專利名稱：從活性血多肽中分離的活性單肽、其制備工藝、活性及序列的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明公開了一種活性肽及其制備方法，特別是從活性血多肽-小牛血去蛋白提取物中分離的活性單肽及其制備方法、活性檢測(cè)和序列分析以及該活性肽的用途。
肽是一類生物活性物質(zhì)。它涉及激素神經(jīng)細(xì)胞生長(zhǎng)和生殖等多個(gè)領(lǐng)域，其重要性在于調(diào)節(jié)體內(nèi)各系統(tǒng)、器官和細(xì)胞的功能活動(dòng)。生物活性肽的研究是當(dāng)前生物學(xué)研究中最活躍的領(lǐng)域之一。二十世紀(jì)六、七十年代，垂體和下丘腦的一些肽類激素分離純化取得重大突破，七十年代中期內(nèi)源性阿片肽的分離純化取得成功，極大的推動(dòng)了神經(jīng)肽研究的發(fā)展。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)眾多生物活性肽，如神經(jīng)肽、腦腸肽、心房肽等等，廣泛參與生物體的各種功能活動(dòng)的調(diào)節(jié)，引起各相關(guān)學(xué)科的注意。在生物活性肽的研究中，極其重要而且必不可少的內(nèi)容就是肽的分離純化工作，但由于肽不但本身結(jié)構(gòu)復(fù)雜，而且所處的環(huán)境往往是含有各種各樣大分子的混合物，因此肽的分離純化一直是生物學(xué)工作者十分關(guān)注長(zhǎng)期研究的課題。
生物活性肽一般所處的環(huán)境往往是各種各樣大小分子的混雜體，分離純化的目的是為了進(jìn)一步研究其組成、結(jié)構(gòu)、生物活性、功能和作用機(jī)理等，并進(jìn)一步通過人工合成的方法合成這種肽。肽含量非常低，因此至今沒有一個(gè)單獨(dú)或一套現(xiàn)成的方法能把任何一種多肽從復(fù)雜的混合物中提取出來。
在生物活性肽的分離純化述程中，關(guān)鍵的步驟是建立自始至終都要用的生物活性測(cè)定方法，且該測(cè)活方法始終是可信的，以保證純化出能在測(cè)活實(shí)驗(yàn)中給出信號(hào)的來西。分離純化肽的基礎(chǔ)主要是利用分子之間各種特性的差異，如分子的大小和形狀、酸堿性質(zhì)、溶解度、吸附性質(zhì)和對(duì)其它分子的生物學(xué)親和力?，F(xiàn)用于純化肽的分離純化模式主要有三種一是凝膠色譜，按肽分子的大小進(jìn)行分離；二是離子交換色譜，按肽分子所具有的帶電基因的性質(zhì)數(shù)目進(jìn)行分離；三是反相色譜，按肽分子的疏水強(qiáng)弱進(jìn)行分離。從成分極其復(fù)雜的混合物中將肽分離出來，常?？衫没衔锓肿拥牟煌匦?體積、帶電性、疏水性)連續(xù)選用幾種模式的色譜方法以達(dá)到有效的分離純化。但是每一步的分離過程中總有部分樣品不可避免地?fù)p失掉，如肽的濃度很低時(shí)應(yīng)避免分離步驟過多。正確的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)是選用最少的分離步驟達(dá)到最佳的分離效果。所以對(duì)于多步驟的分離程序。要選擇柱子的種類及使用順序非常重要。對(duì)于每一種肽應(yīng)該選擇一套適當(dāng)?shù)姆蛛x純化模式以獲得高純度高活性的純品。例如在“高效液相色譜在生命科學(xué)中的應(yīng)用，科學(xué)技術(shù)文獻(xiàn)出版社，1998”中，公開了利用凝膠色譜、離子交換色譜和反相色譜在選擇性上的差異，采用凝膠色譜(Bio-Rad250)、離子交換柱(SynChropakS300)、反相柱(SgnChropak RP-C18)，從免骨路肌肌鈣蛋白中完全分離出所需要的肽分子片段。
活性血多肽的種類很多，一般是從動(dòng)物的血液中分離提純出來的，如小牛血去蛋白提取物(Deproteinized Hemoderivation Calfblood)是以小牛血為原料，分子量小于5000道爾頓的小分子生物活性制劑。
小牛血去蛋白提取物(血活素)1955年由瑞士素高藥廠(SOLCOBASLE A.G.)首先研制開發(fā)出來，在世界各國(guó)已廣泛應(yīng)用多年，目前主要上市產(chǎn)品有奧地利奈科明藥廠(HAFSLUND NYCOMEDAG)愛維治(Actovegin)和瑞士素高藥廠生產(chǎn)的素高捷療(Solcoseryl)，以及由日本和我國(guó)的眾多生產(chǎn)廠家生產(chǎn)的產(chǎn)品。其制劑有注射液、片劑、眼膏、凍膏等，注射液每毫升含有40-50mg小牛血去蛋白提取物。
小牛血去蛋白提取物的主要藥理作用是促進(jìn)細(xì)胞對(duì)氧和葡萄糖的攝取和利用(不依賴于胰島素)，該作用在功能缺陷、代謝受抑的情況(低血氧、基質(zhì)不足)下和能量需求增加時(shí)尤為突出，使葡萄糖的無氧代謝轉(zhuǎn)向有氧代謝，促使能量物質(zhì)生成增多，延長(zhǎng)細(xì)胞生成時(shí)間，促進(jìn)組織細(xì)胞代謝及功能恢復(fù)和組織修復(fù)。作為腦代謝復(fù)活劑，主要用于治療老年性癡呆(包括Alzheimer病、多梗塞性癡呆等)、急、慢性腦血管疾病，特別是中風(fēng)、顱腦外傷、脊髓的一些病癥、腦創(chuàng)傷、腦器質(zhì)性精神障礙、外周血管閉塞疾病，此外，也用于治療各種類型的傷口、潰瘍創(chuàng)面、燒傷、化學(xué)灼傷、放射性損傷等，具有良好的臨床療效。
小牛血去蛋白提取物的成分十分復(fù)雜，在其干物質(zhì)中，主要為無機(jī)物和小分子有機(jī)物，包括氨基酸、糖類、小分子量多肽、核苷、酮酸和類脂代謝的中間產(chǎn)物等，不含抗原性物質(zhì)、致熱源和任何可傳播的感染因子。與小牛血去蛋白提取物相關(guān)的資料見J Cell Physiol 1991 Jan，146(1)681-5；Eksp Kiln Farmakol，1999，62(2)61-3；Acta Physiol Hung 1996；84(1)63-72；Neuropsychobiology 1998，37(1)28-35；Angiology 1992 Jan；43(1)47-58；Arzneimittelforschung 1996 Mar，47(3)269-72；EP824，375；US4,866,033。
作為一種療效確切的生化藥品，將小牛血去蛋白提取物中起主要作用的活性成分——一種活性肽分離純化出來，將有利于對(duì)其性質(zhì)、功能、作用機(jī)理進(jìn)行進(jìn)一步的研究探討，并且有可能按照分離的結(jié)構(gòu)進(jìn)行化學(xué)合成。但是自1955年小牛血去蛋白提取物面市以來，對(duì)其的研究大都集中在其藥理作用及臨床應(yīng)用方面，未見從中分離純化活性成分的報(bào)道。
本發(fā)明的目的在于提供一種由活性血多肽，特別是小牛血去蛋白提取物分離純化出的活性肽成分，進(jìn)一步確定其活性、分子量、序列及其它理化性質(zhì)。
本發(fā)明的另一個(gè)目的在于提供一種由活性血多肽，特別是小牛血去蛋白提取物分離純化活性肽成分的方法。
本發(fā)明的再一個(gè)目的在于公開該活性肽在治療腦血管和外傷等方面的用途。
近年來，真核細(xì)胞從細(xì)胞外到細(xì)胞內(nèi)的信息傳遞的研究工作已取得了很大的進(jìn)展。人們已經(jīng)掌握了細(xì)胞內(nèi)信息傳遞系統(tǒng)的基本結(jié)構(gòu)，這些信息傳遞通道主要由特異性受體、G蛋白、釋放第二信使的功能蛋白、一系列的蛋白激酶、靶向功能蛋白和多種調(diào)控蛋白等一系列環(huán)節(jié)組成。此外，細(xì)胞外信息(如基體激素類)還可通過離子通道或直接傳入細(xì)胞內(nèi)，作用于相應(yīng)系統(tǒng)而引起細(xì)胞反應(yīng)。通過對(duì)小牛血去蛋白提取物成分和藥理作用機(jī)制的分析，估計(jì)其活性成分很有可能為活性肽，可能的機(jī)制是活性肽作用于細(xì)胞表面受體或其它感受器，細(xì)胞經(jīng)過一系列轉(zhuǎn)換系統(tǒng)傳遞給相應(yīng)的反應(yīng)系統(tǒng)，從而導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)線粒體的能量代謝改變。
基于上述分析，本發(fā)明首先建立了瓦氏呼吸儀測(cè)壓法測(cè)定活性，對(duì)腦代謝復(fù)活劑——小牛血去蛋白提取物原料進(jìn)行活性篩選，確定適于分離的原料，本發(fā)明采用色譜的方法，經(jīng)過凝膠色譜、Clg及C4反相色譜、Silica及CN正相色譜多步液相色譜分離純化，每一步分離物用瓦氏呼吸儀測(cè)壓法跟蹤活性測(cè)定，從小牛血去蛋白提取物注射液中得到了一生物活性肽，此活性肽肽能促進(jìn)豚鼠肝細(xì)胞對(duì)氧的攝取和利用，是小牛血去蛋白水解液注射液中的有效成分，進(jìn)一步采用高效毛細(xì)管電泳鑒定純度，HPGC測(cè)定樣品分子量，并測(cè)定了其紫外光譜和質(zhì)譜。
本發(fā)明中首先采用瓦氏呼吸儀測(cè)壓法測(cè)定奧地利Hafslund Nycomed AG出品的“Actovegin注射液”、瑞士Solco Basle出品的“Socolseryl注射液”、錦州醫(yī)學(xué)院出品的“促細(xì)胞生成素”、上海麗寶生物制藥有限公司出品的“血活素注射液”等四種小牛血去蛋白提取物的生物活性。通過活性測(cè)定，篩選其中活性最高的樣品作為用于分離純化的原材料，經(jīng)過凝膠色譜、C18及C4反相色譜、Silica及CN正相色譜分別進(jìn)行分離提純；上述每一步分離純化后，得到的各級(jí)分樣品在冷凍干燥、調(diào)整濃度后，進(jìn)行活性的跟蹤測(cè)定以確定活性組分，得到的活性最高的組分再進(jìn)行下一步分離，至分離純化出小牛血去蛋白提取物中的活性成分；用高效液相色譜、高效毛細(xì)管電泳鑒定其為一活性肽，質(zhì)譜分析確定了其分子量，Edman降解法確定了其氨基酸序列。分離醇化的具體過程如圖27所示。
瓦氏呼吸儀測(cè)壓法是一種在定溫定容的密閉系統(tǒng)中，利用氣體壓力的變化定量測(cè)定生物材料或某些化學(xué)反應(yīng)中微量的氣體交換的技術(shù)。在本發(fā)明中，利用豚鼠肝勻漿細(xì)胞呼吸時(shí)，消耗O2，同時(shí)放出CO2，而CO2被反應(yīng)瓶中所加入的KOH吸收，因此壓力計(jì)的壓力變化是由反應(yīng)瓶中O2的減少所產(chǎn)生的，由壓力的變化量可測(cè)定O2的吸收量，由此計(jì)算出樣品或分離組分的活性。四種小牛血去蛋白提取物的活性測(cè)定，Actovegin注射液在四種樣品中活性最高，決定采用Actovegin注射液作為分離純化的原材料，另外，選擇Actovegin注射液作為進(jìn)一步分離原料的另一個(gè)原因是該樣品中的其它輔料有利于分離純化。
為了更好地選擇分離純化的模式和條件，本發(fā)明測(cè)定了作為分離純化原材料的Actovegin注射液的分子量。凝膠色譜法和電泳法是實(shí)驗(yàn)室常用的分子量測(cè)定方法，但電泳法一般只能測(cè)定分子量5000道爾頓以上的化合物，因此本實(shí)驗(yàn)采用高效液相凝膠色譜法測(cè)定樣品分子量；因Actovegin注射液為小分子復(fù)合物，故采用分離范圍為分子量100～7000道爾頓的Superdex Peptide HR 10/300凝膠色譜柱測(cè)定其分子量。將已知分子量的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，在同一凝膠色譜柱上以相同條件進(jìn)行膠色譜層析。由于加入凝膠色譜柱的物質(zhì)分子量不同，故洗脫體積也不相同。根據(jù)洗脫體積求出Kav值，而Kav值與分子量之間存在線性關(guān)系(Kav＝-blgMW＋c)，因此，可以繪出一條標(biāo)準(zhǔn)曲線。然后，在同樣條件下，由未知分子量物質(zhì)的洗脫體積可求出其Kav值，以此值在標(biāo)準(zhǔn)曲線上就能求出其分子量。用高效液相凝膠色譜法測(cè)定分子量，具有測(cè)定速度快、樣品用量少的優(yōu)點(diǎn)。得到Actovegin注射液的分子量95％小于1500道爾頓。
為了進(jìn)一步為分離純化模式和條件的選擇提供信息，本發(fā)明中利用高效毛細(xì)管區(qū)帶電泳(HPCZE)分析對(duì)Actovegin注射液進(jìn)行了多元定性分析。高效毛細(xì)管電泳(HPCE)分析是目前分辨率較高的分析手段。毛細(xì)管區(qū)帶電泳(CZE)是指溶質(zhì)在毛細(xì)管內(nèi)的背景電極緩沖液中以不同速度遷移而形成一個(gè)獨(dú)立的溶質(zhì)帶的電泳模式，其分離基礎(chǔ)是各溶質(zhì)在電極緩沖液中凈電荷與質(zhì)量比間的差異。CZE模式是HPCE中應(yīng)用最廣的一種操作模式。電極緩沖液的選擇直接影響到溶質(zhì)的遷移和最后的分離，其PH值至少必須比被分析物質(zhì)的等電點(diǎn)高或低一個(gè)PH單位。一般地說，只要條件允許就盡可能采用酸性電極緩沖液，事實(shí)上所有的肽的等電點(diǎn)都大于PH4。
從分離的角度講，多肽的每一步分離要盡可能找到最佳分離方法和分離條件，提高樣品的處理量和回收率。但對(duì)于從復(fù)合物中分離純化未知其生化性質(zhì)的生物活性物質(zhì)，并用活性測(cè)定的方法來監(jiān)測(cè)分離組分時(shí)，更重要的是要注意活性成分不能分散在不同收集部分中，因?yàn)榛钚猿煞挚赡苡蓛煞N或多種物質(zhì)構(gòu)成，最后分離比開始時(shí)省時(shí)省力；因此本發(fā)明采用如下的分離純化方法1.中低壓液相色譜(FPGC)分離小牛血去蛋白提取物在生化分離中，經(jīng)常采用離子交換層析色譜法作為分離純化的第一步，因?yàn)樵谥苽湫缘募兓惺褂么笕萘恐苽湫碗x子交換柱十分方便而且效率較高，但對(duì)于本發(fā)明而言，由于Actovegin注射液中鹽濃度太高(硝酸銀滴定法測(cè)定氯離子濃度6mg/ml)，而且分子量太小無法使用凝膠過濾或透析等方法進(jìn)行脫鹽處理，故本實(shí)驗(yàn)采用中低壓液相色譜儀(FPGC)及制備型的HiLoad 26/60 Superdex柱進(jìn)行凝膠色譜分離作為Actovegin注射液分離純化的第一步。凝膠色譜是根據(jù)化合物大小和形狀的差別實(shí)現(xiàn)分離的一種技術(shù)。凝膠色譜的分離機(jī)制可以用立體排除機(jī)制來說明，即小分子和溶劑可以完全進(jìn)入固定相填料的孔穴中，稱為完全滲透，其分配系數(shù)K＝1；大分子完全不能進(jìn)入，稱為完全排除，其分配系數(shù)K＝0；對(duì)于中間大小的分子則屬于選擇性滲透，它可以進(jìn)入填料的某些孔穴內(nèi)，而不能進(jìn)入另一些填料的較小孔中，故其分配系數(shù)K在0～1之間，這部分是凝膠色譜分離有效的范圍，在這個(gè)范圍內(nèi)，如果分子量的指示正確且不考慮分子形狀的影響，則分子量的對(duì)數(shù)與洗脫體積之間將是線性關(guān)系。
在凝膠色譜中，很重要的一點(diǎn)是選擇合適的柱填料。柱填料的選擇可以從以下幾點(diǎn)來考慮①應(yīng)當(dāng)根據(jù)被分離物質(zhì)的分子量范圍來選擇合適的柱填料。不同大小的化合物，當(dāng)它們的洗脫體積接近填料分離范圍的中值時(shí)，有最好的分離。②選擇具有合適孔體積分布的柱填料?？左w積越大峰容量越大，分離也越高，但孔體積太大時(shí)填料不耐壓，如葡聚糖凝膠、瓊脂糖凝膠，耐壓值小于0.3MPa，不適宜于HPLC上使用。③柱填料顆粒越細(xì)，大小越均勻，分辨率越高，但反壓亦較高，對(duì)填料柱和系統(tǒng)的要求亦越高。④物理穩(wěn)定性和化學(xué)穩(wěn)定性。良好的物理穩(wěn)定性才能承受高流速，同時(shí)保持柱床體積和結(jié)構(gòu)穩(wěn)定，提高色譜的重復(fù)性；高的化學(xué)穩(wěn)定性即指能適應(yīng)較寬的PH濃度及有機(jī)溶劑，其有利于開發(fā)分離條件和在位清洗。根據(jù)Actovegin注射液的性質(zhì)，本發(fā)明中，首先選擇了中低壓液相系統(tǒng)和HiLoad 1.6/60 Superdex柱對(duì)Actovegin注射液進(jìn)行第一步凝膠色譜。HiLoad 1.6/60 Superdex柱，柱體積120ml，顆粒大小22～44um，分離范圍＜10000道爾頓，耐壓值0.3Mpa，介質(zhì)為葡聚糖共價(jià)交聯(lián)瓊脂糖，結(jié)合了葡聚糖的高選擇性和瓊脂糖的高物理穩(wěn)定性，在高流速下不會(huì)變型，批處理重復(fù)性很好。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，F(xiàn)PGC法分離得到的六種組分，其中F5組的相對(duì)活性大大高于其它組分，說明F5組分是活性成分主要存在的組分。因此本發(fā)明中，用分離出的活性最高的F5組繼續(xù)進(jìn)行分離。
2.高效反相液相色譜(HPPC)分離F5組分HPRPC是分離小分子生化物質(zhì)的最常用也是最有效的方法之一。因?yàn)樗哂蟹洲q率高、重復(fù)性好、采用有機(jī)溶劑作流動(dòng)相比鹽水體系易從樣品中除去溶劑和后處理比較方便等特點(diǎn)。硅膠鍵合相填料是HPRPC最常用的固定相。硅膠基質(zhì)的填料機(jī)械強(qiáng)度好，耐受壓力高，適用于在HPLC。在HPRPC中常用的硅膠鍵合相填料有十八烷基硅膠(C18或ODS)、辛基硅膠(C8)、芐基硅膠(C4)等。本發(fā)明的第二步分離中，選擇C18硅膠柱分離第一步得到的活性最高的組份。在條件固定時(shí)，鍵合鏈較長(zhǎng)的有更大的色譜保留，但當(dāng)健合鏈的碳數(shù)超過7時(shí)，碳數(shù)增加，保留時(shí)間并不變化。HPRPC多采用梯度洗脫方式來分離樣品，流動(dòng)相通常是由水相緩沖液和不同濃度的有機(jī)溶劑組成。有機(jī)溶劑中乙腈最常用，因?yàn)槠湓?10～80nm間無紫外吸收，易除去并且在分離生物活性物質(zhì)時(shí)，有較高的生物活性和質(zhì)量回收率。HPRPC的流動(dòng)相中常加入三氟乙酸或七氟丁酸等離子對(duì)試劑，其一是增加化合物與鍵合相的疏水作用，調(diào)節(jié)保留；其二使流動(dòng)相的PH值在2.5～5.0之間，防止固定相中殘留的硅醇基在堿性條件下離子化而引起二次吸附。
本發(fā)明的第二步分離采用液相色譜儀，Zorbax 300SB-C18柱，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明HPRPC分離得到的各組分中的相對(duì)活性，其中I組分的相對(duì)活性為75.3％，高于其它組份，說明I組分是活性成分主要存在的組分，因此選擇I組分進(jìn)行第三步的分離。
3.I組分的高效反相液相色譜(HPRPC)分離采用與第二步相同的液相色譜儀，Vydac 300SB-C4柱進(jìn)行I組分的進(jìn)一步分離，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明分離得到的6個(gè)組份中，Y4組份相對(duì)活性69.2％，大大高于其它組分，說明Y4組分是活性成分主要存在的組分，選擇Y4組分進(jìn)行第四步分離。
4.Y4組分的高效正相液相色譜(HPNPC)分離HPNPC是以親水性的填料作固定相，如在硅膠上鍵合羥基、氨基和氰基的極性固定相，以疏水性溶劑或混合物作流動(dòng)相的液相色譜。HPNPC的分離決定于溶質(zhì)和固定相及之間的分子間作用力，其中氫鍵力和靜電力起著重要的作用。本發(fā)明中，用高效液相色譜儀、Zorbax 300SB-CN柱，梯度洗脫，得到六個(gè)組份Y，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，分離出的六個(gè)組份中，Z3組分相對(duì)活性85.4％遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于其它組分，說明Z3組分是活性成分主要存在的組分，可用于進(jìn)行第五步的分離純化。
5.Z3組分的高效正相液相色譜(HPNPC)純化用高效液相色譜儀，Zorbax RX-SIL柱梯度洗脫分離Z3組份，得到四組分離物Z，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明分離出來的組分中，W3組分相對(duì)活性為50.7％，活性高于其它組分，說明W3組分是活性成分主要存在的組分，用W3進(jìn)行下一步的純化。
6.W3組分的高效正相液相色譜(HPNPC)純化用高效液相色譜儀，Zorbax RX-SIL柱分離，得到三個(gè)組份，其中P2組分的相對(duì)活性為49.6％，高于其它組份，P2組分是活性成分主要存在部分。
從自原料小牛血去蛋白提取物開始，每一步分離的分離色譜圖可以看出，隨著分離的進(jìn)行，得到的組份的純度逐漸提高；譜圖由多個(gè)重疊的峰，經(jīng)分離后色譜圖中的峰逐漸拉開，得到幾個(gè)獨(dú)立的峰，至最后一步分離，得到的譜圖中，基本為一個(gè)主要的峰，只含有少量雜質(zhì)；由于同時(shí)用瓦氏呼吸儀測(cè)壓法跟蹤測(cè)定分離純化得到樣品的活性，可以認(rèn)為得到了小牛血去蛋白提取物中的一種活性肽。
本發(fā)明的上述方法也適用于從其它動(dòng)物的活性血多肽中分離活性單肽。
本發(fā)明采用高效毛細(xì)管區(qū)帶電泳(HPCZE)鑒定分離出的活性肽P2組份純度大于95％；高效液相凝膠色譜法(HPGC)測(cè)定分子量為803道頓；氨基酸組成分析是測(cè)定肽序列的重要組成部分，它不僅為制定測(cè)序方案提供前提，而且為測(cè)序的準(zhǔn)確性和效率起著作用，鹽酸水解是目前水解蛋白質(zhì)和肽應(yīng)用最廣泛的一種方法，鹽酸水解使色氨酸全部破壞，蘇氨酸和絲氨酸破壞5～10％，色氨酸被破壞的原因是氧化，若加入1％的苯酚，一般能達(dá)到70％的回收率，本發(fā)明采用鹽酸水解、柱前衍生法分析法測(cè)定P2組分氨基酸組成。
本發(fā)明測(cè)量了活性肽P2組份在190～300nm的紫外吸收光譜。多肽中的共軛雙鍵系統(tǒng)能吸收190-300nm波長(zhǎng)范圍內(nèi)的紫外光。不同的官能團(tuán)有不同的吸收峰，因此，考查肽的整個(gè)吸收光譜可揭示關(guān)于肽的氨基酸組成和肽定量方面的有關(guān)信息。若知肽的氨基酸組成，則也許有可能通過檢查光譜來評(píng)價(jià)它的純度。在190-220um的紫外光波長(zhǎng)范圍內(nèi)，共軛雙鍵如肽鍵有強(qiáng)列的吸收，其它的生物活物質(zhì)如蛋白質(zhì)和核酸也顯示極強(qiáng)的吸收，因此用此波長(zhǎng)范圍內(nèi)的紫外光檢測(cè)生物活性質(zhì)是比較適當(dāng)?shù)?。但這不是特征的，其它的化合物如三氟乙酸在190-220nm也有類的吸收。
此外本發(fā)明經(jīng)液相二級(jí)質(zhì)譜測(cè)定，確定了分子量和碎片結(jié)構(gòu)信息；并用Edman降解法經(jīng)自動(dòng)氨基酸測(cè)序儀測(cè)定其序列。上述分析測(cè)試進(jìn)一步證明分離出的為一活性肽。
本發(fā)明的活性肽直接作用于細(xì)胞代榭，促進(jìn)細(xì)胞對(duì)葡萄糖的攝取和利用(不依賴于胰島素)，增加細(xì)胞氧的攝入率和利用率，從而使ATP的生成增加，使細(xì)胞能源量提高。這是一種不依賴器官的作用。通過這一作用引起細(xì)胞代謝的改善，從而改善細(xì)胞代謝及功能狀態(tài)，這一作用在缺血缺氧狀態(tài)下尤為顯著。在功能缺陷、代謝受抑的情況(低血氧、基質(zhì)不足)下和能量需求增加時(shí)，在細(xì)胞水平促進(jìn)細(xì)胞能量代謝，改善細(xì)胞功能，使血液供應(yīng)增加。另外，它與各種人類生長(zhǎng)因子有協(xié)同效應(yīng)，對(duì)組織有增殖作用。主要用于治療老年性癡呆(包括Alzheimer病、多梗塞性癡呆等)、急、慢性腦血管疾病，特別是中風(fēng)、顱腦外傷、脊髓的一些病癥、腦創(chuàng)傷、腦器質(zhì)性精神障礙、外周血管閉塞疾病，此外，也用于治療各種類型的傷口、潰瘍創(chuàng)面、燒傷、化學(xué)灼傷、放射性損傷等。
本發(fā)明用建立的活性測(cè)定方法——瓦氏呼吸儀測(cè)壓法，對(duì)腦代謝復(fù)活劑——小牛血去蛋白提取物原料進(jìn)行活性篩選，確定了適于分離提純的原料，用現(xiàn)代液相色譜方法，經(jīng)過凝膠色譜、C18及C4反相色譜、Silica及CN正相色譜，從中分離純化出一活性成分，活性多肽，此多肽經(jīng)活性測(cè)定證明，能促進(jìn)豚鼠肝細(xì)胞對(duì)氧的攝取和利用，是小牛血去蛋白水解液注射液中的有效成分，本發(fā)明進(jìn)一步用高效液相色譜、高效毛細(xì)管電泳鑒定其為一活性肽，質(zhì)譜分析確定了其分子量，Edman降解法確定了其氨基酸序列，本發(fā)明的方法科學(xué)、可靠，所分離出的活性肽，對(duì)于進(jìn)一步研究腦代謝復(fù)活劑——小牛血去蛋白提取物的功能、作用及治療各種疾病的機(jī)理具有重要的意義；同時(shí)，為采用生物及化學(xué)方法合成該活性肽奠定了基礎(chǔ)。分離純化出的活性肽經(jīng)測(cè)定氨基酸序列后，可以進(jìn)行人工合成，如能應(yīng)用于臨床將有巨大的應(yīng)用價(jià)值。
下面結(jié)合附圖和具體實(shí)施例詳細(xì)描述本發(fā)明，所述的實(shí)施例是用于描述本發(fā)明，而不是限制本發(fā)明。


圖1為本發(fā)明的分子量標(biāo)準(zhǔn)混合溶液的HPGC圖譜；圖2為本發(fā)明的分子量標(biāo)準(zhǔn)曲線；圖3為本發(fā)明Actovegin注射液的HPGC圖譜；圖4為本發(fā)明Actovegin注射液的HPCZE分析圖譜；圖5為本發(fā)明Actovegin注射液的FPGC分離圖譜；圖6為本發(fā)明Actovegin注射液FPGC分離各收集組分比較圖譜；圖7為本發(fā)明Superdex的結(jié)構(gòu)圖；圖8為本發(fā)明F5組分的HPRPC分離圖譜；圖9為本發(fā)明F5組份HPRPC分離的各收集組分；圖10為本發(fā)明F5 FPGC分離的各收集組分比較；圖11為本發(fā)明I組分的HPRPC分離色譜圖；圖12為本發(fā)明I組分經(jīng)HPRPC分離后的各收集部分；圖13為本發(fā)明I組分的各分離部分相對(duì)體積、峰面積和活性的比較；圖14為本發(fā)明Y4組分的HPNPC分離色譜圖；圖15為本發(fā)明Y4組分經(jīng)HPNPC分離后的各收集部分；
圖16為本發(fā)明Y4組分的各分離部分相對(duì)體積、峰面積和活性的比較；圖17為本發(fā)明Z3組分的HPNPC分離色譜圖；圖18為本發(fā)明Z3組分經(jīng)HPNPC分離后的各收集部分；圖19為本發(fā)明Z3組分的各分離部分相對(duì)體積、峰面積和活性的比較；圖20為本發(fā)明W3組分的純化色譜圖；圖21為本發(fā)明P2組分HPCZE純度鑒定圖譜(在PH值2.5的電極緩沖液中)；圖22為本發(fā)明P2組分HPCZE純度鑒定圖譜(在PH值8.0的電極緩沖液中)；圖23為本發(fā)明HPGC測(cè)定樣品P2組分分子量圖譜；圖24為本發(fā)明PTC-氨基酸標(biāo)準(zhǔn)色圖譜；圖25為本發(fā)明P2組分的紫外吸收光譜；圖26為本發(fā)明P2組分的質(zhì)譜圖；圖27為本發(fā)明的由小牛血去蛋白提取物分離活性單肽的流程圖；圖28為小牛血去蛋白提取物分離的流程圖。
實(shí)施例1本實(shí)施例涉及用瓦氏呼吸儀測(cè)壓法測(cè)定分離純化樣品的活性。具體如下材料與儀器瓦氏呼吸儀Warburg系統(tǒng)12062型，德國(guó)Braun-Melsungen生產(chǎn)；已標(biāo)化無側(cè)臂反應(yīng)瓶；高速勻漿機(jī)；動(dòng)物為250±10g重的清潔級(jí)雄性豚鼠；四種小牛血去蛋白提取物為奧地利Hafslund Nycomed AG生產(chǎn)的批號(hào)為152842的Actovegin注射液；瑞士Solco Basle生產(chǎn)的批號(hào)為414409的Socolseryl注射液；錦州醫(yī)學(xué)院生產(chǎn)的批號(hào)為981216的促細(xì)胞生成素；上海麗寶生物制藥有限公司生產(chǎn)的批號(hào)為990102的血活素注射液。試劑為10％KOH溶液、0.2mol/ml PBS和Brodie測(cè)壓液，小牛血去蛋白提取物的配制方法為稱取牛膽酸鈉5g，NaCI 23g分別溶解后合并，加入伊文思藍(lán)100mg，定容至500ml，加入幾滴香草酚酒精溶液防腐。
實(shí)驗(yàn)方法豚鼠禁食24小時(shí)后，頸部打擊處死，迅速取出肝臟。稱取肝組織4g，加入24ml 0.2mol/ml PBS，6000rpm勻漿30秒，多層紗布過濾，得到肝勻漿液，在預(yù)先洗凈及干燥的反應(yīng)瓶中按表1加入樣品及試劑；將裝好的反應(yīng)瓶與相應(yīng)的側(cè)壓管連接后，將反應(yīng)瓶浸入37±1℃恒溫水浴中，開動(dòng)振蕩器(100次/分鐘)振蕩20分鐘，進(jìn)行溫度和壓力補(bǔ)償；將測(cè)壓計(jì)右側(cè)柱測(cè)壓液面調(diào)至150mm處，記錄左側(cè)測(cè)壓液讀數(shù)(A1)，關(guān)閉三向活塞，開動(dòng)振蕩器；15分鐘后，關(guān)閉振蕩器，利用旋鈕調(diào)節(jié)測(cè)壓計(jì)右側(cè)柱測(cè)壓液液面至150mm處，記錄左側(cè)測(cè)壓液液面讀數(shù)(E1)；重復(fù)4、5過程兩次，讀數(shù)分別記錄為A2、E2，A3、E3。
相對(duì)活性計(jì)算方法如下反應(yīng)瓶常數(shù)K值的計(jì)算K(O2)=(V1+V2-3300)×(273÷300)+3300×0.0239*1000]]>
其中V1為反應(yīng)瓶體積(μl)1；V2為測(cè)壓管體積(μl)；*0.0239為37℃時(shí)O2的溶解度。
耗氧量ΔO2(μl)的計(jì)算ΔO2＝[(Al－E1)＋(A2－E2)＋(A3－E3)]×K相對(duì)活性(％)的計(jì)算 由瓦氏呼吸儀測(cè)壓法測(cè)定的四種樣品的相對(duì)活性測(cè)定結(jié)果見表1--4。由表1--4可以看出，Actovegin注射液在四種樣品中活性最高，決定采用Actovegin注射液作為進(jìn)一步分離純化的原材料，另外，Actovegin注射液中其它輔料，有利于分離純化。
表1.促細(xì)胞生成素活性測(cè)定結(jié)果 平均相對(duì)活性為99.04％表2血活素注射液活性測(cè)定結(jié)果 平均相對(duì)活性為153.697％
表3.Actovegin注射液活性測(cè)定結(jié)果 平均相對(duì)活性為234.32％表4.Socolseryl注射液活性測(cè)定結(jié)果 平均相對(duì)活性為175.27％在瓦氏呼吸測(cè)壓法中，要注意的問題有取豚鼠肝組織時(shí)，部位大小要合適，尤其是不能將膽剪破；勻漿前將肝組織剪成大小均勻并盡量小的小塊，保證勻漿的均一；從取肝組織到測(cè)壓開始這一段時(shí)間盡可能迅速并保持各次活性測(cè)定中時(shí)間一致等，這祥才能盡量減小各樣品測(cè)定間誤差。為保證活性測(cè)定準(zhǔn)確性和精確度，瓦氏呼吸測(cè)壓法實(shí)驗(yàn)每次檢測(cè)同一樣品必須設(shè)置三個(gè)平行樣并設(shè)三個(gè)Actovegin注射液對(duì)照品平行樣，且檢測(cè)結(jié)果滿足以下條件①空白的耗氧量ΔO2≥20μl；②對(duì)照品的相對(duì)活性≥150％，否則無效。另外，雖然每次活性測(cè)定耗費(fèi)較多的樣品，但為了保證測(cè)定結(jié)果的正確性，對(duì)結(jié)果重復(fù)檢定后才能確活性組分。
實(shí)施例2
本實(shí)施例涉及用高效液相凝膠色譜法(HPGC)測(cè)定作為進(jìn)一步分離純化的原材料的Actovegin注射液分子量，具體如下材料與儀器高效液相色譜儀Beckman 125NM泵，126NM檢測(cè)器，工作站；SuperdexPeptideHR 10/300柱10mm×30cm，柱體積24ml，柱填料顆粒大小22～44um，分離范圍100～7000道爾頓，耐壓值1.5MPa，Pharmacia產(chǎn)品；流動(dòng)相0.05mol/L磷酸鈉＋0.1mol/L氯化鈉的水溶液，PH7.0。
標(biāo)樣為相對(duì)分子量13700道爾頓的二核糖核酸酶A，Pharmacia產(chǎn)品；相對(duì)分子量5180道爾頓的胰島素，F(xiàn)isherbrand產(chǎn)品；相對(duì)分子量1508道爾頓的生長(zhǎng)抑素(14肽)；相對(duì)分子量560道爾頓的六肽，Biomol產(chǎn)品；樣品為奧地利HafslundNycomed AG的批號(hào)為152842的Actovegin注射液。
方法分別稱取適量的核糖核酸酶A、胰島素、14肽和六肽配制成分子量標(biāo)準(zhǔn)混合溶液；色譜條件流速lml/min，柱溫室溫，檢測(cè)波長(zhǎng)214nm，進(jìn)樣量20μl。
實(shí)驗(yàn)結(jié)果見圖1-3，其中圖1是核酸酶A、胰島素、14肽、六肽分子量標(biāo)準(zhǔn)混合溶液的HPGC圖譜，圖2是分子量標(biāo)準(zhǔn)曲線，各標(biāo)樣的保留時(shí)間及對(duì)數(shù)分子量為Rt(min) lgMW核酸酶A 13.93 4.1367胰島素 14.93 3.763414肽 16.87 3.1821六肽 18.62.7482結(jié)果表明在此凝膠色譜條件下，分子量標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的分子量對(duì)數(shù)與保留時(shí)間基本呈線性關(guān)系(R＝0.9972)，結(jié)合Actovegin注射液的HPGC圖譜，圖3得到Actovegin注射液的分子量95％小于1500道爾頓。
實(shí)施例3本實(shí)施例涉及Actovegin注射液的高效毛細(xì)管區(qū)帶電泳(HPCZE)分析。
材料與儀器毛細(xì)管電泳儀Beckman P/ACE 5000，固定波長(zhǎng)紫外檢測(cè)器，工作站；熔凝石英毛細(xì)管柱Beckman FS 75um×57cm(有效長(zhǎng)度為50cm)；樣品Actovegin注射液，批號(hào)同實(shí)施例1、2。
方法配制電極緩沖液取1.7m185％磷酸，加入10ml乙腈，加水至250ml，1mol/l NaOH，調(diào)PH值至2.5，0.45um濾膜過濾，用前超聲波處理。毛細(xì)管在使用前依次用1mol/1NaOH清洗5分鐘，超純水清洗5分鐘，進(jìn)樣前用0.1mol/1NaOH清洗2分鐘，超純水清洗1分鐘，電極緩沖液清洗2分鐘。采用高壓進(jìn)樣方式，進(jìn)樣時(shí)間為3秒，毛細(xì)管進(jìn)樣端為正極，檢測(cè)端為負(fù)極，分離電壓為20kv。檢測(cè)波長(zhǎng)為214nm，毛細(xì)管柱分離溫度為25℃。
實(shí)驗(yàn)結(jié)果見圖4，利用HPCZE進(jìn)行復(fù)雜樣品中的多元定性分析，目的是為分離純化模式和條件的選擇提供信息。
實(shí)施例4本實(shí)施例涉及用中低壓液相凝膠色譜(FPGC)分離Actovegin注射液。
材料與儀器中低壓液相色譜儀AKTA Purifier 100，多波長(zhǎng)紫外檢測(cè)器，PH/電導(dǎo)檢測(cè)器，自動(dòng)進(jìn)樣器，工作站；HiLoad 16/60 Superdex柱16mm×60cm，Pharmacia產(chǎn)品；樣品Actovegin注射液同實(shí)施例1-3，真空冷凍干燥機(jī)。
方法在系統(tǒng)穩(wěn)定，柱飽和、平衡后進(jìn)樣，色譜條件為流動(dòng)相10％乙腈＋0.1％TFA的水溶液，流速為1.2ml/min，柱溫為室溫，檢測(cè)波長(zhǎng)為214nm，用電導(dǎo)檢測(cè)，自動(dòng)加樣器進(jìn)樣，進(jìn)樣量1.5ml，閥收集，按體積分段收集F3、F4、F5、F6、F7、F8各組分，各組分經(jīng)低壓抽去有機(jī)溶劑后，冷凍干燥后，各組分經(jīng)適量稀釋后，瓦氏呼吸儀測(cè)壓法分別測(cè)定活性。圖6為Superdex柱的結(jié)構(gòu)。
結(jié)果分別見圖5、圖7，結(jié)果表明F3、F4、FS、F6、F7、F8組分的相對(duì)活性分別為9.1％、5.3％、97.5％、0.6％、-3.6％、-2.4％，F(xiàn)5組分的相對(duì)活性大大高于其它組分，說明F5組分是活性成分主要存在的組分。因此用F5組分進(jìn)行下一步的分離。
實(shí)施例5本實(shí)施例涉及F5組分的高效反相液相色譜(HPRPC)分離材料與儀器高效液相色譜儀Shimadzu LC-10ATvp泵，DGU-12A脫氣機(jī)，CTO-10Asvp柱溫箱，SPD-M10Avp檢測(cè)器，F(xiàn)RC-10A收集器，SCL-10Avp控制器，工作站；Zorbax 300SB-C18柱9.4mm×25cm，DuPont公司產(chǎn)品。流動(dòng)相A液0.1％TFA的水溶液，PH值2.5，0.45μm濾膜過濾，用前超聲脫氣；流動(dòng)相B液0.1％TFA＋80％乙腈的水溶液，0.45μm濾膜過濾，用前超聲脫氣。F5組分真空冷凍干燥后，用流動(dòng)相A液稀釋成50mg/ml左右，真空冷凍干燥機(jī)。
方法色譜條件為檢測(cè)波長(zhǎng)214nm，柱溫37℃，進(jìn)樣體積500μl，梯度洗脫，按時(shí)間分段收集各組分，順序編為A、B、C、D、E、F、G、H、I、J、K、L、M、N、0、P、Q、R、S、T，各組分經(jīng)低壓抽去有機(jī)溶劑后冷凍干燥，冷凍干燥后的各組分經(jīng)適量稀釋后，瓦氏呼吸儀測(cè)壓法分別測(cè)定活性。洗脫梯度如下時(shí)間(min) 流速(ml/min)B％0.00 2.00010.00 2.00 1015.00 2.00 2053.00 2.00 10040.00 2.00 10050 00 2.000
結(jié)果分別見圖8、圖9、圖l0。結(jié)果表明A、B、C、D、E、F、G、H、I、J、K、L、M、N、O、P、Q、R、S、T組分的相對(duì)活性分別為0 9％、10.2％、-7.2％、6.9％、0.2％、1.3％、9.4％、1.8％、75.3％、69％、-23.0％、2.5％、26.5％、-22.9％、0.3％、10.4％、4.7％、8.4％、4.5％、-9.3％。I組分相對(duì)活性大大高于其它組分，說明I組分是活性成分主要存在的組分，因此選用I組分進(jìn)行進(jìn)一步的分離提純。
實(shí)施例6本實(shí)施例涉及實(shí)施例5中得到的I組分的高效反相液相色譜(HPRPC)分離材料與儀器采用實(shí)施例5的高效液相色譜儀，Vydac 300SB-C4柱6mm×25cm，Vydac產(chǎn)品。流動(dòng)相A液0.1％TFA＋20％乙腈的水溶液(PH值2.80)；流動(dòng)相B液0.1％TFA的乙腈溶液，流動(dòng)相均用0.45μm濾膜過濾，用前超聲脫氣；樣品I組分真空冷凍干燥后，用流動(dòng)相A液稀釋成3.5mg/ml左右。
方法色譜條件為檢測(cè)波長(zhǎng)214nm，柱溫37℃，進(jìn)樣體積50μl，梯度洗脫，按時(shí)間分段收集各組分，順序編為Y1、Y2、Y3、Y4、Y5、Y6組分，各組分經(jīng)低壓抽去有機(jī)溶劑后，冷凍干燥，干燥后的各組分經(jīng)適量稀釋后，用瓦氏呼吸儀測(cè)壓法分別測(cè)定活性。洗脫梯度時(shí)間(min) 流速(ml/min)B％0.001.00 05.001.00 015.001.005525.001.006530.001.006535.001.00 10040.001.00 100結(jié)果分別見圖11、圖12、圖13。表明Y1、Y2、Y3、Y4、Y5、Y6組分的相對(duì)活性分別為-14.5％、2.7％、64％、69.2％、22.1％、1.8％。Y4組分相對(duì)活性高于其它組分，說明Y4組分是活性成分主要存在的組分，因此選用Y4組分進(jìn)行進(jìn)一步分離提純。
實(shí)施例7本實(shí)施例涉及Y4組分的高效正相液相色譜(HPNPC)分離材料與儀器高效液相色譜儀同前，Zorbax 300SB-CN柱4.6mm×25cm，DoPont產(chǎn)品；流動(dòng)相A液10mM磷酸銨的水溶液(PH值7.0)；流動(dòng)相B液10mM磷酸按＋60％乙腈的水溶液，流動(dòng)相用0.45μm濾膜過濾，用前超聲脫氣。Y4組分真空冷凍干燥后，用流動(dòng)相A液適量稀釋。
方法色譜條件為檢測(cè)波長(zhǎng)、柱溫和進(jìn)樣體積同實(shí)施例6，梯度洗脫，按時(shí)間分段收集，順序編為Z1、Z2、Z3、Z4、ZS、Z6各組分，后處理及活性測(cè)定同實(shí)施例6。洗脫梯度時(shí)間(min)流速(ml/min)B％0.000.8010.000.8 10015.000.8 10020.000.80結(jié)果見圖14、圖15、圖16。表明Z1、Z2、Z3、Z4、Z5、Z6組分的相對(duì)活性分別為6.7％、6.4％、85.4％、1.5％、-6.8％、-20.6％。Z3組分相對(duì)活性高于其它組分，說明Z3組分是活性成分主要存在的組分。用Z3組分進(jìn)行進(jìn)一步分離提純。
實(shí)施例8實(shí)施例7得到的Z3活性組分的高效正相液相色譜(HPNPC)分離提純材料與儀器高效液相色譜儀同前，Zorbax RX-SIL柱46mm×15cm，DoPont產(chǎn)品；流動(dòng)相A液0.065％TFA＋10％乙腈的水溶液(PH值2.9)，流動(dòng)相B液0.065％TFA＋90％乙腈的水溶液，流動(dòng)相用0.45μm濾膜過濾，用前超聲脫氣。Z3組分真空冷凍干燥后，用流動(dòng)相A適量液稀釋。
方法色譜條件為檢測(cè)波長(zhǎng)和柱溫同實(shí)施例7，進(jìn)樣體積20μl，梯度洗脫按時(shí)間分段收集，順序編為W1、W2、W3、W4各組分，后處理及活性測(cè)試同實(shí)施例6、7，梯度洗脫時(shí)間(min)流速(ml/min) B％0.00 0.805.00 0.8010.00 0.8 1020.00 0.8 3530.00 0.8 10035.00 0.8 10045.00 0.80結(jié)果分別見圖17、圖18、圖19。表明W1、W2、W3、W4組分的相對(duì)活性分別為6.7％、6.4％、50.7％、-6.8％。W3組分相對(duì)活性高于其它組分，說明W3組分是活性成分主要存在的組分。選用W3組分進(jìn)行進(jìn)一步分離提純。
實(shí)施例9實(shí)施例8得到的W3活性組分的高效正相液相色譜(HPNPC)分離純化材料與儀器高效液相色譜儀同前，Zorbax RX-SIL柱4.6mm×15cm，DoPont產(chǎn)品；流動(dòng)相正己烷/甲醇＝95/5，0.45μm濾膜過濾，用前超聲脫氣；W3組分真空冷凍干燥后，用流動(dòng)相適量液稀釋。
方法色譜條件同實(shí)施例8，收集主峰前25％部分，主峰中間50％部分，主峰后25％部分及其它部分，分別編為P1，P2，p3組分，后處理及測(cè)活同上。
純化色譜圖見圖20?；钚詼y(cè)定結(jié)果表明P1組分的相對(duì)活性為20.9％，P2組分的相對(duì)活性為49.6％，P3組分的相對(duì)活性為14.7％，P2組分是活性成分主要存在部分。
從自原料小牛血去蛋白提取物開始，每一步分離的分離色譜圖，即圖5、8、11、14、17、20可以看出，隨著分離的進(jìn)行，得到的組份的純度逐漸提高；圖5顯示多個(gè)重疊的峰，經(jīng)分離后色譜圖中的峰逐漸拉開，見圖8、11，得到幾個(gè)較為清楚的峰，峰的數(shù)量逐漸減少，至最后一步分離，得到的譜圖20中，基本為一個(gè)主要的峰，只含有少量雜質(zhì)；由于同時(shí)用瓦氏呼吸儀測(cè)壓法跟蹤測(cè)定分離純化得到樣品的活性，可以認(rèn)為得到了小牛血去蛋白提取物中的一種活性肽。
實(shí)施例10血活性成分，即的P2組分的鑒定1.高效毛細(xì)管區(qū)帶電泳(HPCZE)鑒定純度HPCZE方法和PH值2.5的電極緩沖液配制同前，另配制PH值8.0的NaH2PO4-Na2HPO4電極緩沖液取0.2mol/L Na2HPO459.2ml，0.02mol/LNaH2PO4；3.3ml，混勻，調(diào)PH值至8.0，然后加水至250ml，用0.45μm濾膜過濾。P2組分稀釋為150μg/ml，進(jìn)樣量為6秒，電泳電壓20KV。實(shí)驗(yàn)結(jié)果見圖21、圖22。結(jié)果表明樣品的純度達(dá)到95％以上。
2.高效液相凝膠色譜法(HPGC)測(cè)定分子量HPGC實(shí)驗(yàn)方法同前，結(jié)果見圖23，測(cè)得P2組分分子量為803道頓。
3.柱前衍生法分析P2組分氨基酸組成材料與儀器高效液相色譜儀同前，Phenomonnex ODS(3)層析柱4.6mm×25cm，17種標(biāo)準(zhǔn)氨基酸溶液；濃度約為100μg/ml P2組分。
試劑0.1mol/L異硫氰酸苯酯(PITC)溶液取PITC12uL，加乙腈988μl，混勻；1mol/L三乙胺溶液取三乙胺139μl，加入乙腈861μl，混勻；流動(dòng)相A稱取30.3511g乙酸鈉，加水3400mL溶解，乙酸調(diào)PH至6.5然后加水至3700mL，加乙腈300mL，加入丙酮10μl，用0.45um濾膜過濾，流動(dòng)相B乙腈/水＝4/1，用前超聲脫氣。
方法取80μl P2組分放入樣品小管內(nèi)，將樣品小管放入反應(yīng)瓶，真空干燥后在反應(yīng)瓶中加入含1％苯酚的6NHCL溶液200μl，將空氣置換為氮?dú)?，將反?yīng)瓶放入恒溫加熱器，150℃加熱1小時(shí)，取20μl標(biāo)準(zhǔn)氨基酸溶液放入樣品小管內(nèi)，標(biāo)準(zhǔn)液小管和樣品小管分別加入100mmol/L異硫氰酸苯酯的已腈溶液10μl、三乙胺10uμl，放置1時(shí)，分別加入40μl正己烷，混勻。取下層液用0.45μm濾膜過濾，取1μl進(jìn)樣。
色譜條件為檢測(cè)波長(zhǎng)254nm，流速1ml/min，柱溫40℃，進(jìn)樣體積1μl。
洗脫梯度時(shí)間(min)流速(ml/min) B％01.00021.00531.00751.00 12111.00 15161.00 3016.01 1.00 100201.00 10020.01 1.000261.000氨基酸標(biāo)準(zhǔn)圖譜見圖24，樣品水解氨基酸色圖譜略，實(shí)驗(yàn)結(jié)果樣品為一小分子量肽，并確定了其氨基酸組成。
4.樣品的紫外吸收光譜將P2組分溶解于超純水中，波度約為0.1mg/ml，以超純水作空白對(duì)照，測(cè)量190～300nm的吸收光譜，光譜圖見圖25，由圖25可以看出，紫外吸收光譜中190-220nm有強(qiáng)烈的吸收。
5.樣品的質(zhì)譜分析P2組分經(jīng)液相二級(jí)質(zhì)譜測(cè)定，確定了分子量和其它結(jié)構(gòu)信息。質(zhì)譜圖見圖26，碎片為589.2、545.2、403.1、346.1、244.2和187.2。
6.樣品的Edman降解法測(cè)序P2組分采用Edman降解法經(jīng)自動(dòng)氨基酸測(cè)序儀測(cè)定其序列。序列圖譜略。
總之，小牛血去蛋白提取物的主要適應(yīng)癥為老年癡呆和中風(fēng)，大量的基礎(chǔ)和臨床研究表明，小牛血去蛋白提取對(duì)這些疾病的治療是安全有效的，但小牛血去蛋白提取物的治療機(jī)理尚需進(jìn)一步的研究和探討，本發(fā)明分離提純小牛血去蛋白提取物的活性肽及其分離提純方法，對(duì)于上述的研究和探討是非常有意義的。
隨著科學(xué)技術(shù)的發(fā)展，新生物活性多肽的發(fā)現(xiàn)速度日益增加。現(xiàn)在內(nèi)分泌器官的概念擴(kuò)大了，大量多肽結(jié)構(gòu)的調(diào)節(jié)因子在醫(yī)學(xué)上有潛在的重要性。從小牛血去蛋白提取物中分離純化出的生物活性肽具有細(xì)胞調(diào)節(jié)因子可能性，有必要進(jìn)行進(jìn)一步的研究探討。
權(quán)利要求
1.一種活性單肽，其特征在于高效毛細(xì)管區(qū)帶電泳鑒定純度大于95％，高效液相凝膠色譜法測(cè)定分子量為803道頓，紫外吸收光譜中190-220nm有強(qiáng)烈的吸收，液相二級(jí)質(zhì)譜測(cè)定碎片為589.2、545.2、403.1、346.1、244.2和187.2，瓦氏呼吸儀測(cè)壓法測(cè)得相對(duì)活性49.6％，能促進(jìn)豚鼠肝細(xì)胞對(duì)氧的攝取和利用，是小牛血去蛋白水解液注射液中的有效成分。
2.權(quán)利要求1活性單肽的制備方法，其特征在于由活性血多肽經(jīng)過中低壓液相色譜、C18及C4反相色譜、CN及Silica正相色譜多步分離純化，分離過程中每一步用瓦氏呼吸儀測(cè)壓法跟蹤測(cè)定分離樣品的相對(duì)活性測(cè)定，取活性最大的成分進(jìn)行進(jìn)一步分離，得到活性血的活性單肽成分。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的制備方法，其特征在于中低壓液相色譜分離過程中，采用中低壓液相色譜儀，HiLoad 16/60 Superdex柱，流動(dòng)相為10％乙腈＋0.1％TFA的水溶液，流速為1.2ml/min，柱溫為室溫，檢測(cè)波長(zhǎng)為214nm。
4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的制備方法，其特征在于高效反相液相色譜分離過程中，采用高效液相色譜儀，Zorbax 300SB-C18柱，流動(dòng)相A液0.1％TFA的水溶液，PH值25，0.45μm濾膜過濾，用前超聲脫氣；流動(dòng)相B液0.1％TFA＋80％乙腈的水溶液，檢測(cè)波長(zhǎng)214nm，柱溫37℃，進(jìn)樣體積500μl，梯度洗脫，按時(shí)間收集，洗脫梯度時(shí)間(min) 流速(ml/min)B％0.00 2.00010.00 2.00 1015.00 2.00 2053.00 2.00 10040.00 2.00 10050.00 2.00 0
5.根據(jù)權(quán)利要求2所述的制備方法，其特征在于高效反相液相色譜分離過程中采用高效液相色譜儀，Vydac 300SB-C4柱，流動(dòng)相A液0.1％TFA＋20％乙腈的水溶液(PH值2.80)；流動(dòng)相B液0.1％TFA的乙腈溶液，檢測(cè)波長(zhǎng)214nm，柱溫37℃，進(jìn)樣體積50μ1，梯度洗脫，按時(shí)間分段收集。洗脫梯度時(shí)間(min)流速(ml/min)B％0.00 1.0005.00 1.00015.00 1.00 5525.00 1.00 6530.00 1.00 6535.001.0010040.001.00100
6.根據(jù)權(quán)利要求2所述的制備方法，其特征在于高效正相液相色譜(HPNPC)分離過程中采用高效液相色譜儀，Zorbax 300SB-CN柱流動(dòng)相A液10mM磷酸銨的水溶液(PH值7.0)；流動(dòng)相B液10mM磷酸按＋60％乙腈的水溶液，梯度洗脫，按時(shí)間分段收集；洗脫梯度 時(shí)間(min)流速(ml/min)B％0.000.8010.000.8 10015.000.8 10020.000.80
7.根據(jù)權(quán)利要求2所述的制備方法，其特征在于高效正相液相色譜(HPNPC)分離提純過程中采用高效液相色譜儀，Zorbax RX-SIL柱，流動(dòng)相A液0.065％TFA＋10％腈的水溶液(PH值2.9)，流動(dòng)相B液0.065％TFA＋90％乙腈的水溶液，梯度洗脫按時(shí)間分段收集。梯度洗脫時(shí)間(min)流速(ml/min) B％0.00 0.8 05.00 0.8 010.00 0.81020.00 0.83530.00 0.8 10035.00 0.8 10045.00 0.8 0
8.根據(jù)權(quán)利要求2所述的制備方法，其特征在于高效正相液相色譜(HPNPC)分離純化過程中采用高效液相色譜儀，Zorbax RX-SIL柱，流動(dòng)相正己烷/甲醇＝95/5。
9.根據(jù)權(quán)利要求1所述的活性單肽，其特征在于由小牛血去蛋白提取物經(jīng)過中低壓液相色譜、C18及C4反相色譜、CN及Silica正相色譜多步分離純化，分離過程中每一步用瓦氏呼吸儀測(cè)壓法跟蹤測(cè)定分離樣品的相對(duì)活性測(cè)定，取活性最大的成分進(jìn)行進(jìn)一步分離，得到活性多肽成分。
10.根據(jù)權(quán)利要求2所述的制備方法，其特征在于所述的活性血多肽為小牛血去蛋白提取物。
11.權(quán)利要求1所述活性單肽，其特征在于用于治療腦血管和外傷。
全文摘要
本發(fā)明公開了從活性血多肽－小牛血去蛋白提取物中分離的活性單肽、其制備工藝、活性及序列檢測(cè);用建立的活性測(cè)定方法,對(duì)分離后的各組分進(jìn)行活性篩選,并分析了生化性質(zhì);用現(xiàn)代液相色譜方法,經(jīng)過凝膠色譜、C18及C4反相色譜、Silica及CN正相色譜,分離純化出小牛血去蛋白提取物中的活性成分;用高效液相色譜、高效毛細(xì)管電泳、質(zhì)譜鑒定其為一活性肽并測(cè)定了分子量,該活性肽主要用于治療腦血管疾病。
文檔編號(hào)A61P9/10GK1337403SQ00121559
公開日2002年2月27日 申請(qǐng)日期2000年8月4日 優(yōu)先權(quán)日2000年8月4日
發(fā)明者徐康森, 廖志湘 申請(qǐng)人:中國(guó)藥品生物制品檢定所