專利名稱：人類乳頭瘤病毒11l1－e7重組蛋白及其應用的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及一種新的病毒重組蛋白和這種重組蛋白的用途，尤其是一種人類乳頭瘤病毒11L1-E7重組蛋白及其在感染性疾病的預防與治療中的應用。
近年來，我國性傳播性疾病的發(fā)病率持續(xù)快速升高已嚴重危害我國人民的健康和家庭幸福。尖銳濕疣(condyloma acuminatum)是性傳播性疾病之一，它在我國的發(fā)病率已占性傳播性疾病的首位。由于缺乏理想的治療方法，尖銳濕疣的復發(fā)率高達30％到70％。因此尋求理想的治療和預防手段應成為我國迫在眉捷的大事。
尖銳濕疣由人類乳頭瘤病毒(Human Papilloma Virus，HPV)引起。HPV是一群小DNA腫瘤病毒，屬乳多空病毒科的多瘤病毒。目前已確定130個型別，其中78個型已被完全克隆。引起尖銳濕疣的HPV有11型、6型、16型、18型和33型等，其中最常見的是HPV11型。HPV不僅可以引起皮膚粘膜上皮的過度增殖，還與多種鱗狀細胞癌的發(fā)生發(fā)展有關。乳頭瘤病毒的感染具有嚴格的宿主特異性和嗜上皮性，人是HPV的唯一宿主，至今仍未能體外培養(yǎng)。
HPV研究的重大突破是發(fā)現HPV的晚期結構蛋白L1能在體外真核細胞表達系統(tǒng)表達并自動形成病毒樣顆粒(Virus Like Particles，VLPs)。研究表明，VLPs的最大特點是其具有與野生型HPV病毒顆粒極為相似的空間結構和抗原決定簇，因此兩者抗原性十分近似。其另一大特點是L1的羧基端可以象載體那樣連接其它基因并隨之在一定的表達系統(tǒng)進行表達，產生的重組蛋白可隨著L1形成嵌合型病毒樣顆粒VLPs。近年研究還表明，病毒樣顆粒VLPs可作為外源性抗原通過非經典的組織相容復合體(MHC)classI抗原提呈通路得到呈遞，并有效激活以細胞毒性T淋巴細胞反應(CTL)為特征的細胞免疫反應。細胞免疫對于機體清除病毒感染至關重要。
為了更好地防治HPV感染性疾病，國外許多學者正在研究乳頭瘤病毒結構蛋白L1和早期蛋白E7引發(fā)機體特異性細胞免疫反應的機制等。體外試驗、動物試驗和人體試驗均證實，乳頭瘤病毒的晚期結構蛋白L1和早期蛋白E7能引發(fā)機體的特異性細胞免疫反應。但關于HPV11L1-E7重組蛋白及其應用尚無記載。
本發(fā)明的目的是提供一種人類乳頭瘤病毒11L1-E7重組蛋白及其在感染性疾病的預防與治療中的應用。
本發(fā)明的目的是這樣實現的將HPV11E7基因利用分子克隆技術克隆入連有HPVL1的載體PUC，再將這HPV11L1-E7基因片段插入桿狀病毒轉染載體pVL1393，然后轉染桿狀病毒線狀DNA并用之感染SF-9昆蟲細胞使HPV11L1-E7基因得到表達，其重組體pVL1393/HPV11L1-E7DNA的序列為(1)pVL1393/HPV11L1-E7aATGTGGCGGCCTAGCGACAGCACAGTATATGTGCCTCCTCCCAACCCTGTATCCAAGGTTGTTGCCACGGATGCGTATGTTAAACGCACCAACATATTTTATCATGCCAGCAGTTCTAGACTCCTTGCTGTGGGACATCCATATTACTCTATCAAAAAAGTTAACAAAACAGTTGTACCAAAGGTGTCTGGATATCAATATAGAGTGTTTAAGGTAGTGTTGCCAGATCCTAACAAGTTTGCATTACCTGATTCATCCCTGTTTGACCCCACTACACAGCGTTTAGTATGGGCGTGCACAGGGTTGGAGGTAGGCAGGGGTCAACCTTTAGGCGTTGGTGTTAGTGGGCATCCATTGCTAAACAAATATGATGATGTAGAAAATAGTGGTGGGTATGGTGGTAATCCTGGTCAGGATAATAGGGTTAATGTAGGTATGGATTATAAACAAACCCAGCTATGTATGGTGGGCTGTGCTCCACCGTTAGGTGAACATTGGGGTAAGGGTACACAATGTTCAAATACCTCTGTACAAAATGGTGACTGCCCCCCGTTGGAACTTATTACCAGTGTTATACAGGATGGGGACATGGTTGATACAGGCTTTGGTGCTATGAATTTTGCAGACTTACAAACCAATAAATCGGATGTTCCCCTTGATATTTGTGGAACTGTCTGCAAATATCCTGATTATTTGCAAATGGCTGCAGACCCTTATGGTGATAGGTTGTTTTTTTATTTGCGAAAGGAACAAATGTTTGCTAGACACTTTTTTAATAGGGCCGGTACTGTGGGGGAACCTGTGCCTGATGACCTGTTGGTAAAAGGGGGTAATAACAGATCATCTGTAGCTAGTAGTATTTATGTACATACACCTAGTGGCTCATTGGTGTCTTCAGAGGCTCAATTATTTAATAAACCATATTGGCTTCAAAAGGCTCAGGGACATAACAATGGTATTTGCTGGGGAAACCACTTGTTTGTTACTGTGGTAGATACCACACGCAGTACAAATATGACACTATGTGCATCTGTGTCTAAATCTGCTACATACACTAATTCAGATTATAAGGAATACATGCGCCATGTGGAGGAGTTTGATTTACAGTTTATTTTTCAATTGTGTAGCATTACATTATCTGCAGAAGTCATGGCCTATATACACACAATGAATCCTTCTGTTTTGGAGGACTGGAACTTTGGTTTATCGCCTCCACCAAATGGTACACTGGAGGATACTTATAGATATGTACAGTCACAGGCCATTACCTGTCAGAAACCCACACCTGAAAAAGAAAAACAGGATCCCTATAAGGATATGAGTTTTTGGGAGGTTAACTTAAAAGAAAAGTTTTCAAGTGAATTAGATCAGTTTCCCCTTGGACGTAAGTTTTTATTGCAAAGTGGATATCGAGGACGGACGTCTGCTCGTACAGGTATAAAGCGCCCAGCTGTGTCTAAGCCCTCTACAGCCCCCAAACGAAAACGTACCAAAACCAAAAAGTAA--- ATG CAT GGA AGA CTTGTT ACC CTA AAG GAT ATA GTA CTA GAC CTG CAG CCT CCT GAC CCT GTA GGG TTACAT TGC TAT GAG CAA TTA GAA GAC AGC TCA(2) pVL1393/HPV11L1-E7bATGTGGCGGCCTAGCGACAGCACAGTATATGTGCCTCCTCCCAACCCTGTATCCAAGGTTGTTGCCACGGATGCGTATGTTAAACGCACCAACATATTTTATCATGCCAGCAGTTCTAGACTCCTTGCTGTGGGACATCCATATTACTCTATCAAAAAAGTTAACAAAACAGTTGTACCAAAGGTGTCTGGATATCAATATAGAGTGTTTAAGGTAGTGTTGCCAGATCCTAACAAGTTTGCATTACCTGATTCATCCCTGTTTGACCCCACTACACAGCGTTTAGTATGGGCGTGCACAGGGTTGGAGGTAGGCAGGGGTCAACCTTTAGGCGTTGGTGTTAGTGGGCATCCATTGCTAAACAAATATGATGATGTAGAAAATAGTGGTGGGTATGGTGGTAATCCTGGTCAGGATAATAGGGTTAATGTAGGTATGGATTATAAACAAACCCAGCTATGTATGGTGGGCTGTGCTCCACCGTTAGGTGAACATTGGGGTAAGGGTACACAATGTTCAAATACCTCTGTACAAAATGGTGACTGCCCCCCGTTGGAACTTATTACCAGTGTTATACAGGATGGGGACATGGTTGATACAGGCTTTGGTGCTATGAATTTTGCAGACTTACAAACCAATAAATCGGATGTTCCCCTTGATATTTGTGGAACTGTCTGCAAATATCCTGATTATTTGCAAATGGCTGCAGACCCTTATGGTGATAGGTTGTTTTTTTATTTGCGAAAGGAACAAATGTTTGCTAGACACTTTTTTAATAGGGCCGGTACTGTGGGGGAACCTGTGCCTGATGACCTGTTGGTAAAAGGGGGTAATAACAGATCATCTGTAGCTAGTAGTATTTATGTACATACACCTAGTGGCTCATTGGTGTCTTCAGAGGCTCAATTATTTAATAAACCATATTGGCTTCAAAAGGCTCAGGGACATAACAATGGTATTTGCTGGGGAAACCACTTGTTTGTTACTGTGGTAGATACCACACGCAGTACAAATATGACACTATGTGCATCTGTGTCTAAATCTGCTACATACACTAATTCAGATTATAAGGAATACATGCGCCATGTGGAGGAGTTTGATTTACAGTTTATTTTTCAATTGTGTAGCATTACATTATCTGCAGAAGTCATGGCCTATATACACACAATGAATCCTTCTGTTTTGGAGGACTGGAACTTTGGTTTATCGCCTCCACCAAATGGTACACTGGAGGATACTTATAGATATGTACAGTCACAGGCCATTACCTGTCAGAAACCCACACCTGAAAAAGAAAAACAGGATCCCTATAAGGATATGAGTTTTTGGGAGGTTAACTTAAAAGAAAAGTTTTCAAGTGAATTAGATCAGTTTCCCCTTGGACGTAAGTTTTTATTGCAAAGTGGATATCGAGGACGGACGTCTGCTCGTACAGGTATAAAGCGCCCAGCTGTGTCTAAGCCCTCTACAGCCCCCAAACGAAAACGTACCAAAACCAAAAAGTAA--- GAA GAT GAG GTG GACAAG GTG GAC AAA CAA GAC GCA CAA CCT TTA ACA CAA CAT TAC CAA ATA CTG ACCTGT TGC TGT GGA TGT GAC AGC(3) pVL1393/HPV11L1-E7cATGTGGCGGCCTAGCGACAGCACAGTATATGTGCCTCCTCCCAACCCTGTATCCAAGGTTGTTGCCACGGATGCGTATGTTAAACGCACCAACATATTTTATCATGCCAGCAGTTCTAGACTCCTTGCTGTGGGACATCCATATTACTCTATCAAAAAAGTTAACAAAACAGTTGTACCAAAGGTGTCTGGATATCAATATAGAGTGTTTAAGGTAGTGTTGCCAGATCCTAACAAGTTTGCATTACCTGATTCATCCCTGTTTGACCCCACTACACAGCGTTTAGTATGGGCGTGCACAGGGTTGGAGGTAGGCAGGGGTCAACCTTTAGGCGTTGGTGTTAGTGGGCATCCATTGCTAAACAAATATGATGATGTAGAAAATAGTGGTGGGTATGGTGGTAATCCTGGTCAGGATAATAGGGTTAATGTAGGTATGGATTATAAACAAACCCAGCTATGTATGGTGGGCTGTGCTCCACCGTTAGGTGAACATTGGGGTAAGGGTACACAATGTTCAAATACCTCTGTACAAAATGGTGACTGCCCCCCGTTGGAACTTATTACCAGTGTTATACAGGATGGGGACATGGTTGATACAGGCTTTGGTGCTATGAATTTTGCAGACTTACAAACCAATAAATCGGATGTTCCCCTTGATATTTGTGGAACTGTCTGCAAATATCCTGATTATTTGCAAATGGCTGCAGACCCTTATGGTGATAGGTTGTTTTTTTATTTGCGAAAGGAACAAATGTTTGCTAGACACTTTTTTAATAGGGCCGGTACTGTGGGGGAACCTGTGCCTGATGACCTGTTGGTAAAAGGGGGTAATAACAGATCATCTGTAGCTAGTAGTATTTATGTACATACACCTAGTGGCTCATTGGTGTCTTCAGAGGCTCAATTATTTAATAAACCATATTGGCTTCAAAAGGCTCAGGGACATAACAATGGTATTTGCTGGGGAAACCACTTGTTTGTTACTGTGGTAGATACCACACGCAGTACAAATATGACACTATGTGCATCTGTGTCTAAATCTGCTACATACACTAATTCAGATTATAAGGAATACATGCGCCATGTGGAGGAGTTTGATTTACAGTTTATTTTTCAATTGTGTAGCATTACATTATCTGCAGAAGTCATGGCCTATATACACACAATGAATCCTTCTGTTTTGGAGGACTGGAACTTTGGTTTATCGCCTCCACCAAATGGTACACTGGAGGATACTTATAGATATGTACAGTCACAGGCCATTACCTGTCAGAAACCCACACCTGAAAAAGAAAAACAGGATCCCTATAAGGATATGAGTTTTTGGGAGGTTAACTTAAAAGAAAAGTTTTCAAGTGAATTAGATCAGTTTCCCCTTGGACGTAAGTTTTTATTGCAAAGTGGATATCGAGGACGGACGTCTGCTCGTACAGGTATAAAGCGCCCAGCTGTGTCTAAGCCCTCTACAGCCCCCAAACGAAAACGTACCAAAACCAAAAAGTAA----ACA GAC GGA GAC ATCAGA CAA CTA CAA GAC CTT TTG CTG GGC ACA CTA AAT ATT GTG TGT CCC ATC TGCGCA CCA AAA CCA TAA通過上述構建所得的重組蛋白可與藥學上可接受的藥物制成藥物組合物，用于預防HPV感染和治療HPV感染性疾病，也可研制用于臨床預防和治療尖銳濕疣的疫苗。
下面結合具體的實施例對本發(fā)明的技術措施作進一步的說明。
實施例1重組桿狀病毒轉染載體的構建、轉染和表達將HPV11E7基因克隆入連有HPVL1的載體PUC，再將這HPV11L1-E7基因片段插入桿狀病毒轉染載體pVL1393，然后轉染桿狀病毒線狀DNA并用之感染SF-9昆蟲細胞使HPV11L1-E7基因得到表達。
具體構建過程如下本發(fā)明利用分子克隆技術構建HPV11E7于主要結構蛋白L1基因。引物設計成可以插入HPV11L1序列的C末端。將此重組體DNA克隆于桿狀病毒轉染載體pVL1393，然后轉化大腸桿菌DHα5進行鑒定和擴增。將桿狀病毒線狀DNA和含目的DNA桿狀病毒載體一起轉染昆蟲細胞Sf9。培養(yǎng)3-5天后，細胞經離心、勻漿化、超聲粉碎、蔗糖超離和CsCl密度梯度離心可獲浮密度1.34g/ml的重組蛋白條帶。其重組體pVL1393/HPV11L1-E7DNA的序列為
(1)pVL1393/HPV11L1-E7aATGTGGCGGCCTAGCGACAGCACAGTATATGTGCCTCCTCCCAACCCTGTATCCAAGGTTGTTGCCACGGATGCGTATGTTAAACGCACCAACATATTTTATCATGCCAGCAGTTCTAGACTCCTTGCTGTGGGACATCCATATTACTCTATCAAAAAAGTTAACAAAACAGTTGTACCAAAGGTGTCTGGATATCAATATAGAGTGTTTAAGGTAGTGTTGCCAGATCCTAACAAGTTTGCATTACCTGATTCATCCCTGTTTGACCCCACTACACACCGTTTAGTATGGGCGTGCACAGGGTTGGAGGTAGGCAGGGGTCAACCTTTAGGCGTTGGTGTTAGTGGGCATCCATTGCTAAACAAATATGATGATGTAGAAAATAGTGGTGGGTATGGTGGTAATCCTGGTCAGGATAATAGGGTTAATGTAGGTATGGATTATAAACAAACCCAGCTATGTATGGTGGGCTGTGCTCCACCGTTAGGTGAACATTGGGGTAAGGGTACACAATGTTCAAATACCTCTGTACAAAATGGTGACTGCCCCCCGTTGGAACTTATTACCAGTGTTATACAGGATGGGGACATGGTTGATACAGGCTTTGGTGCTATGAATTTTGCAGACTTACAAACCAATAAATCGGATGTTCCCCTTGATATTTGTGGAACTGTCTGCAAATATCCTGATTATTTGCAAATGGCTGCAGACCCTTATGGTGATAGGTTGTTTTTTTATTTGCGAAAGGAACAAATGTTTGCTAGACACTTTTTTAATAGGGCCGGTACTGTGGGGGAACCTGTGCCTGATGACCTGTTGGTAAAAGGGGGTAATAACAGATCATCTGTAGCTAGTAGTATTTATGTACATACACCTAGTGGCTCATTGGTGTCTTCAGAGGCTCAATTATTTAATAAACCATATTGGCTTCAAAAGGCTCAGGGACATAACAATGGTATTTGCTGGGGAAACCACTTGTTTGTTACTGTGGTAGATACCACACGCAGTACAAATATGACACTATGTGCATCTGTGTCTAAATCTGCTACATACACTAATTCAGATTATAAGGAATACATGCGCCATGTGGAGGAGTTTGATTTACAGTTTATTTTTCAATTGTGTAGCATTACATTATCTGCAGAAGTCATGGCCTATATACACACAATGAATCCTTCTGTTTTGGAGGACTGGAACTTTGGTTTATCGCCTCCACCAAATGGTACACTGGAGGATACTTATAGATATGTACAGTCACAGGCCATTACCTGTCAGAAACCCACACCTGAAAAAGAAAAACAGGATCCCTATAAGGATATGAGTTTTTGGGAGGTTAACTTAAAAGAAAAGTTTTCAAGTGAATTAGATCAGTTTCCCCTTGGACGTAAGTTTTTATTGCAAAGTGGATATCGAGGACGGACGTCTGCTCGTACAGGTATAAAGCGCCCAGCTGTGTCTAACCCCTCTACAGCCCCCAAACGAAAACGTACCAAAACCAAAAAGTAA--- ATG CAT GGA AGA CTTGTT ACC CTA AAG GAT ATA GTA CTA GAC CTG CAG CCT CCT GAC CCT GTA GGG TTACAT TGC TAT GAG CAA TTA GAA GAC AGC TCA氨基酸序列為MWRPSDSTVYVPPPNPVSKVVATDAYVKRTNIFYHASSSRLLAVGHPYYSIKKVNKTVVPKVSGYQYRVFKVVLPDPNKFALPDSSLFDPTTQRLVWACTGLEVGRGQPLGVGVSGHPLLNKYDDVENSGGYGGNPGQDNRVNVGMDYKQTQLCMVGCAPPLGEHWGKGTQCSNTSVQNGDCPPLELITSVIQDGDMVDTGFGAMNFADLQTNKSDVPLDICGTVCKYPDYLQMAADPYGDRLFFYLRKEQMFARHFFNRAGTVGEPVPDDLLVKGGNNRSSVASSIYVHTPSGSLVSSEAQLFNKPYWLQKAQGHNNGICWGNHLFVTVVDTTRSTNMTLCASVSKSATYTNSDYKEYMRHVEEFDLQFIFQLCSITLSAEVMAYIHTMNPSVLEDWNFGLSPPPNGTLEDTYRYVQSQAITCQKPTPEKEKQDPYKDMSFWEVNLKEKFSSELDQFPLGRKFLLQSGYRGRTSARTGIKRPAVSKPSTAPKRKRTKTKK---MHG RLV TLK DIV LDL QPP DPV GLH CYE QLE DSS(2)pVL1393/HPV11L1-E7bATGTGGCGGCCTAGCGACAGCACAGTATATGTGCCTCCTCCCAACCCTGTATCCAAGGTTGTTGCCACGGATGCGTATGTTAAACGCACCAACATATTTTATCATGCCAGCAGTTCTAGACTCCTTGCTGTGGGACATCCATATTACTCTATCAAAAAAGTTAACAAAACAGTTGTACCAAAGGTGTCTGGATATCAATATAGAGTGTTTAAGGTAGTGTTGCCAGATCCTAACAAGTTTGCATTACCTGATTCATCCCTGTTTGACCCCACTACACAGCGTTTAGTATGGGCGTGCACAGGGTTGGAGGTAGGCAGGGGTCAACCTTTAGGCGTTGGTGTTAGTGGGCATCCATTGCTAAACAAATATGATGATGTAGAAAATAGTGGTGGGTATGGTGGTAATCCTGGTCAGGATAATAGGGTTAATGTAGGTATGGATTATAAACAAACCCAGCTATGTATGGTGGGCTGTGCTCCACCGTTAGGTGAACATTGGGGTAAGGGTACACAATGTTCAAATACCTCTGTACAAAATGGTGACTGCCCCCCGTTGGAACTTATTACCAGTGTTATACAGGATGGGGACATGGTTGATACAGGCTTTGGTGCTATGAATTTTGCAGACTTACAAACCAATAAATCGGATGTTCCCCTTGATATTTGTGGAACTGTCTGCAAATATCCTGATTATTTGCAAATGGCTGCAGACCCTTATGGTGATAGGTTGTTTTTTTATTTGCGAAAGGAACAAATGTTTGCTAGACACTTTTTTAATAGGGCCGGTACTGTGGGGGAACCTGTGCCTGATGACCTGTTGGTAAAAGGGGGTAATAACAGATCATCTGTAGCTAGTAGTATTTATGTACATACACCTAGTGGCTCATTGGTGTCTTCAGAGGCTCAATTATTTAATAAACCATATTGGCTTCAAAAGGCTCAGGGACATAACAATGGTATTTGCTGGGGAAACCACTTGTTTGTTACTGTGGTAGATACCACACGCAGTACAAATATGACACTATGTGCATCTGTGTCTAAATCTGCTACATACACTAATTCAGATTATAAGGAATACATGCGCCATGTGGAGGAGTTTGATTTACAGTTTATTTTTCAATTGTGTAGCATTACATTATCTGCAGAAGTCATGGCCTATATACACACAATGAATCCTTCTGTTTTGGAGGACTGGAACTTTGGTTTATCGCCTCCACCAAATGGTACACTGGAGGATACTTATAGATATGTACAGTCACAGGCCATTACCTGTCAGAAACCCACACCTGAAAAAGAAAAACAGGATCCCTATAAGGATATGAGTTTTTGGGAGGTTAACTTAAAAGAAAAGTTTTCAAGTGAATTAGATCAGTTTCCCCTTGGACGTAAGTTTTTATTGCAAAGTGGATATCGAGGACGGACGTCTGCTCGTACAGGTATAAAGCGCCCAGCTGTGTCTAAGCCCTCTACAGCCCCCAAACGAAAACGTACCAAAACCAAAAAGTAA--- GAA GAT GAG GTG GAGAAG GTG GAC AAA CAA GAC GCA CAA CCT TTA ACA CAA CAT TAC CAA ATA CTG ACCTGT TGC TGT GGA TGT GAC AGC氨基酸序列為MWRPSDSTVYVPPPNPVSKVVATDAYVKRTNIFYHASSSRLLAVGHPYYSIKKVNKTVVPKVSGYQYRVFKVVLPDPNKFALPDSSLFDPTTQRLVWACTGLEVGRGQPLGVGVSGHPLLNKYDDVENSGGYGGNPGQDNRVNVGMDYKQTQLCMVGCAPPLGEHWGKGTQCSNTSVQNGDCPPLELITSVIQDGDMVDTGFGAMNFADLQTNKSDVPLDICGTVCKYPDYLQMAADPYGDRLFFYLRKEQMFARHFFNRAGTVGEPVPDDLLVKGGNNRSSVASSIYVHTPSGSLVSSEAQLFNKPYWLQKAQGHNNGICWGNHLFVTVVDTTRSTNMTLCASVSKSATYTNSDYKEYMRHVEEFDLQFIFQLCSITLSAEVMAYIHTMNPSVLEDWNFGLSPPPNGTLEDTYRYVQSQAITCQKPTPEKEKQDPYKDMSFWEVNLKEKFSSELDQFPLGRKFLLQSGYRGRTSARTGIKRPAVSKPSTAPKRKRTKTKK----EDE VDK VDK QDA QPL TQH YQI LTC CCG CDS(3) pVL1393/HPV11L1-E7cATGTGGCGGCCTAGCGACAGCACAGTATATGTGCCTCCTCCCAACCCTGTATCCAAGGTTGTTGCCACGGATGCGTATGTTAAACGCACCAACATATTTTATCATGCCAGCAGTTCTAGACTCCTTGCTGTGGGACATCCATATTACTCTATCAAAAAAGTTAACAAAACAGTTGTACCAAAGGTGTCTGGATATCAATATAGAGTGTTTAAGGTAGTGTTGCCAGATCCTAACAAGTTTGCATTACCTGATTCATCCCTGTTTGACCCCACTACACAGCGTTTAGTATGGGCGTGCACAGGGTTGGAGGTAGGCAGGGGTCAACCTTTAGGCGTTGGTGTTAGTGGGCATCCATTGCTAAACAAATATGATGATGTAGAAAATAGTGGTGGGTATGGTGGTAATCCTGGTCAGGATAATAGGGTTAATGTAGGTATGGATTATAAACAAACCCAGCTATGTATGGTGGGCTGTGCTCCACCGTTAGGTGAACATTGGGGTAAGGGTACACAATGTTCAAATACCTCTGTACAAAATGGTGACTGCCCCCCGTTGGAACTTATTACCAGTGTTATACAGGATGGGGACATGGTTGATACAGGCTTTGGTGCTATGAATTTTGCAGACTTACAAACCAATAAATCGGATGTTCCCCTTGATATTTGTGGAACTGTCTGCAAATATCCTGATTATTTGCAAATGGCTGCAGACCCTTATGGTGATAGGTTGTTTTTTTATTTGCGAAAGGAACAAATGTTTGCTAGACACTTTTTTAATAGGGCCGGTACTGTGGGGGAACCTGTGCCTGATGACCTGTTGGTAAAAGGGGGTAATAACAGATCATCTGTAGCTAGTAGTATTTATGTACATACACCTAGTGGCTCATTGGTGTCTTCAGAGGCTCAATTATTTAATAAACCATATTGGCTTCAAAAGGCTCAGGGACATAACAATGGTATTTGCTGGGGAAACCACTTGTTTGTTACTGTGGTAGATACCACACGCAGTACAAATATGACACTATGTGCATCTGTGTCTAAATCTGCTACATACACTAATTCAGATTATAAGGAATACATGCGCCATGTGGAGGAGTTTGATTTACAGTTTATTTTTCAATTGTGTAGCATTACATTATCTGCAGAAGTCATGGCCTATATACACACAATGAATCCTTCTGTTTTGGAGGACTGGAACTTTGGTTTATCGCCTCCACCAAATGGTACACTGGAGGATACTTATAGATATGTACAGTCACAGGCCATTACCTGTCAGAAACCCACACCTGAAAAAGAAAAACAGGATCCCTATAAGGATATGAGTTTTTGGGAGGTTAACTTAAAAGAAAAGTTTTCAAGTGAATTAGATCAGTTTCCCCTTGGACGTAAGTTTTTATTGCAAAGTGGATATCGAGGACGGACGTCTGCTCGTACAGGTATAAAGCGCCCAGCTGTGTCTAAGCCCTCTACAGCCCCCAAACGAAAACGTACCAAAACCAAAAAGTAA----ACA GAC GGA GAC ATCAGA CAA CTA CAA GAC CTT TTG CTG GGC ACA CTA AAT ATT GTG TGT CCC ATC TGCGCA CCA AAA CCA TAA氨基酸序列MWRPSDSTVYVPPPNPVSKVVATDAYVKRTNIFYHASSSRLLAVGHPYYSIKKVNKTVVPKVSGYQYRVFKVVLPDPNKFALPDSSLFDPTTQRLVWACTGLEVGRGQPLGVGVSGHPLLNKYDDVENSGGYGGNPGQDNRVNVGMDYKQTQLCMVGCAPPLGEHWGKGTQCSNTSVQNGDCPPLELITSVIQDGDMVDTGFGAMNFADLQTNKSDVPLDICGTVCKYPDYLQMAADPYGDRLFFYLRKEQMFARHFFNRAGTVGEPVPDDLLVKGGNNRSSVASSIYVHTPSGSLVSSEAQLFNKPYWLQKAQGHNNGICWGNHLFVTVVDTTRSTNMTLCASVSKSATYTNSDYKEYMRHVEEFDLQFIFQLCSITLSAEVMAYIHTMNPSVLEDWNFGLSPPPNGTLEDTYRYVQSQAITCQKPTPEKEKQDPYKDMSFWEVNLKEKFSSELDQFPLGRKFLLQSGYRGRTSARTGIKRPAVSKPSTAPKRKRTKTKK----NVR LVV ECT DGD IRQ LQD LLL GTL NIV CPI CAP KP實施例2重組蛋白HPV11L1-E7的鑒定重組蛋白免疫印跡分析包括1.樣本蛋白質定量分析用穿孔酸蛋白分析藥盒(PIERCE BICINCHONIC ACID，BCA)測定蛋白濃度(1)在96孔微滴定板上加系列標準濃度的BCA樣品10μl(同樣濃度加樣兩次)和未知樣品各5μl(同樣濃度加樣三次)；(2)每孔加200μl工作液，其中工作液A比工作液B為50∶1；(3)混勻30秒后37℃孵育30分鐘；(4)測得562nm吸光值，繪制標準曲線并計算樣本的蛋白質濃度。
2.樣品的變性處理取HPV11L1-E7重組蛋白樣品各10μl，分別加5μl水和15μl加樣緩沖液，100℃煮沸5-10分鐘。
3.樣本的SDS-PAGE凝膠(10％)電泳、轉膜、凝膠考馬斯亮籃染色、和免疫雜交和增強化學發(fā)光法(ECL)顯色具體步驟參照《分子克隆實驗指南》(科技出版社第二版1998年)。
4.重組蛋白透射電鏡分析重組蛋白樣本HPV11L1-E7經PBS透析(樣本裝入透析袋，然后用1×PBS在4℃透析過夜以去除氯化銫)后放在碳網上，用2％pH6.2鉬酸胺(SIGMA USA)染色后用日立H-800電鏡進行透射電鏡觀察和攝影。
實施例3體外細胞毒性T淋巴細胞分析(CTL)1.靶細胞的標記靶細胞的標記過程有1)離心C 2細胞和EL-4細胞(1000轉，5分鐘)，用無血清RPMI-1640培養(yǎng)基洗滌EL-4和C2細胞后再離心(1000轉，5分鐘)。2)重懸1×107細胞于200μl無血清RPMI-1640培養(yǎng)液；3)加100μl51Cr到上述細胞中；4)置37℃、5％CO2孵育60分鐘；5)先后用胎牛血清和RPMI-1640培養(yǎng)液洗滌靶細胞以去除游離51Cr加8ml培養(yǎng)液重懸細胞，小心從試管底部加入2ml血清；離心(800轉，8分鐘)后吸去血清上部的培養(yǎng)液，并用培養(yǎng)液洗管壁兩次；再離心(800轉，8分鐘)，去除全部上清(包括血清)；用約1ml培養(yǎng)液重懸細胞；6)數細胞數，調節(jié)細胞濃度至105/ml，將100μl的細胞加入96孔板，即每孔含104細胞。
2.細胞毒性實驗1)用重組蛋白刺激靶細胞。重組蛋白HPV11L1-E7與上述51Cr標記的EL-4細胞共同孵育3小時(濃度為50μg VLPs/106細胞)。作為對照將靶細胞與HPV11L1-VLPs抗體(1∶1000)和無關抗體(抗兔多抗1∶1000，Anti-Ig)孵育一小時后再與重株蛋白孵育3小時。
2)CTL反應測定。分別加100μl效應細胞和靶細胞于圓底96孔板，效應細胞/靶細胞比例(effect celltarget cell ratio，ET ratio)調至5∶1、2.5∶1、0.1∶1，每份樣本重復三孔；作為對照，設三孔100μl靶細胞中加入100μl的10％SDS以及設三孔100μl靶細胞與100μl培養(yǎng)基；置37℃、5％CO2孵育5小時；500RPM離心5MIN并收集每孔100μl上清液于γ計數管內；γ計數儀測定樣本中靶細胞特異性溶解引起的同位素釋放量；靶細胞的特異性溶解百分率計算如下特異性溶解％＝(樣本同位素釋放量－自發(fā)同位素釋放量)/(最大同位素釋放量－自發(fā)同位素釋放量)×100。最大釋放量100μl靶細胞中加入100μl的10％SDS后的同位素釋放量，自發(fā)釋放量100μl靶細胞與100μl培養(yǎng)基孵育而得的同位素釋放量。
實施例4小鼠體內CTL分析1.效應細胞的制備。重組蛋白HPV11L1-E7免疫小鼠并制備成效應細胞。具體步驟如下在8-10周齡雌性C57 BL/6J(H-2b)小鼠的后足墊分別注射50μg HPV11L1-E7，每組注射三個小鼠。對照組注射50μl PBS；4天后殺死小鼠并取其雙側腘窩和腹主動脈旁淋巴結；用尼龍篩網小心碾磨淋巴結以分離出單個淋巴細胞；重懸淋巴細胞于含20U/ml IL-2和10％FCS的RPMI-1640培養(yǎng)基；淋巴細胞懸液于37℃、5％CO2孵箱培養(yǎng)四天即可用作效應細胞進行CTL測定。
2.靶細胞的標記靶細胞的標記過程有離心C-2細胞和EL-4細胞(1000轉，5分鐘)，用無血清RPMI-1640培養(yǎng)基洗滌EL-4和C-2細胞后再離心(1000轉，5分鐘)；2)重懸1×107細胞于200μl無血清RPMI-1640培養(yǎng)液；3)加100μl51Cr到上述細胞中；4)置37℃、5％CO2孵育60分鐘；先后用胎牛血清和RPMI-1640培養(yǎng)液洗滌靶細胞以去除游離51Cr加8ml培養(yǎng)液重懸細胞，小心從試管底部加入2ml血清；離心(800轉，8分鐘)后吸去血清上部的培養(yǎng)液，并用培養(yǎng)液洗管壁兩次；再離心(800轉，8分鐘)，去除全部上清(包括血清)；用約1ml培養(yǎng)液重懸細胞；進行細胞計數，調節(jié)細胞濃度至105/ml；將100μl的細胞加入96孔板，即每孔含104靶細胞。
3.細胞毒性實驗分別加100μl效應細胞和靶細胞于圓底96孔板，效應細胞/靶細胞比例(effect celltarget cell ratio，ET ratio)調至50∶1、25∶1、1∶1，每份樣本重復三孔；作為對照，設三孔100μl靶細胞中加入100μl的10％SDS以及設三孔100μl靶細胞與100μl培養(yǎng)基；置37℃、5％CO2孵育5小時；500RPM離心5MIN；收集每孔100μl上清液于γ計數管內；γ計數儀測定樣本中靶細胞特異性溶解引起的同位素釋放量；靶細胞的特異性溶解百分率計算如前。
實施例5，小鼠感染模型的阻斷重組蛋白HPV11L1-E7免疫小鼠并制備成效應細胞。具體步驟如下在8-10周齡雌性C57 BL/6J(H-2b)小鼠的后足墊分別注射50μg HPV11L1-E7；注射轉染HPV11L1或E7細胞株；觀察小鼠體內接種細胞的生長情況；觀察體液免疫(抗體的測定)和細胞免疫的產生情況(CTL反應、DTH反應)；評價重組蛋白HPV11L1-E7對感染的阻斷作用。
實施例6，制備重組蛋白HPV11L1-E7與其它藥物的組合物重組蛋白HPV11L1-E7可與某些細胞因子混合，如與一定濃度的TNFα、INF或IL-2等混合制成藥物免疫動物C57 BL/6J(H-2b)小鼠(方法同前)，觀察體液免疫(抗體的測定)和細胞免疫的產生情況(CTL反應、DTH反應)；評價重組蛋白HPV11L1-E7對感染的阻斷作用。
實施例7，應用重組蛋白HPV11L1-E7預防和治療尖銳濕疣用重組蛋白HPV11L1-E7給尖銳濕疣感染高危人群(主要指尖銳濕疣患者的性伴侶和家庭成員)和尖銳濕疣患者定期注射，觀察體液免疫(抗體水平的測定)和細胞免疫的產生情況(CTL反應、DTH反應)和免疫維持的時間；評價重組蛋白HPV11L1-E7對感染的阻斷作用和使尖銳濕疣患者疣體消退的作用。
本發(fā)明與已有技術相比較，采用本發(fā)明的技術措施所取得的有益效果是由于CTL反應被認為在清除病毒感染細胞中起著關鍵作用，因此任何針對病毒感染的疫苗必須能夠誘導CTL反應。通常外源性抗原不足以通過MHCI類分子呈CD8+T細胞。我們不但能成功地構建和表達了重組蛋白HPV11L1-E7，還能證實其具有野生型病毒的空間的結構。具有深遠意義的是能發(fā)現重組HPV11L1-E7VLP可以作為抗原通過MHCI類途徑得到呈遞并引發(fā)CTL反應。
權利要求
1.人類乳頭瘤病毒11L1-E7重組蛋白及其應用，其特征在于將HPV11E7基因利用分子克隆技術克隆入連有HPVL1的載體PUC，再將這HPV11L1-E7基因片段插入桿狀病毒轉染載體pVL1393，然后轉染桿狀病毒線狀DNA并用之感染SF-9昆蟲細胞使HPV11L1-E7基因得到表達，其重組體pVL1393/HPV11L1-E7DNA的序列為(1)pVL1393/HPV11L1-E7aATGTGGCGGCCTAGCGACAGCACAGTATATGTGCCTCCTCCCAACCCTGTATCCAAGGTTGTTGCCACGGATGCGTATGTTAAACGCACCAACATATTTTATCATGCCAGCAGTTCTAGACTCCTTGCTGTGGGACATCCATATTACTCTATCAAAAAAGTTAACAAAACAGTTGTACCAAAGGTGTCTGGATATCAATATAGAGTGTTTAAGGTAGTGTTGCCAGATCCTAACAAGTTTGCATTACCTGATTCATCCCTGTTTGACCCCACTACACAGCGTTTAGTATGGGCGTGCACAGGGTTGGAGGTAGGCAGGGGTCAACCTTTAGGCGTTGGTGTTAGTGGGCATCCATTGCTAAACAAATATGATGATGTAGAAAATAGTGGTGGGTATGGTGGTAATCCTGGTCAGGATAATAGGGTTAATGTAGGTATGGATTATAAACAAACCCAGCTATGTATGGTGGGCTGTGCTCCACCGTTAGGTGAACATTGGGGTAAGGGTACACAATGTTCAAATACCTCTGTACAAAATGGTGACTGCCCCCCGTTGGAACTTATTACCAGTGTTATACAGGATGGGGACATGGTTGATACAGGCTTTGGTGCTATGAATTTTGCAGACTTACAAACCAATAAATCGGATGTTCCCCTTGATATTTGTGGAACTGTCTGCAAATATCCTGATTATTTGCAAATGGCTGCAGACCCTTATGGTGATAGGTTGTTTTTTTATTTGCGAAAGGAACAAATGTTTGCTAGACACTTTTTTAATAGGGCCGGTACTGTGGGGGAACCTGTGCCTGATGACCTGTTGGTAAAAGGGGGTAATAACAGATCATCTGTAGCTAGTAGTATTTATGTACATACACCTAGTGGCTCATTGGTGTCTTCAGAGGCTCAATTATTTAATAAACCATATTGGCTTCAAAAGGCTCAGGGACATAACAATGGTATTTGCTGGGGAAACCACTTGTTTGTTACTGTGGTAGATACCACACGCAGTACAAATATGACACTATGTGCATCTGTGTCTAAATCTGCTACATACACTAATTCAGATTATAAGGAATACATGCGCCATGTGGAGGAGTTTGATTTACAGTTTATTTTTCAATTGTGTAGCATTACATTATCTGCAGAAGTCATGGCCTATATACACACAATGAATCCTTCTGTTTTGGAGGACTGGAACTTTGGTTTATCGCCTCCACCAAATGGTACACTGGAGGATACTTATAGATATGTACAGTCACAGGCCATTACCTGTCAGAAACCCACACCTGAAAAAGAAAAACAGGATCCCTATAAGGATATGAGTTTTTGGGAGGTTAACTTAAAAGAAAAGTTTTCAAGTGAATTAGATCAGTTTCCCCTTGGACGTAAGTTTTTATTGCAAAGTGGATATCGAGGACGGACGTCTGCTCGTACAGGTATAAAGCGCCCAGCTGTGTCTAAGCCCTCTACAGCCCCCAAACGAAAACGTACCAAAACCAAAAAGTAA--- ATG CAT GGA AGA CTTGTT ACC CTA AAG GAT ATA GTA CTA GAC CTG CAG CCT CCT GAC CCT GTA GGG TTACAT TGC TAT GAG CAA TTA GAA GAC AGC TCA(2) pVL1393/HPV11L1-E7bATGTGGCGGCCTAGCGACAGCACAGTATATGTGCCTCCTCCCAACCCTGTATCCAAGGTTGTTGCCACGGATGCGTATGTTAAACGCACCAACATATTTTATCATGCCAGCAGTTCTAGACTCCTTGCTGTGGGACATCCATATTACTCTATCAAAAAAGTTAACAAAACAGTTGTACCAAAGGTGTCTGGATATCAATATAGAGTGTTTAAGGTAGTGTTGCCAGATCCTAACAAGTTTGCATTACCTGATTCATCCCTGTTTGACCCCACTACACAGCGTTTAGTATGGGCGTGCACAGGGTTGGAGGTAGGCAGGGGTCAACCTTTAGGCGTTGGTGTTAGTGGGCATCCATTGCTAAACAAATATGATGATGTAGAAAATAGTGGTGGGTATGGTGGTAATCCTGGTCAGGATAATAGGGTTAATGTAGGTATGGATTATAAACAAACCCAGCTATGTATGGTGGGCTGTGCTCCACCGTTAGGTGAACATTGGGGTAAGGGTACACAATGTTCAAATACCTCTGTACAAAATGGTGACTGCCCCCCGTTGGAACTTATTACCAGTGTTATACAGGATGGGGACATGGTTGATACAGGCTTTGGTGCTATGAATTTTGCAGACTTACAAACCAATAAATCGGATGTTCCCCTTGATATTTGTGGAACTGTCTGCAAATATCCTGATTATTTGCAAATGGCTGCAGACCCTTATGGTGATAGGTTGTTTTTTTATTTGCGAAAGGAACAAATGTTTGCTAGACACTTTTTTAATAGGGCCGGTACTGTGGGGGAACCTGTGCCTGATGACCTGTTGGTAAAAGGGGGTAATAACAGATCATCTGTAGCTAGTAGTATTTATGTACATACACCTAGTGGCTCATTGGTGTCTTCAGAGGCTCAATTATTTAATAAACCATATTGGCTTCAAAAGGCTCAGGGACATAACAATGGTATTTGCTGGGGAAACCACTTGTTTGTTACTGTGGTAGATACCACACGCAGTACAAATATGACACTATGTGCATCTGTGTCTAAATCTGCTACATACACTAATTCAGATTATAAGGAATACATGCGCCATGTGGAGGAGTTTGATTTACAGTTTATTTTTCAATTGTGTAGCATTACATTATCTGCAGAAGTCATGGCCTATATACACACAATGAATCCTTCTGTTTTGGAGGACTGGAACTTTGGTTTATCGCCTCCACCAAATGGTACACTGGAGGATACTTATAGATATGTACAGTCACAGGCCATTACCTGTCAGAAACCCACACCTGAAAAAGAAAAACAGGATCCCTATAAGGATATGAGTTTTTGGGAGGTTAACTTAAAAGAAAAGTTTTCAAGTGAATTAGATCAGTTTCCCCTTGGACGTAAGTTTTTATTGCAAAGTGGATATCGAGGACGGACGTCTGCTCGTACAGGTATAAAGCGCCCAGCTGTGTCTAAGCCCTCTACAGCCCCCAAACGAAAACGTACCAAAACCAAAAAGTAA--- GAA GAT GAG GTG GACAAG GTG GAC AAA CAA GAC GCA CAA CCT TTA ACA CAA CAT TAC CAA ATA CTG ACCTGT TGC TGT GGA TGT GAC AGC(3) pVL1393/HPV11L1-E7cATGTGGCGGCCTAGCGACAGCACAGTATATGTGCCTCCTCCCAACCCTGTATCCAAGGTTGTTGCCACGGATGCGTATGTTAAACGCACCAACATATTTTATCATGCCAGCAGTTCTAGACTCCTTGCTGTGGGACATCCATATTACTCTATCAAAAAAGTTAACAAAACAGTTGTACCAAAGGTGTCTGGATATCAATATAGAGTGTTTAAGGTAGTGTTGCCAGATCCTAACAAGTTTGCATTACCTGATTCATCCCTGTTTGACCCCACTACACAGCGTTTAGTATGGGCGTGCACAGGGTTGGAGGTAGGCAGGGGTCAACCTTTAGGCGTTGGTGTTAGTGGGCATCCATTGCTAAACAAATATGATGATGTAGAAAATAGTGGTGGGTATGGTGGTAATCCTGGTCAGGATAATAGGGTTAATGTAGGTATGGATTATAAACAAACCCAGCTATGTATGGTGGGCTGTGCTCCACCGTTAGGTGAACATTGGGGTAAGGGTACACAATGTTCAAATACCTCTGTACAAAATGGTGACTGCCCCCCGTTGGAACTTATTACCAGTGTTATACAGGATGGGGACATGGTTGATACAGGCTTTGGTGCTATGAATTTTGCAGACTTACAAACCAATAAATCGGATGTTCCCCTTGATATTTGTGGAACTGTCTGCAAATATCCTGATTATTTGCAAATGGCTGCAGACCCTTATGGTGATAGGTTGTTTTTTTATTTGCGAAAGGAACAAATGTTTGCTAGACACTTTTTTAATAGGGCCGGTACTGTGGGGGAACCTGTGCCTGATGACCTGTTGGTAAAAGGGGGTAATAACAGATCATCTGTAGCTAGTAGTATTTATGTACATACACCTAGTGGCTCATTGGTGTCTTCAGAGGCTCAATTATTTAATAAACCATATTGGCTTCAAAAGGCTCAGGGACATAACAATGGTATTTGCTGGGGAAACCACTTGTTTGTTACTGTGGTAGATACCACACGCAGTACAAATATGACACTATGTGCATCTGTGTCTAAATCTGCTACATACACTAATTCAGATTATAAGGAATACATGCGCCATGTGGAGGAGTTTGATTTACAGTTTATTTTTCAATTGTGTAGCATTACATTATCTGCAGAAGTCATGGCCTATATACACACAATGAATCCTTCTGTTTTGGAGGACTGGAACTTTGGTTTATCGCCTCCACCAAATGGTACACTGGAGGATACTTATAGATATGTACAGTCACAGGCCATTACCTGTCAGAAACCCACACCTGAAAAAGAAAAACAGGATCCCTATAAGGATATGAGTTTTTGGGAGGTTAACTTAAAAGAAAAGTTTTCAAGTGAATTAGATCAGTTTCCCCTTGGACGTAAGTTTTTATTGCAAAGTGGATATCGAGGACGGACGTCTGCTCGTACAGGTATAAAGCGCCCAGCTGTGTCTAAGCCCTCTACAGCCCCCAAACGAAAACGTACCAAAACCAAAAAGTAA----ACA GAC GGA GAC ATCAGA CAA CTA CAA GAC CTT TTG CTG GGC ACA CTA AAT ATT GTG TGT CCC ATC TGCGCA CCA AAA CCA TAA
2.如權利要求1所述的人類乳頭瘤病毒11L1-E7重組蛋白及其應用，其特征在于通過上述構建所得的重組蛋白可與藥學上可接受的藥物制成藥物組合物，用于預防HPV感染和治療HPV感染性疾病，也可研制用于臨床預防和治療尖銳濕疣的疫苗。
全文摘要
一種人類乳頭瘤病毒11L1－E7重組蛋白及其應用,利用分子克隆技術構建HPV11型早期蛋白基因E7與HPV11晚期基因L1融合的重組體HPV11L1－E7,并使其在桿狀病毒－昆蟲表達系統(tǒng)進行表達。該重組蛋白經證實具有與野生型HPV相似的生物學特性。該重組蛋白可與藥學上可接受的藥物制成藥物組合物,應用于臨床預防和治療HPV感染性疾病,并為今后研制用于臨床預防和治療尖銳濕疣的疫苗奠定基礎。
文檔編號A61P31/20GK1353114SQ0013134
公開日2002年6月12日 申請日期2000年11月3日 優(yōu)先權日2000年11月3日
發(fā)明者程浩, 鄭樹, 張?zhí)K展, 吳金民, 周凱 申請人:浙江大學醫(yī)學院附屬第二醫(yī)院, 浙江大學醫(yī)學院附屬邵逸夫醫(yī)院