專利名稱：豬肺炎支原體mhp3基因的核酸和蛋白質(zhì)及其應(yīng)用的制作方法
mhp3基因編碼豬肺炎支原體(Mycoplasm hyopneumoniae)的一個蛋白。本發(fā)明涉及mhp3的核苷酸和蛋白質(zhì)。本發(fā)明還涉及由mhp3編碼的新型脫輔蛋白質(zhì)抗原，該抗原可用于預(yù)防和治療因豬肺炎支原體感染而引發(fā)疾病的疫苗中，本發(fā)明還涉及這類抗原的重組制備方法。
豬肺炎支原體(M.hyopneumoniae)是一種能引發(fā)豬地方性支原體肺炎的細(xì)菌病原體。地方性支原體肺炎是導(dǎo)致出現(xiàn)下列癥狀的慢性疾病食物消化不良、發(fā)育障礙及繼發(fā)性肺感染的易感性。豬肺炎支原體很容易通過呼吸道分泌物以及通過母豬-豬仔傳遞而傳播開來，并在豬場中大規(guī)模地流行。據(jù)1991年估計，美國約有99％的豬群被感染，養(yǎng)豬業(yè)每年因此耗費(fèi)約3億美元。
目前既無任何簡單實(shí)驗(yàn)檢測豬肺炎支原體，也無遏制感染的有效方法。檢測豬肺炎支原體的努力因下述事實(shí)而受阻抗豬肺炎支原體抗體與豬的其它種類支原體之間交叉反應(yīng)。疫苗領(lǐng)域絕大部分都依賴于豬肺炎支原體的佐劑化胞膜或全細(xì)胞制劑，可這些制劑并不能激發(fā)顯著的免疫應(yīng)答。此外，豬肺炎支原體基因的克隆及重組表達(dá)也未制備出有足夠保護(hù)力能用于制備商品化疫苗的蛋白質(zhì)。
由于缺乏合適的疫苗，地方性支原體肺炎主要通過感染動物的早期檢測及分離來控制。用抗生素治療豬肺炎支原體感染動物在縮短感染過程方面效果不佳。
因此，亟需發(fā)現(xiàn)通過預(yù)防感染或治愈來防止該疾病擴(kuò)散的方法。一種預(yù)防的方法就是免疫。因此，如能體外制備出大量具有抗原性可用于疫苗制劑的豬肺炎支原體蛋白或肽，就可以大大促進(jìn)保護(hù)性疫苗的開發(fā)。
公開號為WO96/28472的國際專利申請鑒定出了6種豬肺炎支原體蛋白質(zhì)抗原，分子量分別為46-48、52-54、60-64、72-75、90-94和110-114Kd，而且公開了分子量為52-54、60-64和72-75Kd抗原的部分蛋白質(zhì)序列，以及分子量為46-48Kd抗原的全長核苷酸及氨基酸序列。在Faulds'和Lee's公開的部分肽序列基礎(chǔ)上的測定結(jié)果表明，該46-48Kd抗原(下文中稱為P46)對應(yīng)于Faulds的美國專利US5,252,328中的44Kd抗原以及文獻(xiàn)(Lee et a1.,1996,J.Chromatogr.A.737:273-279)中公開的48Kd抗原。編碼P46的基因p46也已被Futo等人克隆(1995；細(xì)菌學(xué)雜志177:1915～1917)。此后，該小組的研究表明體外表達(dá)的基因產(chǎn)物可用于診斷豬肺炎支原體感染的抗體應(yīng)答而不與其它種類的支原體交叉反應(yīng)(Futo et aL，1995.臨床微生物學(xué)雜志33:680-683)。Futo等人公開的p46基因的序列及診斷用途還公開于EP 0475 185 Al。
WO96/28472中的60-64Kd抗原的部分肽序列與稱為P102的蛋白質(zhì)(描述見下文)具有顯著同源性。而且該抗原與Faulds公開的64Kd抗原(US5,252,328)高度同源。
WO96/28472中的72-75Kd抗原對應(yīng)于Wise和Kim公開的65Kd蛋白(1987，細(xì)菌學(xué)雜志，169:5546-5555和US5,788,962)，下文稱之為P65。
我們下文中稱為Mhp3的52-54Kd抗原對應(yīng)于Wise和Kim公開的50Kd膜內(nèi)在蛋白(1987，細(xì)菌學(xué)雜志，169:5546-5555)和/或Faulds公開的52Kd蛋白質(zhì)(US5,252,328)。上述52-54Kd抗原下文稱為MHP3。WO96/28472公開了成熟蛋白及內(nèi)部溴化氰片段(internalcyanogen bromide fragment)的氨基端序列。
WO96/28472中的90-94Kd抗原對應(yīng)于Hsu等人公開的粘附素p97，其描述見下文。
WO96/28472還公開了使用60-64Kd抗原、P46或者聯(lián)合使用P65與Mhp3的疫苗實(shí)驗(yàn)結(jié)果。這些疫苗都激發(fā)產(chǎn)生了針對豬肺炎支原體感染的強(qiáng)有力保護(hù)作用。
科技及專利文獻(xiàn)中有大量有關(guān)豬肺炎支原體外膜蛋白的相關(guān)報道。例如，Wise和Kim(1987，細(xì)菌學(xué)雜志，169:5546-5555)報道了名為p70、p65(P65，上述)、p50和p44的4種豬肺炎支原體膜內(nèi)在蛋白質(zhì)，后3種經(jīng)共價脂連接修飾，可激發(fā)強(qiáng)的體液免疫應(yīng)答。對該免疫應(yīng)答的保護(hù)效果未做研究。編碼P65蛋白的基因也已克隆，其序列以及二者在疫苗和診斷試劑中的用途見US5,788,962。
國際專利申請WO91/15593公開了豬肺炎支原體的5種蛋白質(zhì)，它們的表觀分子量分別為105、90、85、70和43Kd。其中提供了編碼85Kd蛋白質(zhì)(C蛋白)的基因的全長序列，以及編碼其余4種蛋白質(zhì)的部分核苷酸序列。使用C蛋白的疫苗實(shí)驗(yàn)可以賦予多試動物顯著的抗豬肺炎支原體保護(hù)反應(yīng)。
Faulds的美國專利US5,252,328公開了免疫反應(yīng)性豬肺炎支原體蛋白的氨基末端序列，其分子量為36、41、44、48、64、68、74.5、79、88.5、96和121Kd。其它依據(jù)電泳遷移率鑒定而未公開蛋白質(zhì)序列的蛋白質(zhì)的表觀分子量為22.5、34和52Kd。盡管US5,252,328中提及這些蛋白質(zhì)可用于疫苗制劑，但是未報道任何疫苗實(shí)驗(yàn)結(jié)果。
國際專利申請WO95/09870公開了純化豬肺炎支原體粘附素的生化方法，該支原體的膜內(nèi)在蛋白負(fù)責(zé)黏附到宿主上呼吸道上皮細(xì)胞的纖毛上。WO95/09870也提供了這些蛋白的測試方法及用途，例如在疫苗及診斷試劑方面的用途。但是，在克隆出名為p97的基因之前無任何粘附素基因的克隆見諸報道，p97的產(chǎn)物下文稱為"P97"，研究表明它能夠使得菌體與感染了豬肺炎支原體的豬的呼吸道纖毛細(xì)胞結(jié)合(Hsu et al.,1997，細(xì)菌學(xué)雜志179:1317-1323)。King等人的研究論文(1997；疫苗15:25-35)公開的分子量為124Kd的粘附素Mhp1是P97的一種菌株變體。但是，用GST-Mhp1融合蛋白免疫豬以預(yù)防豬肺炎支原體的嘗試未獲得針對地方性支原體肺炎的統(tǒng)計學(xué)意義上的顯著保護(hù)。Wilton等人(1998，微生物學(xué)144:1931-1943)測定出了P97的一種94Kd變體。此外，研究表明p97基因是另外還能編碼名為P102的第二種蛋白質(zhì)的操縱子的一部分，該蛋白推測分子量約102Kd(Hsu et eL,1998，基因214:13-23)。Minion和Hsu在國際專利申請WO99/26684中提出P102可用于疫苗制備，但未報道疫苗實(shí)驗(yàn)。
本發(fā)明包括豬肺炎支原體mhp3基因的核苷酸及蛋白質(zhì)。本發(fā)明還包括由mhp3基因編碼的新型脫輔蛋白質(zhì)抗原，該抗原可用于預(yù)防和治療因豬肺炎支原體感染而引發(fā)疾病的疫苗中。本發(fā)明還提供了脫輔-Mhp3的重組制備方法。
本發(fā)明提供了一種包含多肽和藥物學(xué)可接受載體的疫苗制劑，所述多肽包括SEQ ID NO:2列出的氨基酸序列或其由至少10、至少20、至少30、至少40、至少50或至少100個連續(xù)氨基酸組成的任一片段。在某些實(shí)施方案中，該疫苗還包括至少一種其它的免疫原性或抗原性多肽，這種其它多肽可以來源于病毒、細(xì)菌或寄生蟲。在一個優(yōu)選實(shí)施方案中，所述疫苗還包括至少一種多肽，該多肽選自豬肺炎支原體P46、P65、P97和P102蛋白及其片段、變體和衍生物。
本發(fā)明提供了一種包含抗原性或免疫原性的多肽和藥物學(xué)可接受載體的疫苗制劑，所述多肽包括對應(yīng)于SEQ ID NO:4的氨基酸序列或其衍生物、變體或片段。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述抗原性或免疫原性多肽以硫氧還融合蛋白的形式表達(dá)，優(yōu)選通過克隆到表達(dá)載體pBAD/硫-TOPO，并用大腸桿菌BL21菌株制備而成。在一個特別優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述疫苗還包括至少一種多肽，該多肽選自豬肺炎支原體P46、P65、P97和P102蛋白及其片段、變體和衍生物。
本發(fā)明提供了治療和預(yù)防動物因豬肺炎支原體感染引發(fā)的疾病或癥狀的方法，該方法包括向受試者施用足以增強(qiáng)豬肺炎支原體特異性細(xì)胞或體液應(yīng)答的量的疫苗制劑，所述疫苗制劑包括抗原性或免疫原性多肽和藥物學(xué)可接受載體，所述多肽包括對應(yīng)于SEQ ID NO:2的氨基酸序列或其任一脫輔衍生物、變體或片段。在一個優(yōu)選實(shí)施方案中，所述氨基酸序列如SEQ ID NO:4所示。在另一優(yōu)選實(shí)施方案中，所述動物是豬。
本發(fā)明還提供了用于檢測豬肺炎支原體的試劑盒。在一個實(shí)施方案中，所述試劑盒提供了用于檢測抗豬肺炎支原體Mhp3蛋白質(zhì)的循環(huán)抗體的試劑。在另一實(shí)施方案中，所述試劑盒提供了用于通過聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)或雜交方法檢測豬肺炎支原體核酸的試劑。
附圖簡述

圖1是豬肺炎支原體的Mhp3(SEQ ID NO:2)與Ag234-5(SEQ IDNO:41)之間的群集(Clustal)W(1.7)序列排布，Ag234-5最初被認(rèn)為分離自精氨酸支原體但后來表明出自豬鼻支原體。相同的氨基酸用星號(*)表示，高度保守取代用冒號()表示，保守取代用句點(diǎn)(。)表示?？傊?，這兩種蛋白之間的氨基酸同一性百分率為36.2％。
FIG.2的Western印跡實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明取自豬肺炎支原體實(shí)驗(yàn)攻擊后的豬的抗體與提取自豬肺炎支原體、豬鼻支原體或蕈狀支原體的蛋白質(zhì)提取物，或者與純化后的重組Mhp3之間的反應(yīng)性。
位于種名之前的縮寫M.代表支原體屬。
術(shù)語“重組mhp3”是指編碼以通用遺傳密碼編碼Mhp3抗原的核酸?！癕.hyopneumoniae mhp3”是指以豬肺炎支原體密碼編碼Mhp3抗原的核酸。在豬肺炎支原體中，密碼子TGA對應(yīng)的是一個色氨酸殘基而并非翻譯終止密碼子。因此，重組mhp3基因與M.hyopneumoniaemhp3不同之處在于用TGG密碼子代替了TGA密碼子。
術(shù)語“Mhp3”是指由mhp3基因編碼的蛋白質(zhì)。
術(shù)語脫輔蛋白質(zhì)是指通過例如缺失或突變作為所述脂質(zhì)組成成份受體起作用的氨基酸而除去了脂質(zhì)組成成份的蛋白質(zhì)。
術(shù)語“ORF”是指“開放閱讀框”，即基因的編碼區(qū)域。
核酸及多肽的“序列同一性百分率”是通過在一個對比窗口中對兩個最佳排列的序列進(jìn)行比較的測定結(jié)果，其中所述的最佳排列能提供最高級別的匹配并可向測試或參照序列導(dǎo)入添加或缺失。同一性百分率是通過計算測試序列與參照序列在給定位置上相同氨基酸所占的百分比得出的。最佳序列排列及同一性百分率也可以手工測定，或者更優(yōu)選用電腦算法，包括但不限于TBLASTN,BIA'STP.FASTA,TFASTA,GAP,BESTFIT,和CLUSTALW(Altschul et al.,1990，分子生物學(xué)雜志215(3):403～10;Pearson and Lipman 1988,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85(8):2444-8;Thompson,et al,1994，核酸研究22(22)4873-80;Devereux et al.,1984，核酸研究12:387-395);Higgins,et al,1996，酶學(xué)方法266:383～402)。優(yōu)選使用設(shè)定了默認(rèn)參數(shù)(default parameters)的NCBI Blast服務(wù)器(http:/www.ncbi.nlm.nih.gov)來測定序列同一性百分率。
當(dāng)用于描述啟動子時，異源性一詞是指該啟動子對其所控制表達(dá)的開放閱讀框而言并非是天然的。
術(shù)語“分離的蛋白質(zhì)”是指蛋白質(zhì)組合物，其中經(jīng)過分離的蛋白質(zhì)所占重量比至少為50％。更優(yōu)選所述組合物包括約95％，最優(yōu)選包括99％重量百分比的分離的蛋白質(zhì)。
術(shù)語“以可溶形式回收”是指從表達(dá)了蛋白質(zhì)或多肽的細(xì)胞的胞質(zhì)中回收所述的蛋白質(zhì)或多肽。
術(shù)語“以不溶形式回收”是指表達(dá)了蛋白或多肽的細(xì)胞中的包涵體內(nèi)回收所述的蛋白質(zhì)或多肽。
本文使用的術(shù)語“功能等同物”是指能夠被特異于Mhp3的抗體識別的蛋白質(zhì)，該蛋白質(zhì)能夠激發(fā)產(chǎn)生與內(nèi)源性Mhp3蛋白基本類似的免疫應(yīng)答。因此，針對功能等同物的蛋白質(zhì)的抗體也可以識別Mhp3。
術(shù)語“免疫原性”是指蛋白質(zhì)或多肽能夠激發(fā)產(chǎn)生特異性地針對該蛋白或多肽的免疫應(yīng)答能力。
“抗原性”一詞是指蛋白質(zhì)或多肽能夠與抗該蛋白質(zhì)或多肽的抗體免疫特異性結(jié)合的能力。
本文就疫苗而使用的“保護(hù)”一詞是指所述疫苗能夠防止或減緩某種生物引發(fā)疾病的癥狀，所述疫苗中的抗原就出自該生物。
本文使用的“抗體”一詞是指能夠結(jié)合抗原的免疫球蛋白分子?？贵w可以是多克隆混合物或單克隆抗體?？贵w可以是取自天然或重組來源的完整免疫球蛋白，也可以是完整免疫球蛋白的免疫反應(yīng)性部分。抗體可以多種形式存在，包括，例如，F(xiàn)v，F(xiàn)ab'，F(xiàn)(ab')2以及單鏈抗體。另外還可使用將編碼重鏈和輕鏈的基因結(jié)合成單個編碼序列表達(dá)而成的單鏈抗體。
術(shù)語“有效量”是指mhp3核苷酸或Mhp3多肽的量足以在其所施用的受試者體內(nèi)激發(fā)產(chǎn)生免疫應(yīng)答。所述免疫應(yīng)答可以包括但不限于，細(xì)胞和/或體液免疫的誘導(dǎo)。
術(shù)語“治療或預(yù)防豬肺炎支原體感染”是指抑制豬肺炎支原體的復(fù)制，抑制豬肺炎支原體的傳播，或者防止豬肺炎支原體在其宿主體內(nèi)定居，以及減輕豬肺炎支原體感染引發(fā)疾病的癥狀。如果細(xì)菌荷載量減少、肺部感染減輕和/或攝食量和/或體重增加，那么就可以認(rèn)為所述的治療達(dá)到了治療效果。
術(shù)語“藥物學(xué)上可接受的載體”是指載體介質(zhì)不會干擾活性組分的生物活性的療效，所述載體介質(zhì)是化學(xué)惰性的，并且不會對其所施用的受試者產(chǎn)生毒害作用。
術(shù)語“治療劑”是指有助于治療細(xì)菌感染或其引發(fā)疾病的任何分子、化合物或治療物，優(yōu)選其為抗菌劑。
如本文所述，本發(fā)明人已發(fā)現(xiàn)并鑒定了一種編碼Mhp3的豬肺炎支原體基因，據(jù)信Mhp3通過共價連接到該蛋白上的脂質(zhì)鏈與豬肺炎支原體的質(zhì)膜相連。本發(fā)明提供了重組表達(dá)不含信號序列及脂質(zhì)修飾必需信號的Mhp3蛋白的方法，該方法能高效并大量地表達(dá)Mhp3以用于抗豬肺炎支原體感染引發(fā)疾病的疫苗并治療該疾病。
因此，本發(fā)明包括豬肺炎支原體mhp3核苷酸序列及其編碼的蛋白質(zhì)。本發(fā)明還包括以通用遺傳密碼編碼這類蛋白質(zhì)的核酸，該核酸適于在分別例如大腸桿菌和桿狀病毒的真細(xì)菌及真核宿主中表達(dá)這種蛋白質(zhì)。
本發(fā)明還包括具有下述序列的蛋白質(zhì)所述序列含有SEQ ID NO:4中的至少10、至少20、至少30、至少40、至少50或至少100個連續(xù)氨基酸，以及以通用遺傳密碼編碼這類蛋白質(zhì)的核酸。
本發(fā)明還包括用本發(fā)明所述的蛋白質(zhì)和/或抗體治療豬肺炎支原體引發(fā)的疾病的方法。
本發(fā)明還包括包含Mhp3蛋白的疫苗制劑。在某些實(shí)施方案中，所述疫苗制劑包括選自P46、P65、P97和P102及其片段、變體和衍生物的分離的蛋白質(zhì)。
為了清楚地描述，而非限制本發(fā)明，將本發(fā)明的詳述分成以下幾個部分，用來描述或說明本發(fā)明的特定的特征、實(shí)施方案或應(yīng)用。
mhp3核苷酸序列本發(fā)明包括mhp3基因的核苷酸序列，并包括編碼在其它種類豬肺炎支原體中發(fā)現(xiàn)的Mhp3種變體的核苷酸序列。本發(fā)明的一個優(yōu)選實(shí)施方案包括編碼氨基端截短形式的Mhp3蛋白的核苷酸序列，這種形式的Mhp3蛋白沒有經(jīng)共價連接脂肪酸鏈而修飾因此不會發(fā)生膜定位。在本發(fā)明的該優(yōu)選實(shí)施方案的一個模式中，對應(yīng)于Mhp3氨基端的mhp3的5’缺失包括編碼Mhp3第2-29位氨基酸的核苷酸序列。在本發(fā)明的另一模式中，mhp3的5’缺失對應(yīng)于前30、31-32或33-40位氨基酸的缺失。
本發(fā)明提供了一種分離或純化的DNA或其互補(bǔ)物，所述DNA以支原體遺傳密碼編碼一種具有下述氨基酸序列的蛋白質(zhì)所述氨基酸序列中包括SEQ ID NO:2中的至少10、至少20、至少30、至少40、至少50或至少100個連續(xù)氨基酸。本發(fā)明還提供了一種其序列中包括SEQ IDNO:1中至少90個連續(xù)核苷酸的DNA或其互補(bǔ)物。
本發(fā)明還提供了一種以通用遺傳密碼編碼具有下述氨基酸序列的蛋白質(zhì)的DNA或其互補(bǔ)物其氨基酸序列中包括SEQ ID NO:4中的至少10、至少20、至少30、至少40、至少50或至少100個連續(xù)氨基酸。本發(fā)明還提供了一種具有SEQ ID NO:3所示序列的DNA。
本發(fā)明還提供了一種包含15～40個核苷酸的片段的分離后的DNA或其互補(bǔ)物。該片段能在PCR的嚴(yán)緊條件(描述見下文)下與一種以支原體遺傳密碼編碼具有SEQ ID NO:2中的至少5個連續(xù)氨基酸序列的蛋白質(zhì)的DNA雜交。在一個優(yōu)選實(shí)施方案中，所述雜交特異地針對豬肺炎支原體。本文使用的術(shù)語“與豬肺炎支原體特異性雜交”是指與豬肺炎支原體基因組選擇性雜交而不與豬鼻支原體、絮狀支原體、蕈狀支原體等其它相關(guān)種類支原體的基因組雜交。
本發(fā)明還提供了一種包含至少90個核苷酸片段的分離的DNA或其互補(bǔ)物，所述片段能在濾膜雜交的高度嚴(yán)緊條件下(描述見下文)與一種以支原體遺傳密碼編碼具有SEQ ID NO:2中的至少30個連續(xù)氨基酸序列的蛋白質(zhì)的DNA雜交。
在一個具體的實(shí)施方案中，提供了一種核酸，它能在低嚴(yán)緊條件下與下列核酸雜交mhp3核酸(例如，具有SEQ IDNO:1、SEQ IDNO:3或SEQ ID NO:5所示序列)或其互補(bǔ)物，編碼mhp3衍生物或類似物的核酸或其互補(bǔ)物。例如但不限于，使用下列這類低嚴(yán)緊條件進(jìn)行多于90個核苷酸的區(qū)域雜交的方法(參見Shilo and Weinberg,1981,Proc.Natl.Acad.Sci.U.SA.78,678～792)。將含有DNA的濾膜在含有下述物質(zhì)的溶液中40℃預(yù)處理6小時35％甲酰胺、5×SSC、50mMTris-HCl(pH7.5)、5mM EDTA、0.1％PVP、0.1％Ficoll、1％BSA和500ug/ml變性鮭精DNA。用同種溶液進(jìn)行雜交，對溶液僅作如下變動0.02％PVP、0.02％Ficoll、0.2％BSA，100ug/ml變性鮭精DNA、10％(wt/vol)葡聚糖硫酸酯，并使用5～20×1076cpm32P標(biāo)記的探針。將濾膜在雜交混合物中40℃保溫18～20小時，然后用含2X SSC、25mM Tris-HCl(pH7.4)、5mM EDTA和0.1％SDS的溶液55℃洗滌1.5小時。用新鮮溶液替換洗滌液，60℃下繼續(xù)保溫1.5小時。吸干濾膜并進(jìn)行放射自顯影。如有必要，在65～68℃下第三次洗滌濾膜并用膠片再次顯影。其它可以用的低嚴(yán)緊條件是本領(lǐng)域技術(shù)人員眾所周知的(例如，種間交叉雜交)。
另一個具體的實(shí)施方案中，提供了一種能在高度嚴(yán)緊條件下與mhp3核酸或其互補(bǔ)片段雜交的核酸。例如但不限于，使用下列這類高度嚴(yán)緊條件進(jìn)行多于90個核苷酸的區(qū)域雜交的方法。將含有DNA的濾膜在由下述物質(zhì)組成的緩沖液中65℃預(yù)雜交8小時至過夜6X SSC、50mMTris-HCl(pH7.5)、1mM EDTA、0.02％PVP、0.02％Ficoll、0.02％BSA和500ug/ml變性鮭精DNA。將濾膜在含有100ug/ml變性鮭精DNA和5～20×1076cpm32P標(biāo)記探針的預(yù)雜交混合物中65℃雜交48小時。37℃下，在含有2X SSC、0.01％PVP、0.01％Ficoll和0.01％BSA的溶液中洗滌濾膜1小時。接下來，在進(jìn)行放射自顯影之前用0.1X SSC 50℃下再洗滌45分鐘。
其它高度嚴(yán)緊條件的選用取決于核酸的特性(例如，長度、GC含量等)以及雜交的目的(檢測、擴(kuò)增等)，這些條件都是本領(lǐng)域眾所周知的。例如，聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)中，一段約15～40個堿基的寡核苷酸與互補(bǔ)序列之間嚴(yán)緊雜交是在下述條件下進(jìn)行的鹽濃度為50mM KCl、緩沖液濃度為10mM Tris-HCl、Mg2+濃度為1.5mM、pH值為7-7.5以及退火溫度為55～60℃。
另一個具體實(shí)施方案中，提供了一種能在中等嚴(yán)緊條件下與mhp3核酸或其互補(bǔ)片段雜交的核酸。這類嚴(yán)緊條件的選定是本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的(參見，例如，Sambrook et al.,1989，分子克隆-實(shí)驗(yàn)室手冊，第2版冷泉港實(shí)驗(yàn)室出版社，冷泉港，紐約，參見，Ausubelet al.,eds.，分子生物是最新方法，實(shí)驗(yàn)室技術(shù)手冊系列1987-1997,最新方法1994-1997 John Wiley and Sons,Inc.)。
另外還提供了編碼mhp3-所編碼蛋白質(zhì)的衍生物及類似物的核酸，以及mhp3的反義核酸。從本發(fā)明中很容易看出“編碼mhp3-所編碼蛋白質(zhì)的片段或部分的核酸”應(yīng)當(dāng)被理解成是指這樣一種連續(xù)序列的核酸，它只編碼mhp3所編碼蛋白質(zhì)的所指片段或部分而不編碼該蛋白質(zhì)中的其它鄰接部分。
在一個優(yōu)選的特定具體方案中，雜交后，按下述條件洗滌。在45℃下用下述溶液將所有膜洗滌2次40mM磷酸鈉、pH7.2、5％SDS、1mM EDTA、0.5％牛血清白蛋白，每次30分鐘，然后用磷酸鈉、pH7.2、1％SDS、1mM EDTA洗滌4次，每次30分鐘，然后將各個膜分別在下述的低、中等、或高度嚴(yán)緊的雜交條件下進(jìn)行不同處理。就低嚴(yán)緊雜交條件而言，不再洗滌膜。就中等嚴(yán)緊雜交條件而言，接著在55℃下再用40mM磷酸鈉、pH7.2、1％SDS、1mM EDTA將膜洗滌4次，每次30分鐘。就高度嚴(yán)緊雜交條件而言，接著在55℃下再用40mM磷酸鈉、pH7.2、1％SDS、1mM EDTA將膜洗滌4次，每次30分鐘，然后在65℃下用磷酸鈉、pH7.2、1％SDS、1mM EDTA洗滌4次，每次30分鐘。
mhp3編碼的蛋白質(zhì)及多肽本發(fā)明提供了重組的Mhp3蛋白。在一個實(shí)施方案中，該蛋白質(zhì)的氨基酸序列中包括SEQ ID NO:4中的至少10、至少20、至少30、至少40、至少50或至少100個連續(xù)氨基酸并且不與脂肪酸組成成份共價連接。另一個實(shí)施方案中，所述蛋白質(zhì)是一種分離的蛋白質(zhì)。本發(fā)明還提供了包括這類Mhp3蛋白的組合物。在某些具體的實(shí)施方案中，所述組合物包括Mhp3蛋白和藥物學(xué)上可接受的載體，或者M(jìn)hp3蛋白和佐劑。在另一個具體實(shí)施方案中，所述組合物包括至少一種其它種類的豬肺炎支原體蛋白質(zhì)，例如但不限于，P46、P65、P97或P102。在其它實(shí)施方案中，所述組合物包括Mhp3蛋白和至少一種其它免疫原性或抗原性多肽，這種免疫原性或抗原性多肽不是豬肺炎支原體多肽并且優(yōu)選是一種病毒、細(xì)菌或寄生蟲多肽。這樣的組合物適于用作聯(lián)合疫苗。
另外，本發(fā)明所述的用于疫苗制品的Mhp3蛋白基本上是純的或均質(zhì)的?？梢允褂帽绢I(lǐng)域技術(shù)人員熟知的方法測定蛋白質(zhì)純度或均一性，例如，首先對樣品進(jìn)行聚丙烯酰胺電泳，接著觀察染色凝膠上的單個多肽條帶?？梢杂肏PLC或其它本領(lǐng)域熟知的方法進(jìn)行高分辨率測定。
本發(fā)明包括典型地從表達(dá)編碼這些蛋白質(zhì)的重組核苷酸序列的宿主細(xì)胞中純化出來的多肽。這種蛋白質(zhì)純化可以通過本領(lǐng)域熟知的眾多方法來實(shí)現(xiàn)。在一個實(shí)施方案中，本發(fā)明所述的Mhp3蛋白以融合蛋白的形式表達(dá)，例如與硫氧還蛋白融合。得到的重組融合蛋白可以用親和層析的方法純化。在該實(shí)施方案的一個模式中，將所述的Mhp3蛋白與異源組成成份切割開來產(chǎn)生基本上純化的Mhp3蛋白樣品。其它方法也可以使用，例如，文獻(xiàn)“酶學(xué)方法”，1990,Academic Press,Inc.,San Diego，“蛋白質(zhì)純化原理及方法”1982,Sprlnger-Verlag,NewYork中描述的技術(shù)。
表達(dá)系統(tǒng)本發(fā)明包括的表達(dá)系統(tǒng)既有原核表達(dá)載體也有真核表達(dá)載體，它們都可以用來表達(dá)mhp3蛋白的截短及全長形式。
在本發(fā)明的一個優(yōu)選實(shí)施方案中，所述核酸具有SEQ ID NO:3所示的序列并編碼SEQ ID NO:4所示的蛋白質(zhì)，所述蛋白質(zhì)包括SEQ ID NO:2中的第30～444位殘基。豬肺炎支原體中的TGA密碼子已變?yōu)門GG密碼子。
可以用多種的宿主表達(dá)載體系統(tǒng)來表達(dá)本發(fā)明所述的抗原性蛋白質(zhì)序列。這類表達(dá)宿主系統(tǒng)可以是目的編碼序列可以從中產(chǎn)生并隨后純化的載體，也可以是當(dāng)用合適的核苷酸編碼序列轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染時能夠在原位展示出本發(fā)明的mhp3基因產(chǎn)物的細(xì)胞。這些包括但不限于微生物，例如用含有mhp3編碼序列的重組噬菌體DNA、質(zhì)粒DNA或粘粒DNA表達(dá)載體轉(zhuǎn)化的細(xì)菌(例如，大腸桿菌、枯草芽胞桿菌)；用含有mhp3基因產(chǎn)物編碼序列的重組酵母表達(dá)載體轉(zhuǎn)化的酵母(例如，糖酵母、畢赤氏酵母)；用含有mhp3編碼序列的重組病毒表達(dá)載體(例如桿狀病毒)轉(zhuǎn)染的昆蟲細(xì)胞系統(tǒng)；用重組病毒表達(dá)載體(例如，花椰菜花葉病毒，CaMV；煙草花葉病毒，TMV)轉(zhuǎn)染或用含有mph3編碼序列的重組質(zhì)粒表達(dá)載體(例如，Ti質(zhì)粒)轉(zhuǎn)化的植物細(xì)胞系統(tǒng)；或者用含有取自哺乳動物細(xì)胞基因組的啟動子(例如金屬硫蛋白啟動子)或哺乳動物病毒啟動子(如腺病毒晚期啟動子、牛痘病毒7.5K啟動子)的重組表達(dá)構(gòu)建體轉(zhuǎn)化的哺乳動物細(xì)胞系統(tǒng)(例如，COS、CHO、BHK、293、3T3)。
在一個優(yōu)選實(shí)施方案中，所述表達(dá)載體是細(xì)菌系統(tǒng)?？梢愿鶕?jù)所表達(dá)mhp3產(chǎn)物的預(yù)期用途從大量表達(dá)載體中優(yōu)先選擇。例如，當(dāng)為了制備Mhp3藥物組合物或生產(chǎn)抗Mhp3抗體而需要制備大量這種蛋白質(zhì)時，期望使用的載體能介導(dǎo)易純化的融合蛋白產(chǎn)物高水平表達(dá)。優(yōu)選地，所述載體含有能夠介導(dǎo)可誘導(dǎo)的基因表達(dá)的啟動子。合適的載體包括但不限于，大腸桿菌表達(dá)載體pUR278(Ruther et al.,1983.EMBOJ.2:1791)，其中可將mhp3編碼序列單獨(dú)連接到載體中的lac Z編碼區(qū)域的閱讀框中從而生產(chǎn)出融合蛋白；pIN載體(Inouye ＆ lnouye11985，核酸研究，13:3101-3109;Van Heeke ＆ Schuster,1989.生物化學(xué)雜志264:5503-5509);pET載體(Studier and Moffatt 1986，分子生物學(xué)雜志189:113;Rosenberg et al.,1987.基因56:125-135;載體可得自Novagen,Madison,Wisconsin)，其中mhp3編碼序列與多聚(如六聚)組氨酸殘基編碼序列框內(nèi)融合；pBAD載體(Guzman etal.,1995，細(xì)菌學(xué)雜志171:4121-4130)，使用該載體可以使Mhp3的表達(dá)置于阿拉伯糖誘導(dǎo)型啟動子的調(diào)控之下。也可以使用PGEX載體(Promega公司)將外源多肽與谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶(GST)表達(dá)成融合蛋白的形式。通常，這類融合蛋白是可溶性的，并且可以通過下述操作很容易地從裂解細(xì)胞中純化出來吸附至谷胱甘肽-瓊脂糖珠上，然后在游離的谷胱甘肽存在下洗脫。PGEX載體被設(shè)計成包括凝血酶或Xa因子蛋白酶切割位點(diǎn)以確?？寺〉陌谢虍a(chǎn)物能夠同GST組成成份分開?？梢詫hp3序列克隆到λ表達(dá)載體中并在λ-菌株中表達(dá)。在該實(shí)施方案的優(yōu)選模式中，所述菌株是LW14，其含有溫敏λ阻遏物，從而使入載體的蛋白質(zhì)表達(dá)在30℃下被抑制而在42℃下被活化。在一個更優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述載體Mhp3被表達(dá)為硫氧還蛋白融合蛋白，這樣促使通常為不溶性的蛋白質(zhì)溶解。優(yōu)選地，硫氧還蛋白-Mhp3融合蛋白通過將Mhp3編碼序列連接到pBAD載體pBAD/Thio-TOPO(Invitrogen Corporation,Carlsbad,California)中來表達(dá)。在一個更優(yōu)選的實(shí)施方案中，用大腸桿菌菌株BL21表達(dá)硫氧還蛋白-Mhp3融合蛋白。其它載體也可使用并為本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知。
Mhp3抗體根據(jù)本發(fā)明，可以使用mhp3-編碼的蛋白質(zhì)及其衍生物和類似物作為免疫原制備能與這種免疫原免疫特異性結(jié)合的抗體。
本領(lǐng)域已知的各種方法都可以用來制備抗Mhp3的多克隆抗體。就制備抗體而言，可以通過注射天然Mhp3蛋白或其合成形式或其衍生物來免疫各種宿主動物，包括但不限于，兔、小鼠、大鼠等。可以根據(jù)宿主動物的不同，選用各種佐劑(例如，那些用于制備疫苗的佐劑)增強(qiáng)免疫應(yīng)答。
就制備抗mhp3-編碼的蛋白質(zhì)序列或其類似物的單克隆抗體而言，任何一項(xiàng)能夠用于連續(xù)傳代細(xì)胞系組織培養(yǎng)方法制備抗體分子的技術(shù)都可以使用。例如，Kohler和Milstein首創(chuàng)的雜交瘤技術(shù)，(Kohler andMilstein 1975,自然256:49～97)，以及trioma技術(shù)，人B-細(xì)胞雜交瘤技術(shù)(Kozbor et al.,1983，今日免疫學(xué)472)，以及制備人單克隆抗體的EBV-雜交瘤技術(shù)(Cole et al.,1985.in單克隆抗體和癌癥方法，Alan R.Lisa,Inc.,mpp.77-96)。在本發(fā)明的另一實(shí)施方案中，可以用最新技術(shù)(參見，例如，PCT/US902545)在無菌動物中制備單克隆抗體。根據(jù)本發(fā)明，人抗體可以使用，而且可以通過使用人雜交瘤，(Cole et al.11983,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.80:2026-2030)或者通過用EBV病毒體外轉(zhuǎn)化人B細(xì)胞(Cole et al.,1985,in單克隆抗體和癌癥療法，Alan R.Liss,pp.77-96)制備而成。實(shí)際上，根據(jù)本發(fā)明，也可以使用制備“嵌合抗體“的技術(shù)(Morrison at al.,1984，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.81:6851-6855;Neuberger et al.,1984，自然312:604-608;Takeda et al.,1985，自然314:452-454)，該技術(shù)具體操作是將取自抗mhp3編碼蛋白質(zhì)的小鼠抗體分子的基因與取自具有合適生物活性的人源抗體分子的基因剪接起來；這類抗體也在本發(fā)明的范圍之內(nèi)。
根據(jù)本發(fā)明，可以將制備單鏈抗體的技術(shù)(US4,946,778)改進(jìn)后用于制備mhp3基因產(chǎn)物-特異性的單鏈抗體。本發(fā)明另一實(shí)施方案使用構(gòu)建Fab’表達(dá)文庫的技術(shù)(Huse et al.,1989，科學(xué)246:1275-1281)，可以快速容易地鑒定出期望的特異性針對mhp3編碼蛋白質(zhì)或其衍生物或其類似物的單克隆Fab片段。
可以用已知方法制備出含有獨(dú)特型分子的抗體片段。例如，這類片段包括但不限于，經(jīng)胃蛋白酶消化抗體分子得到的F(ab’)2片段，通過還原F(ab’)2片段中的二硫鍵得到的Fab’片段，通過用木瓜蛋白酶和還原劑處理抗體分子得到的Fab片段，以及Fv片段。
在抗體制備中，可以通過本領(lǐng)域已知技術(shù)(例如，酶聯(lián)免疫吸附測定或ELISA)來實(shí)現(xiàn)目的抗體的篩選。例如，為了篩選能夠識別mhp3編碼蛋白質(zhì)的一個特定結(jié)構(gòu)域的抗體，技術(shù)人員可以對得到的雜交瘤進(jìn)行測試，從中篩選出能夠與含這類結(jié)構(gòu)域的Mhp3片段結(jié)合的產(chǎn)物。為了篩選出只特異性結(jié)合第一種Mhp3同系物而不能特異結(jié)合另一種不同的Mhp3同系物的抗體，技術(shù)人員可以根據(jù)只同第一種Mhp3同系物結(jié)合而不結(jié)合其它Mhp3同系物的結(jié)果，完成篩選。
本發(fā)明還提供了特異性針對mhp3編碼蛋白質(zhì)的一個結(jié)構(gòu)域的抗體。另外還提供了特異性針對mhp3編碼蛋白質(zhì)的一個表位的抗體。
上述抗體可以用于本領(lǐng)域中與本發(fā)明所述的mhp3編碼的蛋白質(zhì)序列的定位及活性有關(guān)的已知方法中，例如，測定其在合適生理樣品、診斷方法、免疫治療等實(shí)驗(yàn)中的水平。
mhp3試劑盒本發(fā)明還提供了用于檢測豬肺炎支原體的試劑盒。在一個實(shí)施方案中，所述試劑盒提供了用于檢測抗豬肺炎支原體Mhp3蛋白的循環(huán)抗體的試劑。在某些實(shí)施方案中，所述試劑盒包括一份說明該試劑盒可用于診斷豬肺炎支原體感染的說明書。所述試劑盒中至少包括一個其中盛有一種蛋白質(zhì)的容器，該蛋白質(zhì)的氨基酸序列中包含SEQ ID NO:4所示序列中的至少30個連續(xù)的氨基酸。在該實(shí)施方案的一個模式中，所述試劑盒還包括一種抗-豬的第二抗體。在該實(shí)施方案的一個優(yōu)選模式中，所述第二抗體偶聯(lián)到一種能夠催化顯色反應(yīng)的酶上，例如，偶聯(lián)到堿性磷酸酶或辣根過氧化物酶上。在該實(shí)施方案的另一模式中，所述試劑盒還包括用于顯色反應(yīng)的試劑。
在另一個實(shí)施方案中，所述試劑盒提供了用于檢測豬肺炎支原體核酸的試劑。在該實(shí)施方案的一個模式中，所述試劑盒提供了用于PCR檢測豬肺炎支原體核酸的試劑，并且該試劑盒中包括至少一個其中盛有第一種分離的DNA以及第二種分離的DNA的容器，所述第一種分離的DNA包含至少15個核苷酸的片段，這些片段能在嚴(yán)緊條件下與以支原體遺傳密碼編碼序列中包含SEQ ID NO:2中的至少5個連續(xù)氨基酸的蛋白質(zhì)的DNA雜交，所述第二種分離的DNA包含至少15個核苷酸的片段，這些片段能在嚴(yán)緊條件下與以支原體遺傳密碼編碼序列中包含SEQ IDNO:2中的至少5個連續(xù)氨基酸的蛋白質(zhì)的DNA的互補(bǔ)DNA雜交。在該實(shí)施方案的另一模式中，所述試劑盒提供了用于以雜交為基礎(chǔ)檢測豬肺炎支原體基因組的方法中所使用的試劑，并且該試劑盒中包括至少一個其中盛有一種分離的DNA的容器，所述DNA包含至少15個核苷酸的片段，該片段能在嚴(yán)緊條件下與以支原體遺傳密碼編碼序列中包含SEQID NO:2中的至少5個連續(xù)氨基酸的蛋白質(zhì)的DNA或其互補(bǔ)序列雜交，其中所述雜交特異性地針對豬肺炎支原體。本文使用的術(shù)語“與豬肺炎支原體特異性雜交”是指與豬肺炎支原體基因組選擇性雜交而不與豬鼻支原體、絮狀支原體、蕈狀支原體等其它相關(guān)種類支原體的基因組雜交。
疫苗制劑以及使用方法由于本發(fā)明所述Mhp3蛋白抗原能夠大規(guī)模生產(chǎn)，所以這樣制備并純化而成的抗原可以用于生產(chǎn)疫苗制劑。所述Mhp3蛋白還可以用于免疫分析，例如，檢測或測量取自免疫后或潛在感染的實(shí)驗(yàn)動物的體液樣品中的抗該抗原的抗體，從而監(jiān)測免疫應(yīng)答和/或診斷動物感染。
含有以免疫原性多肽作活性成分的疫苗制劑的制備是本領(lǐng)域技術(shù)人員眾所周知的。
疫苗效果的測定用Mhp3抗原單獨(dú)或與至少一種其它多肽聯(lián)合免疫后監(jiān)測實(shí)驗(yàn)動物的免疫應(yīng)答，或者使用本領(lǐng)域已知的任一免疫分析實(shí)驗(yàn)可測定Mhp3抗原的免疫能力。在一個優(yōu)選實(shí)施方案中，所述的其它多肽選自豬肺炎支原體P46、P65、P97和P102蛋白質(zhì)。可以將體液(抗體)應(yīng)答和/或細(xì)胞介導(dǎo)的免疫力的產(chǎn)生視為免疫應(yīng)答的指征。
該疫苗的接種方法包括口服、皮內(nèi)、肌內(nèi)、腹膜內(nèi)、靜脈內(nèi)、皮下、鼻內(nèi)或其它任一種常用的免疫途徑。受試者免疫應(yīng)答也可以用下述的多種方法來分析用已知技術(shù)分析得到的免疫血清與Mhp3抗原的反應(yīng)能力，所述技術(shù)如酶聯(lián)免疫吸附測定(ELISA)、免疫印跡、放射性免疫沉淀等，或者當(dāng)Mhp3抗原能展示抗原性或免疫原性時，通過保護(hù)免疫宿主不受豬肺炎支原體感染和/或減輕免疫宿主因豬肺炎支原體感染所引發(fā)的癥狀來分析免疫應(yīng)答。
疫苗制劑本發(fā)明所述疫苗包含重組Mhp3和/或其片段、變體及衍生物。在某些實(shí)施方案中，本發(fā)明所述疫苗中含有Mhp3以及至少一種其它抗原性豬肺炎支原體多肽。適合與Mhp3聯(lián)合使用的抗原性多肽包括但不限于P46、P65、P97和P102蛋白質(zhì)和/或所述多肽的片段、變體及衍生物。所述疫苗中的非Mhp3多肽，例如P46、P65、P97和P102蛋白和/或其片段、變體及衍生物可以從豬肺炎支原體培養(yǎng)物中純化而來，或以重組表達(dá)方法得到。
所述疫苗的合適制劑還包括可注射的液體溶液或懸浮液；也可以制備成在注射前溶于或懸浮于液體中的固體形式。也可以制成乳化劑。通常，將所述的活性成分與藥物學(xué)上可接受并能與該活性成分匹配的佐劑相混合。
有效佐劑的實(shí)例包括，但不限于氫氧化鋁、N-乙酰-胞壁酰-L-蘇氨酰-D-異谷氨酰胺(thr-MDP)、N-乙酰-去甲(nor)-胞壁酰-L-丙氨酰-D-異谷氨酰胺、N-乙酰胞壁酰-L-丙氨酰-D-異谷氨酰-L-丙氨酸-2-(1’-2’-棕櫚酰-順(sn)-甘油基-3-羥基磷酰氧基)-乙胺。
佐劑的效果可以通過下述手段來測定測量抗含Mhp3多肽表位的免疫原性多肽的抗體的誘導(dǎo)量，測量接種含這種多肽并同時還含有各種佐劑的疫苗后抗體的生成量。
可以將所述多肽配制成中性或鹽類的疫苗形式。藥物學(xué)上可接受的鹽類包括酸加成鹽(所述肽游離氨基端形成的)以及與無機(jī)酸形成的鹽，所述無機(jī)酸如，鹽酸或磷酸等無機(jī)酸，或者與乙酸、草酸、酒石酸、馬來酸等有機(jī)酸。由游離的羧基形成的鹽類也可以衍生自氫氧化鈉、氫氧化鉀、氫氧化銨、氫氧化鈣、或氫氧化三鐵等無機(jī)堿，以及異丙胺、三甲胺、2-乙氨基乙醇、組氨酸、普魯卡因等有機(jī)堿。
可以使用多種方法將本發(fā)明所述疫苗制劑引入體內(nèi)；這些方法包括但不限于口服、皮內(nèi)、肌內(nèi)、腹膜內(nèi)、靜脈內(nèi)、皮下、鼻內(nèi)途徑以及通過劃痕(劃破皮膚表層，例如用一叉狀針)。
所述的接種疫苗的受試者優(yōu)選是一種動物，最優(yōu)選是豬。
本發(fā)明所述的疫苗制劑含有免疫有效量的Mhp3蛋白和藥物學(xué)上可接受的載體。疫苗制劑包含免疫有效量的一種或多種抗原以及藥物學(xué)上可接受的載體。本領(lǐng)域所熟知的藥物學(xué)上可接受的載體包括但不限于鹽水、緩沖鹽水、葡萄糖、水、甘油、無菌的等滲含水緩沖液及其組合。這種可接受載體的一個實(shí)例是含有一種或多種穩(wěn)定劑的生理平衡培養(yǎng)基，所述穩(wěn)定劑如穩(wěn)定的水解蛋白、乳糖等。優(yōu)選該載體是無菌的。制劑形式應(yīng)該適合所述的接種方式。
在一個具體的實(shí)施方案中，在第一個容器中提供了一種凍干的本發(fā)明所述的Mhp3多肽；第二個容器中包含由50％甘油水溶液、0.25％苯酚、以及一種防腐劑(例如，0.005％亮綠)組成的稀釋劑。
可以用標(biāo)準(zhǔn)方法將純化后的抗原用于疫苗制劑。例如，應(yīng)該將所述純化蛋白質(zhì)調(diào)整到一合適的濃度，配以任一合適的疫苗佐劑并包裝，備用。合適的疫苗佐劑包括，但不限于礦物凝膠，例如氫氧化鋁；表面活性劑，例如溶血卵磷脂；糖甙，例如Quill A等皂角甙衍生物；多聚醇；聚陰離子；非離子嵌段多聚物，例如多聚醇(Pluronic F-I 27)(BA.S.F.,USA)；肽；礦物油，例如Montanide ISA-SO(Seppic,Paris,France)，油類乳狀液(oil emulsions)，例如BayolF/Arlacel A和水等礦物油乳狀液，或者一種由植物油、水和乳化劑如卵磷脂組成的油乳狀液；明礬，以及MDP。也可以將所述免疫原引入到脂質(zhì)體中，或者偶聯(lián)到多糖和/或其它可用于疫苗制劑的聚合物上。當(dāng)重組抗原是一種半抗原，即具有抗原性因而能與相關(guān)抗體選擇性反應(yīng)，但不具有免疫原性因而不能激發(fā)免疫應(yīng)答的分子時，可以將所述半抗原共價偶聯(lián)到一種載體或免疫原性分子上；例如，血清白蛋白等大分子蛋白可賦予與其偶聯(lián)的半抗原免疫原性?？梢耘渲扑霭肟乖?載體用作疫苗。
本發(fā)明所述疫苗的有效劑量(免疫量)可以從根據(jù)模式實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)繪制的劑量-反應(yīng)曲線中推算出來。
本發(fā)明還提供了一種含有一個或多個容器的藥用包裝或試劑盒，這些容器中裝有本發(fā)明所述疫苗制劑中的一種或多種成分。
因此，本發(fā)明提供了一種免疫動物或者治療或預(yù)防動物的各種疾病或癥狀的方法，該方法包括向該動物施用有效免疫劑量的本發(fā)明所述疫苗。
用本發(fā)明所述疫苗生產(chǎn)的抗體的用途用本發(fā)明所述Mhp3蛋白免疫生產(chǎn)的抗所述抗原的抗體還在診斷免疫分析、被動免疫治療以及抗獨(dú)特性抗體制備等方面具有潛在用途。
可以用本領(lǐng)域已知技術(shù)(例如，免疫親和層析、離心、沉淀等)分離生產(chǎn)到的抗體并將其用于診斷免疫分析。也可以將本發(fā)明所述抗體用于監(jiān)控治療和/或疾病進(jìn)程。任一本領(lǐng)域已知的免疫分析系統(tǒng)，例如上述的免疫分析系統(tǒng)都可以用于這項(xiàng)用途，這些系統(tǒng)包括但不限于使用下述技術(shù)的競爭性或非競爭性分析系統(tǒng)所述技術(shù)如放射性免疫分析、ELISA(酶聯(lián)免疫吸附測定)、“夾心”免疫測定、沉淀素反應(yīng)、凝膠擴(kuò)散沉淀素反應(yīng)、免疫擴(kuò)散測定、凝集試驗(yàn)、補(bǔ)體-固定試驗(yàn)、免疫放射分析、熒光免疫測定、蛋白A免疫測定和免疫電泳試驗(yàn)，等。
本發(fā)明所述疫苗制劑也可以用于制備可用于被動免疫療法的抗體，其中通過施用預(yù)先制備的抗異源生物的抗體可以為宿主提供短期保護(hù)。
在免疫方法中，所用免疫原的量以及免疫方案可由本領(lǐng)域技術(shù)人員來確定，并可根據(jù)受試者的免疫應(yīng)答及抗體滴度來測定。
包裝如果需要，可以將所述組合物置于一包裝或分裝裝置，該包裝或分裝裝置包括一個或多個含活性成分的單位劑量形式。所述包裝可以例如包括金屬或塑料箔、例如泡沫包裝。所述包裝或分裝裝置可以配有給藥說明。還可以制備組合物，并將其置于一合適容器中，而且標(biāo)示治療適應(yīng)癥，上述組合物包括一種置于可接受藥用載體中的本發(fā)明所述化合物。
實(shí)施例豬肺炎支原體染色體DNA的分離采用Dybvig和Alderete(質(zhì)粒.20:33-41;1985)的方法，從豬肺炎支原體基因組中分離基因組DNA，其中離心(10min.、6000g、4℃)收獲細(xì)胞，然后懸浮于磷酸鹽緩沖液中，加入0.1體積的10％十二烷基硫酸鈉裂解。用經(jīng)Tris-HCl飽和后的苯酚、氯仿及異戊醇(25:24:1)混合物抽提裂解物。用氯仿提取水相，加入0.1體積的3M乙酸鈉和2體積的冰冷乙醇沉淀核酸。-20℃保溫1小時，用微量離心機(jī)離心10分鐘回收核酸。將核酸重懸于加入了20μg RNase A/ml的水中，所得樣品保存于-20℃。
豬肺炎支原體mhp3的分子克隆根據(jù)此前鑒定的Mhp3的部分氨基酸序列(SEQ ID NOs:7-9)，設(shè)計并合成了(Genosys Biotechnologies,Inc.;The Woodlands,TX)簡并的寡核苷酸引物KWK40、KWK41、KWK42、KWK43、KWK42RC和KWK43RC(SEQ ID NOs:10-15)(國際專利申請WO96/28472)。在含有1x PCR緩沖液(Perkin Elmer;Foster City,CA)、2.0mM MgCl2、1mM各種引物、400uM各種脫氧NTP以及2.5 U AmpliTaq Gold(Perkin Elmer)的50μl反應(yīng)溶液中用各種組合的上述引物進(jìn)行聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)。擴(kuò)增條件為94℃變性2分鐘，接著進(jìn)行變性(94℃、1min)、退火(56℃、1min)和聚合(72℃,1mim)共25個循環(huán)。使用引物KWK41(SEQ IDNO:11)和KWK42RC(SEQ ID NO:14)，用410ng的豬肺炎支原體232菌株(傳代次數(shù)n=5)的染色體DNA擴(kuò)增出長約250bp的片段。將該片段亞克隆到pCR2.1-TOPO(Invitrogen;Carlsbad,CA)的TA克隆位點(diǎn)中；用連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌TOP10細(xì)胞(Invitrogen)。用雙脫氧核苷酸鏈終止測序(Advanced Genetic Analysis Center;St.Paul,MN)以及限制性內(nèi)切酶消化后接瓊脂糖凝膠電泳的方法，對克隆進(jìn)行鑒定。
反向PCR是一種用于擴(kuò)增DNA核心區(qū)域的側(cè)翼序列的方法(Ochman,H.,Medhora,M.M.,Garza,D.,and Harti,D.L.1990.In”PCR法方法及應(yīng)用指南”Academic Press,San Diego,CA)。用該方法克隆Mhp3編碼基因的殘留5’和3’末端。豬肺炎支原體232菌株(傳代次數(shù)n=5)染色體DNA片段的庫(Pools)通過僅用下列限制性內(nèi)切酶消化未切割DNA便可制備而成AluⅠ,BamHⅠ,EcoRV,EcoRⅠ,HaeⅢ,HincⅡ,HindⅢ,NdeⅠ,PvuⅡ,Sau3AⅠ,SpeⅠ,SspⅠ,XbaⅠ.消化后，通過連接環(huán)化這些片段，并用寡核苷酸引物RAC3(SEQ ID NO:16)和RAC4(SEQ ID NO:17)進(jìn)行PCR反應(yīng)，這兩個引物是根據(jù)上述250bp片段的序列設(shè)計而成。這些引物的擴(kuò)增條件為94℃變性2分鐘，接著進(jìn)行變性(94℃、1min)、退火(55℃、1min)和聚合(72℃,2mim)共40個循環(huán)。經(jīng)Sspl-消化的染色體DNA的庫產(chǎn)生了長約600bp的片段，將該片段亞克隆到PCR2.1-TOPO中。該克隆片段的序列分析鑒定了所述基因的5’末端。為了得到mhp3 3’末端的相應(yīng)序列，根據(jù)這一序列設(shè)計寡核苷酸引物RAC7(SEQ ID NO:18)和RAC8(SEQ ID NO:19)。這些引物的擴(kuò)增條件為94℃變性9分鐘，接著進(jìn)行變性(94℃、30秒)、退火(50℃、30秒)和聚合(72℃，1分鐘)共40個循環(huán)。當(dāng)用Spel-消化的DNA庫用作模板時，擴(kuò)增出多種產(chǎn)物(從250bp到大于1Kb)；將得到的片段混合物克隆到PCR2.1-TOPO中。最大克隆片段(約1.2Kb)的序列分析提供了另外的3′序列數(shù)據(jù)。從這些數(shù)據(jù)中設(shè)計并合成出了寡核苷酸RAC12(SEQ ID NO:20)和RAC15(SEQ ID NO:23)，這兩引物可用于以HindⅢ-消化的DNA庫作模板的PCR擴(kuò)增反應(yīng)中。反應(yīng)參數(shù)為94℃變性9分鐘，接著進(jìn)行變性(94℃、30秒)、退火(55℃、30秒)和聚合(722,2mim)共40個循環(huán)，最后于72℃繼續(xù)聚合2分鐘。擴(kuò)增到一長約600bp的片段，克隆到pCR2.1-TOPO中并測序。得到的數(shù)據(jù)提供了Mhp3編碼序列的其余3’序列。用HincⅡ消化的DNA庫作模板進(jìn)一步用RAC12(SEQ ID NO:20)和RAC15(SEQ ID NO:23)進(jìn)行PGR擴(kuò)增。擴(kuò)增條件為94℃變性9分鐘，接著進(jìn)行變性(94℃、1分鐘)、退火(55℃、1分鐘)和聚合(72℃,3mim)共35個循環(huán)，最后72℃繼續(xù)聚合7分鐘。擴(kuò)增到約700bp片段，將其克隆到pCR2.1-TOPO中。對克隆片段測序得到新的3’序列數(shù)據(jù)，包括編碼所述多肽羧基端的序列數(shù)據(jù)。
用從上述初始測序中得到的結(jié)果，設(shè)計用于特異性擴(kuò)增直接來源于低傳代次數(shù)(n=4)豬肺炎支原體232菌株染色體DNA的mhp3基因的寡核苷酸引物。對這些產(chǎn)物直接測序，以避免因PCR擴(kuò)增及后續(xù)克隆步驟中可能出現(xiàn)的突變而在序列中引入人為假象。
用位于mhp3基因側(cè)翼的合成寡核苷酸從染色體DNA中特異性地擴(kuò)增出開放閱讀框(ORF)。PCR擴(kuò)增分三份進(jìn)行，50μl樣品終體積中含引物Mhp3-U1(SEQ ID NO:31)和Mhp3-D(SEQ ID NO:33)各1μM、360ng純化的染色體DNA、1xPCR緩沖液(Ab Peptides,Inc;St.Louis,MO)、dNTP各200μM、7.5 U KlenTaql(Ab Peptides,Inc)以及0.15 U克隆的Pfu(Stratagene;La Jolla1CA)熱穩(wěn)定性聚合酶。擴(kuò)增條件為94℃變性5分鐘，接著進(jìn)行變性(94℃、30秒)、退火(55℃、30秒)和聚合(72℃；3分鐘，45秒)共40個循環(huán)，最后72℃繼續(xù)延伸7分鐘。擴(kuò)增后，收集三份擴(kuò)增后的樣品，并通過旋轉(zhuǎn)層析(QlAiulckTM PCR純化試劑盒，Olagen;Santa Clarita,CA)提取，純化到特異性產(chǎn)物。然后，在ABI自動DNA測序儀(Lark TechnologiesInc.,l-louston,TX)上，用雙脫氧末端終止反應(yīng)對收集到的混合物直接測序。
用合成的寡核苷酸引物(SEQ ID NOs:16～28,31，和33)對豬肺炎支原體232菌株擴(kuò)增產(chǎn)物的兩條DNA帶測序。所述mhp3基因的核苷酸序列以及推導(dǎo)的由該區(qū)域編碼的Mhp3蛋白分別見SEQ ID NO:1和SEQID No 2。
由SEQ ID NO:1中第97-1452位核苷酸組成的mhp3 ORF編碼451個氨基酸的蛋白質(zhì)(SEQ ID NO:2)，該蛋白的理論分子量為49,775道爾頓。這種編碼多肽中含有8個色氨酸殘基，其中的7個由TGA密碼子編碼(mRNA中為UGA)，已知該氨基酸在許多支原體亞種(Dybvig,K.,1990.微生物學(xué)年評44:81-104;Yamao1F.1Muto,A.1Kawauchi1Y.11985,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.82:2306-2309)中特異性增加。該編碼蛋白質(zhì)的氨基末端具有特征性的原核細(xì)胞信號序列(von Heijne,G.,1985.分子生物學(xué)雜志184:99-105;Nielsen,H.,Engelbrecht,J.,Brunak,S.,and yon Heijne,G.1 1997.蛋白質(zhì)工程10:1-6)，盡管切割的確切位點(diǎn)目前還未知。該編碼蛋白質(zhì)(SEQ ID NO:2)第29位半胱氨酸殘基被認(rèn)為是經(jīng)下述處理修飾而成的添加與巰基-連結(jié)的脂肪酸使Mhp3成為脂蛋白(Razin,S.,Yogev,D.,and Naot,Y.1998.微生物學(xué)和分子生物學(xué)評論62:1094-1156)。
當(dāng)用Basic Local Alignment Search Tool(BLAST)程序(Altschul,S.F.,Gish,W.,Miller,w.,Myers,E.W.1 Lipman,D.J.,1990.分子生物學(xué)雜志215:403-410)將mhp3 ORF與現(xiàn)有的核苷酸及蛋白數(shù)據(jù)庫對比時，登錄顯示它與精氨酸支原體的Ag 234-5蛋白質(zhì)(GenBankAccession No.D1 6674)之間具有最大同源性。當(dāng)用CLUSTAL W(Thompson,J.D.,Higgins,D.G.,and Gibson,T.J.,1994.核酸研究，22:4673-4680)排列這兩多肽時，Mhp3和Ag 234-5蛋白質(zhì)(圖1)之間的氨基酸同一性百分率為36.2％。盡管Ag 234-5編碼基因最初從精氨酸支原體中鑒定出來(Ushio,S.,Iwaki,K.,Taniai,M,Ohta,T.,Fukuda,S.,Sugimura,K,and Kurimoto,M.,1995.微生物學(xué)和免疫學(xué)39:395-400)，但是最近研究結(jié)果表明該基因?qū)嶋H來自豬鼻支原體(Droesse,M.,Wise,KS.,1998.Abstract E20～12thInternational Organisation of Mycoplasmology Conference.Sydney,AU)。在那些研究中，用PGR、Southern印跡雜交以及Western印跡分析得到的結(jié)論認(rèn)為Ag 234-5在包括豬肺炎支原體在內(nèi)的其它支原體中不是保守的。
使用威斯康星大學(xué)遺傳學(xué)計算機(jī)小組的STEMLOOP程序(Devereux,J.,Haeberli,P.,and Smithies,O.,1984.核酸研究12:387-395)，鑒定mhp3 ORF的下游序列，具體為SEQ ID NO:1中的第1519-1550位核苷酸，這些核苷酸可以形成一莖-環(huán)結(jié)構(gòu)。莖由14個堿基反向重復(fù)序列形成，被4堿基的環(huán)間隔開來。該結(jié)構(gòu)的實(shí)際存在狀態(tài)及潛在功能目前還不得而知。
另一個ORF也由SEQ ID NO:5中的DNA片段編碼。這個ORF存在于基因mhp3的相反鏈中，包括SEQ ID NO:1中的第602～1位核苷酸。這個預(yù)測的ORF編碼至少為200個氨基酸的蛋白質(zhì)，被稱為“ORF1”并示于SEQ ID NO:6，其理論分子量為22,528道爾頓。該ORF經(jīng)由所述DNA片段(SEQ ID NO:1)末端延續(xù)并且呈開放狀態(tài)，這一事實(shí)表明編碼多肽的實(shí)際分子量可能大于22，528道爾頓。盡管Mhp3和“ORF1”編碼于相反鏈，但是它們之間每個密碼子第三個堿基(“擺動”位置)是相同的。因此，“ORF 1”中的任一特定氨基酸密碼子的擺動堿基都為mhp3基因中編碼特定氨基酸的相反鏈所共有。理論上講，兩種蛋白質(zhì)的共有編碼序列的獨(dú)特排列能夠?qū)hp3和“ORF1”的密碼子擺動位置上的遺傳漂移影響降到最低，從而使這兩種蛋白質(zhì)的保守程度最高。
質(zhì)粒及保藏材料的制備制備mhp3基因片段，將其保藏于美國典型培養(yǎng)物保藏中心(ATCC)。將上述使用特異性5’及3’引物Mhp3-U1(SEQ ID NO:31)及Mhp3-D(SEQ ID NO:33)的三份PCR反應(yīng)中得到的收集混合物，使用旋轉(zhuǎn)層析(spin chromatography)(QlAquickTM)提取對其進(jìn)行分離，并將其插入到pCR2.1-TOPO的TA克隆位點(diǎn)。使用載體特異性測序引物的單一序列延伸反應(yīng)確證了擴(kuò)增到的1,692堿基對片段的終點(diǎn)，結(jié)果表明Mhp3的編碼基因與乳糖啟動子的方向相反。這種質(zhì)粒構(gòu)建體被稱為pER427，將其導(dǎo)入大腸桿菌TOP10細(xì)胞(Invitrogen,Carlsbad,CA)，得到的菌株被命名為Pz427。
mhp3基因的定點(diǎn)誘變制備用于大腸桿菌表達(dá)的Mhp3編碼DNA需要對豬肺炎支原體mhp3基因進(jìn)行如下修飾除去編碼假定前導(dǎo)序列及脂肪酸連接位點(diǎn)半胱氨酸29的序列，寧將6個TGA密碼子轉(zhuǎn)變?yōu)門GG密碼子。用于擴(kuò)增不含信號肽編碼序列的基因的寡核苷酸引物被稱為為RAC 23(SEQ ID NO:29)和RAC 24(SEQ ID NO:30)。擴(kuò)增豬肺炎支原體基因組232菌株(傳代次數(shù)n=5)染色體DNA的條件為94℃變性9分鐘，接著進(jìn)行變性(94℃、1分鐘)、退火(50℃、1分鐘)和聚合(72℃，2分鐘)共25個循環(huán)，最后72℃繼續(xù)聚合7分鐘。將擴(kuò)增到的片段克隆到pCR2。1-TOPO中；測序并限制性內(nèi)切酶消化后進(jìn)行凝膠電泳分析確定克隆是否成功?？寺∑?’末端序列編碼起始甲硫氨酸殘基，隨后是位于編碼多肽第29位半胱氨酸殘基后的色氨酸殘基(參見SEQ ID NO:2)。在3’端，在序列RAC 24(SEQ ID NO:30)的作用下無意間導(dǎo)入了(SEQ ID NO:1中第1427和位1428之間)T核苷酸，從而使野生型多肽的羧基端7個氨基酸Ile-Thr-Asp-Ile-Asn-Lys-Asn(SEQ ID NO:2)被序列Asn-Tyr-Arg-Tyr所取代。寡核苷酸RAC 23(SEQ ID NO:29)及RAC 24(SEQ ID NO:30)在近5’端分別含有限制性位點(diǎn)NdeⅠ和xbaⅠ，這樣可將所述基因克隆到不同質(zhì)粒中。另外，在各引物5’端添加了附加核苷酸(RAC 23(SEQ IDNO:29)為6個；RAC 24(SEQ ID NO:30)為7個)這樣有助于各自限制酶的切割。
編碼信號肽的序列一旦被除去，6個內(nèi)在的TGA密碼子便保留于基因中。為了確保全長多肽在大腸桿菌中的表達(dá)，通過體外寡核苷酸定點(diǎn)誘變將這些密碼子轉(zhuǎn)化為TGG密碼子。將質(zhì)粒pCR2.1-TOPO:mhp3轉(zhuǎn)化入大腸桿菌CJ236菌株(dut-ung-)。向含有質(zhì)粒的細(xì)胞中加入輔助噬菌體R408，生產(chǎn)具有含尿嘧啶-單鏈(ss)DNA的噬菌體顆粒。分離這些顆粒，然后提取并沉淀純化出ssDNA。使用寡核苷酸Mhp3-2M、Mhp3-3M、Mhp3-4M、Mhp3-5M、Mhp3-6M、Mhp3-7M(見SEQ ID NOs:35-40)作模板以及來源于MutaGene System(BioRad Laboratories;Hercules,CA)的試劑進(jìn)行誘變。將上述ssDNA、寡核苷酸以及退火緩沖液混合在一起，加熱到70℃，然后在1小時內(nèi)將溫度降至30℃。加入T4 DNA連接酶、T7 DNA聚合酶以及合成緩沖液進(jìn)行互補(bǔ)鏈的合成。將混合物在冰上放置5分鐘，然后室溫放置5分鐘，然后37℃下保溫30分鐘。將得到的雙鏈DNA分子轉(zhuǎn)化到DH5α超感受態(tài)(UltraComp)細(xì)胞(GibcoBRL;Gaithersburg,MD)中。增殖克隆，通過測序篩選所需突變。所有突變(TGA＞TGG)都用該方法確證。此外，利用寡核苷酸Mhp3-2M(SEQID NO:35)序列，在野生型基因(SEQ ID NO:1)的第388位核苷酸處不經(jīng)意地發(fā)生了A＞G轉(zhuǎn)變。這就導(dǎo)致野生型Mhp3(SEQ ID NO:2)中第98位氨基酸殘基由絲氨酸(AGT)變?yōu)楦拾彼?GGT)。
上述變化得到的重組mhp3基因(具有或不具有上述非故意(Inadvertent)A＞G轉(zhuǎn)變)描述見SEQ ID NO:3，所述重組mhp3基因編碼的開放閱讀框見SEQ ID NO:4。
將重組mhp3基因克隆到表達(dá)載體和表達(dá)宿主菌株中為了表達(dá)重組蛋白，將突變后的不含信號肽編碼序列的mhp3基因(SEQ ID NO:3)克隆到pBAD/Thio-TOPO表達(dá)質(zhì)粒(Invitrogen)；將該構(gòu)建體直接轉(zhuǎn)化入表達(dá)宿主大腸桿菌BL21。鑒定出含有適合質(zhì)粒的克隆。
重組Mhp3蛋白的表達(dá)將表達(dá)硫氧還蛋白-Mhp3融合蛋白的大腸桿菌BL21轉(zhuǎn)化子的凍存溶液融化，并將其以1∶5000稀釋度接種到RWLDM/D vi已知成分培養(yǎng)基，所述培養(yǎng)基中含有如下成分K2HPO4(6g/l),KH2PO4(3g/l),(NH4)2SO4(5g/l),NaCl(2g/l),0.2ml CaCl2(15 g/l),0.4ml FeCl3·6H2O(5g/l),0.4ml MgSO4·7H2O(480g/l),ZnCl2(6.5 g/l,MnSO4·H2O(12g/l),Na2MoO4·2H2O(5g/l),CuSO4(1.5g/l),CoCl2·6H2O(2g/l),H3BO3(0.5g/l)，以及37％HCl(5ml/l)。另外再加入羧芐青霉素至濃度為125μg/ml。37℃下，在5升工作體積的BioFlow 3000發(fā)酵罐(NewBrunswick Scientific;Edison,N,1)中，采取補(bǔ)料分批方法(50％葡萄糖)培養(yǎng)培養(yǎng)物，直至A625達(dá)10～20。
用離心的方法，從上述5升發(fā)酵罐中收獲表達(dá)有重組硫氧還蛋白-Mhp3大腸桿菌BL21轉(zhuǎn)化子的濕細(xì)胞，并將其重懸于磷酸鹽緩沖液。機(jī)械方法裂解上述細(xì)胞。離心后，棄沉淀。將上清液流經(jīng)離子交換柱，用NaCl梯度溶液洗脫。收集含融合蛋白的級分，透析除去NaCl，用0.2μm濾器過濾除菌。將該制品用于疫苗實(shí)驗(yàn)。
重組Mhp3的免疫學(xué)特性用BCA蛋白分析試劑盒(Pierce)，測定用上述方法制備的重組硫氧還蛋白-Mhp3的蛋白濃度。簡要地說，每種樣品用無菌的去離子蒸餾水(ddH2O)作1/10、1/20、1/40和1/80稀釋。將BSA(蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn))稀釋為200～800μg/ml的濃度。取20μl樣品或標(biāo)準(zhǔn)物以三份孔的方式加入到96孔微量滴定板。向每孔中加入200μl以1/50稀釋于試劑A中的試劑B。將上述滴定板37℃保溫30分鐘。560nm處測定樣品吸光度。用BSA標(biāo)準(zhǔn)曲線通過外推法計算各樣品的蛋白質(zhì)濃度。
將重組Mhp3(蛋白含量可變)以及豬肺炎支原體、豬鼻支原體和蕈狀支原體蕈狀亞種整個細(xì)菌細(xì)胞裂解物的等份試樣重懸于10μl終體積，加入10μl 2x還原樣品緩沖液(Owl Scientific)。樣品100℃加熱10min，將上述的全體積加入到10-孔，1.5mm厚，10％Tris-甘氨酸凝膠的獨(dú)立孔中(Novex)。所述凝膠中還包括未染色的大范圍分子量的標(biāo)準(zhǔn)參照物(Novex)。
在100mA恒定電流下作用1小時，將SDS-PAGE分離的蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到PVDF膜(Owl Scientific)。將印跡置于含5％脫脂奶粉和0.5％Tween20的TBS(TBST)封閉緩沖液中，室溫保溫1小時，同時輕柔振蕩。除去封閉緩沖液，用TBST洗膜1次，5分鐘。用豬肺炎支原體232菌株進(jìn)行攻擊試驗(yàn)后，從豬體內(nèi)取得第一抗體。將稀釋后的血清加到膜上，室溫保溫1小時。稀釋堿性磷酸酶-偶聯(lián)蛋白G抗體(Pierce)，加到洗滌后的膜上，室溫保溫1小時。用TBST洗膜，將底物BCIP/NBT(Kirkegaerd and Perry Laboratories)加到膜上，保溫至出現(xiàn)合適的顏色。然后用水浸膜終止反應(yīng)，室溫干燥。
從用豬肺炎支原體實(shí)驗(yàn)攻擊后的豬體中得到的血清確實(shí)識別出了純化后的重組表達(dá)Mhp3(圖2)，鑒定出60kDa條帶。這一結(jié)果表明所述重組蛋白表達(dá)有這樣的表位，所述表位能被豬應(yīng)答豬肺炎支原體全細(xì)胞攻擊后體內(nèi)產(chǎn)生的抗體所識別。
測試重組Mhp3作為候選疫苗的效果的動物實(shí)驗(yàn)獲取未被豬肺炎支原體免疫或沒有豬肺炎支原體引發(fā)疾病史的健康雜種豬(約12～16日齡)。按隨機(jī)分組方法分配動物。開始實(shí)驗(yàn)前，讓豬有至少5天的適應(yīng)新環(huán)境的時間。
當(dāng)豬為約19～23日齡時，在第“0”天時，用1ml合適實(shí)驗(yàn)疫苗通過肌內(nèi)(IM；頸部左側(cè)肌肉)途徑免疫動物。
第一次免疫后約2～3周時，給豬第二次接種上述合適實(shí)驗(yàn)疫苗，劑量為1ml(IM；頸部右側(cè)肌肉)。接近觀察所有的豬(1小時或指定的時間內(nèi))，看其是否出現(xiàn)接種后的信號嘔吐、抑郁、腹瀉、共濟(jì)失調(diào)、呼吸急促、或顫抖。
第二次免疫后約2～4周時，用1ml/鼻孔豬肺炎支原體232菌株的活的強(qiáng)毒性肺組織勻漿培養(yǎng)物攻擊鼻腔，上述培養(yǎng)物中含約5.0×108顏色改變單元/ml(CCU/ml)。
攻擊后約4天時，將所有攻擊后的動物作尸體剖檢。取肺，并對豬肺炎支原體感染導(dǎo)致的特征性病變作粗略評估。用圖象分析測定單個肺部病變的分值?？梢詮拿總€攻擊動物中獲得偏性樣品(biassample)，用于細(xì)菌分離(組織的CCU/g)、病理組織學(xué)及IFA。
微生物的保藏在1999年9月9日，將下列微生物菌株保藏于美國典型培養(yǎng)物保藏中心(ATCC),10801 UnIversity Blvd.,Manassas,VA，獲得下列保藏號微生物 保藏號Pz427 PTA-634本發(fā)明不僅限于本發(fā)明所述特定實(shí)施方案的范圍。實(shí)際上，本領(lǐng)域技術(shù)人員很容易地認(rèn)識到，除本發(fā)明描述的內(nèi)容外，可以從上述說明書及附圖中做出各種改進(jìn)。這些改進(jìn)都將落入所附權(quán)利要求的范圍之內(nèi)。
本發(fā)明中上述的各種參考文獻(xiàn)，包括專利申請、專利及公開出版物，在此整體引入作為參考。
SEQUENCE LISTING<110>King et a1.<120>豬肺炎支原體mhp3基因的核酸和蛋白以及其應(yīng)用<130>PC10555<140>To be assigned<141>1999-09-29<160>41<170>patentIn Ver.2.0<210>1<211>1692<212>DNA<213>豬肺炎支原體<400> 1gtttttgaat ataatagaaa atgtaaaata aaaattaatt tattaaaaaa taattgaaag 60tcatcgtaat taaaacaatt aattaggaga acaactatga aaaaaaagat aaaatgaaat 120aaatttcttg gcttaggctt agtttttccg ctttcagcaa tcgcgacaat ctctgccgga 180tgttgggata aagaaacaac taaagaagaa aaatcagccg ataatcaaaa taagcaaatc 240actgatgtct caaaaatttc aggactagtt aatgaacgaa aatccgaaat tatggccgca 300aaagctgatg caaacaaaca ttttgggcta aatatggcaa ttgtaaccgc tggtggaacg 360gtaaatgata attcatttaa ccaatcaagt tgagaggcaa ttcaacaact tggcgctctt 420actggaggtg agattacttc agtagatagt tcaactgctg aacttgaagg aaaatatagc 480tcacttgcta ataccaacaa aaatgtttga gtactttctg gttttcaaca cggtgatgcg 540ttcacaagat gattaaaaat ccctgaaaat aagcaattat ttactgaaaa aaatattatc 600atactcggaa ttgactgaac tgatactgaa aatgtaattc caacaggtcg atatattaat 660ttaacctata aaactgaaga agccggatga cttgcaggat atgcgaatgc 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tttttgttcc ggatttttta tttttgtgtt actatttaat ataatgataa 1620atcaggatta tgcaattgaa tttattcaag tctcgaaaaa atttggcagt ttttatgcca 1680attacaaaat ag 1692<210>2<211>451<212>PRT<213>豬肺炎支原體<400>2Met Lys Lys Lys Ile Lys Trp Asn Lys Phe Leu Gly Leu Gly Leu Val1 5 10 15Phe Pro Leu Ser Ala Ile Ala Thr Ile Ser Ala Gly Cys Trp Asp Lys20 25 30Glu Thr Thr Lys Glu Glu Lys Ser Ala Asp Asn Gln Asn Lys Gln Ile35 40 45Thr Asp Val Ser Lys Ile Ser Gly Leu Val Asn Glu Arg Lys Ser Glu50 55 60Ile Met Ala Ala Lys Ala Asp Ala Asn Lya His Phe Gly Leu Asn Met65 70 75 80Ala Ile Val Thr Ala Gly Gly Thr Val Asn Asp Asn Ser Phe Asn Gln85 90 95Ser Ser Trp Glu Ala Ile Gln Gln Leu Gly Ala Leu Thr Gly Gly Glu100 105 110Ile Thr Ser Val Asp ger Ser Thr Ala Glu Leu Glu Gly Lys Tyr ger115 120 125Ser Leu Ala Asn Thr Asn Lys Asn Val Trp Val Leu Ser Gly Phe Gln130 135 140His Gly Asp Ala Phe Thr Arg Trp Leu Lys Ile Pro Glu Asn Lys Gln145 150 155 160Leu Phe Thr Glu Lys Asn Ile Ile Ile Leu Gly Ile Asp Trp Thr Asp165 170 175Thr Glu Asn Val Ile Pro Thr Gly Arg Tyr Ile Asn Leu Thr Tyr Lys180 185 190Thr Glu Glu Ala Gly Trp Leu Ala Gly Tyr Ala Asn Ala Ser Phe Leu195 200 205Ala Lys Lys Phe Pro Ser Asp Pro Thr Lys Arg Ser Ala Ile Val Ile210 215 220Gly Gly Gly Ile Ser Pro Ala Val Thr Asp Phe Ile Ala Gly Tyr Leu225 230 235 240Ala Gly Ile Lys Ala Trp Asn Leu Lys Asn Ser Asp Lys Lys Thr Lys245 250 255Ile Thr Thr Asp Lys Ile Glu Ile Asn Leu Gly Phe Asp Val Gln Asp260 265 270Thr Ser Thr Lys Glu Arg Leu Glu Gln Ile Ala Ser Lys Asp Lys Pro275 280 285Ser Thr Leu Leu Ala Val Ala GIy Pro Leu Thr Glu Ile Phe Ser Asp296 295 300Ile Ile Ala Asn Gln Asn Asp Arg Tyr Leu Ile Gly Val Asp Thr Asp305 310 315 320Gln Ser Leu Val Tyr Thr Lys Thr Lys Asn Lys Phe Phe Thr Ser Ile325 330 335Leu Lys Asn Leu Gly Tyr Ser Val Phe Ser Val Leu Ser Asp Leu Tyr340 345 350Thr Lys Lys Ser Ash Ser Arg Asn Leu Ala Gly Phe Glu Phe Gly Lys355 360 365Lys Ser Ala Thr Val Tyr Leu Gly Ile Lys Asp Arg Phe Val Asp Ile370 375 380Ala Asp Thr Ser Leu Glu Gly Asn Asp Lys Lys Leu Ala Thr Glu Ala385 390 395 400Ile Ser Glu Ala Lys Lys Glu Phe Glu Glu Lys Thr Lys Thr Ile Pro405 410 415Ala Glu Glu Val Arg Lys Thr Leu Glu Ile Pro Glu Met Pro Asp Lys420 425 430Gln Pro Asp Lys Gln Gln Glu Ser Leu Asp Lys Leu Ile Thr Asp Ile435 440 445Asn Lys Asn450<210>3<211>1263<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述為體外表達(dá)而制備的mhp3<400>3atgtgggata aagaaacaac taaagaagaa aaatcagccg ataatcaaaa taagcaaatc 60actgatgtct caaaaatttc aggactagtt aatgaacgaa aatccgaaat tatggccgca 120aaagctgatg caaacaaaca ttttgggcta aatatggcaa ttgtaaccgc tggtggaacg 180gtaaatgata attcatttaa ccaatcargt tgggaggcaa ttcaacaact tggcgctctt 240actggaggtg agattacttc agtagatagt tcaactgctg aacttgaagg aaaatatagc 300tcacttgcta ataccaacaa aaatgtttgg gtactttctg gttttcaaca cggtgatgcg 360ttcacaagat ggttaaaaat ccctgaaaat aagcaattat ttactgaaaa aaatattatc 420atactcggaa ttgactggac tgatactgaa aatgtaattc caacaggtcg atatattaat 480ttaacctata aaactgaaga agccggatgg cttgcaggat atgcgaatgc ttcctttttg 540gcaaaaaaat tcccaagtga tccaactaaa agatcagcaa ttgttatcgg tggtgggatt 600tcgccagctg taactgattt tatcgctggt tatctagccg gaattaaagc ttggaatcta 660aaaaattctg ataaaaaaac aaagataaca actgataaaa tcgagataaa tcttgggttt 720gatgttcaag atacttcaac aaaagaaaga cttgaacaaa ttgcttcaaa agataaacct 780tcaacactat tagctgtcgc tggaccactt actgaaattt tctcggatat aatcgcaaac 840caaaatgatc gttatctcat tggtgttgac accgaccaat cacttgttta tacaaaaact 900aaaaataaat ttttcacctc aattttgaaa aatttaggtt actccgtttt cagcgttctt 960agtgatttat ataccaaaaa atcaaattca agaaatttag ccggctttga atttggtaaa 1020Arg Lys Ser Glu Ile Met Ala Ala Lys Ala Asp Ala Asn Lys His Phe35 40 45Gly Leu Asn Met Ala Ile Val Thr Ala Gly Gly Thr Val Asn Asp Asn50 55 60Ser Phe Ash Gln Ser Gly Trp Glu Ala Ile Gln Gln Leu Gly Ala Leu65 70 75 80Thr Gly Gly Glu Ile Thr Ser Val Asp Ser Ser Thr Ala Glu Leu Glu85 90 95Gly Lys Tyr Ser Ser Leu Ala Asn Thr Asn Lye Asn Val Trp Val Leu100 105 110Ser Gly Phe Gln His Gly Asp Ala Phe Thr Arg Trp Leu Lys Ile Pro115 120 125Glu Asn Lys Gln Leu Phe Thr Glu Lys Asn Ile Ile Ile Leu Gly Ile130 135 140Asp Trp Thr AsD Thr Glu Asn Val Ile Pro Thr Gly Arg Tyr Ile Asn145 150 155 160Leu Thr Tyr Lys Thr Glu Glu Ala Gly Trp Leu Ala Gly Tyr Ala Asn165 170 175Ala Ser Phe Leu Ala Lys Lys Phe Pro Ser Asp Pro Thr Lys Arg Ser180 185 190Ala Ile Val Ile Gly Gly Gly Ile Ser Pro Ala Val Thr Asp Phe Ile195 200 205Ala Gly Tyr Leu Ala Gly Ile Lys Ala Trp Asn Leu Lys Asn Ser Asp210 215 220Lys Lys Thr Lys Ile Thr Thr Asp Lys Ile Glu Ile Asn Leu Gly Phe225 230 235 240Asp Val Gln Asp Thr Ser Thr Lys Glu Arg Leu Glu Gln Ile Ala Ser245 250 255Lys Asp Lys Pro Ser Thr Leu Leu Ala Val Ala Gly Pro Leu Thr Glu260 265 270Ile Phe Ser Asp Ile Ile Ala Asn Gln Asn Asp Arg Tyr Leu Ile Gly275 280 285Val Asp Thr Asp Gln Ser Leu Val Tyr Thr Lys Thr Lys Asn Lys Phe290 295 300Phe Thr Ser Ile Leu Lys Asn Leu Gly Tyr Ser Val Phe Ser Val Leu305 310 315 320Ser Asp Leu Tyr Thr Lys Lys Ser Asn Ser Arg Asn Leu Ala Gly Phe325 330 335Glu Phe Gly Lys Lys Ser Ala Thr Val Tyr Leu Gly Ile Lys Asp Arg340 345 350Phe Val Asp Ile Ala Asp Thr Ser Leu Glu Gly Asn Asp Lys Lys Leu355 360 365Ala Thr Glu Ala Ile Ser Glu Ala Lys Lys Glu Phe Glu Glu Lys Thr370 375 380Lys Thr Ile Pro Ala Glu Glu Val Arg Lys Thr Leu Glu Ile Pro Glu385 390 395 400Mer Pro Asp Lys Gln Pro Asp Lys Gln Gln Glu Set Leu Asp Lys Leu405 410 415Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa420<210>5<211>602<212>DNA<213>豬肺炎支原體<400>5atgataatat ttttttcagt aaataattgc ttattttcag ggatttttaa tcatcttgtg 60aacgcatcac cgtgttgaaa accagaaagt actcaaacat ttttgttggt attagcaagt 120gagctatatt ttccttcaag ttcagcagtt gaactatcta ctgaagtaat ctcacctcca 180gtaagagcgc caagttgttg aattgcctct caacttgatt ggttaaatga attatcattt 240accgttccac cagcggttac aattgccata tttagcccaa aatgtttgtt tgcatcagct 300tttgcggcca taatttcgga ttttcgttca ttaactagtc ctgaaatttt tgagacatca 360gtgatttgct tattttgatt atcggctgat ttttcttctt tagttgtttc tttatcccaa 420catccggcag agattgtcgc gattgctgaa agcggaaaaa ctaagcctaa gccaagaaat 480ttatttcatt ttatcttttt tttcatagtt gttctcctaa ttaattgttt taattacgat 540gactttcaat tattttttaa taaattaatt tttattttac attttctatt atattcaaaa 600ac602<210>6<211>200<212>PRT<213>豬肺炎支原體<400>6Met Ile Ile Phe Phe Ser Val Asn Asn Cys Leu Phe Ser Gly Ile Phe1 5 10 15Asn His Leu Val Asn Ala Ser Pro Cys Trp Lys Pro Glu Ser Thr Gln20 25 30Thr Phe Leu Leu Val Leu Ala Ser Glu Leu Tyr Phe Pro Ser Ser Ser35 40 45Ala Val Glu Leu Ser Thr Glu Val Ile Ser Pro Pro Val Arg Ala Pro50 55 60Ser Cya Trp Ile Ala Ser Gln Leu Asp Trp Leu Asn Glu Leu Ser Phe65 70 75 80Thr Val Pro Pro Ala Val Thr Ile Ala Ile Phe Ser Pro Lys Cys Leu85 90 95Phe Ala Ser Ala Phe Ala Ala Ile Ile Ser Asp Phe Arg Ser Leu Thr100 105 110Ser Pro Glu Ile Phe Glu Thr Ser Val Ile Cys Leu Phe Trp Leu Ser115 120 125Ala Asp Phe Ser Ser Leu Val Val Ser Leu Ser Gln His Pro Ala Glu130 135 140Ile Val Ala Ile Ala Glu Ser Gly Lys Thr Lys Pro Lys Pro Arg Asn145 150 155 160Leu Phe His Phe Ile Phe Phe Phe Ile Val Val Leu Leu Ile Asn Cys165 170 175Phe Asn Tyr Asp Asp Phe Gln Leu Phe Phe Asn Lys Leu Ile Phe Ile180 185 190Leu His Phe Leu Leu Tyr Ser Lys195 200<210>7<211>14<212>PRT<213>豬肺炎支原體<220><221>SITE<222>(3)<223>Xaa=未知氨基酸<400>7Ala Gly Xaa Trp Ala Lys Glu Thr Thr Lys Glu Glu Lys Ser1 5 10<210>8<211>10<212>pRT<213>豬肺炎支原體<220><223>人工序列的描述寡核苷酸<400> 8Ala Trp Val Thr Ala Asp Gly Thr Val Asn1 5 10<210>9<211>21<212>pRT<213>豬肺炎支原體<220><223>人工序列的描述寡核苷酸<400>9Ala Ile Val Thr Ala Asp Gly Thr Val Asn Asp Asn Lys Pro Asn Gln1 5 10 15Trp Val Arg Lys Tyr20<210>10<211>30<212>DNA<213>Artificial Sequence<220><223>人工序列的描述寡核苷酸<220><221>修飾后的堿基<222>(9)<223>n=a,c,g,or t<220><221>修飾后的堿基<222>(18)<223>n=a,c,g,or t<220><221>修飾后的堿基<222>(21)<223>n=a,c,g,or t<400>10tgytgrgcna argaracnac naargargar30<210>11<211>30<212>DNA<213>Artificial Sequence<220><223>人工序列的描述寡核苷酸<400>11tgttgagcwa aagaaacwac waaagaagaa30<210>12<211>27<212>DNA<213>Artificial Sequence<220><223>人工序列的描述寡核苷酸<220><221>修飾后的堿基<222>(6)<223>n=a,c,g,ort<220><221>修飾后的堿基<222>(9)<223>n=a,c,g , or t<220><221>修飾后的堿基<222>(11)<223>n=a,c,g,or t<220><221>修飾后的堿基<222>(18)<223>n=a,c,g, or t<220><221>修飾后的堿基<222>(21)<223>n=a,c,g,or t<220><221>修飾后的堿基<222>(24)<223>nsa,c,g,ort<400>12tgrgtnacng cngayggnac ngtnaay27<210>13<211>27<212>DNA<213>Artificial Sequence<220><223>人工序列的描述寡核苷酸<400>13tgagtwacwg cwgatggwac wgtwaat27<210>14<211>26<212>DNA<213>Artificial Sequence<220><223>人工序列的描述寡核苷酸<220><221>修飾后的堿基<222>(4)<223>n=a,c,g,or t<220><221>修飾后的堿基<222>(7)<223>n=a,c,g,or t<220><221>修飾后的堿基<222>(10)<223>n=a,c,g,or t<220><221>修飾后的堿基<222>(16)<223>n=a,c,g,or t<220><221>修飾后的堿基<222>(19)<223>n=a,c,g,or t<220><221>修飾后的堿基<222>(22)<223>n=a,c,g,or t<400>14rttnacngtn ccrtcngcng tnacyc26<210>15<211>26<212>DNA<213>Artificial Sequence<220><223>人工序列的描述寡核苷酸<400>15attsacsgts ccatcsgcsg tsactc26<210>16<211>21<212>DNA<213>Artificial Sequence<220><223>人工序列的描述寡核苷酸<400>16tttgagacat cagtgatttg c 21<210>17<211>22<212>DNA<213>ARtificial Sequence<220><223>人工序列的描述寡核苷酸<400>17gaacgaaaat ccgaaattat gg 22<210>18<211>22<212>DNA<213>Artificial Sequence<220><223>人工序列的描述寡核苷酸<400>18ctatctactg aagaatctca cc 22<210>19<211>20<212>DNA<213>Artificial Sequence<220><223>人工序列的描述寡核苷酸<400>19gtgatgccgt tcacaagatg 20<210>20<211>21<212>DNA<213>Artificial Sequence<220><223>人工序列的描述寡核苷酸<400>20cactaagaac gctgaaaacg g21<210>21<211>21<212>DNA<213>Artificial Sequence<220><223>人工序列的描述寡核苷酸<400>21gattacaact gtaaaatcga g21<210>22<211>20<212>DNA<213>Artificial Sequence<220〉<223>人工序列的描述寡核苷酸<400>22ggcttcttca gttttatagg 20<210>23<211>18<212>DNA<213>Artificial Sequence<223>人工序列的描速寡核苷酸<400>23aaactcgcaa ctgaagcc 18<210>24<211>20<212>DNA<213>Artificial Sequence<220><223>人工序列的描述寡核苷酸<400>24gaaatgcctg ataaacaacc 20<210>25<211>22<212>DNA<213>Artificial Sequence<220><223>人工序列的描述寡核苷酸<400>25cttcagaaat ggcttcagtt gc22<210>26<211>25<212>DNA<213>Artificial Sequence<220><223>人工序列的描速寡核苷酸<400>26gctagataac cagcgataaa atcag 25<210>27<211>19<212>DNA<213>Artificial Sequence<220><223>人工序列的描述寡核苷酸<400>27tgcataatcc tgatttatc 19<210>28<211>22<212>DNA<213>Artificial Sequence<220><223>人工序列的描述寡核苷酸<400>26tgaaagtcat cgtaattaaa ac 22<210>29<211>34<212>DNA<213>Artificial Sequence<220><223>人工序列的描述寡核苷酸<400>29aatcggcata tgtgggataa agaaacaact aaag 34<210>30<211>34<212>DNA<213>Artificial Sequence<220><223>人工序列的描述寡核苷酸<400>30ggagtaatct agattattaa tatcggtaat taag 34<210>31<211>23<212>DNA<213>Artificial Sequence<220><223>人工序列的描述寡核苷酸<400>31gtttttgaat ataatagaaa atg 23<210>32<211>28<212>DNA<213>Artificial Sequence<220><223>人工序列的描述寡核苷酸<400>32tttattaaaa aataattgaa agtcatcg 28<210>33<211>28<212>DNA<213>Artificial Sequence<220><223>人工序列的描述寡核苷酸<400>33ctattttgta attggcataa aaactgcc 28<210>34<211>24<212>DNA<213>Artificial Sequence<220><223>人工序列的描述寡核苷酸<400>34gataaaatgg aataaatttc ttgg 24<210>35<211>21<212>DNA<213>Artificial Sequence<220><223>人工序列的描述寡核苷酸<400>35caggttggga ggcaattcaa c21<210>36<211>24<212>DNA<213>Artificial Sequence<220><223>人工序列的描述寡核苷酸<400>36caaaaatgtt tgggtacttt ctgg24<210>37<211>21<212>DNA<213>Artificial Sequence<220><223>人工序列的描述寡核苷酸<400>37cacaagatgg 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Ser130 135 140Asn Gly Lys Lys Tyr Ser Asp Leu Leu Ala Glu Lys Lys Val Ile Ile145 150 155 160Val Ala Val Asp Trp Asp Leu Ser Lys Glu Asp Lys Asp Leu Ile Lys165 170 175Ala Gly His Phe Ile Ser Leu Leu Tyr Lys Thr Glu Glu Ala Gly Phe180 185 190Ile Ala Gly Tyr Ala Ser Ser Lys Phe Leu Ala Tyr Lys Phe Pro Asn195 200 205Asp Glu Ala Lys Arg Thr Ile Ala Pro Phe Gly Gly Gly His Gly Ala210 215 220Gly Val Thr Asp Phe Ile Ala Gly Phe Leu Ala Gly Ile Ala Lys Tyr225 230 235 240Asn Asn Asp Asn Pro Thr Ala Lys Val Thr Ile Ser Asp Asn Asn Ile245 250 255Asn Ile Asp Thr Gly Phe Ile Ser Asn Asp Lys Thr Ala Thr Phe Ile260 265 270Asn Gly Ile Val Asn Lys Ser Ser Leu Val Leu Pro Val Ala Gly Ser275 280 285Leu Thr Ser Ser Val Val Asp Ala Ile Lys Lys Ser Asn Lys Asp Thr290 295 300Lys Tyr Leu Ile Gly Val Asp Thr Asp Gln Ser Lys Ile Phe Ser Pro305 310 315 320Ala Thr Val Phe Phe Thr Ser Ile Glu Lys His Leu Gly Arg Thr Ile325 330 335Tyr Gln Val Leu Thr Asp Ile Trp Leu Lys Lys Glu Asp Ser Lys Phe340 345 350Leu Gly Ser Phe Arg Ser Phe Lya Leu Thr Asn Pro Ala Asn Ala Thr355 360 365Val Tyr Lys Gly Ile Ser Asp Asp Phe Val Gly Val Ser Asn Ser Thr370 375 380Val Ala Asp Ala Asp Lys Val Lys Ala Gln Glu Phe Leu Asn Glu Ala385 390 395 400Thr Ala Asp Phe Lys Lya Gln Ile Gln Ala Asn Pro Thr Asn Tyr Lys405 410 415Ser Val Leu Gly Ile Pro Thr Met Leu Ile Asn Asp Asn Asp Ala Lys420 425 430Asp Asn Glu Lys Ala Ser Leu Phe His Phe Asp Asn Trp Gln Thr Tyr435 440 445Trp Ala Phe His Ser Arg Phe Ile Asn450 45權(quán)利要求
1．一種蛋白質(zhì)，其氨基酸序列中包含SEQ ID NO4中的至少30個連續(xù)氨基酸，其中所述的蛋白質(zhì)在氨基酸序列Trp Asp Lys Glu后不具有脂肪酸酰化的半胱氨酸，而且不具有C-末端高絲氨酸內(nèi)酯。
2．權(quán)利要求1的蛋白質(zhì)，該蛋白質(zhì)具有氨基酸序列包含SEQ ID NO4中的至少50個連續(xù)氨基酸。
3．一種蛋白質(zhì)，其氨基酸序列中至少包含SEQ ID NO4中的第1～30位氨基酸。
4．權(quán)利要求3的蛋白質(zhì)，其氨基酸序列包含SEQ ID NO4。
5．權(quán)利要求1、2、3或4中的蛋白質(zhì)，該蛋白質(zhì)是分離的蛋白質(zhì)。
6．權(quán)利要求1的蛋白質(zhì)，該蛋白質(zhì)是融合蛋白。
7．權(quán)利要求6的蛋白質(zhì)，其中融合蛋白為硫氧還蛋白融合蛋白。
8．一種組合物，其中含有權(quán)利要求1、2、3、或4中所述的蛋白質(zhì)和藥物學(xué)上可接受的載體。
9．權(quán)利要求8的組合物，該組合物還包括佐劑。
10．權(quán)利要求8的組合物，其中還包括至少一種選自豬肺炎支原體P46、P65、P97和P102的多肽。
11．一種具有SEQ ID NO2所示氨基酸序列的免疫原性蛋白質(zhì)或其片段、變體或衍生物，其中所述的免疫原性蛋白質(zhì)在氨基酸序列TrpAsp Lys Glu后不具有脂肪酸?；陌腚装彼?，而且不具有C-末端高絲氨酸內(nèi)酯。
12．一種具有SEQ ID NO4所示氨基酸序列的免疫原性蛋白質(zhì)或其片段、變體或衍生物，其中所述的免疫原性蛋白質(zhì)在氨基酸序列TrpAsp Lys Glu后不具有脂肪酸?；陌腚装彼?，而且不具有C-末端高絲氨酸內(nèi)酯。
13．一種用于治療或預(yù)防因豬肺炎支原體(M.hyopneumoniae)感染而引發(fā)的動物疾病或癥狀的方法，該方法包括向該動物施用一種疫苗制劑，該疫苗制劑包含(ⅰ)一種蛋白質(zhì)，該蛋白質(zhì)的氨基酸序列中包含SEQ ID NO4中的至少30個連續(xù)氨基酸，其中所述的蛋白質(zhì)在氨基酸序列Trp Asp Lys Glu后不具有脂肪酸?；陌腚装彼幔约?ⅱ)藥物學(xué)上可接受的載體，所施用疫苗制劑的含量足以增強(qiáng)豬肺炎支原體特異性的細(xì)胞或體液應(yīng)答。
14．權(quán)利要求13的方法，其中所述的蛋白質(zhì)氨基酸序列中包含SEQ ID NO4.中的至少50個連續(xù)氨基酸。
15．一種用于治療或預(yù)防因豬肺炎支原體感染而引發(fā)的動物疾病或癥狀的方法，該方法包括向該動物施用一種疫苗制劑，該疫苗制劑包含(ⅰ)一種抗原性或免疫原性蛋白質(zhì)，該蛋白質(zhì)的氨基酸序列中包含SEQ ID NO4中的至少1～30位氨基酸，以及(ⅱ)藥物學(xué)上可接受的載體，所施用的疫苗制劑的含量足以增強(qiáng)豬肺炎支原體特異性的細(xì)胞或體液應(yīng)答。
16．權(quán)利要求15的方法，其中所述的蛋白質(zhì)氨基酸序列中包含SEQID NO4的氨基酸序列。
17．權(quán)利要求13、14、15或16的方法，其中所述動物是豬。
18．一種分離的或純化的DNA或其互補(bǔ)序列，所述DNA以支原體遺傳密碼編碼一種蛋白質(zhì)，該蛋白質(zhì)的氨基酸序列中含有SEQ ID NO2中的至少30個連續(xù)氨基酸。
19．權(quán)利要求18的DNA，其中所述的蛋白質(zhì)的序列中包含SEQ IDNO2中的至少50個連續(xù)氨基酸。
20．權(quán)利要求18的DNA，其中所述的DNA質(zhì)的序列中包含SEQ IDNO1中的至少90個連續(xù)核苷酸。
21．一種DNA或其互補(bǔ)序列，其中所述DNA以通用遺傳密碼編碼一種其氨基酸序列中包含SEQ ID NO4中的至少30個連續(xù)氨基酸的蛋白質(zhì)。
22．權(quán)利要求21的DNA，其中所述的蛋白質(zhì)的氨基酸序列中包含SEQID NO4中的至少50個連續(xù)氨基酸。
23．權(quán)利要求21的DNA，其中所述DNA的序列中包含SEQ ID NO3中的至少90個連續(xù)核苷酸。
24．權(quán)利要求22的DNA，該DNA與一異源啟動子可操作相連。
25．權(quán)利要求24的DNA，該DNA進(jìn)一步包含在原核細(xì)胞中具有活性的復(fù)制起點(diǎn)。
26．權(quán)利要求24的DNA，該DNA進(jìn)一步包含在真核細(xì)胞中具有活性的復(fù)制起點(diǎn)。
27．一種宿主細(xì)胞，其含有權(quán)利要求24的分離的DNA。
28．權(quán)利要求27的宿主細(xì)胞，其中所述細(xì)胞是大腸桿菌BL21，所述DNA是表達(dá)載體pBAD/Thio-TOPO。
29．一種用于制備脫輔-Mhp3或其片段的方法，所述方法包括(ⅰ)在所述脫輔-Mhp3能得以表達(dá)的條件下培養(yǎng)權(quán)利要求27的細(xì)胞，以及(ⅱ)回收所述蛋白質(zhì)。
30．權(quán)利要求29的方法，其中所述的蛋白質(zhì)以可溶形式回收。
31．權(quán)利要求29的方法，其中所述的蛋白質(zhì)以不溶形式回收。
32．一種用于治療或預(yù)防因豬肺炎支原體感染而引發(fā)的動物疾病或癥狀的方法，該方法包括向該動物施用一種疫苗制劑，該疫苗制劑包含(ⅰ)權(quán)利要求20的DNA，以及(ⅱ)藥物學(xué)上可接受的載體，所用疫苗制劑的含量足以增強(qiáng)豬肺炎支原體特異性的細(xì)胞或體液應(yīng)答。
33．權(quán)利要求32的方法，其中所述動物是豬
34．一種分離的DNA或其互補(bǔ)序列，所述DNA包括15～40個核苷酸的片段，所述片段能在PCR的嚴(yán)緊條件下與以支原體遺傳密碼編碼其序列中含有SEQ ID NO2中至少5個連續(xù)氨基酸的蛋白質(zhì)的DNA雜交。
35．權(quán)利要求34的分離的DNA，其中所述雜交是豬肺炎支原體特異性的。
36．一種分離的DNA或其互補(bǔ)序列，所述DNA包括至少90個核苷酸的片段，所述片段能在濾膜雜交的高度嚴(yán)緊條件下與以支原體遺傳密碼編碼其序列中含有SEQ ID NO2中至少30個連續(xù)氨基酸的蛋白質(zhì)的DNA雜交。
37．一種試劑盒，其中包括至少一個容器，該容器中盛有第一種分離的DNA和第二種分離的DNA，所述第一種分離的DNA包括含至少15個核苷酸的片段，該片段能在PCR的嚴(yán)緊條件下與以支原體遺傳密碼編碼序列中包含SEQ ID NO2中至少5個連續(xù)氨基酸的蛋白質(zhì)的DNA雜交，所述第二種分離的DNA包括含至少15個核苷酸的片段，該片段能在PCR的嚴(yán)緊條件下與以支原體遺傳密碼編碼其序列中含SEQ ID NO2中的至少5個連續(xù)氨基酸的蛋白質(zhì)的DNA的互補(bǔ)DNA雜交，其中所述試劑盒包括一份說明該試劑盒如何用于診斷豬肺炎支原體感染的說明書。
38．權(quán)利要求37的試劑盒，其中所述的雜交是豬肺炎支原體特異性的。
39．一種包括至少1個容器的試劑盒，該容器中盛有權(quán)利要求34中所述的分離的DNA，其中所述的雜交是豬肺炎支原體特異性的，而且其中所述的試劑盒包括一份說明該試劑盒如何用于診斷豬肺炎支原體感染的說明書。
40．一種包括至少1個容器的試劑盒，該容器中盛有一種氨基酸序列中含SEQ ID NO4中的至少30個連續(xù)氨基酸的蛋白質(zhì)，以及一份說明該試劑盒如何用于診斷豬肺炎支原體感染的說明書。
41．權(quán)利要求40的試劑盒，該試劑盒進(jìn)一步包括一種抗-豬第二抗體。
42．權(quán)利要求41的試劑盒，其中所述的第二抗體與一種能催化顯色反應(yīng)的酶相連。
43．權(quán)利要求42的試劑盒，其中所述的酶選自堿性磷酸酶和辣根過氧化物酶。
44．權(quán)利要求42的試劑盒，該試劑盒進(jìn)一步包括比色分析的試劑。
全文摘要
本發(fā)明涉及mhp3核酸及其編碼的蛋白質(zhì)。本發(fā)明還涉及mhp3編碼的新型脫輔蛋白抗原,該抗原可用于預(yù)防和治療因豬肺炎支原體感染而引發(fā)的疾病和癥狀的疫苗。本發(fā)明還涉及重組制備這類抗原的方法。
文檔編號A61P31/04GK1296953SQ0012908
公開日2001年5月30日 申請日期2000年9月29日 優(yōu)先權(quán)日1999年9月29日
發(fā)明者K·W·金, R·A·馬杜拉, E·L·羅塞 申請人:輝瑞產(chǎn)品公司