專利名稱：一種豬瘟病毒表位疫苗及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及用生物工程技術(shù)制備的疫苗及其制備方法，特別是涉及一種豬瘟病毒疫苗及其制備方法。
豬瘟是由豬瘟病毒(Classical Swine fever virus，CSFV或Hog Choleravirus，HCV)引發(fā)的惡性傳染疾病，一旦爆發(fā)往往在短時(shí)間內(nèi)帶來(lái)巨大的經(jīng)濟(jì)損失。早在50年代，我國(guó)便研制出了豬瘟兔化弱毒疫苗，該疫苗是減毒活疫苗的一種，利用減毒后的活豬瘟病毒來(lái)誘導(dǎo)免疫防護(hù)，有效地控制了豬瘟在我國(guó)的大流行和散發(fā)，因其安全性和預(yù)防效果很好，許多國(guó)家也使用此疫苗。進(jìn)入70年代后期，豬瘟的流行以散發(fā)和慢性感染為特征，并且普遍出現(xiàn)免疫失敗現(xiàn)象。事實(shí)證明，現(xiàn)有的豬瘟兔化弱毒疫苗在預(yù)防已發(fā)生變異的豬瘟病毒引發(fā)的豬瘟流行時(shí)，存在著很大的困難。豬瘟病毒亞單位疫苗是目前國(guó)內(nèi)外正在研制的一種豬瘟疫苗，該疫苗是利用基因重組的病毒包膜蛋白來(lái)誘導(dǎo)免疫防護(hù)。這種疫苗雖然在一定程度上能夠?qū)Ω敦i瘟病毒的變異，但疫苗中只包含病毒的一個(gè)遺傳信息，當(dāng)病毒發(fā)生變異時(shí)，該疫苗即會(huì)失去效力，并且，該疫苗的生產(chǎn)成本目前仍然較高。
另一方面，豬瘟病毒包膜蛋白E2上的抗原區(qū)序列(第690-866位氨基酸殘基)已被證實(shí)能誘導(dǎo)免疫防護(hù)，即能保護(hù)豬預(yù)防豬瘟病毒的感染(Vaccine 2000，182351；Vaccine 1999，17433；J.Virology 1995，696479；Vaccine 2000，181374；J.Virology 1993，675435)。
同時(shí)，本發(fā)明的發(fā)明人研究發(fā)現(xiàn)，多表位的表位多肽能夠誘導(dǎo)高滴度的、預(yù)先定義的、多中和表位以及變異表位表位特異性的中和抗體。
本發(fā)明的目的是提供一種能對(duì)付豬瘟病毒變異的豬瘟病毒表位疫苗。
本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供一種生產(chǎn)上述豬瘟病毒表位疫苗的方法。
為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采取以下設(shè)計(jì)方案一種豬瘟病毒表位疫苗，它包括至少一個(gè)耦聯(lián)到載體蛋白或載體多肽上形成耦聯(lián)物的含有至少一次重復(fù)的單表位或者至少一次重復(fù)的多表位的表位多肽，所述表位選自豬瘟病毒包膜蛋白E2上的中和表位以及變異表位。
所述豬瘟病毒包膜蛋白E2上的中和表位或變異表位位于豬瘟病毒包膜蛋白E2上的抗原區(qū)。
更具體地說(shuō)，所述抗原區(qū)為豬瘟病毒包膜蛋白E2上的第690-866位氨基酸殘基。
所述中和表位可以選自于RRYLASLHSVTFEL
DTSPVVKGKYNTDDFRFG所述中和表位的變異表位可以選自于KGALLTSKKALPTSKEALPTSYSHDLQYNHDLQYSODLQYNHNLQKGKYNTKAICVAKASCVAKAVCTA所述疫苗可以是包括分別耦聯(lián)到載體蛋白或載體多肽上形成耦聯(lián)物的下述多肽中的一個(gè)或幾個(gè)CRRYLASLHGRRYLASLHGRRYLASLHCSVTFELGSVTFELGSVTFELGSVTFELCDTSPVVGDTSPVVGDTSPVVGDTSPVVCKGKYNTGKGKYNTGKGKYNTGKGKYNTCDDFRFGGDDFRFGGDDFRFGGDDFRFG為了使疫苗能誘導(dǎo)更強(qiáng)的免疫力，疫苗中還包括可接受的藥用佐劑。
一種制備上述豬瘟病毒表位疫苗的方法，基本上包括以下步驟(1)、人工合成至少一條含有至少一次重復(fù)的豬瘟病毒包膜蛋白E2上抗原區(qū)單個(gè)中和表位或單個(gè)變異表位或多個(gè)中和表位或多個(gè)變異表位或多個(gè)中和表位及變異表位的表位多肽；(2)、將上述表位多肽分別耦聯(lián)到載體蛋白或載體多肽上形成耦聯(lián)物；(3)、將上述耦聯(lián)物配以可接受的佐劑制備成豬瘟病毒表位疫苗。
所述人工合成的多肽可以選自CRRYLASLHGRRYLASLHGRRYLASLHCSVTFELGSVTFELGSVTFELGSVTFELCDTSPVVGDTSPVVGDTSPVVGDTSPVV
CKGKYNTGKGKYNTGKGKYNTGKGKYNTCDDFRFGGDDFRFGGDDFRFGGDDFRFG本發(fā)明利用豬瘟病毒包膜蛋白E2上的中和表位能夠誘導(dǎo)豬產(chǎn)生較強(qiáng)，而且時(shí)間較長(zhǎng)的免疫防護(hù)的特性，針對(duì)豬瘟病毒變異較多的特點(diǎn)，運(yùn)用多聯(lián)疫苗使豬產(chǎn)生多種對(duì)豬瘟病毒的抗體，也就是說(shuō)，當(dāng)豬瘟病毒的一個(gè)或幾個(gè)表位發(fā)生變異時(shí)，注射了疫苗的豬還有足以對(duì)付該變異豬瘟病毒的對(duì)應(yīng)于其它未變異表位的抗體。本發(fā)明的疫苗具有以下優(yōu)點(diǎn)1、該疫苗是一種能刺激產(chǎn)生多種中和抗體的高效多聯(lián)疫苗，能有效對(duì)付病毒的變異，進(jìn)而克服已有豬瘟疫苗預(yù)防效果差甚至無(wú)效的缺點(diǎn)。2、該疫苗的有效成分是耦聯(lián)到載體蛋白或載體多肽上形成耦聯(lián)物的包含有豬瘟病毒包膜蛋白E2上的中和表位或變異表位的表位多肽，這些表位多肽不需要減毒或滅活的病原體或病原體的天然蛋白，也不需要基因重組蛋白抗原以及病原體的核酸，能夠直接誘導(dǎo)預(yù)先確定的、多個(gè)中和表位及變異表位特異性的免疫應(yīng)答，沒(méi)有豬瘟病毒的遺傳物質(zhì)及活性，不會(huì)產(chǎn)生因豬瘟病毒的遺傳物質(zhì)誘發(fā)的副作用，也沒(méi)有滅活疫苗或減毒疫苗可能復(fù)性的危險(xiǎn)，同時(shí)也可排除使用豬瘟弱毒疫苗(如豬瘟兔化弱毒疫苗)在種豬、母豬和肉豬體內(nèi)誘導(dǎo)產(chǎn)生的豬瘟減毒活病毒的感染和復(fù)制，從而克服豬瘟減毒活病毒感染肉豬給人類帶來(lái)的潛在的、目前未知的危害。3、能誘導(dǎo)很強(qiáng)的針對(duì)特定中和表位的免疫應(yīng)答，是相應(yīng)的亞單位疫苗誘導(dǎo)的特定中和抗體水平的10-20倍，針對(duì)特定中和表位的抗體量為10-240微克/毫升血清。4、根據(jù)豬瘟病毒的變異，可以很快生產(chǎn)出其相應(yīng)類型的疫苗，不需進(jìn)行長(zhǎng)時(shí)間的試驗(yàn)，降低生產(chǎn)成本。該技術(shù)將對(duì)世界預(yù)防醫(yī)學(xué)研究產(chǎn)生重大影響，將使豬瘟病毒疫苗的制備技術(shù)產(chǎn)生革命性變化，并且將帶來(lái)巨大的經(jīng)濟(jì)效益和社會(huì)效益。
下面結(jié)合非限制性具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步說(shuō)明。
實(shí)施例1、制備以豬瘟病毒E2蛋白為基礎(chǔ)的單表位-豬瘟病毒表位疫苗1.人工合成含有豬瘟病毒E2蛋白抗原區(qū)(第690-866位氨基酸殘基)序列中和表位KGKYNT，并且重復(fù)4次的表位多肽CKGKYNTGKGKYNTGKGKYNTGKGKYNT2.利用MBS(m-maleimidobenzoyl-N-hydroxy succinimide ester)將該表位多肽與載體蛋白牛血清白蛋白耦聯(lián)；3.將上述耦聯(lián)物配以油佐劑制備成豬瘟病毒單表位-表位疫苗。
實(shí)施例2、制備以豬瘟病毒E2蛋白為基礎(chǔ)的豬瘟病毒多聯(lián)-表位疫苗1.人工合成分別含有豬瘟病毒E2蛋白抗原區(qū)序列5個(gè)主要中和表位，并且多次重復(fù)的5個(gè)表位多肽CRRYLASLHGRRYLASLHGRRYLASLH
CSVTFELGSVTFELGSVTFELGSVTFELCDTSPVVGDTSPVVGDTSPVVGDTSPVVCKGKYNTGKGKYNTGKGKYNTGKGKYNTCDDFRFGGDDFRFGGDDFRFGGDDFRFG2.利用戊二醛將5種表位多肽分別與載體蛋白BSA耦聯(lián)；3.將上述耦聯(lián)物配以油佐劑混合，制備成豬瘟病毒多聯(lián)-表位疫苗。其中，5種耦聯(lián)物的份數(shù)比可以根據(jù)不同年份統(tǒng)計(jì)學(xué)處理得出的各位點(diǎn)的變異機(jī)率進(jìn)行調(diào)整。
實(shí)施例3、制備以豬瘟病毒E2蛋白為基礎(chǔ)的豬瘟病毒多表位-表位疫苗1.人工合成含有豬瘟病毒E2蛋白抗原區(qū)序列2個(gè)中和表位的重復(fù)表位多肽CRRYLASLHGSVTFELCRRYLASLHGSVTFEL2.利用MBS(m-maleimidobenzoyl-N-hydroxy succinimide ester)將該表位多肽與載體蛋白雞卵白蛋白耦聯(lián)；3.將上述耦聯(lián)物配以油佐劑制備成豬瘟病毒多表位-表位疫苗。
實(shí)施例4、制備以豬瘟病毒E2蛋白為基礎(chǔ)的豬瘟病毒多表位-多聯(lián)-表位疫苗1.人工合成含有豬瘟病毒E2蛋白抗原區(qū)序列重復(fù)的不同主要中和表位的4個(gè)表位多肽CRRYLASLHGSVTFELGRRYLASLHGSVTFELCSVTFELGDTSPVVGSVTFELGDTSPVVCKGKYNTGDDFRFGKGKYNTGDDFRFGCGDDFRFGSVTFELGDDFRFGSVTFEL2.利用戊二醛將4種表位多肽分別與載體蛋白雞卵白蛋白耦聯(lián)；3.將上述耦聯(lián)物配以油佐劑混合，制備成多表位-多聯(lián)-豬瘟表位疫苗。其中，4種耦聯(lián)物的份數(shù)比可以根據(jù)不同年份統(tǒng)計(jì)學(xué)處理得出的各位點(diǎn)的變異機(jī)率進(jìn)行調(diào)整。
實(shí)施例5、制備以豬瘟病毒E2蛋白為基礎(chǔ)的豬瘟病毒抗變異-多聯(lián)-表位疫苗，步驟為1.人工合成含有豬瘟病毒E2蛋白抗原區(qū)序列重復(fù)的不同主要中和表位和其變異表位的13個(gè)表位多肽CKGALLTSGKGALLTSGKGALLTSCKKALPTSGKKALPTSGKKALPTSCKEALPTSGKEALPTSGKEALPTSCYSHDLQGYSHDLQGYSHDLQGYSHDLQ
CYNHDLQGYNHDLQGYNHDLQGYNHDLQCYSQDLQGYSQDLQGYSQDLQGYSQDLQCYNHNLQGYNHNLQGYNHNLQGYNHNLQCKGKYNTGKGKYNTGKGKYNTGKGKYNTCKGKYNTGKGKYNTGKGKYNTGKGKYNTCKGKYNTGKGKYNTGKGKYNTGKGKYNTCKAICVAGKAICVAGKAICVAGKAICVACKASCVAGKASCVAGKASCVAGKASCVACKAVCTAGKAVCTAGKAVCTAGKAVCTA2.利用MBS(m-maleimidobenzoyl-N-hydroxy succinimide ester)將上述表位多肽分別與載體蛋白牛血清白蛋白耦聯(lián)；3.將上述耦聯(lián)物配以油佐劑混合，制備成豬瘟病毒多表位-多聯(lián)-表位疫苗。其中，13種耦聯(lián)物的份數(shù)比可以根據(jù)不同年份統(tǒng)計(jì)學(xué)處理得出的各位點(diǎn)的變異機(jī)率進(jìn)行調(diào)整。
權(quán)利要求
1.一種豬瘟病毒表位疫苗，它包括至少一個(gè)耦聯(lián)到載體蛋白或載體多肽上形成耦聯(lián)物的含有至少一次重復(fù)的單表位或者至少一次重復(fù)的多表位的表位多肽，所述表位選自豬瘟病毒包膜蛋白E2上的中和表位以及變異表位。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的豬瘟病毒表位疫苗，其特征在于所述豬瘟病毒包膜蛋白E2上的中和表位及變異表位位于豬瘟病毒包膜蛋白E2上的抗原區(qū)。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的豬瘟病毒表位疫苗，其特征在于所述抗原區(qū)為豬瘟病毒包膜蛋白E2上的第690-866位氨基酸。
4.根據(jù)權(quán)利要求1或2或3所述的豬瘟病毒表位疫苗，其特征在于所述中和表位選自于RRYLASLHSVTFELDTSPVVKGKYNTDDFRFG所述變異表位選自于KGALLTSKKALPTSKEALPTSYSHDLQYNHDLQYSODLQYNHNLQKGKYNTKAICVAKASCVAKAVCTA
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的豬瘟病毒表位疫苗，其特征在于所述疫苗包括分別耦聯(lián)到載體蛋白或載體多肽上形成耦聯(lián)物的下述多肽中的一個(gè)或幾個(gè)CRRYLASLHGRRYLASLHGRRYLASLHCSVTFELGSVTFELGSVTFELGSVTFELCDTSPVVGDTSPVVGDTSPVVGDTSPVVCKGKYNTGKGKYNTGKGKYNTGKGKYNTCDDFRFGGDDFRFGGDDFRFGGDDFRFG
6.根據(jù)權(quán)利要求1或2或3或5所述的豬瘟病毒表位疫苗，其特征在于疫苗中還包括可接受的藥用佐劑。
7.根據(jù)權(quán)利要求4所述的豬瘟病毒表位疫苗，其特征在于疫苗中還包括可接受的藥用佐劑。
8.一種制備豬瘟病毒表位疫苗的方法，基本上包括以下步驟(1)、人工合成至少一條含有至少一次重復(fù)的豬瘟病毒包膜蛋白E2上抗原區(qū)單個(gè)中和表位或單個(gè)變異表位或多個(gè)中和表位或多個(gè)變異表位或多個(gè)中和表位及變異表位的表位多肽；(2)、將上述表位多肽分別耦聯(lián)到載體蛋白或載體多肽上形成耦聯(lián)物；(3)、將上述耦聯(lián)物配以可接受的佐劑制備成豬瘟病毒表位疫苗。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的一種制備豬瘟病毒表位疫苗的方法，其特征在于所述人工合成的多肽選自CRRYLASLHGRRYLASLHGRRYLASLHCSVTFELGSVTFELGSVTFELGSVTFELCDTSPVVGDTSPVVGDTSPVVGDTSPVVCKGKYNTGKGKYNTGKGKYNTGKGKYNTCDDFRFGGGDDFRFGGDDFRFGGDDFRFG
全文摘要
本發(fā)明涉及一種表位豬瘟疫苗,它包括至少一個(gè)耦聯(lián)到載體蛋白或載體多肽上形成耦聯(lián)物的含有至少一次重復(fù)的單表位或者至少一次重復(fù)的多表位的表位多肽,所述表位選自豬瘟病毒包膜蛋白E2上的中和表位及變異表位。制備豬瘟疫苗的方法為:(1)人工合成至少一條分別含有至少一次重復(fù)的豬瘟病毒包膜蛋白E2上抗原區(qū)中和單表位或多表位及變異表位的多肽;(2)將多肽分別耦聯(lián)到載體上形成耦聯(lián)物;(3)將耦聯(lián)物配以佐劑制備成疫苗。本發(fā)明能有效對(duì)付豬瘟病毒的變異,具有廣泛的經(jīng)濟(jì)及社會(huì)效益。
文檔編號(hào)A61P31/14GK1338310SQ0012129
公開(kāi)日2002年3月6日 申請(qǐng)日期2000年8月10日 優(yōu)先權(quán)日2000年8月10日
發(fā)明者陳應(yīng)華, 董曉楠, 肖翌 申請(qǐng)人:清華大學(xué)