專利名稱：人血管內(nèi)皮抑素在巴斯德畢氏酵母中高效表達(dá)純化的方法及在抗腫瘤血管增殖治療中彈的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及醫(yī)藥生物技術(shù)領(lǐng)域，具體地說是人血管內(nèi)皮抑素在巴斯德畢氏酵母中高效表達(dá)純化的方法及在抗腫瘤血管增殖治療中的應(yīng)用。
據(jù)世界衛(wèi)生組織的最新統(tǒng)計，腫瘤的發(fā)病率和死亡率繼心管疾病、感染性疾病之后位居第三。實體腫瘤的臨床治療目前包括手術(shù)治療、放療、化療和生物治療。但以上治療的非有效性是使腫瘤死亡率居高不下的主要原因。血管生成為實體腫瘤生長與轉(zhuǎn)移的必要條件，豐富的新生血管為不斷增殖的惡性細(xì)胞提供所需要的營養(yǎng)原料。抑制腫瘤的血管生成，“切斷”腫瘤的營養(yǎng)供應(yīng)從而達(dá)到限制腫瘤細(xì)胞生長和繁殖，最終以消除腫瘤，為治療腫瘤提供一全新思路。血管內(nèi)皮抑素(endostatin)即是近年來發(fā)現(xiàn)的具有上述特異抗瘤作用的最有效血管生成抑制因子之一。
運用DNA重組技術(shù)，開發(fā)研究重組人血管內(nèi)皮抑素蛋白進(jìn)行抗腫瘤血管生成雖然在國內(nèi)外已起步研究，如美國哈佛大學(xué)醫(yī)學(xué)院兒童醫(yī)院Folkman實驗室率先克隆了該基因，并嘗試了在多個表達(dá)系統(tǒng)如大腸桿菌、桿狀病毒，哺乳動物細(xì)胞表達(dá)該基因。公開號為CN1177005A的專利申請也公開了“一種人實體腫瘤血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖抑制因子的基因克隆方法及在抗腫瘤血管再生治療中的應(yīng)用”，其中也克隆了該基因，并在大腸桿菌中進(jìn)行了表達(dá)，但因為桿狀病毒、哺乳動物細(xì)胞的表達(dá)量偏低，以及該蛋白在大腸桿菌中的表達(dá)純化過程中的部分失活，均限制了該蛋白的大量獲取。
本發(fā)明的目的是提供一種能大量獲得該蛋白的有效方法，為該重組蛋白抗體腫瘤的臨床應(yīng)用成為可能，即人血管內(nèi)皮抑素在巴斯德畢氏酵母中高效表達(dá)純化的方法及在抗腫瘤血管增殖治療中的應(yīng)用。
本發(fā)明的目的是這樣實現(xiàn)的1、人血管內(nèi)皮抑素(Human endostatin)的基因克隆及在巴斯德畢氏酵母中大量生產(chǎn)及純化方法1)人血管內(nèi)皮抑素基因的克隆及DNA序列分析人血管內(nèi)皮抑素為膠原蛋白ⅩⅧNC1區(qū)域內(nèi)C末端184氨基酸，其編碼基因通過從健康胎肝組織提取總RNA，經(jīng)RT-PCR獲得，RT中以寡聚T和隨機(jī)引物(Random primer)作為引物，以AMV為反轉(zhuǎn)錄酶42℃,1小時。PCR條件為95℃,5分鐘；95℃,30秒，60℃,1分鐘，72℃,1分鐘；38個循環(huán)后，72℃,10分鐘。PCR中兩引物分別為5′GCC CAC ACC CGC GAC TTC3′和5′CTA CTT GGA GGCAGT CAT GAA GC 3′，PCR產(chǎn)物經(jīng)純化后克隆到PCR2.1(Invitrogen)中，經(jīng)轉(zhuǎn)化，挑選白菌落，小量抽提質(zhì)粒后DNA序列測定；2)合成帶限制性內(nèi)切酶酶切位點的引物①5′CGG TGC GCA CAC AGC CACCGC GAC TTCC 3′,②5′GGA ATT CAC CAT GGC CCA CAG CCA CCG GGA C 3′,③5′GGA ATT CTT ACT ACT TGG AGG CAG TCA TG 3′以經(jīng)DNA序列鑒定的陽性質(zhì)粒為模板，分別以①、③和②、③為引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增；以①、③為引物擴(kuò)增出的片段經(jīng)FspⅠ(TGC GCA)、EcoRⅠ(GA ATT C)雙酶切后克隆到巴斯德畢氏酵母分泌型表達(dá)載體pPIC9K(Invitrogen)的SnaBⅠ、EcoRⅠ位點；以②、③為引物擴(kuò)增出的片段經(jīng)EcoRⅠ酶切后克隆到胞內(nèi)型表達(dá)載體pAO815的EcoRⅠ位點。經(jīng)體外重組或體內(nèi)抗生素篩選(G418)得到高效、穩(wěn)定的表達(dá)酵母菌株；3)酵母菌株作為工程菌經(jīng)發(fā)酵、純化工藝的摸索得到重組人血管內(nèi)皮抑素；4)將重組人血管內(nèi)皮抑素加入到經(jīng)VEGF誘生后的人毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞，培養(yǎng)2-3天后通過細(xì)胞計數(shù)，測量它們的毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖抑制作用活性強(qiáng)度。
2、人血管內(nèi)皮抑素作為重組基因工程藥物在治療實體腫瘤中的應(yīng)用1)人血管內(nèi)皮抑素蛋白按每公斤體重20mg肌肉注射接種Lewis肺癌細(xì)胞的小鼠，以測量抗腫瘤血管再生作用；2)重組人血管內(nèi)皮抑素作為重組基因工程藥物在實體腫瘤中的應(yīng)用。
本發(fā)明的人血管內(nèi)皮抑素基因通過RT-PCR方法獲得。重組人血管內(nèi)皮抑素蛋白通過在巴斯德畢氏酵母多拷貝表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)，并經(jīng)過親和層折，離子交換樹脂、分子篩等蛋白分離純化技術(shù)獲得。
本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)比較具有如下獨特優(yōu)點重組人血管內(nèi)皮抑素作為治療腫瘤已展示了其獨特的前景。動物實驗及現(xiàn)有臨床資料證明，血管內(nèi)皮抑素抑制腫瘤活性，需要較大的量。如前所述，現(xiàn)有的方法均難以做到，從而大大限制了此因子在臨床上的廣泛應(yīng)用，本發(fā)明最出的貢獻(xiàn)即在于提供了一嶄新的表達(dá)、純化方法，使上述問題得以解決，從而該藥的產(chǎn)業(yè)化成為可能。同時，本發(fā)明中所采用的基因克隆方法也為該基因的克隆提供又一途徑。此外，重組人血管內(nèi)皮抑素蛋白專一性作用用于增殖的毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞，對機(jī)體許多其它細(xì)胞不起作用，而實體腫瘤細(xì)胞增殖擴(kuò)大必須伴隨腫瘤內(nèi)血管不斷再生，腫瘤內(nèi)再生的毛細(xì)血管內(nèi)皮不斷增殖，腫瘤內(nèi)已有的毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞也不斷增殖，所以重組人血管肉皮抑素蛋白專一性抑制這些不斷增殖的內(nèi)皮細(xì)胞，使腫瘤血管不能再生或抑制血管再生，腫瘤組織得不到足夠的營養(yǎng)供應(yīng)，也得不到血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖所帶給腫瘤細(xì)胞的刺激，從而實體腫瘤產(chǎn)生萎縮，腫瘤細(xì)胞凋亡壞死。
本發(fā)明的另一特點是提供了治療腫瘤的另一手段，即可從抑制實體腫瘤的血液營養(yǎng)供應(yīng)來達(dá)到治療的目的，并且這一療法還可結(jié)合已有的許多針對腫瘤細(xì)胞的療法(如放療、化療等)結(jié)合進(jìn)行，從而抑制實體腫瘤血管再生和間接、直接殺死腫瘤細(xì)胞兩種療法同時進(jìn)行治療，這樣能大大提高其療效。
以下結(jié)合實施例對本發(fā)明作進(jìn)一步的詳述，但不限于實施例。
實施例1、用固相合成法人工合成兩引物①:5′GCC CAC AGC CAC CGC GAC TTC 3′②:5′CTA CTT GGA GGC AGT CAT GAA GC 3′。
2、取健康人胎肝組織100mg，加入TRIZOL 1ml(GIBCO)，在小勻漿器中勻漿后，轉(zhuǎn)入1.5ml Eppendorf管中，按GIBCO公司提供的方法抽提細(xì)胞總RNA，RNA溶于30μl(微升)DEPC水中。
3、RNA經(jīng)1×TBE1％瓊脂糖凝膠電泳電泳檢測其完整性后，取RNA4μl,5×RT緩沖液4μl,10mM dNTPS 2μl,0.1M DTT 1μl，多聚T引物0.5μl，隨機(jī)引物0.5μl,RNA酶抑制劑(20μ/μl)2μl,AMV(20μ/μl)1μl，重蒸水5μl，反應(yīng)體系為20μl,42℃1小時后，95℃,5分鐘。取反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物5μl 10×PCR緩沖液50μl，引物①1μl(100pmol/μl，引物②1μl(100pm ol/μl),10mM dNTPS 2μl,Taq DNA pol.1μl，重蒸水35μl，反應(yīng)體系50μl,PCR條件為95℃,5分鐘；95℃,30秒，60℃,1分鐘，72℃,10分鐘；38個循環(huán)后，95℃,10分鐘。取5μl經(jīng)1％瓊脂糖凝膠電泳電泳檢測PCR擴(kuò)增產(chǎn)物后，余物電泳回收，并以Qiagen公司膠回收試劑盒回收，回收PCR產(chǎn)物溶于30μ重蒸水中。
4、取回收PCR產(chǎn)物6μl,5×連接緩沖液2μl,PCR2.1 1μl,T4DNA連接酶1μl，連接體系10μl；16℃連接3小時后，轉(zhuǎn)化到大腸桿菌DH5α中，經(jīng)X-gal IPTG篩選，挑選白色菌落，經(jīng)小量抽提質(zhì)粒DNA后，進(jìn)行DNA序列測定(如圖所示)。
5、合成帶限制性內(nèi)切物酶酶切位點的引物①:5′CGG TGG GCA CAC AGC CAC CGC GAC TTC C 3′；②:5′G GA ATT CAC CAT GGC CCA CAG CCA CCG CGA C 3′；③:5′GGA ATT CTT ACT ACt TGG AGG CAG TCA TG 3′；以經(jīng)DNA序列測定的陽性質(zhì)粒為模板，分別以①③和②③為引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增；PCR產(chǎn)物電泳后回收。以①③為引物擴(kuò)增出的片段經(jīng)FspⅠ(TGC GCA)、EcoRⅠ(GA ATT C)雙酶切后克隆到巴斯德畢氏酵母分泌型表達(dá)載體pPIC9K(Invitrogen)的SnaBⅠ.EcoRⅠ位點，以②③為引物擴(kuò)增出的片段經(jīng)EcoRⅠ酶切后克隆到胞內(nèi)型表達(dá)載體pAO815的EcoRⅠ位點。
6、胞內(nèi)型多挎貝表達(dá)質(zhì)粒的獲得單挎貝的重組質(zhì)粒經(jīng)酶切鑒定方向后，以BamHⅠ+BglⅡ雙酶切，電泳回收1.7Kb表達(dá)單位，；同時單挎貝的重組質(zhì)粒以BamHⅠ單酶切，CIP處理后，同1.7Kb表達(dá)單位連接，獲得兩挎貝表達(dá)單位重組質(zhì)粒，以此類推，獲得多挎貝表達(dá)單位質(zhì)粒。
7、胞內(nèi)型多挎貝表達(dá)單位質(zhì)粒及分泌型重組質(zhì)粒10μg或以上，經(jīng)SalⅠ酶切線性化，并經(jīng)酚/氯仿抽提，乙醇沉淀回收DNA,DNA經(jīng)電轉(zhuǎn)化至酵母菌株GS115中。
8、分泌型多挎貝表達(dá)菌株的體內(nèi)篩選分泌型重組質(zhì)粒的酵母菌株GS115在YPD含不同濃度的G418培養(yǎng)皿上篩選，G418的最終篩選濃度為4mg/ml。
9、高表達(dá)穩(wěn)定菌株的篩選及保存經(jīng)體外重組或體內(nèi)抗生素篩選獲得的胞內(nèi)型、分泌型菌株經(jīng)培養(yǎng)后裂胞或取上清經(jīng)SDS-PAGE電泳檢測不同菌株的表達(dá)水平。挑選最高表達(dá)的菌株保存以作為大規(guī)模發(fā)酵的菌種。
10、重組血管內(nèi)皮抑素生物學(xué)活性的檢測人毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)至6孔培養(yǎng)板上，細(xì)胞濃度為5×106/孔，每孔加入10ng VEGF誘導(dǎo)后加入2-10μg不同濃度的重組人血管內(nèi)皮抑素，同時設(shè)立陰性對照，培養(yǎng)3天后通過細(xì)胞計數(shù)測量抑制摶細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖的活性。
11、小鼠皮下接種肺癌長至100-200立方毫米時，將小鼠隨機(jī)分成兩組，一組作為對照，另一組分別皮下注射重組人血管內(nèi)皮抑素蛋白，每天每公斤體重注射20mg，連續(xù)注射20天，以觀察在動物體內(nèi)抑制實體瘤生長的特性。
權(quán)利要求
1.一種人血管內(nèi)皮抑素的基因克隆及用巴斯德畢氏酵母中大量生產(chǎn)純化的方法，其特征在于1)人血管內(nèi)皮抑素基因的克隆及DNA序列分析人血管內(nèi)皮抑素為膠原蛋白ⅩⅧNC1區(qū)域內(nèi)C末端184氨基酸肽段，編碼此肽段基因通過從健康胎肝組織提取總RNA，經(jīng)RT-PCR獲得；2)人血管內(nèi)皮抑素基因經(jīng)DNA序列分析確證后，合成帶限制性內(nèi)切酶酶切位點引物后，經(jīng)PCR擴(kuò)增得到帶適合限制性內(nèi)切酶切位點的基因片段；3)片段經(jīng)酶切后克隆到巴斯德畢氏酵母多挎貝表達(dá)載體中，經(jīng)體外重組或體內(nèi)經(jīng)抗生素篩選得到高效、穩(wěn)定表達(dá)酵母菌株；4)經(jīng)發(fā)酵、純化得到的重組人血管內(nèi)皮抑素具有顯著的體外抑制血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖和抑制小鼠腫瘤的增長活性作為治療實體腫瘤的重組基因工程藥物。
2.按權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于RT中以寡聚T和隨機(jī)引物(Random primer)作為引物，加入AMV42℃,1小時，PCR條件為95℃,5分鐘；95℃,30秒，60℃,1分鐘，72℃,1分鐘℃；38個循環(huán)后，72℃,10分鐘；PCR中兩引物分別為5′GCC CAC AGC CGC GAC TTC 3′和5′CTA CTT GGA GGC AGT CAT GAA GC 3′,PCR產(chǎn)物經(jīng)純化后克隆到PCR21中，經(jīng)轉(zhuǎn)化，挑選白菌落，小量抽提質(zhì)粒后DNA序列測定。
3.按權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于所述的合成帶限制性內(nèi)切酶酶切點引物為①5′CGG TGC GCA CAC AGC CAC CGC GAC TTCC 3′；②5′GGA ATT CACCAT GGC CCA CAG CCA CCG CGA C 3′；③5′GGA ATT CTT ACT ACT TGG AGG CAGTCA TG 3′，并以經(jīng)DNA序列鑒定的陽性質(zhì)粒為模板，分別以①、③和②、③為引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增。
4.按權(quán)利要求1所述方法，其特征在于以①、③為引物擴(kuò)增出的片段經(jīng)FspⅠ、ECORⅠ雙酶切后克隆到巴斯德畢氏酵母分泌型表達(dá)載體pPIC9K的SnaBⅠ、EcoRⅠ位點；以②、③為引物擴(kuò)增出的片段經(jīng)EcoRⅠ酶切后克隆到胞內(nèi)型表達(dá)載體pAO815的EcoRⅠ位點，經(jīng)體外重組或體內(nèi)抗生素篩選得到高效、穩(wěn)定的表達(dá)酵母菌株；
5.按權(quán)利要求1或4所述的方法，其特征在于酵母菌株作為工程菌經(jīng)發(fā)酵、純化工藝的摸索得到重組人血管內(nèi)皮抑素。
6.按權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于將重組人血管內(nèi)皮抑素加入到經(jīng)VEGF誘生后的人毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞，培養(yǎng)2-3天后通過細(xì)胞計數(shù)，測量它們的毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖抑制作用活性強(qiáng)度。
7.人血管內(nèi)皮抑素作為重組基因工程藥物在治療實體腫瘤中的應(yīng)用，其特征在于1)人血管內(nèi)皮抑素蛋白按每公斤體重2mg肌肉注射接種Lewis肺癌細(xì)胞的小鼠，以測量的抗腫瘤血管再生作用；2)重組人血管內(nèi)皮抑素作為重組基因工程藥物在實體腫瘤中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明是一種人血管內(nèi)皮抑素在巴斯德畢氏酵母中高效表達(dá)純化的方法及在抗腫瘤血管增殖治療中的應(yīng)用。其特征在于:人血管內(nèi)皮抑素為膠原蛋白ⅩⅧNC1區(qū)域內(nèi)C末端184氨基酸肽段,從健康胎肝組織中提取總RNA,經(jīng)RT－PCR得到人血管內(nèi)皮抑素基因,并克隆到巴斯德畢氏酵母多挎貝表達(dá)載體中經(jīng)篩選獲得高效穩(wěn)定表達(dá)的酵母菌株,可大量得到重組人血管內(nèi)皮抑素蛋白。此蛋白能顯著抑制血管內(nèi)皮細(xì)胞的增殖和小鼠在體腫瘤的生長。本發(fā)明提供了一種嶄新的方法,從而使該藥的產(chǎn)業(yè)化成為可能。同時,該因子為治療腫瘤提供了又一手段。
文檔編號A61K38/17GK1307060SQ0011268
公開日2001年8月8日 申請日期2000年2月2日 優(yōu)先權(quán)日2000年2月2日
發(fā)明者彭小忠, 徐林, 楊上川, 郭仁, 謝伯林, 張翔 申請人:昆明廣博科技有限公司