專利名稱：用于預(yù)防或抗過(guò)敏反應(yīng)的桑寄生提取物,含它的藥物組合物及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及用于預(yù)防或抗過(guò)敏反應(yīng)的桑寄生提取物，含它的藥物組合物，桑寄生提取物在制備用于抗過(guò)敏反應(yīng)的藥物中的用途，及桑寄生提取物的制備方法。
I型變態(tài)反應(yīng)或稱速發(fā)型過(guò)敏反應(yīng)，是臨床上常見的變態(tài)反應(yīng)，發(fā)病率較高。中國(guó)約有過(guò)敏病人一千萬(wàn)左右。過(guò)敏性疾病包括1、藥物與血清引起的過(guò)敏性休克，表現(xiàn)為胸悶、氣急、呼吸困難等呼吸道癥狀，以及出冷汗、面色蒼白、脈細(xì)速、血壓下降等循環(huán)衰竭癥狀，嚴(yán)重者可因過(guò)敏性休克而迅速死亡；2、呼吸道過(guò)敏反應(yīng)，典型疾病是支氣管哮喘和過(guò)敏性鼻炎，前者支氣管平滑肌痙攣和肺部血管擴(kuò)張、通透性增強(qiáng)出現(xiàn)哮喘和呼吸困難，后者鼻粘膜水腫，分泌增加，出現(xiàn)流涕、打噴嚏等癥狀。3、食物過(guò)敏癥(消化道變態(tài)反應(yīng))，由于胃腸道的異常吸收，引起尋麻疹、腹痛、腹瀉、嘔吐等癥狀，嚴(yán)重者亦可出現(xiàn)過(guò)敏性休克。4、皮膚過(guò)敏反應(yīng)，表現(xiàn)為濕疹、尋麻疹和血管神經(jīng)性水腫。
I-型變態(tài)反應(yīng)由過(guò)敏原引起，發(fā)病分為三個(gè)階段，即致敏階段、發(fā)敏階段和效應(yīng)階段。
致敏階段過(guò)敏原亦稱變應(yīng)原通過(guò)呼吸道、消化道或皮膚粘膜等進(jìn)入機(jī)體，刺激機(jī)體產(chǎn)生抗體，IgE類抗體引起I-型變態(tài)反應(yīng)。
發(fā)敏階段相同的過(guò)敏原再次進(jìn)入機(jī)體時(shí)，可以與肥大細(xì)胞膜上的IgE結(jié)合，導(dǎo)致脫顆粒反應(yīng)，釋出多種介質(zhì)。過(guò)敏病人的細(xì)胞膜上結(jié)合的IgE密集，過(guò)敏原有可能落于相鄰的IgE的Fab段上，形成“橋聯(lián)”?！皹蚵?lián)”導(dǎo)致迅猛地釋放存儲(chǔ)的顆粒，同時(shí)又有一系列的繼發(fā)介質(zhì)被合成出來(lái)，與此同時(shí)還有一些酶被釋放出來(lái)。在發(fā)敏階段的早期，F(xiàn)cR聚集會(huì)引起一系列的變化，特別是蛋白激酶C的激活和蛋白激酶A的抑制。
效應(yīng)階段發(fā)敏階段使肥大細(xì)胞脫顆粒，釋放出多種介質(zhì)，包括組胺、白三烯類化合物、激肽和前列腺素等，由于過(guò)敏病人釋放介質(zhì)過(guò)猛、過(guò)多，使機(jī)體產(chǎn)生一系列的癥狀。過(guò)敏反應(yīng)主要靠藥物治療，這些藥物基本有三類a.抑制介質(zhì)釋放的藥物色甘酸鈉可以穩(wěn)定肥大細(xì)胞膜，防止脫顆粒釋放介質(zhì)。腎上腺素、麻黃素、氨茶堿可以提高細(xì)胞c-AMP，抑制脫顆粒作用；b.介質(zhì)的拮抗劑苯海拉明、異丙嗪等抗組胺藥。腎上腺素收縮外周血管，擴(kuò)張支氣管，用于搶救藥物過(guò)敏性休克；c.其它糖皮質(zhì)激素、葡萄糖酸鈣、氯化鈣用于減輕毛細(xì)管擴(kuò)張和降低通透性。臨床主要使用異丙嗪類藥物，它的缺點(diǎn)是嗜睡。色甘酸鈉由于藥效差基本不使用。桑寄生在中藥中屬抗風(fēng)濕藥類，未見有抗過(guò)敏的報(bào)道。
本發(fā)明人現(xiàn)發(fā)現(xiàn)桑寄生具有抑制蛋白激酶C和提高細(xì)胞c-AMP的含量能力，而且桑寄生本身就具有c-AMP樣作用，可以激活蛋白激酶A。與此同時(shí)它可以穩(wěn)定肥大細(xì)胞膜，控制介質(zhì)的釋放并具有色甘酸鈉與氨茶堿兩類藥物的作用，因此可以更好地抑制過(guò)敏反應(yīng)的發(fā)敏階段，本發(fā)明基于上述發(fā)現(xiàn)得以完成。
本發(fā)明目的是尋找并開發(fā)中藥桑寄生的新醫(yī)藥用途。
本發(fā)明第一方面涉及用于預(yù)防或抗過(guò)敏反應(yīng)的桑寄生提取物。
本發(fā)明再一方面涉及用于預(yù)防或抗過(guò)敏反應(yīng)的藥物組合物，其包括桑寄生提取物及藥用載體或賦形劑。
本發(fā)明再一方面涉及桑寄生提取物在制備用于預(yù)防或抗過(guò)敏反應(yīng)的藥物中用途。
本發(fā)明還涉及預(yù)防或抗過(guò)敏反應(yīng)的方法，其包括將預(yù)防或治療有效量的桑寄生提取物給予需預(yù)防或治療過(guò)敏反應(yīng)的患者。
本發(fā)明還涉及桑寄生提取物的制備方法，其包括i)將粉狀桑寄生用選自石油醚、乙烷、二氯甲烷、氯仿、苯或甲苯的有機(jī)溶劑提取，去除脂溶性物質(zhì)，過(guò)濾，棄去濾液，保留濾餅，ii)將i)中濾餅用選自醇或酮的有機(jī)溶劑提取，過(guò)濾，棄去濾餅，濾液減壓濃縮，得桑寄生提取物，或先進(jìn)行ii)所述提取，再進(jìn)行i)所述提取，得所要桑寄生提取物；iii)如需要，將上面得到的桑寄生提取物通過(guò)大孔吸附樹脂和纖維素柱純化。
根據(jù)本發(fā)明，本發(fā)明純化前的桑寄生提取物含有生物堿(通過(guò)碘化鉍鉀反應(yīng)證明)，純化后的桑寄生提取物僅含有生物堿。進(jìn)一步講，本發(fā)明僅含生物堿的桑寄生提取物的甲醇溶液的紫外吸收光譜顯示，其峰值位于278nm(見

圖1，桑寄生提取物的紫外光譜)，僅含生物堿的桑寄生提取物的甲醇溶液20μl的高壓液相分析(C-18反向柱，檢測(cè)波長(zhǎng)254nm)顯示其保留時(shí)間為2.56分鐘(見圖2，桑寄生提取物的高壓液相圖譜)。
根據(jù)本發(fā)明，本發(fā)明所述“過(guò)敏反應(yīng)”指I型變態(tài)反應(yīng)或速發(fā)型過(guò)敏反應(yīng)。
根據(jù)本發(fā)明，本發(fā)明方法中所用“醇”可例如是甲醇，乙醇或丙醇等；所用“酮”可例如是丙酮，甲乙酮等。
本發(fā)明因此還涉及含有作為活性成份的有效劑量的桑寄生提取物以及常規(guī)藥物賦形劑或輔劑的藥物組合物。通常本發(fā)明藥物組合物含有0.1-90重量％的桑寄生提取物。藥物組合物可根據(jù)本領(lǐng)域已知的方法制備。用于此目的時(shí)，如果需要，可將桑寄生提取物與一種或多種固體或液體藥物賦形劑和/或輔劑結(jié)合，制成可作為人用的適當(dāng)?shù)氖┯眯问交騽┝啃问健?br> 本發(fā)明的桑寄生提取物或含有它的藥物組合物可以單位劑量形式給藥，給藥途徑可為腸道或非腸道，如口服、肌肉、皮下、鼻腔、口腔粘膜、皮膚、腹膜或直腸等。給藥劑型例如片劑、膠囊、滴丸、氣霧劑、丸劑、粉劑、溶液劑、混懸劑、乳劑、顆粒劑、脂質(zhì)體、透皮劑、口含片、栓劑、凍干粉針劑等?？梢允瞧胀ㄖ苿⒕忈屩苿?、控釋制劑及各種微粒給藥系統(tǒng)。為了將單位給藥劑型制成片劑，可以廣泛使用本領(lǐng)域公知的各種載體。關(guān)于載體的例子是，例如稀釋劑與吸收劑，如淀粉、糊精、硫酸鈣、乳糖、甘露醇、蔗糖、氯化鈉、葡萄糖、尿素、碳酸鈣、白陶土、微晶纖維素、硅酸鋁等；濕潤(rùn)劑與粘合劑，如水、甘油、聚乙二醇、乙醇、丙醇、淀粉漿、糊精、糖漿、蜂蜜、葡萄糖溶液、阿拉伯膠漿、明膠漿、羧甲基纖維素鈉、紫膠、甲基纖維素、磷酸鉀、聚乙烯吡咯烷酮等；崩解劑，例如干燥淀粉、海藻酸鹽、瓊脂粉、褐藻淀粉、碳酸氫鈉與枸櫞酸、碳酸鈣、聚氧乙烯山梨糖醇脂肪酸酯、十二烷基磺酸鈉、甲基纖維素、乙基纖維素等；崩解抑制劑，例如蔗糖、三硬脂酸甘油酯、可可脂、氫化油等；吸收促進(jìn)劑，例如季銨鹽、十二烷基硫酸鈉等；潤(rùn)滑劑，例如滑石粉、二氧化硅、玉米淀粉、硬脂酸鹽、硼酸、液體石蠟、聚乙二醇等。還可以將片劑進(jìn)一步制成包衣片，例如糖包衣片、薄膜包衣片、腸溶包衣片，或雙層片和多層片。為了將給藥單元制成丸劑，可以廣泛使用本領(lǐng)域公知的各種載體。關(guān)于載體的例子是，例如稀釋劑與吸收劑，如葡萄糖、乳糖、淀粉、可可脂、氫化植物油、聚乙烯吡咯烷酮、Gelucire、高嶺土、滑石粉等；粘合劑如阿拉伯膠、黃蓍膠、明膠、乙醇、蜂蜜、液糖、米糊或面糊等；崩解劑，如瓊脂粉、干燥淀粉、海藻酸鹽、十二烷基磺酸鈉、甲基纖維素、乙基纖維素等。為了將給藥單元制成栓劑，可以廣泛使用本領(lǐng)域公知的各種載體。關(guān)于載體的例子是，例如聚乙二醇、卵磷脂、可可脂、高級(jí)醇、高級(jí)醇的酯、明膠、半合成甘油酯等。為了將給藥單元制成膠囊，將有效成分桑寄生提取物與上述的各種載體混合，并將由此得到的混合物置于硬的明明膠囊或軟膠囊中。也可將有效成分桑寄生提取物制成微囊劑，混懸于水性介質(zhì)中形成混懸劑，亦可裝入硬膠囊中或制成注射劑應(yīng)用。為了將給藥單元制成注射用制劑，如溶液劑、乳劑、凍干粉針劑和混懸劑，可以使用本領(lǐng)域常用的所有稀釋劑，例如，水、乙醇、聚乙二醇、1，3-丙二醇、乙氧基化的異硬脂醇、多氧化的異硬脂醇、聚氧乙烯山梨醇脂肪酸酯等。另外，為了制備等滲注射液，可以向注射用制劑中添加適量的氯化鈉、葡萄糖或甘油，此外，還可以添加常規(guī)的助溶劑、緩沖劑、pH調(diào)節(jié)劑等。
此外，如需要，也可以向藥物制劑中添加著色劑、防腐劑、香料、矯味劑、甜味劑或其它材料。
本發(fā)明桑寄生提取物的給藥劑量取決于許多因素，例如所要預(yù)防或治療過(guò)敏反應(yīng)疾病的性質(zhì)和嚴(yán)重程度，患者或動(dòng)物的性別、年齡、體重及個(gè)體反應(yīng)，所用的具體化合物，給藥途徑及給藥次數(shù)等。上述劑量可以單一劑量形式或分成幾個(gè)，例如二、三或四個(gè)劑量形式給藥。
下面的實(shí)施例及生物活性實(shí)驗(yàn)用來(lái)進(jìn)一步說(shuō)明本發(fā)明，但這并不意味著對(duì)本發(fā)明的任何限制。實(shí)施例1桑寄生提取物的制備1kg桑寄生粉，加入3倍量的二氯甲烷浸泡，脫脂，浸泡反復(fù)數(shù)次，去除脂溶物質(zhì)。過(guò)濾，棄去濾液，保留濾餅。
濾餅用三倍量的乙醇浸泡數(shù)次，抽濾，濾餅棄去，濾液減壓濃縮至干，得桑寄生粗提品120克。
桑寄生粗提物40克，溶于蒸餾水中，通過(guò)大孔吸附樹脂，分去雜質(zhì)，用乙醇解吸附，收集洗脫液，減壓蒸干，得產(chǎn)品桑寄生提取物3.4克。
將上述提取物溶于甲醇，通過(guò)纖維素柱，用0.05M的磷酸三鈉洗脫，收集第二個(gè)色帶，洗脫液除去磷酸三鈉，得到精制的桑寄生提取物0.33克。
桑寄生1kg，得到粗提品120g，第一步純化得11.2g，第二步純化得到1g，總收率0.1％。
生物活性一桑寄生提取物抑制細(xì)胞蛋白激酶C的活性桑寄生提取物抑制紅白血病K-562細(xì)胞的發(fā)泡反應(yīng)將K-562細(xì)胞培養(yǎng)在96孔培養(yǎng)板上，用蛋白激酶C激活劑佛波醇酯激活時(shí)，細(xì)胞膜出現(xiàn)囊泡，蛋白激酶C的抑制劑可以抑制囊泡的形成，結(jié)果見表1，由表1中數(shù)據(jù)可看到桑寄生提取物可以顯著地抑制K-562細(xì)胞受佛波醇酯刺激形成的囊泡。因此，桑寄生提取物是蛋白激酶C的抑制劑。
用人白血病細(xì)胞HL-60的PKC分析系統(tǒng)檢查桑寄生提取物的活性，結(jié)果見表2，由表2可看到桑寄生提取物對(duì)HL-60細(xì)胞的蛋白激酶C也有明顯的抑制作用，抑制率達(dá)68％。
二桑寄生提取物提高細(xì)胞蛋白激酶A的活性1.桑寄生提取物可提高紅白血病K-562細(xì)胞的c-AMP的含量6.94倍。具體結(jié)果見表3。
2.桑寄生提取物在無(wú)細(xì)胞的情況下，可以表現(xiàn)出c-AMP的活性，結(jié)果見表4，表4說(shuō)明桑寄生提取物本身就具有″c-AMP″樣作用。
3.桑寄生提取物對(duì)人白血病HL-60細(xì)胞中蛋白激酶A的活性有顯著增強(qiáng)作用，結(jié)果見表5，表5中數(shù)據(jù)說(shuō)明桑寄生提取物80μg/ml可以提高蛋白激酶A活性4.22倍。
三.桑寄生提取物抑制大鼠肥大細(xì)胞脫顆粒桑寄生提取物能提高細(xì)胞內(nèi)c-AMP水平，激活蛋白激酶A，同時(shí)能抑制細(xì)胞內(nèi)蛋白激酶C的活性，說(shuō)明它可以穩(wěn)定細(xì)胞膜。肥大細(xì)胞脫顆粒反應(yīng)，是過(guò)敏反應(yīng)的重要環(huán)節(jié)。穩(wěn)定肥大細(xì)胞的細(xì)胞膜的藥物可用于過(guò)敏的防治。
1.桑寄生提取物可以顯著地抑制大鼠肥大細(xì)胞的脫顆粒反應(yīng)，且呈劑量依賴關(guān)系，結(jié)果見表6，由表6可看到桑寄生提取物半數(shù)抑制濃度為10.28μg/ml。
2.桑寄生提取物抑制脫顆粒的能力明顯優(yōu)于陽(yáng)性對(duì)照藥色甘酸鈉，在相同的劑量下，是色甘酸鈉的1.9倍。結(jié)果見表7。表1 桑寄生提取物對(duì)佛波醇酯誘導(dǎo)的K-562胞囊泡形成的影響組別 對(duì)照細(xì)胞細(xì)胞＋佛波醇酯細(xì)胞＋桑寄生提取物+佛波醇酯細(xì)胞數(shù) 104104104目測(cè)評(píng)價(jià) - +++++表2 桑寄生提取物對(duì)HL-60胞的PKC活性的影響組別 總PKC活性 抑制(％)(pmol/min)對(duì)照細(xì)胞 0.2448 -桑寄生提取物(80μg/ml)0.0773 68.42桑寄生提取物(40μg/ml)0.1460 40.36表3桑寄生提取物對(duì)K-562細(xì)胞內(nèi)c-AMP濃度的影響組別c-AMP 增減倍數(shù)pmol/40ul對(duì)照0.209-桑寄生提取物組 1.456.93色甘酸鈉組 0.163 0.78表4桑寄生提取物的″c-AMP樣″作用桑寄生提取物劑量 與結(jié)合蛋白結(jié)合的量 與結(jié)合蛋白結(jié)合的量(mg/ml) (增加30ul標(biāo)準(zhǔn)c-AMP)0.125 1.26 2.330.25 2.30 5.970.50 4.36 10.671.00 10.914.14注1桑寄生提取物與c-AMP相似，能與酶蛋白結(jié)合，且呈劑量依賴關(guān)系。
注2增加標(biāo)準(zhǔn)c-AMP可以增加與酶蛋白結(jié)合，且出現(xiàn)飽和現(xiàn)象。
表5桑寄生提取物對(duì)人白血病細(xì)胞HL-60的蛋白激酶A(PKA)的影響組別 相對(duì)活性 增加的倍數(shù)對(duì)照組11.17桑寄生提取物(80μg/ml)47.14 4.22桑寄生提取物(40μg/ml)34.94 3.13表6桑寄生提取物對(duì)大鼠肥大細(xì)胞(Con A激活)脫顆粒的影響組別劑量組胺釋放 抑制率μg/ml (發(fā)射光讀數(shù)) ％對(duì)照組 - 36.0259.25 74桑寄生提取物 12.5 15.2 586.25 23.45 353.125 29.4 18劑量與抑制率的關(guān)系抑制率＝0.0014[濃度]2＋0.0635[濃度]半數(shù)抑制濃度為10.28μg/ml。
表7桑寄生提取物與色甘酸鈉抑制肥大細(xì)胞脫顆粒的比較組別 劑量 組胺釋放 抑制率Pμg/ml (發(fā)射光讀數(shù)) ％對(duì)照組 - 39.35+/-1.350色甘酸鈉組 2524.15+/-1.27438.63桑寄生提取物2510.26+/-1.04073.93＜0.000權(quán)利要求
1.用于預(yù)防或抗過(guò)敏反應(yīng)的桑寄生提取物。
2.用于預(yù)防或抗過(guò)敏反應(yīng)的藥物組合物，其包括桑寄生提取物及藥用載體或賦形劑。
3.權(quán)利要求1的桑寄生提取物，其中過(guò)敏反應(yīng)指I型變態(tài)反應(yīng)或速發(fā)型過(guò)敏反應(yīng)。
4.權(quán)利要求2的藥物組合物，其中過(guò)敏反應(yīng)指I型變態(tài)反應(yīng)或速發(fā)型過(guò)敏反應(yīng)。
5.桑寄生提取物在制備用于預(yù)防或抗過(guò)敏反應(yīng)的藥物中用途。
6.權(quán)利要求5的用途，其中過(guò)敏反應(yīng)是I型變態(tài)反應(yīng)或速發(fā)型過(guò)敏反應(yīng)。
7.桑寄生提取物的制備方法，其包括i)將粉狀桑寄生用選自石油醚、乙烷、二氯甲烷、氯仿、苯或甲苯的提取，去除脂溶脂物質(zhì)，過(guò)濾，棄去濾液，保留濾餅，ii)將i)中濾餅用選自醇或酮的有機(jī)溶劑提取，過(guò)濾，棄去濾餅，濾液減壓濃縮，得桑寄生提取物，或先進(jìn)行ii)中處理，再進(jìn)行i)處理，得所要桑寄生提取物；iii)如需要，將上面得到的桑寄生提取物通過(guò)大孔吸附樹脂和纖維素柱純化。
全文摘要
本發(fā)明涉及用于預(yù)防或抗過(guò)敏反應(yīng)的桑寄生提取物,含它的藥物組合物,桑寄生提取物在制備用于抗過(guò)敏反應(yīng)的藥物中的用途,及桑寄生提取物的制備方法。
文檔編號(hào)A61P37/00GK1329899SQ0011930
公開日2002年1月9日 申請(qǐng)日期2000年6月27日 優(yōu)先權(quán)日2000年6月27日
發(fā)明者許津, 馬瑜, 徐榕, 姚晨, 張煒, 張秀敏 申請(qǐng)人:中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)藥生物技術(shù)研究所