專利名稱：來氟米特一種新適應(yīng)癥的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及免疫抑制調(diào)節(jié)劑，更具體地說免疫抑制及調(diào)節(jié)劑來氟米特在治療銀屑病藥物中應(yīng)用。
銀屑病(又稱牛皮癬)是一種常見的慢性皮膚病，其發(fā)病病因尚未闡明，銀屑病屬于紅斑鱗屑性皮膚病范圍，是一種容易復(fù)發(fā)的皮膚病，它的表皮生長細(xì)胞的細(xì)胞周期是100小時(shí)比正常細(xì)胞生長周期快2倍，可采用抗腫瘤藥物來抑制細(xì)胞核的有絲分裂，從而獲得治療效果。內(nèi)服藥主要為維生素D、E、C、及普魯卡因封閉等治療，病情嚴(yán)重者可酌情使用甲氨喋呤、氨基喋呤等。
外用療法按病情輕重而定，進(jìn)行期應(yīng)用溫和的藥物，例3％-5％硼酸軟膏，水楊酸軟膏，穩(wěn)定期或消退期可用濃度較高的外用藥，例如0.05％-0.1％維生素A酸軟膏；0.5-1％蒽林軟膏等，中醫(yī)療法主要采用活血化瘀、散風(fēng)軟堅(jiān)為治則，對銀屑病進(jìn)行了研究、發(fā)現(xiàn)免疫功能異常與銀屑病發(fā)病有關(guān)，證實(shí)白介素-1活化的T淋巴細(xì)胞及其分泌的細(xì)胞因子在銀屑病的損害中起重要作用，活動期病損皮膚的病理檢查發(fā)現(xiàn)基底細(xì)胞超出正常10倍的速度過度角化，大量的淋巴細(xì)胞浸潤，在銀屑病的角化上皮和血管內(nèi)皮各內(nèi)皮粘附因子(ICAM-1)表達(dá)明顯增加，ECAM-1和VCAM-1主要表達(dá)在真皮血管內(nèi)皮上，雖然科學(xué)家對銀屑病的病因、治療等方面進(jìn)行了大量研究，但目前對此病仍未能找到一種治療效果好，副作用小的藥物或其他治療方法。
本發(fā)明目的是以銀屑病發(fā)病與免疫系統(tǒng)有關(guān)，故從免疫抑制、調(diào)節(jié)劑中尋找出一種治療銀屑病效果好、副作用小的藥物。
來氟米特為一種新型免疫抑制及免疫調(diào)節(jié)劑，它的化學(xué)結(jié)構(gòu)如下 分子式C12H9F3N2O2化學(xué)命名為ααα三氟-5-甲基異噁-N-?；?對甲苯胺，它為白色薄膜衣片。
來氟米特口服吸收后于腸壁和肝臟內(nèi)迅速轉(zhuǎn)化為活性代謝物，它在體內(nèi)發(fā)揮所有主要的藥理作用，來氟米特在血漿中的濃度非常低，在最初來氟米特藥代動力學(xué)研究中，主要檢測活性代謝物的血漿濃度。它達(dá)峰時(shí)間在0.558±0.506天，半衰期8.79±0.77天。多劑量給藥(20mg，pd)連續(xù)30天，其活性代謝物血藥濃度接近穩(wěn)態(tài)。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)導(dǎo)，在臨床應(yīng)用中使用三天(100mg/天)負(fù)荷劑量可以快速達(dá)到穩(wěn)態(tài)濃度。來氟米特口服的生物利用度80％，高脂飲食對活性代謝物血漿濃度不會產(chǎn)生大的影響?；钚源x物于肝、腎和皮膚組織內(nèi)分布濃度較高，腦組織中含量低。游離濃度較低，并且廣泛和血漿蛋白結(jié)合(99.3％)，結(jié)合蛋白量在治療濃度時(shí)呈線性關(guān)系。來氟米特吸收后被代謝為主要活性代謝物及許多微量代謝物，這些微量代謝物中只有三氟甲基苯胺(TFMA)能被檢測，在血漿中很少測到母體化合物。目前不知道來氟米特代謝的確切臟器，但在體內(nèi)和體外試驗(yàn)中，發(fā)現(xiàn)肝臟和胃腸壁具有代謝作用。來氟米特初始代謝所需的酶也不清楚，但肝細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞的微粒體已經(jīng)被確定為是藥物代謝的部位?；钚源x物，從腎肝排泄以及直接從肝汁排泄。43％從尿中排泄，48％從糞便中排泄，樣品分析顯示最初在尿中的代謝物是葡萄糖苷酸和活性代謝物的苯胺羰酸衍生物，糞便的主要代謝物是活性代謝物。在兩個(gè)代謝途徑中，最初96小時(shí)主要是腎臟排泄，以后糞便排泄占主導(dǎo)地位。文獻(xiàn)報(bào)導(dǎo)，靜脈給藥研究中，清除率大約31ml/h。活性炭或消膽胺可促進(jìn)藥物代謝，使體內(nèi)代謝物的半衰期從大于1周減少到大約1天，腸肝循環(huán)是導(dǎo)致活性代謝物半衰期較長的主要因素。血液透析和腹膜透析研究表明活性代謝物是不可透析的。
來氟米特的藥理作用來氟米特通過活性代謝物在體內(nèi)發(fā)揮其免疫調(diào)節(jié)作用，作用機(jī)制包括以下幾方面抑制酪酸激酶的活性和細(xì)胞粘附來氟米特可抑制酪酸激酶的活性，而酪酸激酶是細(xì)胞生成和分裂中的信息傳導(dǎo)的關(guān)鍵酶。此外，來氟米特可明顯抑制激活的白細(xì)胞粘附到血管內(nèi)皮上，減緩炎細(xì)胞進(jìn)入關(guān)節(jié)，其作用機(jī)制尚不完全清楚，可能與影響粘附分子和細(xì)胞因子的信息傳導(dǎo)有關(guān)。因此，來氟米特可以逆轉(zhuǎn)已經(jīng)發(fā)生的排斥反應(yīng)而環(huán)孢酶素卻無此作用，這點(diǎn)已在動物試驗(yàn)中證實(shí)。
抑制嘧啶的從頭合成途徑來氟米特通過抑制二氫乳清酸脫氫酶(DHODH)的活性，阻斷嘧啶的從頭合成途徑。來氟米特對不同種類的細(xì)胞的抑制作用取決于該細(xì)胞利用補(bǔ)救途徑合成嘧啶的能力，依賴從頭合成途徑的細(xì)胞(增生活躍的細(xì)胞，如活化的淋巴細(xì)胞，骨髓結(jié)構(gòu)、肝細(xì)胞、上皮細(xì)胞等)是來氟米特作用的主要靶細(xì)胞。二氫乳清酸脫氫酶的活性被活性代謝物抑制，防止嘧啶的過度產(chǎn)生，使腫瘤抑制蛋白細(xì)胞翻譯轉(zhuǎn)錄中的一種因子(P53)增加，活化的P53可調(diào)節(jié)P21WAF-1的轉(zhuǎn)錄，抑制細(xì)胞周期依賴蛋白酶(cdk(cyclin-dependent-kinase))的活性，防止成視網(wǎng)膜細(xì)胞瘤蛋白(Rb(retinoblastoma protein))的高磷酸化合失活。Rb是轉(zhuǎn)錄因子E2F的負(fù)性調(diào)節(jié)劑，而E2F是S期特異性基因表達(dá)所必需的因子，從而影響DNA和RNA的合成，使活化的細(xì)胞休眠在細(xì)胞周期的DNA合成前期G1S靜止期交界處或S期?；钚源x物對細(xì)胞的抑制作用是可逆的，不會引起細(xì)胞凋亡。抑制作用解除后，休眠的細(xì)胞可以恢復(fù)正常，這種抑制作用可被外源性的嘧啶所逆轉(zhuǎn)。
抑制抗體(免疫球蛋白)的產(chǎn)生，來氟米特抑制嘧啶的合成，可以阻斷活化的B細(xì)胞增殖，從而減少抗體的生成；此外，來氟米特還可直接抑制抗體的分泌。 來氟米特可抑制非特異性免疫、體液免疫、細(xì)胞免疫、淋巴因子分泌、抑制淋巴細(xì)胞再生、局部結(jié)締組織增生、局部炎癥及關(guān)節(jié)炎全身反應(yīng)。來氟米特的活性代謝物對大鼠胸膜炎滲出液細(xì)胞分泌白三烯B4的產(chǎn)生有明顯抑制作用，對非特異性(刀豆蛋白A(Con-A)誘導(dǎo)的小鼠脾細(xì)胞)T輔助細(xì)胞(Th細(xì)胞)有明顯抑制作用，小鼠熱板法及輻射甩尾法試驗(yàn)顯示有明顯抗炎鎮(zhèn)痛作用。利用患先天性系統(tǒng)性紅斑狼瘡(SLE)MRL/lpr小鼠模型，來氟米特可抑制SLE的進(jìn)展，防止腎小球腎炎的發(fā)生，降低抗雙旋DNA抗體及類風(fēng)濕因子(RF)的水平。來氟米特能預(yù)防治療SLE及并發(fā)的腎小球腎炎，停藥后觀察，SLE及腎小球腎炎均無復(fù)發(fā)。在器官移植試驗(yàn)中來氟米特有效抑制大鼠、狗、猴等動物多種器官的急、慢性排異反應(yīng)，并克服了異種移植排異反應(yīng)，成功地延長了倉鼠至大鼠移植心臟存活時(shí)間。
來氟米特的毒理作用來氟米特小鼠單次灌胃或腹腔注射給藥，觀察14天測得LD50分別為258.9mg/kg及166.9mg/kg。SD大鼠6個(gè)月口服來氟米特(1.8、3.5、6.6mg/kg)長期毒性試驗(yàn)顯示高劑量組有厭食、體重減輕現(xiàn)象，雌性大鼠丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶(ALT)及天門冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶(AST)有增高現(xiàn)象，高劑量組中7只(23％)于給藥期死于感染。低、中劑量組無動物死亡。應(yīng)用移植模型，口服高劑量來氟米特20mg/kg及30mg/kg治療大鼠112天，顯示其靶器官為再生活躍的器官如骨髓、脾臟、小腸粘膜，以及免疫器官如胸腺及脾臟，與國外資料吻合。Lewis大鼠出現(xiàn)肝功能損害及骨髓抑制。Beagle狗6個(gè)月口服來氟米特(2、10、16、20mg/kg)長期毒性試驗(yàn)顯示，僅高劑量組使紅系細(xì)胞總數(shù)略下降及血球壓積降低。來氟米特的微生物回復(fù)突變試驗(yàn)，哺乳動物培養(yǎng)細(xì)胞染色體畸變試驗(yàn)，及嚙齒動物微核試驗(yàn)結(jié)果均無致突變作用。來氟米特于中、高劑量10、20mg/kg有致畸作用。
來氟米特是一個(gè)新型免疫抑制劑，對器官移植及自身免疫性疾病有較好的治療作用，來氟米特對T-淋巴細(xì)胞和白介素-1的作用進(jìn)行了多種試驗(yàn)，具體方法如下1、來氟米特對T-淋巴細(xì)胞和白介素-1的作用實(shí)驗(yàn)采用雌性，體重19-21克，ICR小鼠50只，隨機(jī)分為5組，即對照組、環(huán)磷酰胺組(120mg/kg)、來氟米特三個(gè)劑量組(2、9、45mg/kg)，每組10只。各組小鼠灌胃給藥5天，每鼠0.5ml每天一次，對照組給同容量的1％羧甲基纖維素鈉溶液。于給藥第三天，每鼠再腹腔注射0.25％淀粉液0.5ml，第五天給藥后4小時(shí)，每鼠腹腔注射5％雞紅細(xì)胞懸液0.5ml(無菌操作自雞翼靜脈采用，加5倍量阿氏液，4℃冰箱保存，使用前用無菌生理鹽水離心洗滌三次，配成5％雞紅細(xì)胞生理鹽水懸液)，間隔30分鐘，頸惟脫臼處死，經(jīng)腹腔注射Hank氏液2.5ml，經(jīng)輕揉按小鼠腹部，使Hank氏液充分涮洗腹腔巨噬細(xì)胞。
然后，吸取腹腔洗液，滴于二張載玻片上，放入墊有濕紗布的盒內(nèi)，于37℃孵育30分鐘，孵畢，于生理鹽水中漂洗，除去未貼片的細(xì)胞。涼干，甲醇固定，吉姆薩斯染劑(Giemsa Wright)染液染色，蒸餾水漂洗、涼干，用油鏡計(jì)數(shù)100個(gè)巨噬細(xì)胞，計(jì)算百分率和吞噬指數(shù)。
實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，來氟米特能明顯抑制小鼠腹腔巨噬細(xì)胞的吞噬功能，與對照組比較，中、高劑量組有顯著性差異。
2、來氟米特對小鼠的細(xì)胞免疫功能的影響采用雌、雄各半、體重23±1g質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)同上的ICR小鼠40只，隨機(jī)分為4組，來氟米特二個(gè)劑量組，口服環(huán)磷酰胺和溶媒作對照組。
將ICR小鼠隨機(jī)分為4組，雌雄各半，來氟米特二個(gè)劑量組(9、45mg/kg/d×5d)，口服給藥環(huán)磷酸胺(120mg/kg/d×5d)和溶媒對照組，各組每鼠每天腹腔注射0.2ml藥液，連續(xù)5天，處死小鼠，按常規(guī)3HTdR摻入法定量測定T淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化程度。
T淋巴細(xì)胞與植物凝素(PHA)一起體外培養(yǎng)時(shí)，可轉(zhuǎn)化成淋巴母細(xì)胞，并出現(xiàn)旺盛的分裂現(xiàn)象。細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)和核酸合成增加，以反映DNA合成速率的3H-胸腺嘧啶核苷(3HTdR)摻入值為指標(biāo)，可定量表示淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化程度，從而反映T淋巴細(xì)胞的免疫功能。從實(shí)驗(yàn)結(jié)果可見，來氟米特高低劑量組(9、45mg/kg/d×5d)的小鼠(3HTdR)摻入值明顯低于對照組(P＜0.05)，表明來氟米特對小鼠淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化功能有明顯的抑制作用，即抑制小鼠T細(xì)胞的免疫功能。
巨噬細(xì)胞產(chǎn)生白細(xì)胞介素1(IL-1)試驗(yàn)健康純系雌性小鼠80只，體重18-20g，米氟米特按不同劑量分成各組，脂多糖(LPS)和環(huán)磷酰胺作為對照組，將藥物用1640培養(yǎng)液(補(bǔ)上)在無菌條件下配制成不同濃度同等容量的溶液備用。
IL-1誘導(dǎo)產(chǎn)生在無菌操作室內(nèi)取純系小鼠70只，隨機(jī)分成以上七個(gè)試驗(yàn)組，每組10只，脫臼處死，用75％乙醇浸泡片刻，仰臥固定，剪開腹部表皮，注射5ml Hank氏液，挪動腹部，回收腹腔液，離心(500rpm×3min)棄去上清液，沉淀物加1640培養(yǎng)液至3ml，混均離心(2000rpm×10min)，計(jì)數(shù)Mφ，用10％小牛血清(FCS)細(xì)胞保存液(RPMI)1640培養(yǎng)液稀釋至2×106/ml細(xì)胞數(shù)。加入24孔培養(yǎng)板中(1ml孔)，置37℃5％CO2培養(yǎng)2小時(shí)，棄去非粘附細(xì)胞，獲Mφ單層，在Mφ單層中，加入不同濃度的受試物，每孔終容積為1ml，置37℃5％CO2培養(yǎng)48小時(shí)，收集上清液(4000rpm×8min)過濾，20℃保存。
胸腺細(xì)胞制備在無菌操作室內(nèi)另取純系小鼠10只，眼球放血致死，75％乙醇浸泡片刻，仰臥固定，取出胸腺，剝盡周圍組織，用撕碎法撕碎胸腺至10ml刻度離心管中，離心(500rpm×5分)棄去上清液，沉淀物(胸腺細(xì)胞)加少量1640培養(yǎng)液，混均，勻漿液加1640培養(yǎng)液至70ml，加210μl刀豆素A(conA)溶液，充分混勻，分別另取不同濃度的藥液至96孔培養(yǎng)板中，每孔100μl，然后加入con-A胸腺細(xì)胞懸液100μl，(conA終濃度3μg/ml)胸腺細(xì)胞終濃度1.87×108/ml)，置37℃5％CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)48小時(shí)。培養(yǎng)結(jié)束前6小時(shí)，每孔加入3H-TdR20μl(0.2uci/孔)。收集細(xì)胞于49型纖維濾紙上，用LKB自動液體閃爍計(jì)數(shù)器測定放射活性強(qiáng)度(cpm)。結(jié)果以三分復(fù)管的cpm均值±DS表示，根據(jù)IL-1活性記錄樣品在不同濃度時(shí)刺激小鼠胸腺細(xì)胞增殖而摻入3H-TdR的量(cpm±DS)，進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，評價(jià)來氟米特抑制Mφ產(chǎn)生IL-1的作用。
使用來氟米特5、10、15和20μg/ml時(shí)，對抑制Mφ產(chǎn)生IL-1均有較強(qiáng)的作用，其cpm均值分別為678.65±293.14、415.41±297.90、39.72±13.71和66.9±52.0，與Lps10μg/ml組比較均有顯著性差異(P＜0.01)和(P＜0.001)。但使用來氟米特1μg/ml時(shí)，其cpm均值為1263.55±564.32、與Lps組比較無顯著必差異(P＞0.05)。使用環(huán)磷酰胺10μg/ml時(shí)，其cpm均值為1199.3±193.3，與Lps組比較無顯著性差異(P＞0.05)結(jié)果表明，來氟米特5、10、15、20μg/ml劑量組對Mφ產(chǎn)生IL-1有明顯的抑制作用，作用強(qiáng)度呈劑量效應(yīng)相關(guān)關(guān)系。從而可以證明來氟米特不僅能抑制T淋巴細(xì)胞的免疫功能，還能明顯地抑制巨噬細(xì)胞的功能，對巨噬細(xì)胞產(chǎn)生IL-1有很強(qiáng)的抑制作用，作用強(qiáng)度與劑量呈一定的效應(yīng)關(guān)系。
實(shí)施例1對小鼠腹腔巨噬雞紅細(xì)胞功能的影響實(shí)驗(yàn)材料ICR小鼠，雌性，體重19～21克，由浙江省實(shí)驗(yàn)動物中心提供，合格證號為浙實(shí)驗(yàn)動物質(zhì)量準(zhǔn)字[94]008號，飼養(yǎng)設(shè)施條件合格證為浙實(shí)驗(yàn)動物設(shè)施準(zhǔn)字[94]201號。
雞紅細(xì)胞懸液制備無菌操作自雞翼靜脈采血，加5倍量阿氏液，4℃冰箱保存。使用前用無菌生理鹽水離心洗滌三次，配成5％雞紅細(xì)胞生理鹽水懸液。
0.25％淀粉生理鹽水，煮沸消毒15分鐘，備用。
對照品環(huán)磷酰胺受試藥物來氟米特批號CK-95-SH1純度＞99％上述實(shí)驗(yàn)材料由美國欣凱公司上海代表處提供實(shí)驗(yàn)方法取體重19～21克ICR小鼠50只，隨機(jī)分為5組，即對照組、環(huán)磷酰胺組(120mg/kg)、來氟米特三個(gè)劑量(2、9、45mg/kg)，每組10只。各組小鼠灌胃給藥5天，每鼠0.5ml每天一次，對照組給同容量的1％羧甲基纖維素鈉溶液。于給藥第三天，每鼠再腹腔注射0.25％淀粉液0.5ml，第五天給藥后4小時(shí)，每鼠腹腔注射5％雞紅細(xì)胞懸液0.5ml，間隔30分鐘，頸惟脫臼處死，經(jīng)腹腔注射Hank氏液2.5ml，輕輕揉按小鼠腹部，使Hank氏液充分涮洗腹腔巨噬細(xì)胞。
然后，吸取腹腔洗液，滴于二張載玻片上，放入墊有濕紗布的盒內(nèi)，于37℃孵育30分鐘。孵畢，于生理鹽水中漂洗，除去未貼片的細(xì)胞，涼干，甲醇固定，Giemsa Wright染液染色，蒸餾水漂洗、涼干，用油鏡計(jì)數(shù)100個(gè)巨噬細(xì)胞，計(jì)算百分率和吞噬指數(shù)。
實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表1。結(jié)果表明，來氟米特能明顯抑制小鼠腹腔巨噬細(xì)胞的吞噬功能，與對照組比較，中、高劑量組有著性差異。
實(shí)施例2來氟米特對小鼠的細(xì)胞免疫功能的影響來氟米特對小鼠淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化試驗(yàn)(H-TdR摻入法)的影響實(shí)驗(yàn)材料ICR小鼠40只，雌雄各半，體重23±1g，質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)同前。
RPM1640培養(yǎng)液(含20％小牛血清，青鏈霉素各100μ/ml，10mmol Hepes5×10-5M二硫基乙酸，2mmol谷氨酰胺)。
3HTdRlmci/ml中國科學(xué)院上海原子能研究所產(chǎn)品，批號960118。
PHA，廣州醫(yī)藥工業(yè)研究所產(chǎn)品，規(guī)格10mg/支。
2％臺酚藍(lán)染液。
培養(yǎng)板實(shí)驗(yàn)方法將ICR小鼠隨機(jī)分為4組，雌雄各半，來氟米特二個(gè)劑量(9、45mg/kg/d×5d)，口服給藥環(huán)磷酰胺(120mg/kg/d×5d)和溶媒對照組，各組每鼠每天腹腔注射0.2ml藥液，連續(xù)5天，處死小鼠，按常規(guī)3HTdR摻入法定量測定T淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化程度。
實(shí)驗(yàn)結(jié)果T淋巴細(xì)胞與植物血凝素(PHA)一起體外培養(yǎng)時(shí)，可轉(zhuǎn)化成淋巴母細(xì)胞，并出現(xiàn)旺盛的分裂現(xiàn)象。細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)和核酸合成增加，以反映DNA合成速率的3H-胸腺嘧啶核苷(3HTdR)摻入值為指標(biāo)，可定量表示淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化程度，從而反映T淋巴細(xì)胞的免疫功能。從表3結(jié)果可見，來氟米特高低劑量組(9、45mg/kg/d×5d)的小鼠(3HTdR)摻入值明顯低于對照組(P＜0.05)，表明來氟米特對小鼠淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化功能有明顯的抑制作用，即抑制小鼠T細(xì)胞的免疫功能。
實(shí)施例3巨噬細(xì)胞產(chǎn)生白細(xì)胞介素1(IL-1)試驗(yàn)健康純系小鼠，80克，體重18～20g，雌性，由浙江省實(shí)驗(yàn)動物中心提供，合格證號為浙實(shí)驗(yàn)動物質(zhì)量準(zhǔn)字(94)008號，飼養(yǎng)設(shè)施條件合格證為浙實(shí)驗(yàn)動物設(shè)施準(zhǔn)字(94)201。
供試品來氟米特(LEF，A771726)；白色粉末，無臭無味，溶于水，常溫保存批號OT 25/2，由美國欣凱公司上海代表處提供。
Lps真空干燥，白色粉末，規(guī)格10mg/支，購自上海第二軍醫(yī)大學(xué)微生物教研組。
環(huán)磷酰胺(CY)白色粉末，購自浙江省腫瘤醫(yī)院。
第一組來氟米特20mg/ml第二組來氟米特15μg/ml第三組來氟米特10μg/ml第四組來氟米特5μg/ml第五組來氟米特1μg/ml第六組Lps10μg/ml第七組cy10μg/ml
以上藥物均用1640培養(yǎng)液，在無菌條件下配制成不同濃度同等容量的溶液，供實(shí)驗(yàn)用。
實(shí)驗(yàn)方法IL-1誘導(dǎo)產(chǎn)生在無菌操作室內(nèi)取純系小鼠70只，隨機(jī)分成以上七個(gè)試驗(yàn)組，每組10只，脫臼處死，用75％乙醇浸泡片刻，仰臥固定，剪開腹部表皮，注射5mlHank氏液，挪動腹部，回收腹腔液，離心(500rpm×3min)棄去上清液，沉淀物加1640培養(yǎng)液至3ml，混均離心(2000rpm×10min)，計(jì)數(shù)Mφ單層，用10％FCS RPMI1640培養(yǎng)液稀釋至2×106/ml細(xì)胞數(shù)。加入24孔培養(yǎng)板中(1ml/孔)，置37℃5％CO2培養(yǎng)2小時(shí)，棄去非粘附細(xì)胞，獲Mφ單層，在Mφ單層中，加入不同濃度的受試物，每孔終容積為1ml，置37℃5％CO2培養(yǎng)48小時(shí)，收集上清液(4000rpm×8min)過濾，20℃保存。
在無菌操作室內(nèi)另取純系小鼠10只，眼球放血致死，75％乙醇浸泡片刻，仰臥固定，取出胸腺，剝盡周圍組織，用撕碎法撕碎胸腺至10ml刻度離心管中，離心(500rpm×5′)棄去上清洗，沉淀物(胸腺組織)加少量1640培養(yǎng)液，混均，勻漿液加1640培養(yǎng)液至70ml，加210μlconA溶液，充分混勻，分別另取不同濃度的藥液至96孔培養(yǎng)液中，每孔100μl，然后加入con-A胸腺細(xì)胞懸液100μl，(conA濃度3μg/ml)胸腺細(xì)胞終濃度1.87×108/ml)，置37℃5％CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)48小時(shí)。培養(yǎng)結(jié)束前6小時(shí)，每孔加入3H-TdR20μl(0.2uci/孔)。收集細(xì)胞49型纖維濾紙上，用LKB自動液體閃灼計(jì)數(shù)器測定放射活性強(qiáng)度(cpm)。結(jié)果以三分復(fù)管的cpm均值±DS表示，根據(jù)IL-1活性記錄樣品在不同濃度時(shí)刺激小鼠胸腺細(xì)胞增殖而摻入3H-TdR的量(cpm±SD)，進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，評價(jià)來氟米特抑制Mφ產(chǎn)生IL-1的作用。
實(shí)驗(yàn)結(jié)果使用來氟米特5、10、15和20μl/ml時(shí)，對抑制Mφ產(chǎn)生IL-1均有較強(qiáng)的作用，其cpm均值分別為678.65±293.14、415.41±297.90、39.72±13.71和66.9±52.0與Lps10μg/ml組比較均有顯著性差異(P＜0.01)和(P＜0.001)。但使用來氟米特1μg/ml時(shí)，其cpm均值為1263.55±564.32、與Lps組比較無顯著性差異(P＞0.05)。使用環(huán)磷酰胺10μg/ml時(shí)，其cpm均值為1199.3±193.3，與Lps組比較無顯著性差異(P＞0.05)。
結(jié)果表明來氟米特5、10、15、20μg/ml劑量組對Mφ產(chǎn)生IL-1有明顯的抑制作用，作用強(qiáng)度呈劑量效應(yīng)相關(guān)關(guān)系，而來氟米特1μg/ml劑量對MφIL-1沒有抑制作用。
權(quán)利要求
1.來氟米特一種適應(yīng)癥，其特征在于在治療銀屑病藥物中應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明提供來氟米特新適應(yīng)癥,來氟米特是一種新型免疫抑制、調(diào)節(jié)劑、利用它的免疫抑制、調(diào)節(jié)作用對由免疫系統(tǒng)故障問題引起的銀屑疾病有治療作用,來氟米特在制備治療銀屑病藥物中應(yīng)用。
文檔編號A61K31/42GK1286085SQ0012510
公開日2001年3月7日 申請日期2000年9月8日 優(yōu)先權(quán)日2000年9月8日
發(fā)明者肖飛 申請人:欣凱醫(yī)藥化工中間體(上海)有限公司