專利名稱：生物衍生組織工程骨及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及骨組織修復(fù)的材料，特別是經(jīng)過物理、化學(xué)方法處理過的生物衍生骨支架，復(fù)合胚胎成骨細(xì)胞或骨髓基質(zhì)干細(xì)胞構(gòu)建的生物衍生組織工程骨。
組織工程學(xué)是采用生命科學(xué)和工程學(xué)的基本原理和方法，構(gòu)建人體組織(器官)，以修復(fù)、替代因創(chuàng)傷、疾病而無功能的組織(器官)。組織工程骨研究的關(guān)鍵問題是種子細(xì)胞和支架材料。種子細(xì)胞包括胚胎成骨細(xì)胞、組織干細(xì)胞等。在支架材料方面，過去多以無機(jī)材料(如羥基磷灰石、生物玻璃陶瓷、磷酸三鈣等)、有機(jī)材料(如聚乳酸、聚羥基乙酸及二者共聚物等)或有機(jī)與無機(jī)材料復(fù)合構(gòu)建組織工程骨支架，與細(xì)胞復(fù)合培養(yǎng)后，形成組織工程骨。人工合成材料的生物相容性、生物活性、生物降解性及與宿主骨的力學(xué)匹配等方面還存在一些缺點(diǎn)，且在孔隙率及孔徑大小等方面的仿生制作還有一定難度(見LangerR,Vacanti JP.Tissue engineering.Science,1993；260(5110):920～926)，同時某些人工材料(如聚乳酸等)大量使用時在體內(nèi)降解過程中產(chǎn)生的酸性物質(zhì)堆積，不利于細(xì)胞的附著、分裂、增殖；有的材料(如陶瓷類材料)碎性大，易斷裂，在體內(nèi)降解十分緩慢，以致成為異物，不能被機(jī)體接受，因此，支架材料已成為妨礙組織工程骨研究進(jìn)程的重大問題。
早在80年代就有生物衍生材料的研究，如牛骨來源的重組異種骨材料，經(jīng)臨床試用獲得一定成功。但牛與人的同源性差距較大，并不是理想的供體。最近的研究發(fā)現(xiàn)，豬與人在遺傳背景上有96％以上的同源性，同時還發(fā)現(xiàn)，豬的主要結(jié)締組織(如骨等)和周圍神經(jīng)未發(fā)現(xiàn)超急排斥靶抗原存在或僅有微弱表達(dá)(見李濤，李幼平，楊志明。豬到人異種移植抗原與移植免疫研究。中國修復(fù)重建外科雜志，1998；12(1):42～46)。
同種異體骨移植已有60年左右的臨床應(yīng)用歷史，過去主要用冷凍或硫柳泵處理，但臨床骨移植療效差異很大。最近的報道長骨缺損的修復(fù)其并發(fā)癥發(fā)生率達(dá)36.7％(見劉建中，王臻，胡蘊(yùn)玉等。異體骨關(guān)節(jié)移植修復(fù)肢體大段骨缺損的術(shù)后并發(fā)癥。中華外科雜志，2000；38(5):332～335)，主要原因是保存了異體骨的抗原性和沒有生物活性。冷凍骨移植平均愈合時間長達(dá)7～9個月。
本發(fā)明意于改進(jìn)現(xiàn)有技術(shù)中的不足，采用物理和化學(xué)的方法將異體骨和豬骨制成組織工程骨的支架，復(fù)合細(xì)胞后構(gòu)建生物衍生組織工程骨，用于臨床上修復(fù)骨缺損。
本發(fā)明的生物衍生組織工程骨，由豬骨或異體骨制成基本去除抗原性和細(xì)胞成分，保留基本框架的衍生組織工程骨支架，表面修飾可生物降解的高分子材料、蛋白質(zhì)、多肽、生長因子類的物質(zhì)，和接種其上的胚胎成骨細(xì)胞或骨髓基質(zhì)干細(xì)胞組成。
上述生物衍生骨支架的制備方法，(1)是用豬或異體骨采用物理化學(xué)方法制備三類衍生組織工程骨支架，即部分脫蛋白生物衍生骨支架、完全脫蛋白生物衍生骨支架和部分脫鈣生物衍生骨支架，其具體制備方法見說明書附圖3、4和5，制備的骨支架保存原來骨組織的基本框架，具有一定的生物力學(xué)功能，基本去除抗原性；(2)在生物衍生骨支架上進(jìn)行表面修飾，引入可生物降解的高分子材料、蛋白質(zhì)、多肽或氨基酸序列、生長因子類的物質(zhì)；(3)采用胚胎成骨細(xì)胞和骨髓基質(zhì)干細(xì)胞與制作的生物衍生骨支架復(fù)合培養(yǎng)，構(gòu)建生物衍生組織工程骨，用于臨床修復(fù)骨缺損。
本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比具有如下優(yōu)點(diǎn)1．采用物理化學(xué)方法制備的生物衍生骨支架，其抗原性較弱，有良好的組織親和性和結(jié)合力，其天然的孔隙結(jié)構(gòu)、大小和形態(tài)端正，為種子細(xì)胞的粘附、增殖、分化、成骨提供天然的三維生長空間結(jié)構(gòu)。這種材料來源豐富，制作簡便，易于塑形，并在功能適應(yīng)性、組織相容性、理化性能、生物降解性、造價等方面優(yōu)于人工合成材料。
2．生物衍生骨支架本身具有良好骨誘異性和骨引導(dǎo)性，進(jìn)一步復(fù)合表面修飾物質(zhì)后，為種子細(xì)胞粘附、增殖及發(fā)揮成骨作用提供好的微環(huán)境。
3．利用上述的良好支架材料，復(fù)合種子細(xì)胞后，成為有生命的生物衍生組織工程骨，可廣泛用于臨床上修復(fù)骨缺損。
以下是說明書附圖的圖面說明

圖1和圖2是本發(fā)明的結(jié)構(gòu)示意圖。圖中1為生物衍生骨支架；2為支架表面修飾物質(zhì)；3為種子細(xì)胞；4為構(gòu)建的生物衍生組織工程骨；5為骨缺損；6為宿主骨。
圖3是本發(fā)明部分脫蛋白生物衍生骨支架的制備方法。
圖4是本發(fā)明完全脫蛋白生物衍生骨支架的制備方法。
圖5是本發(fā)明部分脫鈣生物衍生骨支架的制備方法。
實施例1．一種生物衍生組織工程骨及其制備方法，參見附圖1、2和3是一類制備部分脫蛋白生物衍生骨支架的方法取新鮮豬骨或異體骨，去除其上所附軟組織、中心骨髓及軟骨部分，蒸餾水沖洗干凈，于38℃ 30％過氧化氫中脫脂72小時，每24小時換液一次；蒸餾水浸洗干凈，于75％酒精中去除殘余過氧化氫24小時，蒸餾水浸洗干凈；氯仿∶甲醇為3∶1，于室溫下部分脫蛋白4小時，蒸餾水清洗；在-38℃,10-5Pa條件下冷凍干燥24小時；25KGYγ射線輻射處理消毒并清除剩余膠原蛋白的抗原性，最后獲得部分脫蛋白生物衍生骨支架〔1〕；再將上述生物衍生骨支架進(jìn)行表面修飾，引入有膠原蛋白、多肽等物質(zhì)〔2〕，采用胚胎成骨細(xì)胞或骨髓基質(zhì)干細(xì)胞〔3〕與制作的生物衍生骨支架復(fù)合培養(yǎng)，構(gòu)建生物衍生組織工程骨〔4〕，用于修復(fù)骨缺損〔5〕，重建宿主骨〔6〕的結(jié)構(gòu)和功能。
實施例2．一種生物衍生組織工程骨及其制備方法，參見附圖1、2和4是一類制備完全脫蛋白生物衍生骨支架的方法取新鮮豬骨或異體骨，去除其上所附軟組織、中心骨髓及軟骨部分，蒸餾水沖洗干凈，于38℃ 30％過氧化氫中脫脂48小時，每24小時換液一次；蒸餾水浸洗干凈，氯仿∶甲醇為3∶1，于室溫下部分脫蛋白4小時，蒸餾水清洗；入110℃乙二胺中循環(huán)提取24小時，蒸餾水浸洗干凈，于室溫下入乙醇中浸泡24小時，除去殘余乙二胺，蒸餾水清洗；在-38℃,10-5Pa條件下冷凍干燥24小時；于20～50℃下經(jīng)環(huán)氧乙烷滅菌3～9小時，最后獲得完全脫蛋白生物衍生骨支架〔1〕；再將上述生物衍生骨支架進(jìn)行表面修飾，引入可生物降解的高分子材料聚乳酸、膠原蛋白、氨基酸序列RGD等〔2〕，采用胚胎成骨細(xì)胞或骨髓基質(zhì)干細(xì)胞〔3〕與制作的生物衍生骨支架復(fù)合培養(yǎng)，構(gòu)建生物衍生組織工程骨〔4〕，用于修復(fù)骨缺損〔5〕，重建宿主骨〔6〕的結(jié)構(gòu)和功能。
實施例3．一種生物衍生組織工程骨及其制備方法，參見附圖1、2和5是一類制備部分脫鈣生物衍生骨支架的方法取新鮮豬骨或異體骨，去除其上所附軟組織、中心骨髓及軟骨部分，蒸餾水沖洗干凈，于38℃ 30％過氧化氫中脫脂48小時，每24小時換液一次；蒸餾水浸洗干凈，入0.6M鹽酸在4℃下部分脫鈣72小時，每24小時換液一次，蒸餾水浸洗干凈；入乙醇中浸泡4小時，除去殘余過氧化氫；氯仿∶甲醇為3∶1，于室溫下部分脫蛋白4小時，蒸餾水清洗；在-38℃,10-5Pa條件下冷凍干燥24小時；25KGYγ射線輻射處理消毒并清除剩余膠原蛋白的抗原性，最后獲得部分脫鈣生物衍生骨支架〔1〕；再將上述生物衍生骨支架進(jìn)行表面修飾，引入可生物降解的高分子材料聚羥基乙酸、生長因子IGF-1等物質(zhì)〔2〕，采用胚胎成骨細(xì)胞或骨髓基質(zhì)干細(xì)胞〔3〕與制作的生物衍生骨支架復(fù)合培養(yǎng)，構(gòu)建生物衍生組織工程骨〔4〕，用于修復(fù)骨缺損〔5〕，重建宿主骨〔6〕的結(jié)構(gòu)和功能。
實施例4．取新鮮同種新鮮肋骨應(yīng)用實施例1所制得的一種生物衍生組織工程骨，采用自體骨髓基質(zhì)干細(xì)胞與生物衍生骨支架復(fù)合構(gòu)建，用于修復(fù)因腫瘤切除所致3條肋骨缺損，重建了胸廓支架，術(shù)后心肺功能恢復(fù)良好。
實施例5．取新鮮同種異體骨應(yīng)用實施例2所制得的一種生物衍生組織工程骨，采用同種異體胚胎成骨細(xì)胞與生物衍生骨支架復(fù)合構(gòu)建，用于修復(fù)股骨缺損，術(shù)后愈合良好，無明顯組織反應(yīng)。
實施例6．取新鮮同種異體骨應(yīng)用實施例3所制得的一種生物衍生組織工程骨，采用同種異體胚胎成骨細(xì)胞與生物衍生骨支架復(fù)合構(gòu)建，用于修復(fù)尺、橈骨上1/3陳舊骨折畸形愈合、切骨矯正后植骨，術(shù)后未發(fā)現(xiàn)明顯組織反應(yīng)，達(dá)到骨性愈合。
權(quán)利要求
1．一種生物衍生組織工程骨，其構(gòu)成的特征在于豬骨或異體骨制成基本去除抗原性和細(xì)胞成分，保留基本框架的生物衍生骨支架〔1〕，該生物衍生骨支架有三類部分脫蛋白生物衍生骨支架、完全脫蛋白生物衍生骨支架和部分脫鈣生物衍生骨支架；在上述生物衍生骨支架表面修飾有可生物降解的高分子材料、蛋白質(zhì)、多肽或氨基酸、生長因子類的物質(zhì)〔2〕，和接種其上的胚胎成骨細(xì)胞或骨髓基質(zhì)干細(xì)胞〔3〕，構(gòu)建出生物衍生組織工程骨〔4〕，用于修復(fù)骨缺損〔5〕，重建宿主骨〔6〕的結(jié)構(gòu)和功能。
2．一種制備權(quán)利要求1生物衍生組織工程骨的方法，其特征在于2.1制備部分脫蛋白生物衍生骨支架的方法是取新鮮豬骨或異體骨，去除其上所附軟組織、中心骨髓及軟骨部分，蒸餾水沖洗干凈，于38℃ 30％過氧化氫中脫脂72小時，每24小時換液一次；蒸餾水浸洗干凈，于75％酒精中去除殘余過氧化氫24小時，蒸餾水浸洗干凈；氯仿∶甲醇為3∶1，于室溫下部分脫蛋白4小時，蒸餾水清洗；在-38℃,10-5Pa條件下冷凍干燥24小時；25KGYγ射線輻射處理消毒并清除剩余膠原蛋白的抗原性，最后獲得部分脫蛋白生物衍生骨支架；2.2制備完全脫蛋白生物衍生骨支架的方法是取新鮮豬骨或異體骨，去除其上所附軟組織、中心骨髓及軟骨部分，蒸餾水沖洗干凈，于38℃ 30％過氧化氫中脫脂48小時，每24小時換液一次；蒸餾水浸洗干凈，氯仿∶甲醇為3∶1，于室溫下部分脫蛋白4小時，蒸餾水清洗；入110℃乙二胺中循環(huán)提取24小時，蒸餾水浸洗干凈，于室溫下入乙醇中浸泡24小時，除去殘余乙二胺，蒸餾水清洗；在-38℃,10-5Pa條件下冷凍干燥24小時；于20～50℃下經(jīng)環(huán)氧乙烷滅菌3～9小時，最后獲得完全脫蛋白生物衍生骨支架；2.3制備部分脫鈣生物衍生骨支架的方法是取新鮮豬骨或異體骨，去除其上所附軟組織、中心骨髓及軟骨部分，蒸餾水沖洗干凈，于38℃ 30％過氧化氫中脫脂48小時，每24小時換液一次；蒸餾水浸洗干凈，入0.6M鹽酸在4℃下部分脫鈣72小時，每24小時換液一次，蒸餾水浸洗干凈；入乙醇中浸泡4小時，除去殘余過氧化氫；氯仿∶甲醇為3∶1，于室溫下部分脫蛋白4小時，蒸餾水清洗；在-38℃,10-5Pa條件下冷凍干燥24小時；25KGYγ射線輻射處理消毒并清除剩余膠原蛋白的抗原性。最后獲得部分脫鈣生物衍生骨支架；上述三類制備的骨支架保存原來骨組織的基本框架，具有一定的生物力學(xué)功能，基本去除抗原性；2.4在上述三類生物衍生骨支架上進(jìn)行支架表面修飾，引入可生物降解的高分子材料、蛋白質(zhì)、多肽、氨基酸序列、生長因子類的物質(zhì)；2.5在上述三類生物衍生骨支架上采用胚胎成骨細(xì)胞或骨髓基質(zhì)干細(xì)胞與制作的生物衍生骨支架復(fù)合培養(yǎng)，構(gòu)建生物衍生組織工程骨，用于臨床修復(fù)骨缺損。
全文摘要
本發(fā)明涉及生物衍生組織工程骨,是人體組織修復(fù)的材料。采用物理化學(xué)處理方法,將來源于豬骨或異體骨制成生物衍生骨支架,保留天然骨的無機(jī)或部分有機(jī)成分所形成的天然網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)及基本生物力學(xué)性能,引入可生物降解的高分子材料、蛋白質(zhì)、多肽或氨基酸、生長因子類的物質(zhì),種植人胚胎成骨細(xì)胞或骨髓基質(zhì)干細(xì)胞,構(gòu)建有生命的生物衍生組織工程骨,用于臨床上修復(fù)骨缺損。
文檔編號A61F2/28GK1304711SQ0013208
公開日2001年7月25日 申請日期2000年12月15日 優(yōu)先權(quán)日2000年12月15日
發(fā)明者楊志明, 秦廷武 申請人:華西醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院