專利名稱：制備表?xiàng)攦翰杷貨]食子酸酯的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及制備(-)-表?xiàng)攦翰杷貨]食子酸酯(EGCG)的方法。本發(fā)明尤其涉及通過從茶葉兒茶素中分離來制備EGCG的方法，其中所述分離包括用大孔極性樹脂處理。
按干燥重量計(jì)，綠茶植物茶(cameLLia sinensis)的葉子中含有高達(dá)36％的多元酚，然而，其組成隨氣候、季節(jié)、品種以及成熟狀態(tài)變化而變化。綠茶兒茶素是主要的綠茶多元酚。兒茶素的實(shí)例有(-)-表兒茶素(EC)、(-)-表?xiàng)攦翰杷貨]食子酸酯(EGCG)、表?xiàng)攦翰杷?EGC)和表兒茶素沒食子酸酯(ECG)。
在上述兒茶素中，EGCG是人們最感興趣的化合物，因?yàn)槠渚哂袕?qiáng)的抗氧化作用。此外，已經(jīng)證實(shí)，EGCG具有抗誘變作用、抗菌作用以及對血液中膽固醇水平有有益作用。茶葉中存在的其它兒茶素的作用很弱。綠茶還含有其它組分，例如咖啡因、蛋白、果膠和/或可能不需要的金屬離子。
因此需要通過簡單且經(jīng)濟(jì)的方法以高產(chǎn)率分離純的EGCG。然而，各種茶葉兒茶素所具有的類似結(jié)構(gòu)使得難以把各個(gè)單獨(dú)的兒茶素分離開。此外，茶葉中的兒茶素通常伴隨咖啡因一起存在，其中咖啡因的含量占干燥綠茶茶葉干重高達(dá)4％。已知咖啡因常與兒茶素混在一起，并且不易于除去。
綠茶提取物的生產(chǎn)是本領(lǐng)域眾所周知的。US5879733描述了生產(chǎn)具有改善的澄清度和顏色的綠茶提取物。該茶葉提取物是通過用食品級陽離子交換樹脂把綠茶提取物在25℃-60℃溫度下處理制得的，其中所述陽離子交換樹脂的用量是能有效地將提取物中的金屬離子除去的量。然后將處理的提取物與納米過濾膜接觸。然而，在US5879733中描述的方法不適合于從茶葉兒茶素中分離EGCG。
US4613672描述了一種制備純EGCG的方法，該方法包括下述步驟用熱水或用40-75％甲醇水溶液、40-75％乙醇水溶液或30-80％丙酮水溶液提取茶葉。將所得提取物用氯仿洗滌，并把該洗滌過的提取物溶于有機(jī)溶劑中。將有機(jī)溶劑蒸餾掉，并用逆相分配柱將該濃縮的萃取組份進(jìn)行高速液相色譜處理，用丙酮/四氫呋喃/水(0-25∶0-35∶65-85，％體積)作為展開劑，從而將(-)表兒茶素、(-)-表?xiàng)攦翰杷亍?-)表兒茶素沒食子酸酯、和(-)表?xiàng)攦翰杷貨]食子酸酯彼此分離開。在工業(yè)規(guī)模上，US4613672中描述的方法并不能經(jīng)濟(jì)地制備EGCG，因?yàn)槠涫褂昧税嘿F的填柱物。此外，US4613672中描述的方法不能用于制備可加到食品中的EGCG，因?yàn)槠涫褂玫娜軇┗旌衔?丙酮/四氫呋喃/氯仿)不能通過食品許可。
雖然現(xiàn)有技術(shù)公開了制備兒茶素混合物的方法，但是仍然需要簡單、安全且經(jīng)濟(jì)的制備可用作加到補(bǔ)品和食品中的組分的純EGCG的方法。
現(xiàn)在已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，當(dāng)用大孔極性樹脂和合適的極性洗脫溶劑進(jìn)行分離時(shí)，可從茶葉兒茶素和/或咖啡因混合物中以改善的選擇性分離到EGCG。
因此，本發(fā)明涉及制備表?xiàng)攦翰杷貨]食子酸酯(EGCG)的方法，所述方法包括a)提供綠茶提取物；b)在約10℃-約80℃，用大孔極性樹脂將綠茶提取物進(jìn)行色譜處理；c)在約10℃-約80℃以及約0.1巴-約50巴壓力下，用極性洗脫溶劑從所述大孔極性樹脂洗脫EGCG；d)任選濃縮步驟c)的洗脫液；e)任選通過解吸剩余兒茶素來再生所述大孔極性樹脂；和f)任選濃縮步驟e)的解吸的兒茶素。
用作原料的綠茶提取物的生產(chǎn)是本領(lǐng)域眾所周知的。例如，一般用熱水或冷水提取綠茶葉，以形成含有兒茶素和咖啡因的溶液?？蓪⒃摼G茶溶液進(jìn)一步濃縮以形成濃縮提取溶液或干粉末。該提取溶液或粉末可含有穩(wěn)定劑，例如食品可接受酸，例如檸檬酸、抗壞血酸、異抗壞血酸等。
茶葉提取物粉末也可從商業(yè)途徑獲得，例如可從貴州海音(音譯)生物制品公司，貴陽，中國(貴州海音(音譯)生物制品公司，Guiyang，P.R.China)，或浙江中科(音譯)植物技術(shù)有限公司，杭州，浙江，中國(Zhejang Zhongke Plant Technical Co.Ltd.，Hangzhou，Zhejang，P.R.China)購得。
一般是用填充有大孔極性樹脂的柱子將綠茶提取物柱層析來分離EGCG的。
本說明書所用“大孔極性樹脂”是指丙烯酸樹脂，例如聚丙烯酸酯類，如Rohm and Haas，Philadelphia，Pa的AMBERLITE_XAD-7，或聚甲基丙烯酸酯類，例如Toso haas的AMBERCHROM_CG-71或Mitsubishi Chem.Corp.，Philadelphia，Pa的DIAION HP 2MG；或聚酰胺類，例如Merck，Darmstadt，德國的Polyamide 11；Fluka，Buchs，Switzerland的Polyamide 6和Nylon 6，6(二者的商品目錄號(Catalogue Nos.)分別為02395和74712)；EMS Chemie，Domat，Switzerland的Polyamide 12(Grilamid L 25 natur)；或Sigma的Polyvinylpyrrolidone P 6755；或者芳族聚酰胺類和聚酯類。
優(yōu)選將樹脂脫氣并用洗脫溶劑平衡。
在約10℃-約80℃，優(yōu)選約40℃-約60℃的溫度下進(jìn)行本發(fā)明方法。可以例如將分離柱置于恒溫控制區(qū)例如加熱夾套中來進(jìn)行恒溫控制。
流動(dòng)相流過分離柱的液壓可在寬范圍內(nèi)變化。以約0.1巴-約50巴、優(yōu)選0.1巴-約20巴、更優(yōu)選0.1巴-約10巴的壓力優(yōu)選泵送流動(dòng)相流過分離柱。
流動(dòng)相包含極性洗脫溶劑，所述極性洗脫溶劑是水和有機(jī)溶劑的混合物。本說明書所用術(shù)語“有機(jī)溶劑”是指醇，例如甲醇、乙醇、異丙醇等，和酮例如丙酮，或酯例如乙酸乙酯，或者它們的混合物。優(yōu)選使用食品級醇，例如乙醇和異丙醇。當(dāng)使用包含約70％-約95％體積、優(yōu)選約90％體積的水和約5％-約30％體積、優(yōu)選約10％體積有機(jī)溶劑的混合物的流動(dòng)相時(shí)，可獲得特別好的結(jié)果。將流動(dòng)相脫氣并將流動(dòng)相保持在惰性氣氛下例如氮?dú)饣驓鍤夥障率怯欣摹?br> 使用流動(dòng)相穩(wěn)定分離柱。流動(dòng)相流過分離柱的流速可在寬的范圍內(nèi)改變。流速為約0.5-約20柱床體積/小時(shí)，優(yōu)選為約0.5-約10柱床體積/小時(shí)，更優(yōu)選為約0.8-約5柱床體積/小時(shí)(1柱床體積相當(dāng)于1m3溶液或溶劑/m3樹脂)。
在固定相與流動(dòng)相之間建立起平衡后，將茶葉提取溶液導(dǎo)入流動(dòng)相中，從而用大孔極性樹脂對綠茶提取物進(jìn)行色譜分離。如果使用綠茶提取物粉末作為原料，可將粉末溶于流動(dòng)相內(nèi)。如果使用含水綠茶提取物，通過加入有機(jī)溶劑將提取物中水與有機(jī)溶劑的比例調(diào)節(jié)到流動(dòng)相中的比例是有利的。
本發(fā)明的關(guān)鍵方面是，在約10℃-約80℃、優(yōu)選約40℃-約60℃的溫度下用大孔極性樹脂處理綠茶提取物，并用極性溶劑洗脫EGCG。樹脂、洗脫劑和溫度三個(gè)特征的這種特別互相作用是本發(fā)明的重要方面，并導(dǎo)致從兒茶素和/或咖啡因混合物中特定分離出EGCG，由此洗脫后獲得了含有至少75％、優(yōu)選85％以上、更優(yōu)選約90％-約97％EGCG的EGCG級分，其中所述百分比是基于提取物或濃縮物中存在的兒茶素總量而計(jì)的。
根據(jù)所用洗脫劑和溫度的不同，所述大孔極性樹脂吸附咖啡因、EGCG和其余兒茶素的能力是不同的。其對咖啡因的親和力小于對EGCG的親和力，因此，如果存在咖啡因的話，咖啡因首先被洗脫掉并可被分離出來。如果合適的話，也可借此回收純的咖啡因，從經(jīng)濟(jì)方面考慮這也是有利的。分離出的第二級分是含有EGCG的級分。剩余兒茶素的親和力比EGCG強(qiáng)，因此，通過用能將剩余兒茶素解吸的溶劑洗脫，可把吸附的剩余兒茶素解吸直至樹脂再生為止。例如，可通過用純有機(jī)溶劑洗脫或者通過改變流動(dòng)相中水與有機(jī)溶劑的比例來把剩余兒茶素解吸。適當(dāng)?shù)脑偕軇┦抢缂冇袡C(jī)溶劑，或者約10％-約60％體積水與約40％-約90％體積有機(jī)溶劑的混合物，優(yōu)選約40％體積水和約60％體積有機(jī)溶劑的混合物。
可通過本領(lǐng)域眾所周知的方法、例如通過蒸餾將洗脫液中的EGCG濃縮?？蓪GCG洗脫液蒸發(fā)至干，從而形成含有高純度EGCG的粉末，或者將EGCG洗脫液濃縮至結(jié)晶?？赏ㄟ^向洗脫液中加入穩(wěn)定劑例如食品可接受酸如檸檬酸、抗壞血酸等來進(jìn)行濃縮。所述酸的優(yōu)選加入量相對于EGCG為約0.1-約2.5％。
可如上所述將含有兒茶素的前級分和含有剩余兒茶素的步驟e)級分濃縮。
可用單個(gè)色譜柱或多色譜柱系統(tǒng)來實(shí)施本發(fā)明方法。還可用在本領(lǐng)域內(nèi)稱為“模擬移動(dòng)床色譜法”或“環(huán)形色譜法”的技術(shù)實(shí)施本發(fā)明方法。
可用簡單且經(jīng)濟(jì)的操作實(shí)施本發(fā)明方法，因此本發(fā)明方法在產(chǎn)率和操作方面適于大規(guī)模生產(chǎn)。
如上所述制得的EGCG具有強(qiáng)抗氧化活性，因此可用作各種食品、化妝品、油品等的抗氧化劑。此外，EGCG還具有抗誘變作用、抗茵作用、以及對血液中膽固醇水平具有有益作用。因此，EGCG提取物或純EGCG可用于保健品。
用下述實(shí)施例更詳細(xì)地說明本發(fā)明。實(shí)施例1分離EGCG使用含有不同兒茶素和咖啡因的綠茶提取物(貴州海音生物制品公司，貴陽，中國出產(chǎn)，“綠茶提取物，最少含有95％的多元酚”)作為原料。通過使用UV吸收的HPLC來測定茶組分的濃度，以重量％表示。EGCG、咖啡因、其它兒茶酚以及沒食子酸的含量如表1所示。
表1原料中茶葉組分的濃度
將33.51(26kg)粒徑為0.3-1.2mm的Amberlite_XAD-7樹脂填充到內(nèi)直徑為150mm、長2m且容量為35.4l的試驗(yàn)規(guī)模柱中。給該柱裝上加熱套。將樹脂用水充分洗滌，并用水/異丙醇(體積比為9∶1)混合物平衡。在使用前，將所用裝置和溶劑脫氣，并保持在氮?dú)夥障隆?br> 將該填充柱在60℃恒溫。把含有152.5g純EGCG的0.4kg上述綠茶提取物(表1)溶于1.8kg水/異丙醇(體積比為9∶1)混合物，并加載到該柱頂部。在60℃、0.5巴壓力下通過泵用水/異丙醇(體積比為9∶1)混合物以50kg/小時(shí)的恒定流速將EGCG從柱中洗脫。144kg的起始洗脫液(前級分)之后，收集含有112gEGCG作為主要多元酚組分的174kg主要洗脫液。EGCG在主要洗脫液中的濃度為0.064％。從茶葉提取物中152.5gEGCG分離出的EGCG的產(chǎn)率為73.5％。
為了將樹脂再生，通過用78.3kg水/異丙醇(體積比為4∶6)混合物洗脫將剩余兒茶素解吸。在下一分離前，以逆流方式用86kg水/異丙醇(體積比為9∶1)混合物以120kg/小時(shí)的流速穩(wěn)定該柱。
表2通過EGCG的相對百分比表明了分離效果。通過使用UV吸收的HPLC來測定主要洗脫液中各茶組分的濃度，以重量％或ppm表示。
表2主要洗脫液中茶葉組分的濃度
實(shí)施例2用其組成如表3所示的購自貴州海音生物制品公司的另一批“綠茶提取物，最少含有95％多元酚”重復(fù)實(shí)施例1。
表3原料中各茶組分的濃度
將實(shí)施例1洗過的柱在60℃下恒溫，并使用其進(jìn)行分離。把含有140.5g純EGCG的0.4kg上述綠茶提取物(表3)溶于1.8kg水/異丙醇(體積比為9∶1)混合物，并加載到該柱頂部。如實(shí)施例1所述洗脫該柱。200kg的起始洗脫液(前級分)之后，收集含有72.8gEGCG作為主要多元酚組分的177kg主要洗脫液。EGCG在主要洗脫液中的濃度為0.062％。從茶葉提取物中140.5gEGCG離出的EGCG的產(chǎn)率為51.8％。
為了將樹脂再生，通過用100.0kg水/異丙醇(體積比為4∶6)混合物洗脫將剩余兒茶素解吸。在下一分離前，以逆流方式用100kg水/異丙醇(體積比為9∶1)混合物以120kg/小時(shí)的流速穩(wěn)定該柱。
表4通過EGCG的相對百分比表明了分離效果。通過使用UV吸收的HPLC來測定主要洗脫液中各茶組分的濃度，以ppm表示。與實(shí)施例1相比，以更高的百分比獲得了EGCG。
表4主要洗脫液中各茶組分的濃度
實(shí)施例3洗脫液的濃縮加入2％檸檬酸，將通過如實(shí)施例2所述重復(fù)操作制得的吸附/解吸柱的9008kg洗脫液穩(wěn)定，其中所述百分比是按照EGCG的量計(jì)算的。在40℃、55毫巴壓力下，用由不銹鋼制成的、熱交換面積為1.1m2的降膜蒸發(fā)器將該洗脫液濃縮。加到蒸發(fā)器內(nèi)的進(jìn)料溶液中兒茶素和咖啡因的量如表5所示。
表5進(jìn)行蒸發(fā)的純EGCG溶液中茶組分的濃度
在300kg/小時(shí)的循環(huán)流速下，將進(jìn)入蒸發(fā)器的進(jìn)料調(diào)控在120kg/小時(shí)-130kg/小時(shí)的流速范圍內(nèi)。因此，在0.52kg/小時(shí)的底部產(chǎn)物移出速率下，餾出液的流速為123.5Kg/小時(shí)。在濃縮過程中，將第一級分取樣并分析，然后將第二級分也取樣并分析。這兩部分EGCG濃縮物的總重為63.5kg。
表6表示了底部產(chǎn)物中各茶葉組分的濃度。EGCG的回收率為95.9％。分析結(jié)果清楚地表明，在該溶液的濃縮過程中，可保持分離得到的EGCG的高純度。
可通過噴霧干燥或結(jié)晶從濃縮溶液中以固體形式分離到EGCG。
表6由降膜蒸發(fā)器獲得的EGCG濃縮物中各茶葉組分的濃度
實(shí)施例4將450ml平均粒徑為120微米的AMBERCHROM_CG-71c填充到由不銹鋼制成的、內(nèi)直徑為2.2cm且長103cm的實(shí)驗(yàn)室用色譜柱中。給該柱裝上加熱夾套。洗滌樹脂，并用水/乙醇(體積比為9∶1)混合物平衡。
把購自貴州海音生物制品公司的20g濃縮兒茶素粉末“綠茶提取物，最少含有95％多元酚”(原料)溶于20ml水/乙醇(體積比為9∶1)混合物。然后將14g該溶液(相當(dāng)于2.99gEGCG)加載到該柱頂部。在60℃、2-3巴壓力下通過色譜泵用水/乙醇(體積比為9∶1)混合物以16毫升/分鐘的恒定流速洗脫EGCG。在使用前，將洗脫劑脫氣并保持在氮?dú)夥障隆?.48 l的起始洗脫液(前級分)之后，將流速變?yōu)?5.5毫升/分鐘，并收集合有濃度為0.627g/l的EGCG的5.40 l主要洗脫液。對于其它兒茶素和咖啡因而言，通過HPLC測定EGCG在主要洗脫液中的純度，以相對百分比表示，其純度為97.13％。在實(shí)驗(yàn)期間，根據(jù)所采用的流速，系統(tǒng)的壓力在2-3巴之間變化。表7比較了在洗脫液和原料中的各茶葉組分的濃度，由此表明了通過EGCG相對百分比表示的分離效果。原料和主要級分中茶葉組分的濃度是通過使用UV吸收的HPLC測定的，并以重量％或ppm表示。
表7在AMBERCHROM CG-71c上的分離，60℃，溶劑體系水/乙醇
實(shí)施例5將450ml平均粒徑為0.3-1.2mm的Amberlite_XAD-7填充到由玻璃制成的、內(nèi)直徑為2.4cm且長100cm的實(shí)驗(yàn)室用色譜柱中。給該柱裝上加熱夾套，并在底部裝配上玻璃燒結(jié)玻璃料P3。在使用前，將樹脂充分洗滌，并用水/乙醇(體積比為9∶1)混合物平衡。
把購自貴州海音生物制品公司的20g濃縮兒茶素粉末“綠茶提取物，最少含有95％多元酚”(原料)溶于20ml水/乙醇(體積比為9∶1)混合物。然后將14g該溶液(相當(dāng)于2.91gEGCG)加載到該柱頂部。在60℃、0.5-1巴壓力下用水/乙醇(體積比為9∶1)混合物以16.9毫升/分鐘的恒定流速洗脫EGCG。在使用前，將洗脫液脫氣并保持在氮?dú)夥障隆?.48 l的起始洗脫液(前級分)之后，將流速變?yōu)?3.6毫升/分鐘，并收集含有濃度為0.470g/l的EGCG的4.95 l主要洗脫液。相對于其它主要兒茶素和咖啡因而言，通過HPLC測定EGCG在主要洗脫液中的純度為86.22％(見表8)?；贓GCG的產(chǎn)率為79.8％。在實(shí)驗(yàn)期間，根據(jù)所采用的流速，系統(tǒng)的壓力在0.5-1巴之間變化。
為了再生樹脂，通過用1.35L水/乙醇(體積比為4∶6)的混合物以22.5毫升/分鐘的流速洗脫，把剩余兒茶素解吸。得到的這種級分還可用于解吸的兒茶素的進(jìn)一步純化或分離。表8比較了在洗脫液和原料中的各茶葉組分的濃度，由此表明了通過EGCG相對百分比表示的分離效果。原料和主要級分中各茶葉組分的濃度是通過使用UV吸收的HPLC測定的，并以重量％或ppm表示。
表8在Amberlite XAD-7上的分離，60℃，溶劑體系水/乙醇
實(shí)施例6通過泵送水/乙醇(體積比為9∶1)混合物流過樹脂，使在實(shí)施例5所述實(shí)驗(yàn)室用柱中的再生樹脂平衡。
把購自貴州海音生物制品公司的20g濃縮兒茶素粉末“綠茶提取物，最少含有95％多元酚”(原料)溶于20ml水/乙醇(體積比為9∶1)混合物。然后將14g該溶液(相當(dāng)于3.04gEGCG)加載到該柱頂部。在40℃柱溫、1-2巴壓力下用水/乙醇(體積比為9∶1)混合物以22.5毫升/分鐘的恒定流速洗脫EGCG。在使用前，將洗脫液脫氣并保持在氮?dú)夥障隆?.60 l的起始洗脫液(前級分)之后，將流速變?yōu)?6.3毫升/分鐘，并收集4.73 l主要洗脫液。EGCG在主要洗脫液中的濃度為0.278g/l。相對于其它主要兒茶素和咖啡因而言，通過HPLC測定的表?xiàng)攦翰杷貨]食子酸酯在主要洗脫液中的純度為93.2％?；贓GCG而計(jì)的產(chǎn)率為42.8％。在實(shí)驗(yàn)期間，根據(jù)所采用的流速，系統(tǒng)的壓力在1-2巴之間變化。
為了再生樹脂，通過在40℃下用水/乙醇(體積比為4∶6)混合物以26.3毫升/分鐘的流速洗脫，把剩余兒茶素解吸。這種級分還可用于解吸的兒茶素的進(jìn)一步純化或分離。表9比較了在洗脫液和原料中的各茶葉組分的濃度，由此表明了通過EGCG相對百分比表示的分離效果。原料和主要級分中各茶葉組分的濃度是通過使用UV吸收的HPLC測定的，并以重量％或ppm表示。
表9在Amberlite XAD-7上的分離，40℃，溶劑體系水/乙醇
實(shí)施例7用水/異丙醇(體積比為9∶1)混合物平衡實(shí)施例6中的再生樹脂。
把購自貴州海音生物制品公司的20g濃縮兒茶素粉末“綠茶提取物，最少含有95％多元酚”(原料)溶于20ml水/異丙醇(體積比為9∶1)混合物。然后將14g該溶液(相當(dāng)于3.21gEGCG)加載到該柱頂部，在60℃柱溫用水/異丙醇(體積比為9∶1)混合物以18毫升/分鐘的恒定流速洗脫。在使用前，將洗脫液脫氣并保持在氮?dú)夥障隆?.35 l的起始洗脫液(前級分)之后，將流速變?yōu)?6.5毫升/分鐘，并收集2.03 l主要洗脫液。EGCG在主要洗脫液中的濃度為0.998 g/l。相對于其它主要兒茶素和咖啡因而言，通過HPLC測定的表?xiàng)攦翰杷貨]食子酸鹽在該主要洗脫液中的純度為85.7％?；贓GCG而計(jì)的產(chǎn)率為62.8％。在實(shí)驗(yàn)期間，根據(jù)所采用的流速，系統(tǒng)的壓力在1-2巴之間變化。
為了再生樹脂，通過在40℃用水/異丙醇(體積比為4∶6)混合物以16.5毫升/分鐘的流速洗脫，把剩余兒茶素解吸。這種級分還可用于解吸的兒茶素的進(jìn)一步純化或分離。表10比較了在洗脫液和原料中的各茶葉組分的濃度，由此表明了通過EGCG相對百分比表示的分離效果。原料和主要級分中各茶葉組分的濃度是通過使用UV吸收的HPLC測定的，并以重量％或ppm表示。
表10在Amberlite XAD-7上的分離，60℃，溶劑體系水/異丙醇
實(shí)施例8用水/異丙醇(體積比為9∶1)混合物平衡實(shí)施例7中的再生樹脂。
把購自貴州海音生物制品公司的20g濃縮兒茶素粉末“綠茶提取物，最少含有95％多元酚”(原料)溶于20ml水/異丙醇(體積比為9∶1)混合物。然后將14g該溶液(相當(dāng)于3.10gEGCG)加載到該柱頂部。在40℃柱溫用水/異丙醇(體積比為9∶1)混合物以16.9毫升/分鐘的恒定流速洗脫EGCG。在使用前，將洗脫液脫氣并保持在氮?dú)夥障隆?.48 l的起始洗脫液(前級分)之后，將流速變?yōu)?3.66毫升/分鐘，并收集4.95 l主要洗脫液。EGCG在主要洗脫液中的濃度為0.370g/l。相對于其它主要兒茶素和咖啡因而言，通過HPLC測定的EGCG在該主要洗脫液中的純度為86.6％?；贓GCG而計(jì)的產(chǎn)率為59.2％。在實(shí)驗(yàn)期間，根據(jù)所采用的流速，系統(tǒng)的壓力在1-2巴之間變化。
為了再生樹脂，通過在40℃用水/異丙醇(體積比為4∶6)混合物以16.5毫升/分鐘的流速洗脫，把剩余兒茶素解吸。這種級分還可用于解吸的兒茶素的進(jìn)一步純化或分離。
表11比較了在洗脫液和原料中的各茶葉組分的濃度，由此表明了通過EGCG相對百分比表示的分離效果。原料和主要級分中各茶葉組分的濃度是通過使用UV吸收的HPLC測定的，并以重量％或ppm表示。
表11在Amberlite XAD-7上的分離，40℃，溶劑體系水/異丙醇
實(shí)施例9使用有機(jī)溶劑通過Polyamide 11分離EGCG
使用含有如表12所示量的兒茶素和咖啡因的市售綠茶提取物(“綠茶提取物，最少含有95％多元酚”，批號#960328，貴州海音生物制品公司，貴陽，中國出產(chǎn))作為原料。通過使用UV吸收的HPLC來測定各茶葉組分的濃度。
表12原料中各茶葉組分的濃度
將250g粒徑為5-40微米的市售Polyamide 11(商品目類號(Cat.No.)1.07435.0100，Merck，Darmstadt，德國)懸浮在300ml乙酸乙酯中，并轉(zhuǎn)移到內(nèi)直徑為5cm、長36cm的柱中。給該柱裝配上加熱夾套，并在40℃恒溫。將特征如表12所述的含有1.11g純EGCG的3g上述綠茶提取物溶于153ml乙酸乙酯，并加載到該柱頂部。在0.3巴壓力下用乙酸乙酯/乙醇梯度洗脫液(500ml乙酸乙酯，1000ml乙酸乙酯/乙醇(體積比為8.5∶1.5)，1000ml乙酸乙酯/乙醇(體積比為7∶3)，2000ml乙酸乙酯/乙醇(體積比為1∶1))進(jìn)行洗脫，獲得了550ml主要級分，將溶劑蒸發(fā)后獲得了含有0.87gEGCG作為主要兒茶素組分的1.12g固體。EGCG在主要洗脫液中的濃度為0.186％?；诓枞~提取物原料中存在的1.106gEGCG計(jì)算的EGCG的分離產(chǎn)率為76％。
為了再生樹脂，用500ml乙醇進(jìn)行洗脫將剩余兒茶素解吸。在下一分離前，用500ml乙酸乙酯平衡該柱。
表13說明了分離效果。主要洗脫液中各茶葉組分的濃度是通過使用UV吸收的HPLC來測定的。
表13主要洗脫液殘余物(溶劑蒸發(fā)后)中各茶葉組分的濃度
實(shí)施例10使用含水溶劑混合物通過Polyamide 11分離EGCG使用含有如表14所示量的兒茶素和咖啡因的綠茶提取物水溶液作為原料。通過使用UV吸收的HPLC來測定各茶葉組分的濃度，并以重量％表示。
表14用作原料的茶葉提取物溶液的殘余物(將溶劑蒸發(fā)后)中各茶葉組分的濃度
將25g粒徑為5-40微米的Polyamide 11(商品目錄號(Cat.No.)1.07435.0100，Merck，Darmstadt，德國)懸浮在100ml水中，并將pH調(diào)節(jié)至6.5。將該懸浮液轉(zhuǎn)移到內(nèi)直徑為3cm、長8cm的柱中。把含有0.078g純EGCG的10ml上述綠茶提取物(表14)加載到該柱頂部。用水/乙醇梯度洗脫液(500ml水，600ml水/乙醇(體積比為7∶3)，350ml水/乙醇(體積比為6∶4)，500ml水/乙醇(體積比為1∶1))以5毫升/分鐘的流速進(jìn)行洗脫，獲得了110ml(0.072g)含有0.046gEGCG的主要級分。EGCG在主要洗脫液中的濃度為0.06％。基于茶葉提取物中的0.078gEGCG計(jì)算的EGCG的分離產(chǎn)率為59％。
為了再生樹脂，用500ml乙醇進(jìn)行洗脫將剩余兒茶素解吸。在下一分離前，用500ml水平衡該柱。
表15說明了分離效果。主要洗脫液中各茶葉組分的濃度是通過使用UV吸收的HPLC來測定的。
表15主要級分的殘余物(將溶劑蒸發(fā)后)中各茶葉組分的濃度
實(shí)施例11用Amberlite XAD-7分離EGCG，溶劑體系水/乙醇將416ml平均粒徑為0.3-1.2mm的Amberlite XAD-7填充到由玻璃制成的、內(nèi)直徑為2.5cm且長為100cm的實(shí)驗(yàn)室用色譜柱中(ECO25/999 M3V-K，來自Stagroma AG，Wallisellen，Switzerland)。將該色譜柱裝配上加熱套，并在60℃恒溫。洗滌樹脂，并用水/乙醇混合物(體積比為9∶1)平衡。
使用含有如表16所示量的兒茶素和咖啡因的市售綠茶提取物(“茶多酚TP-80”，浙江中科植物技術(shù)有限公司(Zhejang Zhongke PlantTechnical Co.Ltd.)，杭州，浙江，中國生產(chǎn))作為原料。
通過使用UV吸收的HPLC來測定各茶葉組分的濃度，并以重量％表示。
表16原料中各茶葉組分的濃度
將11.2g如表16所示的含有4.5g純EGCG的綠茶提取物原料溶于112.5ml去離子水中，并加載到色譜柱頂部。在60℃柱溫下，用水/乙醇(體積比為9∶1)混合物以0.6升/小時(shí)的恒定流速將兒茶素洗脫。在使用前，將洗脫液脫氣并保持在氮?dú)夥障隆?br> 1.21的起始洗脫液之后，將洗脫液組成變?yōu)轶w積比為8∶2的水/乙醇。用總共1.51洗脫液洗脫后，獲得了含有2.115gEGCG的900ml主要級分。EGCG在主要級分中的濃度為0.245％。從茶葉提取物中4.5gEGCG開始分離EGCG的產(chǎn)率為47％。在實(shí)驗(yàn)期間，系統(tǒng)的壓力在0.8-1.5巴之間變化。
為了再生樹脂，用體積比為4∶6的水/乙醇混合物繼續(xù)進(jìn)行洗脫，由此乙醇將剩余兒茶素解吸。在下一分離前，將該色譜柱用體積比為9∶1的水/乙醇平衡。
表17說明了分離效果。主要級分的殘余物(將溶劑蒸發(fā)后)中各茶葉組分的濃度是通過使用UV吸收的HPLC來測定的，并以重量％表示。
表17主要級分的殘余物(將溶劑蒸發(fā)后)中各茶葉組分的濃度
權(quán)利要求
1．一種制備表?xiàng)攦翰杷貨]食子酸酯(EGCG)的方法，所述方法包括下述步驟a)提供綠茶提取物；b)在約10℃-約80℃，用吸附或色譜法中常用的大孔極性樹脂將綠茶提取物進(jìn)行色譜處理；c)在約10℃-約80℃以及約0.1巴-約50巴壓力下，用極性洗脫溶劑從所述大孔極性樹脂上洗脫EGCG；d)任選濃縮步驟c)的洗脫液；e)任選通過解吸剩余兒茶素來再生所述大孔極性樹脂；和f)任選濃縮步驟e)的解吸的兒茶素。
2．根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中所述大孔極性樹脂選自聚丙烯酸酯、聚甲基丙烯酸酯、聚酰胺和聚酯。
3．根據(jù)權(quán)利要求2的方法，其中所述聚丙烯酸酯樹脂是AMBERLITE_XAD-7。
4．根據(jù)權(quán)利要求2的方法，其中所述聚甲基丙烯酸酯樹脂是AMBERCHROM_CG-71。
5．根據(jù)權(quán)利要求2的方法，其中所述聚酰胺是Polyamide 11。
6．根據(jù)權(quán)利要求1-4任一項(xiàng)的方法，其中步驟b)和c)在約20℃-約60℃的溫度范圍內(nèi)進(jìn)行。
7．根據(jù)權(quán)利要求1-5任一項(xiàng)的方法，其中步驟c)在約0.1巴-約20巴、優(yōu)選約0.1巴-約10巴壓力下進(jìn)行。
8．根據(jù)權(quán)利要求1-6任一項(xiàng)的方法，其中所述極性洗脫溶劑是水與有機(jī)溶劑的混合物。
9．根據(jù)權(quán)利要求7的方法，其中所述洗脫溶劑是約70％-約95％體積、優(yōu)選約90％體積的水與約5％-約35％體積、優(yōu)選約10％體積有機(jī)溶劑的混合物。
10．根據(jù)權(quán)利要求7或8的方法，其中所述有機(jī)溶劑是乙醇、異丙醇、乙酸乙酯或丙酮。
11．根據(jù)權(quán)利要求1-9任一項(xiàng)的方法，其中所述洗脫溶劑的流速為約0.5-約20柱床體積/小時(shí)、優(yōu)選為約0.5-約10柱床體積/小時(shí)、更優(yōu)選為約0.8-約5柱床體積/小時(shí)。
12．根據(jù)權(quán)利要求1-10任一項(xiàng)的方法，其中步驟d)通過加入檸檬酸、抗壞血酸或異抗壞血酸而進(jìn)行。
13．根據(jù)權(quán)利要求11的方法，其中相對于EGCG而言，所述酸的加入量為約0.1％-約2.5％。
14．根據(jù)權(quán)利要求1-12任一項(xiàng)的方法，其中步驟e)通過使用純有機(jī)溶劑，或者約10％-約60％體積水與約40％-約90％體積有機(jī)溶劑的混合物，優(yōu)選約40％體積水和約60％體積有機(jī)溶劑的混合物進(jìn)行。
15．與上述方法基本上相同、尤其是參照實(shí)施例的新方法。
全文摘要
通過下述方法制備表?xiàng)攦翰杷貨]食子酸酯(EGCC);用大孔極性樹脂將綠茶提取物進(jìn)行色譜處理;用極性洗脫溶劑將EGCG洗脫;任選通過將剩余兒茶素解吸來再生樹脂;任選將解吸的兒茶素濃縮。
文檔編號A61K36/82GK1286252SQ0012269
公開日2001年3月7日 申請日期2000年8月16日 優(yōu)先權(quán)日1999年8月16日
發(fā)明者D·C·伯迪克, H·艾格, A·G·岡姆, I·考斯琴司基, E·穆爾齊, I·普萊沃特－霍爾特 申請人:弗·哈夫曼-拉羅切有限公司