酸酶活性抑制作用等生理活性，修復病態(tài)時產生的機能異常，正?；纳矬w功能的調節(jié)、維持物質。
本發(fā)明的目的在于提供一種具有非常高的生理活性的新型生理活性物質。
本發(fā)明的物質是通過將動物的活化組織磨碎，加入提取溶劑除去組織碎片后，進行除蛋白處理，將其用吸附劑吸附，然后在洗脫吸附成分得到的生理活性物質中加入一定量的可溶性硅酸鹽，或用吸附劑進行洗脫操作使之達到高硅酸含量，得到的具有高生理活性的新型生理活性物質。
以下詳細說明本發(fā)明。本發(fā)明中，動物組織是指人和各種動物的病毒感染培養(yǎng)組織、培養(yǎng)細胞和病毒感染炎癥組織或孵化雞蛋的絨毛膜尿囊等，作為用于動物組織活化的應激物的病毒中有痘苗病毒、牛痘病毒、痘瘡病毒、小鼠畸肢病毒、猴痘病毒等原痘病毒，蛇病毒(オ一フウイルス)、副痘苗病毒、牛乳頭狀口內炎病毒等副痘病毒，綿羊痘病毒、山羊痘病毒、銀屑病(塊皮病)病毒等山羊痘病毒，雞痘病毒、野兔纖維腫病毒等鳥痘病毒，兔粘液腫病毒、兔纖維腫病毒等兔痘病毒，其它豬痘病毒、Yava猴腫瘤病毒、Tara痘病毒等屬于痘病毒科的病毒。另外，作為應激物的腫瘤細胞中可以使用來源于人和各種動物細胞的腫瘤培養(yǎng)細胞株，只要是可以接種在上述動物、動物組織中的物質即可。
為了得到活化組織，作為動物可以兔、牛、馬、綿羊、山羊、豬、雞等家畜、家禽類，或猴、大鼠、小鼠、豚鼠、倉鼠等哺乳動物，可以根據(jù)使用的應激物的種類或目的適當選擇。另外，作為培養(yǎng)細胞，只要是所使用的應激物可以增殖的培養(yǎng)細胞即可，例如人血細胞或胎盤等各種組織以及上述動物及其胚胎的腎臟、皮膚、肺臟、睪丸、肝臟、肌肉、腎上腺、甲狀腺、腦、神經細胞、血細胞等各組織的培養(yǎng)細胞。
將這些活化組織無菌取出并磨碎，加入其1倍至5倍量的提取溶劑，形成乳化懸濁液。作為提取溶劑可以使用蒸餾水、生理鹽水、弱酸性至弱堿性的緩沖液，也可以適當添加甘油等穩(wěn)定劑、苯酚等殺菌·防腐劑、氯化鈉、氯化鉀、氯化鎂等無機鹽類等。這時，通過凍結融解、超聲波、細胞膜溶解酶或表面活性劑等的處理，可以破壞細胞組織而易提取。
將得到的乳狀提取液過濾或離心分離除去組織碎片后，進行除蛋白處理。除蛋白可以采用公知的方法進行，可以采用通過加熱、超聲波、蛋白質變性劑，例如酸、堿、尿素、胍、有機溶劑、表面活性劑等進行處理、等電點沉淀、鹽析等方法。然后，通過使用濾紙(纖維素、硝基纖維素等)、玻璃濾器、硅藻土、塞氏過濾板(Seitz filter)等進行過濾、超濾、凝膠過濾、離子交換樹脂、離心分離等，除去析出的不溶蛋白質。
將這樣得到的提取部分用鹽酸、硫酸、氫溴酸等酸調節(jié)為酸性，優(yōu)選pH3.5至5.5，用吸附劑進行吸附操作?？梢允褂玫奈絼├缁钚蕴俊⒏邘X土、離子交換樹脂等，在提取液中加入吸附劑進行攪拌或使之通過填充有吸附劑的柱，可以吸附有效成分。
自吸附劑洗脫生理活性物質，可以在上述吸附劑中加入提取溶劑，例如堿性水溶液或醇等的水混合性溶劑或其混合溶液，優(yōu)選調節(jié)為pH9至12，在室溫下或適當加熱或攪拌進行洗脫，通過過濾等常規(guī)方法除去吸附劑。然后，必要時通過采用層析法、超濾法、反滲透過濾法的透析法等慣用方法或進行脫鹽處理，可以得到進一步精制的生理活性物質。當這樣由活化組織提取的生理活性物質是干燥固體時，1mg中按硅換算含有硅類1～20μg。
上述生理活性物質中添加的硅類為水溶性硅酸或硅酸聚合形成的硅酸聚合物及其鹽類，這些物質能夠以原硅酸、偏硅酸、中二硅酸、中三硅酸、中四硅酸等硅酸或其鈉、鉀等堿金屬鹽、或水玻璃等單體或聚合物的形式加入。另外，能夠以堿性溶液溶解輕質和重質硅酸酐的形式加入，也可以加入將水晶、石英、長石、花崗巖、橄欖巖等含有大量硅的礦物質用堿溶解得到的物質或將硅藻土、膨潤土玻璃、活性炭用堿性物質處理得到的物質，或者加入由硅含量高的木賊、紫芝、杜仲、稻、麥、竹、芒、問荊、海綿、硅藻類等植物或動物或硅藻土中提取的可溶性硅酸鹽。另外，通過活化組織制備生理活性物質的時候，由活性炭、高嶺土、膨潤土等吸附劑洗脫時，由于pH的上升或洗脫時間的延長、洗脫溫度的上升，由吸附劑混入硅類，也可以得到硅酸含量高的本發(fā)明生理活性物質。
本發(fā)明物質中的硅化合物可以根據(jù)其使用目的，并在不防礙其作用的范圍內適當添加到上述生理活性物質中，或使上述生理活性物質中含有本發(fā)明物質中的硅化合物。本發(fā)明物質中含有的硅類是水溶性的硅酸或硅酸鹽聚合得到的硅酸聚合物，這些物質能夠以原硅酸、偏硅酸、中二硅酸、中三硅酸、中四硅酸等硅酸或其鈉、鉀等堿金屬鹽等單體或聚合物的形式存在，本發(fā)明的物質中1mg干燥固體按硅換算含有硅類20μg以上。
以下列出本發(fā)明的優(yōu)選方式。
(1)是由活化組織提取、制備的物質，對氨基酸(茚三酮反應)、糖(苔黑酚-氯化鐵III-鹽酸法)、磷(鉬藍法)和硅酸(鉬藍法)的顯色反應為陽性，對蛋白質(三氯醋酸法)和苯酚(氯化鐵試驗法)的定性反應為陰性，1mg干燥固體中按硅換算含有硅類超過20μg的新型生理活性物質。
(2)如上述(1)所述的生理活性物質，在由活化組織提取的物質中加入硅酸鹽。
(3)如上述(1)所述的生理活性物質，在由活化組織提取的物質中加入硅酸聚合物。
(4)如上述(1)所述的生理活性物質，在由活化組織提取的物質中加入二氧化硅用氫氧化鈉或氫氧化鉀溶解得到的硅酸鹽。
(5)如上述(1)所述的生理活性物質，在由活化組織提取的物質中加入由硅含量高的木賊、紫芝、杜仲、稻、麥、竹、芒、問荊、海綿、硅藻類等植物或動物或硅藻土中提取的可溶性硅酸鹽。
(6)如上述(1)所述的生理活性物質，在由活化組織提取的物質中加入將水晶、石英、長石、花崗巖、橄欖巖、玻璃等含有大量硅的巖石類用堿提取得到的硅酸。
(7)如上述(1)所述的生理活性物質，是在由活化組織提取時，從吸附劑洗脫的操作中增加硅的混入而得到的。
以下是本發(fā)明物質的制備方法的實施例。但是，這些實施例并不能限定本發(fā)明的范圍。實施例1在健康成熟的家兔皮膚上接種痘苗病毒，使之活化后，將活化的皮膚無菌剝離，將其切細，加入水，用勻漿機磨碎形成乳狀物。然后將其加壓過濾，用鹽酸將得到的濾液調節(jié)為pH5.0后，加熱到100℃。過濾除去蛋白后，用氫氧化鈉調節(jié)為pH9.1，再在100℃下加熱處理后過濾。用鹽酸將濾液調節(jié)為pH4.1，加入活性炭2％，攪拌2小時后過濾。再在濾液中加入活性炭5.5％，攪拌2小時后過濾。在最初過濾得到的活性炭中加入水，用氫氧化鈉調節(jié)為pH9.9，在60℃下攪拌1.5小時后過濾。在最初的活性炭和之后的活性炭中加入水，用氫氧化鈉調節(jié)為pH10.9，在60℃下攪拌1.5小時后過濾。合并濾液，用鹽酸中和后，在減壓條件下干燥固化。1kg活化皮膚的收量為4g。以其作為出痘皮膚提取物。該提取物具有以下性質。
(1)性狀淡黃褐色無定形的吸濕粉末。
(2)溶解性可溶于水，不溶于苯、醚。
(3)pH7.5(4)紫外吸收λmax＝270nm(5)顯色反應氨基酸(茚三酮反應陽性)、糖(苔黑酚-氯化鐵III-鹽酸法陽性)、磷(鉬藍法陽性)、蛋白質(三氯醋酸法陰性)、苯酚(氯化鐵試驗法陰性)
在水100mL中加入上述出痘皮膚提取物1g、偏硅酸鈉500mg(按硅為50mg)。用鹽酸將其調節(jié)為pH7.5后，在減壓條件下干燥固化得到粉末狀的本發(fā)明生理活性活性物質。實施例2在鉑或鎳的坩堝中加入輕質硅酸酐3g和氫氧化鈉2g，加入水13mL攪拌。再將該坩堝加熱5分鐘使之沸騰后，在該液體中加入水達到100mL。該液體100mL中含有硅1.4g，以其為硅酸溶液。在水100mL中加入實施例1的出痘提取物0.5mg和硅酸溶液2.1mL，調節(jié)為pH7.5，在減壓條件下干燥固化。
本發(fā)明的生理活性物質與以往的出痘皮膚提取物相比硅化合物含量高，其生理活性效果例如抑制組胺由肥大細胞游離的作用、抑制透明質酸酶活性的作用、抑制由于組胺回流引起鼻腔內血管通透性的作用、抑制II型變態(tài)反應等效果，以下，詳細敘述抑制組胺由肥大細胞游離的作用以及抑制透明質酸酶活性的作用。
(1)抑制組胺由肥大細胞游離的作用將Wistar系大鼠斷頭，按照常規(guī)方法從腹腔內取出肥大細胞。在該細胞液中加入試樣溶液和化合物48/80，在37℃下放置10分鐘后，用冰冷卻停止反應，用原甲醛使之發(fā)生熒光測定游離組胺。由于添加試樣帶來的組胺游離抑制率用％表示。將試樣溶液中出痘皮膚提取物的濃度調節(jié)為15mg/ml，對以各種濃度含有硅類的出痘皮膚提取物考察其抑制組胺游離的作用，確認本發(fā)明的生理活性物質具有高活性。一例結果如表1所示。表1
<p>(2)抑制透明質酸酶活性的作用可以說在變態(tài)反應PCA炎癥反應部位，血管的通透性亢進，同時透明質酸酶活性上升，另外已有抑制透明質酸酶活性可以抑制毛細血管通透性的報道。因此，對于本發(fā)明的物質進行抑制透明質酸內活性的試驗。
將透明質酸酶標準溶液(最終濃度5單位/mL)0.5mL和試樣溶液0.5mL在37℃下培養(yǎng)10分鐘后，將該0.1mL加入到透明質酸溶液(150μg/mL)0.9mL中，在37℃下溫育15分鐘。加入含有2.5mg牛血清白蛋白的醋酸緩沖液(pH4.0)5mL，停止反應，5分鐘后精確測定540nm處的吸光度。用生理鹽水代替試樣溶液得到的吸光度作為對照，求出酶活性抑制率。將試樣溶液中出痘皮膚提取物的濃度調節(jié)為15mg/mL，對本發(fā)明生理活性物質抑制透明質酸酶活性的作用進行考察。一例結果如表2所示。表2
從上述藥理試驗結果可以看出，本發(fā)明生理活性物質與從活化組織提取出的現(xiàn)有生理活性物質相比活性非常高，作為抗變態(tài)反應劑等藥物是非常有用的。
本發(fā)明的生理活性物質與藥用的各種載體或稀釋劑適當組合，按照常規(guī)方法可以制成各種制劑，可以制成口服或非口服的固體、半固體、液體或氣霧劑等劑型。在配方中，可以單獨使用本發(fā)明的物質，也可以與其它藥物活性成分適當組合。
作為注射劑可以制成水性溶劑或非水性溶劑(例如注射用蒸餾水、生理鹽水、林格氏溶液、植物油、合成脂肪酸甘油酯、高級脂肪酸酯、丙二醇等)的溶液或懸濁液，調節(jié)pH達到等滲。另外，可以與食鹽、乳糖、白糖、甘露醇等一同冷凍干燥，制成用時溶解的注射劑。
作為口服給藥制劑，可以直接或與合適的添加劑適當組合制成片劑、散劑、顆粒劑或膠囊劑，其中添加劑例如乳糖、甘露醇、玉米淀粉、結晶纖維素等常用的賦形劑，以及纖維素衍生物、阿拉伯膠、玉米淀粉、明膠等粘合劑，玉米淀粉、馬鈴薯淀粉、羧甲醚纖維素(carmellose)、羧甲醚纖維素鈣等崩解劑，滑石粉、硬脂酸鎂等潤滑劑，其它增量劑、潤濕劑、緩沖劑、防腐劑、香料等。另外，根據(jù)患者的狀態(tài)或疾病的種類，也可以制成最適于其治療的上述以外的劑型，例如與高級脂肪酸、高級醇、丙二醇、硅油、液體石蠟、凡士林、各種表面活性劑一起制成霜劑、軟膏，或與ウイテツプ溶膠一起制成栓劑，或制成其它吸入劑、氣霧劑、巴布劑、滴眼劑等適當?shù)闹苿?br> 權利要求
1.新型生理活性物質，是由活化組織提取、制備的物質，對氨基酸(茚三酮反應)、糖(苔黑酚-氯化鐵III-鹽酸法)、磷(鉬藍法)和硅酸(鉬藍法)的顯色反應為陽性，對蛋白質(三氯醋酸法)和苯酚(氯化鐵試驗法)的定性反應為陰性，1mg干燥固體中按硅換算含有硅類超過20μg。
全文摘要
本發(fā)明提供一種具有非常高活性的新型生理活性物質。本發(fā)明的生理活性物質是對動物或動物組織給予內外應激物,在由活化組織提取出的物質中加入硅酸鹽,或提取使之達到高硅酸含量得到的。本發(fā)明的生理活性物質與從活化組織提取的現(xiàn)有生理活性物質相比活性非常高,作為藥物等非常有用。
文檔編號A61K31/80GK1272365SQ0010659
公開日2000年11月8日 申請日期2000年4月14日 優(yōu)先權日1999年4月15日
發(fā)明者小西甚右衛(wèi)門 申請人:日本臟器制藥株式會社