專利名稱：一種抗腫瘤的雙二羧酸二氨絡鉑衍生物及其藥物組合物的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及一種新穎的抗腫瘤鉑類衍生物，特別是涉及一種新穎的抗腫瘤的雙二羧酸二氨絡鉑衍生物；本發(fā)明還涉及所述的雙二羧酸二氨絡鉑衍生物的制備方法及含有所述雙二羧酸二氨絡鉑衍生物的藥物組合物；本發(fā)明還進一步涉及所述的雙二羧酸二氨絡鉑衍生物在制備抗腫瘤藥物中的應用。
自1969年B.Rosenber發(fā)現(xiàn)順式二氯二氨鉑具有抗腫瘤以來，順鉑(Cisplatin)作為鉑類抗癌藥已廣泛用于臨床，對于泌尿生殖癌、鼻咽癌、頭頸癌、肺癌等多種癌癥療效顯著，但毒副作用嚴重。腎毒、神經(jīng)毒、耳毒、惡心、嘔吐等不良反應限制了藥劑量和長期用藥。作為第二代鉑類抗癌藥的卡鉑(Carboplatin，又名碳鉑)其抗癌譜與順鉑相似，藥效略遜于順鉑，并有交叉抗藥性，毒副作用雖然明顯低于順鉑，但骨髓抑制依然存在，且其在水中穩(wěn)定性較差。因此尋找高效、低毒、廣譜的鉑類抗癌藥劑的研究一直十分活躍。
據(jù)報道，近年來已有多種新鉑類抗癌藥物進入臨床試驗，如異丙鉑(Isoplatin)、草酸鉑(Oxaliplatin)、奧馬鉑(Ormajplatin)、樂巴鉑(Lobapatin)、恩絡鉑(Enloplatin)、增尼鉑(Zeninplatin)，以及L-NDOP,DWA-2114A,CI-973等。這些新鉑類化合物雖然多數(shù)與順鉑無交叉抗藥性，但抗腫瘤株大致與順鉑相同，無更廣的抗癌譜，水中穩(wěn)定性亦較差。在毒性方面多數(shù)低于順鉑，有些仍表現(xiàn)出明顯的腎毒、神經(jīng)毒及骨髓抑制。因此，均未進入臨床應用。至于口服有效的鉑類抗癌藥物，至今尚未見報道。一類更有效、更低毒且在水中穩(wěn)定的鉑類藥物是人們所需求的。
本發(fā)明者對鉑類化合物進行了深入細致的研究，出人意料地發(fā)現(xiàn)，雙二羧酸二氨絡鉑衍生物能夠克服上述缺陷，具有高效、低毒且在水中穩(wěn)定的性能，從而實現(xiàn)本發(fā)明。
因此，本發(fā)明的首要目的是提供一種能克服上述現(xiàn)有技術缺陷的新穎的抗腫瘤的雙二羧酸二氨絡鉑衍生物；本發(fā)明的另一目的是提供一種用于制備雙二羧酸二氨絡鉑衍生物的方法；本發(fā)明的再一目的是提供一種含有作為活性組分的所述雙二羧酸二氨絡鉑衍生物的抗腫瘤的藥物組合物本發(fā)明的進一步的目的是提供所述雙二羧酸二氨絡鉑衍生物在制備抗腫瘤藥物中的應用。
本發(fā)明涉及一種抗腫瘤的雙二羧酸二氨絡鉑衍生物，其特征在于，它具有下式(Ⅰ) 式中R1和R2可相同或不同，其獨自表示氫、C1-12烴基、鹵素、氨基、氰基、羥基、羧基、酰基、磷?；蛄柞０被?，或者R1與R2相互連接并與它們相連的碳原子一起形成含碳原子的3-12元飽和或不飽和的碳環(huán)。
優(yōu)選的是，所述的R1與R2相互連接并與它們相連的碳原子一起形成含碳原子的3-6元的飽和碳環(huán)。
更優(yōu)選的是，所述的雙二羧酸二氨絡鉑衍生物為雙1,1-環(huán)丙烷二羧酸二氨絡鉑或雙1,1-環(huán)丁烷二羧酸二氨絡鉑化合物。
最優(yōu)選的是，本發(fā)明提供下述式(Ⅱ)的雙1,1-環(huán)丁烷二羧酸二氨絡鉑化合物(下文中稱作雙環(huán)鉑) 本發(fā)明還涉及用于制備雙二羧酸二氨絡鉑衍生物的方法，其特征在于，所述的衍生物具有下式(Ⅰ) 式中R1和R2可相同或不同，其獨自表示氫、C1-12烴基、鹵素、氨基、氰基、羥基、羧基、?；⒘柞；蛄柞０被?；或者R1與R2相互連接并與它們相連的碳原子一起形成含碳原子的3-12元飽和或不飽和的碳環(huán)，該方法為1)將卡鉑或卡鉑類物質與下式(Ⅲ)的二羧酸配體衍生物 式中R1和R2的定義如上述式(Ⅰ)中所述生成式(Ⅰ)的雙二羧酸二氨絡鉑衍生物；或
2)將式為(NH3)2PtX2的二鹵二氨鉑式中X為Cl或I與硝酸銀或硫酸銀于水溶液中反應生成式為(NH3)2Pt(H2O)2(NO3)2的水合二氨鉑硝酸鹽；將生成的水合二氨鉑硝酸鹽與下式(Ⅲ)的二羧酸配體衍生物或其鈉鹽或鋇鹽反應， 式中R1和R2的定義如上述式(Ⅰ)中所述生成式(Ⅰ)的雙二羧酸二氨絡鉑衍生物。
制備式(Ⅰ)雙二羧酸二氨絡鉑時，其各步反應溫度都可以在相對寬的范圍內進行。通常，反應是在0℃至100℃，優(yōu)選在10℃至50℃間的溫度下進行。各步的反應時間一般為2-16小時。
本發(fā)明的方法通常是在常壓下進行的。然而，本發(fā)明方法也可以在加壓或減壓下——通常是在0.1巴至10巴間的壓力下進行。
進行本發(fā)明方法時，通常采用大致等摩爾量的起始原料。然而，也可以采用使起始原料之一相對大量地過量。
起始原料二鹵二氨鉑和二羧酸配體衍生物是已知物質，其可以用已知方法制備。
另外，本發(fā)明還涉及一種抗腫瘤的藥物組合物，其特征在于，該組合物中含有作為活性組分的0.1-5wt％濃度的至少一種式(Ⅰ)的雙二羧酸二氨絡鉑衍生物及藥物上可接受的載體。
按照本發(fā)明所述的藥物組合物，優(yōu)選的是，作為活性組分的式(Ⅰ)的雙二羧酸二氨絡鉑衍生物為在式(Ⅰ)中所述R1與R2相互連接并與它們相連碳原子一起形成含碳原子的3-6元的飽和碳環(huán)的那些式(Ⅰ)的雙二羧酸二氨絡鉑衍生物，較優(yōu)選的為雙1,1-環(huán)丙烷二羧酸二氨絡鉑或式(Ⅱ)的雙1,1-環(huán)丁烷二羧酸二氨絡鉑化合物，最優(yōu)選的是式(Ⅱ)的雙1,1-環(huán)丁烷二羧酸二氨絡鉑化合物。
本發(fā)明所述的抗腫瘤藥物組合物的制備是比較簡單的，只要將式(Ⅰ)的雙二羧酸二氨絡鉑衍生物與可藥用載體混合即可，該藥物組合物可以以針劑或膠囊的形式給藥。
所述的可藥用的載體可包括純凈水、醫(yī)用淀粉和維生素C。其中可用純凈水將藥物制成針劑，可以皮下、腹腔、靜脈注射；可用醫(yī)用淀粉和維生素C將藥物制成口服膠囊。
本發(fā)明所述的藥物組合物，如雙環(huán)鉑腹腔注射用時其LD50為283mg/kg，靜脈注射用時其LD50=50.46±0.93mg/kg，口服用時其LD50為500mg/kg；雙1,1-環(huán)丙烷二羧酸二氨絡鉑的注射用時其LD50為180mg/kg。
本發(fā)明所述的藥物組合物的給藥劑量一般為其LD50量的一半。
本發(fā)明還進一步涉及所述式(Ⅰ)的雙二羧酸二氨鉑衍生物在制備抗腫瘤藥物中的應用。
對式(Ⅰ)的雙環(huán)烷二羧酸二氨絡鉑化合物，例如式(Ⅱ)的雙1,1-環(huán)丁烷二羧酸二氨絡鉑進行過多次急毒、藥效實驗并做了長達數(shù)年臨床檢驗，結果如下進行裸鼠的靜脈注射、腹腔注射和口服的急毒實驗。急性毒性限量實驗表明，毒性低，LD50(靜注)=50.46±0.93mg/Kg、LD50(腹腔注射)=283mg/Kg和LD50(口服)=500mg/Kg。
中國醫(yī)學科學院腫瘤醫(yī)院、腫瘤研究所對雙環(huán)鉑做了與治療作用有關的藥效實驗。雙環(huán)鉑對人肝癌細胞BEL-7402 IC50=1.3μg/ml(注將此癌細胞殺死一半需雙環(huán)鉑1.3μg/ml)；對人乳腺癌細胞IC50=2.8μg/ml，并對人乳腺癌、肺癌、肝癌、大腸癌和卵巢及雙環(huán)鉑做裸鼠接種抑瘤率實驗，腹腔注射給藥，分大劑量(LD50×1/5)、中劑量(LD50×1/10)和小劑量(LD50×1/20)組，抑瘤率分別為90％、95％和70％。灌胃方式用上述同樣劑量給藥，抑瘤率略低。北京市藥檢所對人肝癌H22裸鼠接種抑瘤率實驗，靜脈注射給藥，分大劑量(LD50×1/5)、中劑量(LD50×1/10_)和小劑量(LD50×1/20)，與環(huán)磷酰胺進行藥效對照。雙環(huán)鉑大、中、小劑量用量0.2ml/次，每日一次，連續(xù)注射7次，接種荷瘤裸鼠30天處死。大、中、小劑量雙環(huán)鉑抑瘤率分別為50.85％、57.40％和35.20％，裸鼠生活正常，飲食正常，每組10只裸鼠無一死亡。而環(huán)磷酰胺組按其LD50最小劑量給藥僅2次，抑制率達73.15％，但大部分裸鼠近于死亡。
用兔子對雙環(huán)鉑做靜脈注射藥代動力學實驗，用小鼠對雙環(huán)鉑做口服藥代動力學實驗。按時間測定動物血清中鉑的含量，45-60分鐘藥物在血液中達到高峰，24小時在血液中含量趨于0。
大鼠口服雙環(huán)鉑三個月的長期毒性實驗為評價雙環(huán)鉑的安全性，觀察連續(xù)給藥三個月后對機體主要反應及其嚴重程度提供毒性反靶器官及其損害的可逆性，確定無毒反應劑量，為擬定人用安全劑量提供參考。
本藥對內臟的損傷呈量效關系，在治療量給藥下，停藥1個月后，病狀減輕。小劑量組影響不大，并可恢復正常。
離體細胞抑瘤實驗1、雙環(huán)鉑對體外培養(yǎng)的人肝癌BEL-7402細胞的生長抑制作用通過對人肝癌BEL-7402細胞在用雙環(huán)鉑處理后的動態(tài)生長情況的觀察，結果發(fā)現(xiàn)在雙環(huán)鉑處理后2天，10μg/ml及20μg/ml雙環(huán)鉑組與對照組的細胞數(shù)差別不大，從用藥3天開始，用藥組存活細胞數(shù)開始明顯少于對照組，對照組呈對數(shù)生長，而雙環(huán)鉑處理組細胞數(shù)漸趨下降，隨時間推移，各組間差別越明顯，且20μg/ml對雙環(huán)鉑組存活細胞數(shù)低于10μg/ml雙環(huán)鉑組。以上結果表明雙環(huán)鉑對體外培養(yǎng)的人肝BEL-7402細胞具有明顯的生長抑制作用，并顯示劑量時效應關系(參見圖4)。
2、雙環(huán)鉑在一定的劑量范圍內具有選擇性殺死癌細胞的功能而對正常細胞不傷害。
南京大學生命科學院用雙環(huán)鉑對人體正常纖維、表皮細胞和肺癌細胞、黑色素瘤進行實驗，實驗證明人體正常的纖維細胞和表皮細胞未受傷害，肺癌細胞和黑色素細胞被殺害50％和80％(見圖5)。
3、雙環(huán)鉑對人肝癌BEL-7402細胞超微結構影響將BEL-7402細胞用不同劑量的雙環(huán)鉑處理后，收集細胞、固定、包埋、切片，在透射電鏡下觀察細胞超微結構的改變。結果發(fā)現(xiàn)未受藥處肝癌細胞呈不規(guī)則多連形，細胞表面有豐富的微絨毛，胞漿內細胞器豐富，并含有數(shù)量不等的糖原顆粒。受雙環(huán)鉑處理的肝癌細胞，隨藥物濃度的增加，細胞呈現(xiàn)不同程度的退行性變，胞漿內大量空泡、脂滴增多，直到壞死性改變、核固縮、核碎裂、核溶解、細胞器完全崩解等(參見圖6-11)。
同時，我們對雙1,1-環(huán)丙烷二羧酸二氨絡鉑化合物也進行過多次毒性、藥效實驗，實驗表明，雙1,1-環(huán)丙烷二羧酸二氨絡鉑與式(Ⅱ)的雙環(huán)鉑化合物相比，其水溶性較差，毒性較高，但抗腫瘤性能更好。
下面通過一系列的具體試驗來說明本發(fā)明式(Ⅰ)的雙二羧酸二氨絡鉑衍生物作為活性組分的藥物的特性和優(yōu)點1、IC50值的測定a)取胃癌BGC-823細胞，培養(yǎng)于含15％小牛血清RPMJ-1640營養(yǎng)液中，接種于96孔培養(yǎng)板，1×104細胞/孔，置于37℃，5％CO2孵化箱中。用含15％小牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)液將1％雙環(huán)鉑水溶液稀釋至所需濃度，分別加入96孔板各孔中，每濃度3孔，6孔空白對照，培養(yǎng)72小時，加入MTT液，1小時后加DMSO顯色，酶標儀測OD值。計算各濃度藥物殺傷率，按坐標法求出IC50值。
表2 BGC-823細胞IC50=14.80±1.34μg/ml濃度μg/ml 20010050 25 12.5 6.25 3.13 1.56 0.78殺傷率％83.3 80.3 74.6 60.0 51.0 33.0 21.0 19.0 6.0b)應用上述試驗相同方法，測出雙環(huán)鉑對人口腔癌KB細胞的IC50值。
表3 KB細胞IC50=13.24±1.33μg/ml濃度μg/ml 200100 50 25 12.5 6.25 3.13 1.56 0.78殺傷率％93.3 93.0 77.1 66.6 36.7 26.2 28.2 14.8 5.92、具有明顯的抗腫瘤作用a)取40只體重21-22g昆明種小鼠，雌雄各半，隨機分成4組，每組10只。右腹皮下接種肝癌H22細胞懸浮液0.2ml/只。次日，取3組分別腹腔注射雙環(huán)鉑30mg、20mg、10mg/kg，每日一次，連續(xù)7天，對照組IP生理鹽水。于停藥后次日處死小鼠，稱體重、瘤重，計算抑瘤率。如表4所示，給藥組小鼠體重增加較少，但無一只死亡，雙環(huán)鉑對H22有明顯抗腫瘤作用。10mg g、20mg、30m/kg給藥抑瘤率分別為40.4％、67.0％、78.6％，且抑瘤作用強度與給藥劑量呈正相關。
表4 對肝癌H22抑瘤率級別 小鼠(只) 體重(g)瘤重(g)抑瘤率(％) P值前 后 前 后對照 10 10 21.4 30.6 1.59±0.4830mg/kg 10 10 21.6 22.4 0.34±0.09 78.6 ＜0.00120mg/kg 10 10 21.6 24.4 0.53±0.26 67.0 ＜0.00110mg/kg 10 10 21.8 27.9 0.95±0.29 40.4 ＜0.01
b)用與上述試驗相同方法測得雙環(huán)鉑對肉瘤S180抑瘤率示于表5。顯示雙環(huán)鉑對S180同樣具有明顯抑制作用，并呈劑量-效應關系。
表5對肉瘤S180抑瘤率級別 小鼠(只) 體重(g) 瘤重(g) 抑瘤率(％)P值前 后 前后對照 101021.2 29.0 1.7±0.5730mg/kg 101021.6 21.5 0.49+0.1671.0 ＜0.00120mg/kg 101021.6 18.1 0.54+0.1668.0 ＜0.00110mg/kg 101021.5 25.8 1.03±0.30 39.7 ＜0.01c)以10μg/ml、20μg/ml雙環(huán)鉑處理人肝癌BEL-7402細胞，觀察細胞動態(tài)生長情況8天，如圖4所示，兩天以內給藥組與對照組細胞數(shù)差別不大，第三天開始施藥組細胞數(shù)逐漸下降，而對照組癌細胞繼續(xù)呈對數(shù)生長。隨著時間增加，組間差別愈大。顯示雙環(huán)鉑對人肝癌BEL-7402細胞有明顯生長抑制作用，并顯示劑量-效應關系。
3、顯示極低的毒副作用，可選擇性殺死癌細胞，而不傷害正常細胞a)取50只體重在18-22g的昆明種小鼠，雌雄各半，隨機分成5組，每組10只。按400、280、196、137、96mg/kg分別IP給藥雙環(huán)鉑1次，連續(xù)觀察10天，記錄一般表現(xiàn)及死亡數(shù)。除高濃度給藥顯示局部刺激癥狀外，未見異常表現(xiàn)，一般死亡發(fā)生在3-7天。根據(jù)B1iss法求出LD50±SE=210.5+1.14mg/kg。明顯高于相同條件下測定的Cisplation和Carboplatin的LD50值，顯示雙環(huán)鉑的低毒性。
b)選取年齡、體重相近的兩只兔子(3.25kg、3.5kg)，分別靜脈注射100mg雙環(huán)鉑，定時抽取血樣，應用原子吸收光譜(AAS法)測血清樣品中鉑含量。數(shù)據(jù)如表6所示，注射后血液中藥物濃度很快達到最高，發(fā)揮藥效，然后隨時間遞降。12小時后濃度已經(jīng)很低，24小時趨于0，雙環(huán)鉑能夠快速代謝離開機體，故毒副作用很小。
表6兔子血清中鉑含量(μg/ml)時間(小時)兔子1(3.25kg)兔子2(3.5kg)0 34.658.00.5 20.521.81 10.420.32 6.2 10.84 2.4 4.26 1.9 2.88 1.7 2.3101.6 2.1120.9 2.2240 0c)以口服急性毒性試驗LD50500mg/kg為參考，按LD50/10給大鼠口服雙環(huán)鉑，用5％葡萄糖和0.9％氯化鈉(即糖鹽水)溶解，每天給藥一次，連續(xù)90天，進行長毒實驗。每周測體重一次，根據(jù)體重變化調整給藥劑量，服藥12周后停藥，再觀察2周，結果表明(1)大鼠未見死亡，飲食、活動、狀態(tài)無明顯異常。說明雙環(huán)鉑對大鼠無不良作用。
(2)在給藥12周及停藥2周后眼球采血檢測，紅白細胞數(shù)、血紅蛋白含量及分類、血小板均在正常范圍，組間無明顯差異(P＞0.05)；尿素氮(BUN)、谷丙轉氨酶(GPT)、谷草轉氨酶(GOT)三項指標，給藥與對照組間無顯著差異(P＞0.05)。
(3)觀察結束后處死大鼠，測定主要臟器系數(shù)，給藥組肝臟重量略高于空白對照組，但仍在正常值范圍。其它臟器系數(shù)值均未見異常。
(4)對大鼠心、肝、脾、肺、腎、胃、十二指腸、卵巢、睪丸、前列腺、腎上腺、甲狀腺等進行組織檢查，給藥組肝、脾有不同程度充血，水腫，其它臟器未見有藥物引起的器質性病變。
d)用雙環(huán)鉑處理人體正常纖維細胞、表皮細胞、肺癌細胞和黑色素瘤細胞，實驗結果示于圖5，在一定劑量范圍內，正常纖維細胞和表皮細胞未受傷害，而肺癌細胞和黑色素瘤細胞分別被殺死50％和80％，顯示雙環(huán)鉑可選擇性殺死癌細胞而正常細胞無傷害。
e)人肝癌BEL-7402細胞用雙環(huán)鉑處理后，透視電鏡下觀察細胞超微結構的變化。未經(jīng)藥物處理的肝癌細胞呈不規(guī)則多邊形，表面有豐富的微絨毛，胞漿內細胞器豐滿，并含有數(shù)量不等的糖原顆粒(圖6,7)。經(jīng)雙環(huán)鉑處理的肝癌細胞呈現(xiàn)不同程度的退行性改變，胞漿內出現(xiàn)大量空泡(圖8)，脂滴增多(圖9)，直到壞死性改變，核固縮、核碎裂、核溶解，細胞器完全崩解(

圖10,11),5天后死亡。
抗癌新藥雙環(huán)鉑口服膠囊和針劑臨床典型病例1．雙環(huán)鉑和輔料組成的口服膠囊，患者口服膠囊含雙環(huán)鉑20-30mg。
痊愈病例朱某，男，64歲，膀胱癌。發(fā)現(xiàn)血尿激光治部復發(fā)三次后，開始服用雙環(huán)鉑，原3塊2×2cm2大小腫塊完全消失。兩腎、膀胱未見異常。
王某，女，65歲，肝癌，晚期，病危。此后開始服用雙環(huán)鉑，并靜脈注射AT素30mg后，肝左右瘤4.7×3.1cm，用藥45天后，縮小到2.3×1.7cm。腫瘤消失，病治愈，生活正常。
2．雙環(huán)鉑水針劑，5ml安瓿，雙環(huán)鉑含量1％，隔日靜注1次，每次2支。雙環(huán)鉑水劑溶于100ml 5％葡萄糖0.9％氯化鈉注射液。滴畢后再用100ml氯化鈉注射液沖滴，6次(12安瓿)為一個療程。隔兩周后，進行第二療程治療。連續(xù)治療3個療程后，進行全面檢查。
馬某，男，83歲，復發(fā)肝癌晚期轉肺。此后開始服用雙環(huán)鉑膠囊每日四次，每次4-6粒，服用二個月后肺轉移癌腫瘤由2×2cm到消失。骨轉移癌腫瘤由18×14cm縮小為14×11cm，肝癌原發(fā)病灶邊緣較前光滑并略有縮小。
治療期間同時還輸用雙環(huán)鉑針劑，2支/次，隔日一次，共計用藥幾個療程60支。病人精神狀態(tài)及食欲良好，體重由59Kg增至61Kg，血象治療前后對比變化不大，治療效果良好。
徐某，男，59歲，鼻咽癌低分化鱗癌，放療十年后復發(fā)，鼻咽癌晚期，淋巴轉移。復發(fā)時已產(chǎn)生8×8cm腫塊壓迫氣管食道，呼吸，吞咽困難，需切開支氣管用呼吸機。曾相繼出現(xiàn)三次心臟停跳，血壓降至30/50mmHg。后來，開始隔日注射雙環(huán)鉑針劑，2支/次50天內共注射50支，休息一周后繼續(xù)注射，總計用量為74支，患者情況逐日好轉，并出院，出院時血色素8.0克，白血球3000，均于正常。B超查顯示，腫塊15×10mm2，9×8mm2，6×5mm2注射前后無惡心、嘔吐等其他抗癌藥常見反應。
楊某，男，45歲，黑色素瘤，肝肺轉移，注射36針雙環(huán)鉑針劑后，上海腫瘤醫(yī)院各種放、化療無效后，使用安托可金針劑，轉移瘤、肝肺癌已治愈，黑色素瘤已壞死。
李某，男，49歲，原發(fā)性肝癌，腫瘤體積3.3×3.3cm左右膽管轉移門脈癌栓黃膽。用雙環(huán)鉑針劑三個療程36支，第一個療程左肝葉腫瘤體積縮小為3.3×3.3cm，第二療程左肝葉腫瘤基本消失，右膽管僅擴張0.8cm，門脈癌栓消失。第三療程病性穩(wěn)定，病人精神狀態(tài)及食欲良好，血象治療前后變化不大。周期性發(fā)燒達10小時左右有時病區(qū)有陣痛。
孟某，男，48歲，經(jīng)301醫(yī)院診斷為肺腺癌晚期屬Ⅳ期，注射雙環(huán)鉑針劑，同時口服雙環(huán)鉑膠囊，咳嗽、喘、痰等癥狀全都消失，已基本治愈。
某國外患者，男，60歲，俄羅斯及中國醫(yī)科院腫瘤醫(yī)院和空軍總醫(yī)院確診為腸癌肝轉移，并出現(xiàn)黃膽，俄羅斯手術后醫(yī)生建議到中國救診，經(jīng)推薦注射雙環(huán)鉑針劑36針，同時口服雙環(huán)鉑膠囊36粒，肝轉移消失，現(xiàn)已基本治愈。
從以上大量科學實驗，從離體細胞實驗，臨床(口服和針劑注射兩種途徑)結果，急毒、長期毒性以及對正常細胞的實驗結論均證明式(Ⅰ)所示的雙二羧酸二氨絡鉑衍生物(特別是雙環(huán)鉑和雙1,1-環(huán)丙烷二羧酸二氨絡鉑)是一代安全有效的抗癌新藥，為人類攻克癌癥帶來了新的希望。
下面對附圖進行簡要說明圖1為雙環(huán)鉑的紅外光譜圖；圖2A為雙環(huán)鉑的1H-NMR譜圖；圖2B和2C為雙環(huán)鉑的負離子ESI-MS(電噴霧質譜)圖；圖3為雙環(huán)鉑的X-光四元衍射晶胞堆積圖；圖4為雙環(huán)鉑的人肝癌BEL-7402細胞生長曲線圖；圖5為雙環(huán)鉑的選擇性殺癌細胞曲線圖；圖6為空白對照的BEL-7402細胞(EM×10000)；圖7為空白對照的BEL-7402細胞(EM×6000)；圖8為BEL-7402細胞空泡變樣(EM×12000)；圖9為BEL-7402細胞脂肪變性(EM×12000)；圖10為BEL-7402細胞核碎裂(EM×6000)；圖11為BEL-7402細胞核碎裂(EM×8000)。
圖1中主要峰的解釋與歸屬3291cm-1為Pt←NH3的伸縮振動峰；2539-2992cm-1緩慢小丘形升高的峰，表明雙環(huán)鉑中存在羧酸-COOH基團，而不是羧酸鹽的-COO-基團；1716、1704cm-1的強峰為雙環(huán)鉑中羧酸基團中-C=0伸縮振動峰；1608、1566cm-1強峰為分子中-COO-Pt中的C=0伸縮振動峰；1400cm-1的強吸收峰為-C=0的變角振動吸收峰；697～1317cm-1指紋區(qū)的峰，不一一解釋。
上述紅外光譜數(shù)據(jù)是對1,1-環(huán)丁基二羧基二氨絡鉑(Ⅱ)(簡稱雙環(huán)鉑)的指紋表征。
圖2A中雙環(huán)鉑的1H-NMR分析說明如下δPPm 峰形 JHz H數(shù) 質子基團解釋1.64 5重峰 7.5 2結構(Ⅱ)右四元環(huán)3位CH2中2個磁等價的H1.84 5重峰 7.5 2結構(Ⅱ)左四元環(huán)3位CH2中2個磁等價的H2.36 3重峰 7.5 4結構(Ⅱ)右四元環(huán)2,4位2個CH2中4個磁等價H2.49 多重峰 --溶劑DMSO中未氘氧化的H2.65 3重峰 7.5 4結構(Ⅱ)右四元環(huán)2,4位2個CH2中4個磁等價的H3.28 單峰 --溶劑DMSO中微量H2O4.06 單峰 -6結構(Ⅱ)中Pt上兩個NH36個磁等價H12.61 單峰 -2*結構(Ⅱ)中兩個-COOH磁等價H從上述分析數(shù)據(jù)與雙環(huán)鉑(Ⅱ)所示結構完全符合。
雙環(huán)鉑分子重515.36。
圖2B清楚的給出M-1準分子離子峰m/2514。
在圖2C中所有峰所代表的碎片，依據(jù)有機化合物結構是合理的。
圖4中“●”表示對照組，“◆”表示10μg/ml，“×”表示20μg/ml。
圖5中“○”表示正常人的纖維細胞，“●”表示正常人的表皮細胞，“▲”表示人的黑色素瘤細胞，“口”表示人的肝癌細胞。
通過下述制備所述式(Ⅰ)衍生物和其藥物組合物的實施例可進一步說明本發(fā)明實施例1雙1,1-環(huán)丁烷二羧酸二氨絡鉑化合物的制備在反應瓶中加入卡鉑3.54g(10.0mmol)，加純水200ml，避光攪拌至全溶，攪拌下加入環(huán)丁烷二羧酸16.2g(10.0mmol)，攪拌、溶解、旋轉蒸發(fā)至干，加入乙醇50ml，攪拌2小時，過濾，10ml×3乙醇洗，蒸餾水重結晶，抽真空，自然干燥，得標題化合物。
實施例2雙1,1-環(huán)丙烷二羧酸二氨絡鉑化合物的制備在反應瓶中加入Ag2SO46.5g(20.8mmol)，加純水100ml，避光攪拌至全溶，攪拌下分批加入Cis-(NH3)2PtCl26.2g(20.7mmol)，40℃以下水浴攪拌反應5小時。趁熱過濾，以10ml×3溫水洗，濾液轉入反應瓶中，分批加入35％(H2O220ml(232.6mmol)，室溫攪拌反應4小時，升溫至60℃反應2小時。然后加入環(huán)丙二酸鋇12.0g(25.0mmol)，60℃攪拌反應8小時，趁熱過濾，以10ml×3溫水洗，濾液轉入反應瓶中，旋轉蒸發(fā)至干，加入乙醇50ml，攪拌2小時，過濾，10ml×3乙醇洗，蒸餾水重結晶，抽真空，自然干燥，得標題化合物。220℃分解。
實施例3雙1,1-環(huán)丁烷二羧酸二氨絡鉑化合物的制備10.5g(61.8mmol)AgNO3，加純水100ml，在反應瓶中攪拌至溶解，分批加入二氯二氨鉑9.3g(31.1mmol),40℃以下攪拌反應5小時。趁熱過濾，以10ml×3溫水洗，濾液轉入反應瓶中，分批(15ml+15ml×3)加入35％H2O230ml(349.0mmol)，室溫攪拌反應5小時，升溫至60℃反應2小時。然后加入環(huán)丁二酸12.0g(69.0mmol),60℃攪拌反應8小時，趁熱過濾，以10ml×3溫水洗，濾液轉入反應瓶中，旋轉蒸發(fā)至干，加入乙醇50ml，攪拌2小時，過濾，10ml×3乙醇洗，蒸餾水重結晶，抽真空，自然干燥，得標題化合物。
實施例4雙1,1-環(huán)丁烷二羧酸二氨絡鉑化合物的制備采用與實施例3相同的步驟，采用15.0g二碘二氨鉑代替9.3g二氯二氨鉑，得到標題化合物。
實施例5雙1,1-環(huán)戊烷二羧酸二氨絡鉑化合物的制備10.5g(61.8mmol)AgNO3，加純水100ml，在反應瓶中攪拌至溶解，分批加入二氯二氨鉑9.3g(31.1mmol),40℃以下攪拌反應5小時。趁熱過濾，以10ml×3溫水洗，濾液轉入反應瓶中，分批(15ml+15ml×3)加入35％H2O230ml(349.0mmol)，室溫攪拌反應5小時，升溫至60℃反應2小時。然后加入環(huán)戊酸鋇15.6g(53.0mmol),60℃攪拌反應8小時，趁熱過濾，以10ml×3溫水洗，濾液轉入反應瓶中，旋轉蒸發(fā)至干，加入乙醇50ml，攪拌2小時，過濾，10ml×3乙醇洗，蒸餾水重結晶，抽真空，自然干燥，得標題化合物。
實施例6雙1,1-環(huán)己烷二羧酸二氨絡鉑化合物的制備6.7g(39.4mmol)AgNO3，加純水100ml，在反應瓶中攪拌至溶解，分批加入二氯二氨鉑6.2g(19.6mmol)，40℃以下攪拌反應5小時。趁熱過濾，以10ml×3溫水洗，濾液轉入反應瓶中，分批加入35％H2O220ml(232.6mmol)，室溫攪拌反應5小時，升溫至60℃反應2小時。然后加入環(huán)己酸3.7g(21.5mmol)。45℃攪拌下，緩慢滴入水合肼1ml(10.3mmol)。2小時內滴完，再反應6小時，旋轉蒸發(fā)至干，真空脫水干燥5小時。加入甲醇50ml攪拌2小時，過濾，10ml×3甲醇洗，蒸餾水重結晶，抽真空干燥，得標題化合物。
實施例7雙1,1-環(huán)丁烷二羧酸二氨絡鉑的制備及精制12.4g二氯二氨鉑懸浮于800ml純水中，避光攪拌下加入化學計量的1N AgNO3溶液，40℃反應4小時。冰箱靜置過濾。過濾除去沉淀物(回收待用)。向濾液中加入化學計量的環(huán)丁烷二羧酸，60℃攪拌反應16小時，減壓旋轉蒸發(fā)至微晶出現(xiàn)，冰箱靜置48小時，過濾，收集晶體，得粗產(chǎn)品。粗品經(jīng)蒸餾水重結晶精制純化得精品收率90％，熔點182℃～184℃。
制劑實施例1注射劑50g雙環(huán)鉑溶解于5000ml純凈水中，7.5g醫(yī)用炭吸附過濾，用2um濾膜過濾二次，分裝于1000支5ml安瓿中，灼燒封口得注射劑。
制劑實施例2口服劑24g雙環(huán)鉑、1600g醫(yī)用淀粉和120g維生素C，在攪拌機中混合粉碎，消毒，分裝于5000?？诜z囊中，得口服制劑。
上述實施例1、3、4和7制備的式(Ⅱ)雙環(huán)鉑為無色針狀晶體，膠束應用中制成白色微晶粉末。通過熔點、溶解度、pH值測定，碳、氫、氮微量元素分析，ICP-EAS法鉑含量分析，差熱、熱失重分析，紅外光譜、紫外光譜、激光拉曼光譜、薄層色譜、1H、13C、195Pt核磁共振譜、X-四元衍射等多種現(xiàn)代物理、化學方法，對式(Ⅱ)雙環(huán)鉑的組成、結構、純度進行了充分地測試與研究。式(Ⅱ)的雙1,1-環(huán)丁烷二羧酸二氨絡鉑的IR、13C-NMR、TLC、X=ray單晶結構分析等譜圖實驗數(shù)據(jù)證實其為新型籠狀化合物，紅外光譜、1H-NMR、MS和X-四元衍射圖參見附圖1～3及下表1。
表1 X-光四元衍射測度結果單晶尺寸(mm) 0.2×0.2×0.3晶系 單斜空間群 P21/C晶胞參數(shù) a=5.679(2)Ab=12.107(2)Ac=23.430(5)Aβ=95.25(2)°體積 1604.3(7)A3密度 2.123Mg/m3吸收系數(shù) 8.876mm-1晶胞分子數(shù) 4本發(fā)明的新的式(Ⅰ)雙二羧酸二氨絡鉑衍生物具有出人意料地治療癌癥的效果。與現(xiàn)有鉑類抗癌藥相比，本發(fā)明式(Ⅰ)雙二羧酸二氨絡鉑衍生物的特點是該化合物通過分子內四個氫鍵形成了籠狀分子結構，將鉑原子鎖于籠中，使化合物有一定的穩(wěn)定性，又削弱了水分子的進攻，保證了水中的穩(wěn)定性。很好的克服了鉑系化合物毒性大、水中不穩(wěn)定的致命弱點，又很好地保留了其藥效顯著的優(yōu)點，使水溶性大為改善、水中穩(wěn)定，可以皮下、腹腔、靜脈注射及口服給藥。不但具有較高鉑類抗癌藥類的抗癌活性而且大大降低了其毒性。而且克服了其水中的不穩(wěn)定性。其顯著特點如下，以式(Ⅱ)的雙環(huán)鉑化合物為例1、抗癌活性高，如對乳腺癌細胞IC60卡 鉑 9.30μg/ml雙環(huán)鉑 2.80μg/ml
對肝癌細胞BL7402 IC50卡 鉑 8.45μg/ml雙環(huán)鉑 1.30μg/ml2、抗癌譜廣對泌生癌、頭頸癌、鼻咽癌、乳腺癌、肺癌、肝癌、胰腺癌、胃癌、腸癌、淋巴癌等均有顯著療效。
3、毒性低，LD50腹腔注射 順 鉑 13mg/Kg卡 鉑 130mg/Kg雙環(huán)鉑 283mg/Kg口服雙環(huán)鉑 500mg/Kg(順鉑和卡鉑口服無效)臨床試驗毒性反應為0度至1度(按WHO五度分類)，臨床患者無不良反應。
4．水溶性好，穩(wěn)定性好，水溶解度(g/100ml) 順 鉑 0.2卡 鉑 1.5雙環(huán)鉑 4.0順鉑和卡鉑溶解于水后一天失效，而式(Ⅱ)的雙環(huán)鉑化合物制成水劑可長期保存不失效。
5．口服有效，雙二羧酸二氨絡鉑衍生物不但注射有效，而且口服也有效。例如，以式(Ⅱ)的雙環(huán)鉑化合物為主劑，輔以可藥用的賦形劑制成的膠囊，經(jīng)過長期、大量臨床口服試用，療效顯著。
權利要求
1.一種雙二羧酸二氨絡鉑衍生物，其特征在于，它具有下式(Ⅰ) 式中R1和R2可相同或不同，其獨自表示氫、C1-12烴基、鹵素、氨基、氰基、羥基、羧基、?；?、磷酰基或磷酰氨基；或者R1與R2相互連接并與它們相連的碳原子一起形成含碳原子的3-12元飽和或不飽和的碳環(huán)。
2．根據(jù)權利要求1所述的雙二羧酸二氨絡鉑衍生物，其特征在于，所述的R1與R2相互連接并與它們相連的碳原子一起形成含碳原子的3-6元的飽和碳環(huán)。
3．根據(jù)權利要求2所述的雙二羧酸二氨絡鉑衍生物，其特征在于，其為雙1,1-環(huán)丙烷二羧酸二氨絡鉑或雙1,1-環(huán)丁烷二羧酸二氨絡鉑化合物。
4．根據(jù)權利要求3所述的雙二羧酸二氨絡鉑衍生物，其特征在于，其為下式(Ⅱ)的雙1,1-環(huán)丁烷二羧酸二氨絡鉑化合物
5．一種用于制備雙二羧酸二氨絡鉑衍生物的方法，其特征在于，所述的衍生物具有下式(Ⅰ) 式中R1和R2可相同或不同，其獨自表示氫、C1-12烴基、鹵素、氨基、氰基、羥基、羧基、酰基、磷酰基或磷酰氨基；或者R1和R2相互連接并與它們相連的碳原子一起形成含有碳原子的3-12元飽和或不飽和的碳環(huán)，該方法為1)將卡鉑或卡鉑類物質與下式(Ⅲ)的二羧酸配體衍生物反應 式中R1和R2的定義如上述式(Ⅰ)中所述生成式(Ⅰ)的雙二羧酸二氨絡鉑衍生物；或2)將式為(NH3)2PtX2的二鹵二氨鉑式中X為Cl或I與硝酸銀或硫酸銀于水溶液中反應生成式為(NH3)2Pt(H2O)2(NO3)2的水合二氨鉑硝酸鹽；將生成的水合二氨鉑硝酸鹽與下式(Ⅲ)的二羧酸配體衍生物或其鈉鹽或鋇鹽反應 (Ⅲ)式中R1和R2的定義如上述式(Ⅰ)中所述生成式(Ⅰ)的雙二羧酸二氨絡鉑衍生物。
6．一種抗腫瘤的藥物組合物，其特征在于，該組合物中含有0.1-0.5wt％濃度的至少一種權利要求1所述的式(Ⅰ)的雙二羧酸二氨絡鉑衍生物及藥物上可接受的載體。
7．根據(jù)權利要求6所述的藥物組合物，其特征在于，所述的式(Ⅰ)的雙二羧酸二氨絡鉑衍生物為在所述式(Ⅰ)中R1和R2相互連接并與它們相連的碳原子一起形成含碳原子的3-6元的飽和碳環(huán)的那些雙二羧酸二氨絡鉑衍生物。
8．根據(jù)權利要求7所述的藥物組合物，其特征在于，所述的式(Ⅰ)的雙二羧酸二氨絡鉑衍生物為雙1,1-環(huán)丙烷二羧酸二氨絡鉑或雙1,1-環(huán)丁烷二羧酸二氨絡鉑化合物。
9．根據(jù)要求8所述的藥物組合物，其特征在于，所述的式(Ⅰ)的雙二羧酸二氨絡鉑衍生物為雙1,1-環(huán)丁烷二羧酸二氨絡鉑化合物。
10．根據(jù)權利要求6-9任一項所述的藥物組合物，其特征在于，該藥物組合物以針劑或膠囊的形式給藥。
11．權利要求1所述式(Ⅰ)的雙二羧酸二氨絡鉑衍生物在制備抗腫瘤藥物中的應用。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種抗腫瘤的下式[Ⅰ]的雙二羧酸二氨絡鉑衍生物,式中:R
文檔編號A61P35/00GK1311183SQ0012486
公開日2001年9月5日 申請日期2000年9月20日 優(yōu)先權日2000年3月3日
發(fā)明者楊旭清, 楊振云, 尹應武, 崔維川, 楊金力, 王敬尊 申請人:楊旭清