專利名稱：制備一種新的微膠囊的方法
本申請(qǐng)為中國專利申請(qǐng)?zhí)枮?9103098.0、申請(qǐng)日為1989年3月18日、發(fā)明名稱為《制備一種新的微膠囊的方法》的中國專利申請(qǐng)的分案申請(qǐng)。
本發(fā)明涉及口服施用生物活性藥劑的方法和制劑，該藥劑被囊包在一種或多種生物相容的聚合物或共聚物賦形劑中，最好是一種可生物降解的聚合物或共聚物，這種微膠囊由于具有合適的大小及物化性質(zhì)，使得它及其中所含的藥劑能到達(dá)動(dòng)物胃腸道的濾泡淋巴集結(jié)(也稱為“派伊爾氏淋巴集結(jié)”)并被其有效地吸收，而不會(huì)由于藥劑穿過胃腸道失去其有效性。在身體的呼吸道、泌尿生殖道、大腸和其他粘膜組織中也存在類似的濾泡淋巴集結(jié)。上述組織在下文都一般地稱為與粘膜相關(guān)的類淋巴組織。
利用微包囊技術(shù)來保護(hù)敏感的生物活性藥劑不會(huì)降解是眾所周知的。一般說來，生物活性藥劑被囊包在一系列保護(hù)性外壁物質(zhì)的任一種中，它們的本質(zhì)通常是聚合物。被囊包的藥劑可以用聚合物單層外壁包裹(微膠囊)，或者也可以均一地分散于聚合物基質(zhì)中(徵球體)。(在下文中，術(shù)語微膠囊包括微膠囊和微球體二者)。微膠囊中的藥劑量可根據(jù)需要而不同，其范圍從少量可一直到高達(dá)微膠囊組合物的95％或更多。微膠囊的直徑也可根據(jù)需要而不同。其范圍從小于1微米至3微米或更大。
派伊爾氏淋巴集結(jié)是位于小腸、大腸和闌尾壁中的類淋巴結(jié)集體，它是身體防御系統(tǒng)的一個(gè)重要部分，防止外來傳染媒介及其他物質(zhì)的附著和穿透?？乖钦T導(dǎo)抗體生成和/或體內(nèi)細(xì)胞介導(dǎo)的免疫系統(tǒng)的物質(zhì)，包括外源蛋白或組織這類物質(zhì)。由抗原和免疫系統(tǒng)相互作用而誘導(dǎo)的免疫應(yīng)答，就體內(nèi)是否能夠?qū)τ谠摽乖碾S后侵襲而建立抗體或細(xì)胞免疫應(yīng)答來說，可以是陽性的或陰性的。細(xì)胞介導(dǎo)的免疫應(yīng)答包括殺傷外源細(xì)胞或組織，“細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒性”、以及遲滯型過敏這樣一些應(yīng)答。抗體屬于一類稱為免疫球蛋白(Ig)的蛋白質(zhì)，它們是作為對(duì)抗原的應(yīng)答而產(chǎn)生的，它們能與抗原特異性結(jié)合?？贵w和抗原結(jié)合時(shí)形成復(fù)合物。此復(fù)合物有助于從體內(nèi)清除抗原，促進(jìn)活抗原的殺傷，例如傳染媒介和外源組織或癌，并中和毒素或酶的活性。對(duì)于體內(nèi)的粘膜表面來說，在圍繞著這些位點(diǎn)的分泌物中，所存在的重要類抗體是分泌免疫蛋白A(sIgA)。分泌IgA抗體防止傳染媒介和其他抗原對(duì)體內(nèi)粘膜組織的附著和穿透。
在通常采用的免疫方法中，例如肌肉或皮下注射抗原或疫苗雖然有許多抗原通過粘膜組織進(jìn)入體內(nèi)，但很少能在粘膜分泌物中誘導(dǎo)出sIgA抗體。分泌IgA抗體最有效的誘導(dǎo)方法是，對(duì)與粘膜相關(guān)的類淋巴組織進(jìn)行直接免疫，而胃腸道的派伊爾氏淋巴集結(jié)構(gòu)成了體內(nèi)這種組織的最大部分。
派伊爾氏淋巴集結(jié)具有IgA前體B細(xì)胞，這些細(xì)胞能夠聚集于胃腸和上呼吸道的粘膜固有層區(qū)域，并分化成成熟的合成IgA的漿細(xì)胞。正是這些漿細(xì)胞實(shí)際分泌出抗體分子。Heremans和Bazin測(cè)定了用抗原口服免疫了的小鼠的IgA應(yīng)答的發(fā)展，他們的研究表明，抗原特異性的IgA漿細(xì)胞是依次出現(xiàn)的，首先是在隔膜淋巴結(jié)中，然后是在脾中，最后是在胃腸道的粘膜固有層中(H.Bazin,G.Levi,G.Doria，“在口服施用抗原的無細(xì)菌小鼠腸外類淋巴組織中，IgA抗體形成細(xì)胞對(duì)于檢測(cè)到的免疫應(yīng)答的決定性貢獻(xiàn)”，J.Immunol.105:1049,1970；P.A.Crabbe,D.R.Nash,H.Bazin,H.Eyssen,J.F.Heremans，“用鐵蛋白對(duì)無細(xì)菌小鼠進(jìn)行口服或非腸道免疫后腸道漿細(xì)胞中的IgA型抗體”，J.Exp.Med.130:723,1969)。后來的研究表明，口服施用抗原導(dǎo)致腸道中產(chǎn)生sIgA抗體，還在距腸道較遠(yuǎn)的粘膜分泌物中產(chǎn)生sIgA抗體，例如在支氣管洗液、初乳、乳液、唾液和淚水中(J.Mestecky,J.R.McGhee,R,R.,Arnold,S.M.Michalek,S.J.Prince,J.L.Babb，“通過攝取細(xì)菌抗原而在人外分泌中選擇性誘導(dǎo)免疫應(yīng)答”，J.Clin.Invest.61:731,1978,P.C.Montgomery,B.R.Rosner,J.Cohen，“分泌抗體應(yīng)答，由二硝基苯基化的Ⅲ型肺炎球菌誘導(dǎo)的抗DNP抗體，”Immunol.Commum.3:143,1974；L.A.Hanson,S.Ahistedt,B.Carlsson,B.Kaijser.P.Larsson,A.MattsbyBaltzer,A.Sohl Akerlund,C.Svanborg Eden和A.M.Dvennerholm，“針對(duì)腸細(xì)菌毒性抗原的分泌IgA抗體它們的誘導(dǎo)及可能的關(guān)系”，Adv.Exp.Med.Biol.1007:165,1978)。因此很顯然，派伊爾氏淋巴集結(jié)是前體IgA細(xì)胞的豐富來源，這些細(xì)胞在抗原刺激后，沿循環(huán)轉(zhuǎn)移途徑，同時(shí)在最初的抗原刺激區(qū)和較遠(yuǎn)的粘膜表面引起IgA的表達(dá)。這種循環(huán)形式提供了一種粘膜免疫系統(tǒng)，即作為對(duì)腸道遭遇到的環(huán)境抗原和潛在病原體的應(yīng)答，不斷地向粘膜位點(diǎn)輸送敏化B細(xì)胞。
對(duì)本發(fā)明特別重要的是口服免疫來誘導(dǎo)保護(hù)性抗體的能力。已經(jīng)知道，動(dòng)物對(duì)抗原的攝取導(dǎo)致在支氣管和鼻孔洗液中出現(xiàn)抗原特異性的sIgA抗體。例如，對(duì)自愿人員進(jìn)行的研究表明，口服施用流感疫苗能有效地在鼻分泌物中誘導(dǎo)抗流感的分泌抗體。
廣泛研究已經(jīng)證實(shí)了口服免疫誘導(dǎo)普通的粘膜免疫系統(tǒng)的可行性。但在少數(shù)情況下需要大劑量才能達(dá)到有效免疫，因此使這種方法不大切合實(shí)際。很顯然，任何一種涉及口服施用某成分的方法或制劑都要設(shè)計(jì)成使得該藥劑通過胃腸道時(shí)保護(hù)至它不被降解。并達(dá)到將該成分送到派伊爾氏淋巴集結(jié)的目的。如果不是這樣，該成分即使能夠到達(dá)派伊爾氏淋巴集結(jié)處，也是在數(shù)量不足或不能達(dá)到有效的狀態(tài)。
因此，需要有一種口服免疫的方法，它將有效地刺激免疫系統(tǒng)，并克服抗原通過胃腸道到達(dá)派伊爾氏淋巴集結(jié)時(shí)的降解問題。還存在一種更加具體的需要，即需要一種將抗原送至淋巴集結(jié)處，并使抗原一旦到體內(nèi)后就釋放的方法。還存在這樣一種需要，即需要一種通過體內(nèi)其他粘膜組織免疫的方法，該方法克服了抗原的降解問題，并達(dá)到將其送達(dá)與粘膜相關(guān)的類淋巴組織的目的。此外，需要保護(hù)施用于粘膜的生物活性試劑不被降解，改善和/或達(dá)到使它們通過與粘膜相關(guān)的類淋巴組織進(jìn)入體內(nèi)的目的，并在一旦進(jìn)入體內(nèi)后就釋放生物活性試劑。
本發(fā)明涉及通過粘膜應(yīng)用，更具體說是通過口服和氣管內(nèi)施用將生物活性藥劑送至動(dòng)物體內(nèi)然后釋放的方法和制劑。該藥劑以微膠囊形式被包在生物相容的聚合物或共聚物中，最好是可生物降解的聚合物或共聚物，它們能通過腸胃道或存在于粘膜表面而不降解或很少降解，使得其中的藥劑能夠不改變地以有效量到達(dá)并進(jìn)入淋巴集結(jié)或其他與粘膜相關(guān)的類淋巴組織。術(shù)語生物相容的定義為一種對(duì)身體無毒性、沒有致癌作用、不會(huì)在體內(nèi)組織中誘導(dǎo)炎癥的聚合物。微膠囊聚合物賦形劑最好是可生物降解的，也就是說它應(yīng)當(dāng)能通過體內(nèi)過程降解成容易被體內(nèi)處理的產(chǎn)物，而不在體內(nèi)積累下來。微膠囊還是一種其大小和物化性質(zhì)使得它能夠有效地和選擇性地被淋巴集結(jié)攝取的組合物。因此，解決了使藥劑到達(dá)淋巴集結(jié)或其他與粘膜相關(guān)的組織并被攝取的問題。
本發(fā)明的目的之一是提供一種給動(dòng)物口服施用抗原的方法，該方法能使抗原到達(dá)派伊爾氏淋巴集結(jié)并被攝取，因而刺激粘膜免疫系統(tǒng)，而在通過動(dòng)物胃腸道時(shí)不損失其有效性。
本發(fā)明的另一目的是提供一種給動(dòng)物口服施用抗原的方法，該方法能使抗原到達(dá)派伊爾氏淋巴集結(jié)并被攝取，因而刺激全身免疫系統(tǒng)，同時(shí)不因?yàn)橥ㄟ^胃腸道而損失其有效性。
本發(fā)明進(jìn)一步的目的是提供一種給動(dòng)物施用抗原的方法，該方法使抗原到達(dá)與粘膜相關(guān)的類淋巴組織并被攝取，因而刺激粘膜免疫系統(tǒng)，同時(shí)不因?yàn)樵谡衬け砻娴慕到舛鴵p失其有效性。
本發(fā)明進(jìn)一步的目的是提供一種給動(dòng)物施用抗原的方法，該方法使抗原到達(dá)與粘膜相關(guān)的類淋巴組織并被攝取，因而劑激全身免疫系統(tǒng)，同時(shí)不因?yàn)樵谡衬け砻娴慕到舛鴵p失其有效性。
本發(fā)明進(jìn)一步的目的是提供一種給動(dòng)物口服施用生物活性藥劑的方法，該方法使藥劑到達(dá)派伊爾氏淋巴集結(jié)并被攝取，從而導(dǎo)致該藥劑在局部或全身的濃度上升。
本發(fā)明進(jìn)一步的目的是提供一種給動(dòng)物施用生物活性藥劑的方法，該方法使藥劑到達(dá)與粘膜相關(guān)的類淋巴組織并被攝取，從而導(dǎo)致該藥劑在局部或全身的濃度上升。
本發(fā)明進(jìn)一步的目提提供一種由核心生物活性組份和包囊聚合物或共聚物賦形劑組成的制劑，賦形劑具有生物相容性，并且最好是可生物降解的，該制劑能夠用于上述的粘膜施用法中。
本發(fā)明進(jìn)一步的目的是提供一種改進(jìn)的疫苗傳遞系統(tǒng)，以避免對(duì)于免疫增效劑的需要。
本發(fā)明進(jìn)一步的目的是提供一種改進(jìn)的疫苗傳遞系統(tǒng)，用于通過從一次施用的微囊化抗原中搏動(dòng)式釋放抗原來誘導(dǎo)免疫作用。
本發(fā)明進(jìn)一步的目的是提供一種改進(jìn)的疫苗傳遞系統(tǒng)，此系統(tǒng)既避免了對(duì)于免疫增效劑的需要，又能夠通過從一次施用的微囊化抗原中搏動(dòng)式釋放抗原來誘導(dǎo)免疫作用。
本發(fā)明進(jìn)一步的目的是提供一種能夠達(dá)到上述目的的組合物。


圖1是通過終點(diǎn)滴定測(cè)定的小鼠中血漿IgA應(yīng)答。
下面是對(duì)實(shí)施本發(fā)明方法的具體方案的說明。這些說明證實(shí)了抗原至粘膜相關(guān)類淋巴組織的定靶的和按計(jì)劃的傳遞(所用抗原是三硝基苯基鑰孔血盞蛋白和葡萄球菌腸毒素B的類毒素疫苗)。以及一種囊包在50∶50聚(DL-丙交酯-共-乙交酯)中用于小鼠的藥物(苯壬四烯酯)。
但應(yīng)當(dāng)注意，除了聚(DL-丙交酯-共-乙交酯)以外還可使用其他聚合物。這些聚合物的例子包括但不限于聚(乙交酯)、聚(DL-丙交酯-共-乙交酯)、共聚草酸酯、聚己內(nèi)酯、聚(丙交酯-共-己內(nèi)酯)、聚(酯酰胺)、聚原酸酯和聚(8-羥基丁酸)、以及聚酐。
另外，還可使用其他生物活性成分，其實(shí)例包括、但不限于對(duì)抗病毒、細(xì)菌、原生動(dòng)物、真菌疾病例如流感，呼吸合胞體、副流感病毒、流感嗜血桿菌、百日咳博德特氏菌、淋病奈氏球菌、肺炎鏈球菌和鐮狀瘧原蟲或其他由病原微生物導(dǎo)致的疾病等接種的抗原，或?qū)褂扇湎x病原體這類微生物導(dǎo)致的疾病接種的抗原，或?qū)棺儜B(tài)反應(yīng)接種的抗原。另外可用的生物活性試劑包括但不限于免疫調(diào)節(jié)劑、養(yǎng)分、藥物、肽、淋巴因子和細(xì)胞素等。Ⅰ．微包囊A．裝有染料的微膠囊的制備香豆素是一種水不溶性熒光染料，將它用一種不能生物降解的聚合物聚苯乙烯微包囊，這樣制備的熒光微膠囊能用來跟蹤微膠囊侵入派伊爾氏淋巴集結(jié)。制備這種微膠囊的方法如下首先制備聚合物溶液，即將4.95克聚苯乙烯(685D型，Dow Chemical Compary,Midland,MI)溶于29.5克二氯甲烷中(試劑級(jí)，Eastman Kodak,Rochester,NY)。然后在聚合物溶液中加入大約0.05克香豆素(Polysciences,Inc.,Warrington,PA)，用磁性攪拌棒攪拌混合物使其溶解。
在另一個(gè)容器中，通過將40克聚乙烯醇(Vinol 2050,Air Products and Chemicals,Allentown,PA)溶于360克去離子水中制備10％(重量)的聚乙烯醇(PVA)水溶液，即加工介質(zhì)。制備了PVA溶液后，加入6克二氯乙烷使此溶液飽和。然后，將PVA溶液加至1升的樹脂罐中(Ace,Glass,Inc.Vineland,NI)，該罐裝配有真孔攪動(dòng)軸和2.5英吋的聚四氟乙烯葉輪，通過Fisher型穩(wěn)速電動(dòng)機(jī)以大約380rpm攪動(dòng)。
然后，將聚苯乙烯/香豆素混合物加至盛有PVA加工介質(zhì)的樹脂罐中，加入過程是這樣完成的將聚苯乙烯/香豆素混合物通過7mm孔徑的長頸漏斗倒入，該漏斗直接通向樹脂罐的混合物中。形成一種穩(wěn)定的水包油型乳劑，然后在環(huán)境壓力下攪拌大約30分鐘，以產(chǎn)生合適大小的油微滴。然后封閉樹脂罐，使樹脂罐內(nèi)的壓力逐漸降至520mmHg柱，降壓過程通過與壓力計(jì)和放氣閥相連的水力抽氣器進(jìn)行。樹脂罐的內(nèi)容物在減壓下攪拌24小時(shí)，使所有的二氯甲烷揮發(fā)。在所有的二氯甲烷揮發(fā)后，離心收集硬化的微膠囊，于室溫下在真空室中干燥72小時(shí)。B．裝有抗原的微膠囊的制備TNP-KLH是一種水溶性抗原，將它包囊在聚(DL-丙交酯-共-乙交酯)中，這是一種生物相容的可生物降解的聚酯。制備微膠囊的方法如下首先制備聚合物溶液，將0.5g 50∶50的聚(DL-丙交酯-共-乙交酯)溶于4.0g二氯甲烷中。然后，將300微升TNP-KLH水溶液(46mg TNP-LKH/ml；在透析后)加入其中，通過用Vortex-Genie2型(ScientificIndustries,Inc.Bohemia,NY)攪拌混合物使之均勻地分散于聚(DL-丙交酯-共-乙交酯)溶液中。
在另一個(gè)容器中，通過將4.8克PVA溶于55.2克去離子水中制備8％重量的PVA水溶液。在PVA溶解以后，將PVA溶液加至100毫升的樹脂罐中(Kontes Glass,Inc.Vineland,NJ)，該罐裝配有真孔攪拌裝置和1.5英吋的聚四氟乙烯葉輪。將聚合物溶液通過7mm孔徑的長頸漏斗倒入PVA加工介質(zhì)中。在此加入過程中，以大約650rpm攪拌PVA溶液，然后使生成的水包油型乳液在樹脂罐中攪拌大約10分鐘，樹脂罐中的內(nèi)容物轉(zhuǎn)移至裝在4升燒杯中的3.5升的去離子水中，用2英吋的不銹鋼葉輪以800rpm攪拌。產(chǎn)生的微膠囊在去離子水中攪拌大約30分鐘，離心收集，用去離子水洗兩次以除去所有殘留的PVA，然后通過冰凍干燥收集。微膠囊產(chǎn)物由直徑約為1-10微米的球形顆粒組成，以類似的方式可以制備其他微膠囊，例如葡萄球菌腸毒素B微膠囊。
抗原微膠囊的TNP-KLH內(nèi)容物(也即微膠囊的核心裝載物)通過在12毫升離心管中稱出10mg抗原微膠囊進(jìn)行測(cè)定。在管中加入3.0毫升二氯甲烷，通過攪拌使聚(DL-丙交酯-共-乙交酯)溶解。然后，在管中加入3.0ml去離子水并激烈攪拌1分鐘。使離心管中的內(nèi)容物離心，以分離有機(jī)層和水層。將水層轉(zhuǎn)移至10ml容量瓶中。重復(fù)萃取并將水層合并于容量瓶中。用去離子水將容量瓶加至刻度。通過蛋白檢測(cè)法對(duì)瓶中的TNP-KLH進(jìn)行定量，并隨后確定微膠囊中的TNP-KLH量。微膠囊中含有0.2％重量的TNP-KLH。以類似的方式，可對(duì)葡萄球菌腸毒素B微膠囊中的葡萄球菌腸毒素B進(jìn)行定量。Ⅱ．裝有染料的微膠囊在口服施用后對(duì)派伊爾氏淋巴集結(jié)的穿透對(duì)于分泌IgA的應(yīng)答能夠起誘導(dǎo)位點(diǎn)作用的最大量組織是派伊爾氏淋巴集結(jié)。這些離散的淋巴網(wǎng)狀組織集結(jié)位于沿著小腸和蘭尾的整個(gè)長度上。將完整抗原直接定向傳遞入此組織中以達(dá)到較高的局部濃度，目前被認(rèn)為是誘導(dǎo)傳播性粘膜IgA應(yīng)答的最有效的方式。可生物降解的微膠囊是達(dá)到此定點(diǎn)接種的理想載體。實(shí)例1聚苯乙烯微膠囊通過給小鼠口服施用裝有熒光染料香豆素的聚苯乙烯微膠囊，研究腸道淋巴網(wǎng)狀組織對(duì)微膠囊的攝取和此穿透作用的尺寸限制。對(duì)未麻醉但固定好的BALB/C小鼠施用0.5ml 100mg/ml的不同大小的熒光微膠囊懸浮液(直徑小于5微米或8-50微米)，利用飼喂針加自來水注入胃中。在施用后不同時(shí)間(0.5、1和2小時(shí))，處死小鼠并分離小腸。分離出含有離散的淋巴集結(jié)的一些1厘米的腸道切段，洗掉腸腔內(nèi)容物，翻卷后快速冰凍。制備好冰凍段并在熒光顯微鏡下檢查冰凍切段，以觀察由淋巴集結(jié)從腸腔中攝取的微膠囊的數(shù)目、位置和大小。
雖然有些微膠囊陷落于絨毛之間，因此在沖洗時(shí)未被洗出，但除了派伊爾氏淋巴集結(jié)之外，在其他任何位置都未觀察到對(duì)組織的穿透。在口服施用后0.5小時(shí)，觀察到微膠囊在小腸近端(在遠(yuǎn)端沒有)的淋巴集結(jié)中，隨著時(shí)間的延長，微膠囊通過蠕動(dòng)轉(zhuǎn)運(yùn)，因此在2小時(shí)后它們已通過了胃腸道，并發(fā)現(xiàn)它們存在于腸胃的淋巴集結(jié)中。攝入細(xì)胞的微膠囊主要位于淋巴集結(jié)園頂?shù)耐庵?，而不在頂端，似乎是蠕?dòng)時(shí)在園頂和相鄰絨毛之間的物理捕獲促進(jìn)了它們的攝取。比較小于5微米和8-50微米制劑的攝取效率證實(shí)，微膠囊直徑大于10微米時(shí)不被派伊爾氏淋巴集結(jié)吸收，而直徑為1-10微米的微膠囊被選擇性地迅速攝取。這一結(jié)果提示，由可生物降解的外壁物質(zhì)構(gòu)成的微膠囊能作為有效的定點(diǎn)傳遞抗原的手段，將抗原送至淋巴網(wǎng)狀組織以在粘膜表面誘導(dǎo)免疫作用。實(shí)例2、85∶15聚(DL-丙交酯-共-乙交酯)微膠囊1．生物相容的和可生物降解的微膠囊至派伊爾氏淋巴集結(jié)的攝取。
對(duì)幾組小鼠通過胃管以在自來水中的懸浮液方式施用含有熒光染料香豆素-6的可生物降解的微膠囊。這些研究中所選用的微膠囊外壁物質(zhì)由85∶15聚(DL-丙交酯-共-乙交酯)組成，因?yàn)樗?個(gè)星期內(nèi)能夠抵抗嚴(yán)重的生物腐蝕。在施用后1-35天的不同時(shí)間，從單個(gè)小鼠中取出3個(gè)代表性的派伊爾氏淋巴集結(jié)，主要的隔膜淋巴結(jié)和脾，加工并制備系列冰凍段。
利用合適的激發(fā)光和柵欄式濾光鏡在熒光顯微鏡下觀察時(shí)，香豆素表現(xiàn)出深綠色熒光，因此能夠目測(cè)到直徑大大小于1微米的微膠囊。對(duì)所有切段進(jìn)行觀察，以對(duì)每個(gè)組織或器官中微膠囊的全部數(shù)量定量，利用有刻度的目鏡測(cè)微尺確定每個(gè)內(nèi)化微膠囊的大小，并記下它在組織或器官中的位置。
如表1所示，在口服施用后24小時(shí)，以及外伸到35天內(nèi)的所有測(cè)試點(diǎn)，都在淋巴集結(jié)內(nèi)觀察到不同大小的內(nèi)化微膠囊。除了派伊爾氏淋巴集結(jié)以外，在腸道組織的任一點(diǎn)上任何時(shí)候都未觀察到任何大小的微膠囊的穿透。派伊爾氏淋巴集結(jié)內(nèi)的微膠囊總數(shù)到第4天一直上升，然后在隨后的31天內(nèi)下降，降至最高數(shù)目的大約15％。
這與在1，2和4天的時(shí)間點(diǎn)上，在腸道絨毛表面可觀察到游離的微膠囊是一致的。有趣的是，在口服施用微膠囊懸浮液大約10小時(shí)后，能在排泄的糞便中清楚觀察到裝有香豆素的微膠囊。借助于紫外光源跟蹤這一清除作用，發(fā)現(xiàn)到24小時(shí)時(shí)，攝入微膠囊的絕大部份都被排出了。因此，在2和4天時(shí)間點(diǎn)上觀察到的微膠囊的持續(xù)攝入派伊爾氏淋巴集結(jié)，只能歸結(jié)為輸入劑量截留于腸道絨毛間的粘液中的一小部分。此外，這些被截留微膠囊的攝取效率一定比腸腔中(但在粘液層上)的微膠囊的攝取要大好幾個(gè)數(shù)量級(jí)。如果將這些結(jié)果延伸到人，則這些觀察是很重要的，由于人的派伊爾氏淋巴集結(jié)組織比小鼠要大得多，物質(zhì)通過人小腸的轉(zhuǎn)移時(shí)間比小鼠也大得多，因此有理由相信，微膠囊在人的派伊爾氏淋巴集結(jié)的攝取效率也要高得多。
如表1所示，在所有測(cè)試的時(shí)間點(diǎn)，在派伊爾氏淋巴集結(jié)中觀察到不同大小的微膠囊。在第1、2和4天的時(shí)間點(diǎn)上，小于2微米(45-47％)、2-5微米(31-35％)和大于5微米(18-23％)的微膠囊部份保持相對(duì)恒定。在第7天，可以明顯觀察到大小分布的漂移，在更晚的時(shí)間點(diǎn)上這一漂移甚至更明顯，即小的(小于2微米)和中等(2-5微米)的微膠囊不再占優(yōu)勢(shì)，而大的(大于5微米)微膠囊所觀察到的數(shù)目最多。此漂移與第7天及其后觀察到的淋巴集結(jié)中微膠囊總數(shù)的下降是同時(shí)發(fā)生的。這些結(jié)果與微膠囊的運(yùn)動(dòng)趨向是一致的，即小的和中等大小的微膠囊趨于從派伊爾氏淋巴集結(jié)遷移出去，而大(大于5微米)微膠囊則更傾向于保留不動(dòng)。
與微膠囊在淋巴集結(jié)結(jié)構(gòu)中的位置相關(guān)的數(shù)據(jù)是與小的和中等微膠囊傾向于遷移離開派伊爾氏淋巴集結(jié)這一事實(shí)相一致的。在派伊爾氏淋巴集結(jié)中觀察到微膠囊時(shí)，發(fā)現(xiàn)它總是在它進(jìn)入派伊爾氏淋巴集結(jié)處比較靠近園頂上皮處(在200微米以內(nèi))，或是在類淋巴組織的更深處(距最近的可鑒別的園頂上皮處≥200微米)(表1)。在派伊爾氏淋巴集結(jié)組織深處觀察到的微膠囊?guī)缀醵际切『椭械戎睆降?。在施用后?天，92％的微膠囊位于靠近園頂上皮處。位于深處的微膠囊比例在第4天上升至總量的24％，此后隨著時(shí)間下降，在第14天及其后降至大約2％。因此，小的和中等的微膠囊穿過并遷移出派伊爾氏淋巴集結(jié)，而大(大于5微米)微膠囊在較長的期間內(nèi)保留在園頂區(qū)。2．微膠囊至隔膜淋巴結(jié)和脾的遷移。
如表2所示，在施用后1天，在隔膜淋巴結(jié)中觀察到少量微膠囊，其數(shù)目在7天內(nèi)逐步上升。第7天后，數(shù)量逐漸下降，但在第37天仍可檢測(cè)至。大小分布情況清楚地表明，直徑大于5微米的微膠囊不進(jìn)入此組織，在較早的時(shí)間點(diǎn)上，小的(小于2微米)微膠囊相對(duì)于中等(2-5微米)微膠囊的比率較高，這表明直徑較小的微膠囊最容易進(jìn)入此組織。此外，在較早的時(shí)間點(diǎn)上，大部分微膠囊都位于緊靠囊下竇中的囊下。在較晚的時(shí)間點(diǎn)上，分布狀況移向淋巴結(jié)結(jié)構(gòu)的深部，在第14天，90％的微膠囊都位于皮質(zhì)和髓區(qū)中。觀察到微膠囊首先是在囊下竇之中或附近測(cè)測(cè)出的。這一觀察與它們是經(jīng)引流派伊爾氏淋巴集結(jié)的淋巴管進(jìn)入此組織是一致的。在第4天，可清楚分辨出位于此組織深處的微膠囊比率逐步增加，在第10天及其后，跟著是總數(shù)的逐步下降，這一觀察表明微膠囊進(jìn)入此組織中，并通過有效的淋巴排流而滲出。
對(duì)牌進(jìn)行類似的檢察，結(jié)果表明，直到施用后第4天才可檢測(cè)到微膠囊。直到第14天，才在此器官中觀察到微膠囊的峰值。與隔膜淋巴結(jié)中的情況一樣，沒有觀察到直徑大于5微米的微膠囊。在所有時(shí)間點(diǎn)上，都在皮層中的該器官深處觀察到微膠囊。應(yīng)當(dāng)注意到，在脾中觀察到微膠囊峰值的時(shí)間正是隔膜淋巴結(jié)中的大部分微膠囊位于深層并且總數(shù)正在下降的時(shí)間。這些結(jié)果與淋巴液由派伊爾氏淋巴集結(jié)流至隔膜淋巴結(jié)，以及由隔膜淋巴結(jié)通過胸導(dǎo)管流至血流中的已知模式是一致的。因此脾中存在的微膠囊似乎已穿越了派伊爾氏淋巴集結(jié)和隔膜淋巴結(jié)，并通過血流循環(huán)進(jìn)入脾臟。
在另外的一些實(shí)驗(yàn)中，通過組織化學(xué)和免疫組織化學(xué)技術(shù)檢查含有吸附的85∶15 DL-PLG微膠囊的派伊爾氏淋巴集結(jié)、隔膜淋巴結(jié)和脾的組織切段。除了其他的觀察以外，這些研究清楚表明，吸入到派伊爾氏淋巴集結(jié)的微膠囊存在于巨噬細(xì)胞樣細(xì)胞中。這些細(xì)胞中的胞內(nèi)碳水化合物，最可能是糖原，以及主要組織相容性復(fù)合物(MHC)Ⅱ類抗原可以通過高碘酸希夫氏試劑(PAS)被染色。進(jìn)一步，發(fā)現(xiàn)在隔膜淋巴結(jié)和脾中觀察到的微膠囊，都已進(jìn)入到這些PAS和MHCⅡ類陽性細(xì)胞中。因此，含有抗原的微膠囊于派伊爾氏淋巴集結(jié)中被具抗原的副衛(wèi)細(xì)胞(APC)內(nèi)化，這些APC將抗原膠囊傳播至其他類淋巴組織中。
這些結(jié)果表明，由口服施用微膠囊疫苗誘導(dǎo)的免疫應(yīng)答的質(zhì)量可由顆粒大小來控制。直徑小于5微米的微膠囊由派伊爾氏淋巴集結(jié)APC中滲出，并將抗原釋放至作為全身免疫應(yīng)答誘導(dǎo)位點(diǎn)的類淋巴組織中。與此相反，直徑在5-10微米的微膠囊在派伊爾氏淋巴集結(jié)及APC中保留較長時(shí)間，并將抗原釋放至sIgA誘導(dǎo)位點(diǎn)中。實(shí)例3．派伊爾氏淋巴集結(jié)對(duì)10種組合物微膠囊攝取的比較。
通過實(shí)驗(yàn)來鑒別對(duì)實(shí)際的受控釋放傳遞系統(tǒng)有用的微膠囊聚合物賦形劑，它應(yīng)當(dāng)具有這樣的物化性質(zhì)，此性質(zhì)使微膠囊能被定靶吸入與粘膜相關(guān)的類淋巴組織中。對(duì)于后一點(diǎn)而論，研究結(jié)果表明，疏水顆粒更易于被網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)的細(xì)胞吞噬。因此，檢查了10種不同的聚合物的1-10微米微膠囊由派伊爾氏淋巴集結(jié)的吸收。這10種聚合物都具有一定程度的疏水性。這些研究選用的外壁物質(zhì)由在吸水性、生物降解及疏水性方面都不同的聚合物組成。這些聚合物包括聚苯乙烯、聚(L-丙交酯)、聚(DL-丙交酯)、50∶50聚(DL-丙交酯-共-乙交酯)、85∶15聚(DL-丙交酯-共-乙交酯)、聚(羥基丁酸)、聚(異丁烯甲酯)、乙基纖維秦、纖維素醋酸氫酞酸和三乙酸纖維素。如表3所示，由10種賦形劑中的7種制備的微膠囊，在口服施用含有20mg微膠囊的懸浮液48小時(shí)后，被吸收并主要存在于派伊爾氏淋巴集結(jié)的園頂正中。沒有觀察到一個(gè)微球體穿透除派伊爾氏淋巴集結(jié)外的其他組織中。只有一個(gè)例外即乙基纖維素，發(fā)現(xiàn)其吸收效率與賦形劑的相對(duì)疏水性相關(guān)。在小鼠的3個(gè)代表性派伊爾氏淋巴集結(jié)中觀察到1500個(gè)微膠囊，該小鼠施用有最疏水的化合物基團(tuán)〔聚苯乙烯、聚(異丁烯甲酯)、聚(羥基丁酸)〕，而施用疏水性相對(duì)小的聚酯〔聚(L-丙交酯)、聚(DL-丙交酯)、85∶15聚(DL-丙交酯-共-乙交酯)、50∶50聚(DL-丙交酯-共-乙交酯)〕時(shí)只觀察到200-1000個(gè)微膠囊，纖維素類不被吸收。
已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，微膠囊的物化特性通過它們由腸腔吸收至派伊爾氏淋巴集結(jié)的效率而調(diào)節(jié)微膠囊的定靶性能，而且這是一種表面現(xiàn)象，因此，通過對(duì)聚合物進(jìn)行化學(xué)修飾或以包衣方式改變微膠囊的表面特性，能用來調(diào)節(jié)微膠囊將生物活性試劑定靶傳遞至與粘膜相關(guān)的類淋巴組織和APC上的效率。可以采用的包衣實(shí)例包括但不限于化學(xué)試劑、聚合物、抗體、生物粘結(jié)劑、蛋白、肽、碳水化合物、植物凝集素等天然和人工來源的物質(zhì)。Ⅲ．用微膠囊疫苗誘導(dǎo)的抗體應(yīng)答材料和方法小鼠研究中所用小鼠為BALB/C小鼠，8-12周令。
三硝基苯基-鑰孔血蘭素來自鑰孔(Megathuracrenulate)的血蘭素(KLH)購自Calbiochem(SanDiego,C.A)。根據(jù)Rittenburg和Amkraut的方法(M.B.Rittenburg和A.A.Amkraut，“三硝基苯基血蘭素的免疫原性初級(jí)和次級(jí)抗一半抗原沉淀素的產(chǎn)生，”J.Immunol.97:421,1966)，用2,4,6-三硝基苯磺酸使之與三硝基苯基半抗原結(jié)合(TNP-KLH)。用15400的摩爾消光系數(shù)和350nm的波長通過分光光度法測(cè)得取代比例為TNP861-KLH，對(duì)于在此波長下KLH的影響作了30％的修正。
葡萄球菌腸毒素B疫苗根據(jù)Warren等人所述的方法(J.R.Warren,L.Spero.和J.F.Netzger“福爾馬林失活的葡萄球苗腸毒素B的抗原性”，J.Immunol.111:885,1973)，制備福爾馬林化的葡萄球菌腸毒素B(SEB)疫苗。簡(jiǎn)而言之，1克腸毒素溶于0.1M磷酸鈉緩沖液PH7.5中，使其成為2mg/ml。腸毒素溶液中加入甲醛，使甲醛∶腸毒素的摩爾比例為4300∶1。將溶液置于緩慢搖動(dòng)的保溫?fù)u床中，環(huán)境溫度控制在37℃，每天監(jiān)測(cè)pH使之維持在7.5±0.1。30天以后，濃縮該類毒素，使用加壓過濾單元(Amicon)將其洗入硼酸鹽緩沖液中(BBS)，通過過濾消毒。對(duì)3-3.5kg的兔子肌肉注射1mg類毒素物質(zhì)，體質(zhì)未降低，這證實(shí)了腸毒素已轉(zhuǎn)化為類毒素。
免疫以合適的濃度將微囊化和非微囊化的抗原懸浮于8份過濾消毒的自來水和2份碳酸氫鈉溶液中(7.5％的溶液)，在施用0.5ml懸浮液之前把受體小鼠綁縛過夜，用插管針通過胃插管法給予施用(J.L.Babb,H.Kiyono,S.M.和Michalek,J.R.McChee，“免疫應(yīng)答的LPS調(diào)節(jié)免疫應(yīng)答對(duì)于口服施用的T依賴抗原的抑制”，J.Immunol.127:1052,1981)。
生物體液的收集1．血漿對(duì)后眶叢穿刺，用毛細(xì)刻度收管收集血液。凝塊形成后收集血清，離心去除紅細(xì)胞和血小板，熱失活，檢測(cè)前保存于-70℃。
2．腸道分泌物以15分鐘的間隔，給小鼠施用四倍劑量(0.5ml)的灌洗液〔25mM NaCl,40mM Na2SO4,10mM KCl,20mM NaHCo3,48.5mM聚(乙二醇)，530mosM的摩爾滲透壓濃度〕(C.O.Elson,W.Falding，和J.Lefkowitz,“一種能夠重復(fù)測(cè)定小鼠腸道分泌物IgA抗體的灌洗技術(shù)”，J.Immunol.Meth.67:101,1984).最后劑量的灌洗液施用后15分鐘，使小鼠麻醉，再過15分鐘后，通過ip注射給它們施用0.1mg毛果蕓香堿。在隨后的10-20分鐘內(nèi)，刺激腸道內(nèi)容物的排放。將其收集入培養(yǎng)皿中。其中含有3ml在50mM EDTA中的0.1mg/ml大豆胰蛋白酶抑制劑(Sigma St.Louis,MO)，激烈攪拌后離心以去除懸浮物質(zhì)，上清液轉(zhuǎn)移至園底聚碳酸酯離心管中，加入30微升20毫摩爾的苯基甲基磺酰氟(PMSF,Sigma)，然后通過高速離心澄清(27000×g,20分鐘，4℃)。澄清以后，PMSF和1％迭氮鈉各加入20微升，將其配制成FCS的10％溶液，從而為任一種殘留的蛋白酶提供一種可供選擇的底物。
3．唾液在腸道排放的同時(shí)還分泌大量唾液，通過毛細(xì)作用收集0.25ml至巴斯德吸管中，加入胰蛋白酶抑制劑、PMSF、疊氮鈉和FCS各20微升，然后澄清。
4．支氣管肺泡洗液用1.0ml PBS對(duì)肺進(jìn)行灌洗，從而得到支氣管肺泡洗液。將動(dòng)物飼喂針插入氣管內(nèi)，通過縫合進(jìn)行固定。引入PBS并抽取5次以得到洗液，加入胰蛋白酶抑制劑、PMSF、迭氮鈉、和FCS各20微升，然后通過離心澄清。
5．免疫化學(xué)試劑從市場(chǎng)購得對(duì)鼠IgN、IgG和IgA具特異性的固相吸收和親和純化的多克隆山羊IgG抗體(SouthernBiotechnology Associates,Birmingham,AL)。通過它們與適當(dāng)純化的單克隆抗體和骨髓瘤蛋白的結(jié)合能力來測(cè)試其在放射免疫檢測(cè)中的特異性。
6．固相放射免疫檢測(cè)法利用氯胺T法(W.M.Hunter，“放射免疫檢測(cè)法”，《實(shí)驗(yàn)免疫學(xué)手冊(cè)》，M.Weir編，Blackwell Scientific Publishing,Oxford,1978.14.1頁)，用無載體Na125I(Amersham)標(biāo)記純化的抗體。用1μg/ml的結(jié)合TNP的牛血清清蛋白(BSA)或葡萄球菌腸毒素B包衣Immulon Removawell檢測(cè)條(Dynatech)，包衣過程在BBS中于4℃下過夜進(jìn)行。對(duì)照條不預(yù)以包衣，但所有條卻用1％BSA(在BBA中)于室溫下封閉2小時(shí)，該溶液用作為所有樣品和125I標(biāo)記試劑的稀釋液。適當(dāng)稀釋生物體液樣品，加入到3個(gè)一樣的洗滌過的小孔中，于室溫下保溫6小時(shí)。洗滌以后，每孔中加入100000CPm的125I標(biāo)記的同型特異性的抗免疫球蛋白抗體，于4℃保溫過夜。通過洗滌去除未結(jié)合125I標(biāo)記的抗體，然后用伽瑪5500型分光計(jì)(BeckmanInstruments,Inc.,San Ramon,CA)對(duì)小孔計(jì)數(shù)。在檢測(cè)TNP特異性抗體時(shí)，在包衣有1μg/孔同型特異性抗體的小孔上，用含有已知量免疫球蛋白的2倍系列稀釋的標(biāo)準(zhǔn)血清(Miles Seientific,Naperville,IL)來定標(biāo)。通過計(jì)算機(jī)得到定標(biāo)曲線和未知部分的插入(利用“Logit-log“或”Four Parameter Logistic”BASICTechnology Center,Vanderbilt MedicalCenter,Nashville,TN)。對(duì)于特異于葡萄球菌腸毒素B的抗體，其結(jié)果以血清稀釋度的倒數(shù)給出，該稀釋度所產(chǎn)生的信號(hào)比同樣稀釋度的預(yù)抽血對(duì)應(yīng)組大3倍(終點(diǎn)滴定度)。A．通過注射施用疫苗微膠囊1．通過微膠囊化產(chǎn)生的佐劑效應(yīng)實(shí)例1由微膠囊腹腔施用產(chǎn)生的佐劑效應(yīng)我們實(shí)驗(yàn)室的研究結(jié)果已經(jīng)表明，在許多實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)中，微膠囊化對(duì)其中摻入的抗原或疫苗產(chǎn)生顯著增強(qiáng)的免疫應(yīng)答。通過直接比較提供了一個(gè)實(shí)例，即在用可溶性或微膠囊化的類腸毒素免疫以后，比較對(duì)于葡萄球菌腸毒素B(即葡萄球菌食物中毒的致病劑)的循環(huán)抗體應(yīng)答的水平和同型分布。給幾組小鼠施用不同劑量的、滲入在50∶50聚(DL-丙交酯-共-乙交酯)微膠囊中的類毒素疫苗，或以可溶形式通過腹腔(IP)注射施用。在免疫后的第10和20天，收集血漿樣品，用同型特異性的放射免疫檢測(cè)法通過終點(diǎn)滴定檢測(cè)抗毒素活性(表4)?？扇茴惗舅氐淖罴褎┝?25μg)所誘導(dǎo)的針對(duì)毒素的特性免疫應(yīng)答很弱，只在IgM同型中檢測(cè)到。與此相反，施用25μg摻入微膠囊中的類毒素不僅誘導(dǎo)了IgM應(yīng)答，還誘導(dǎo)了IgG應(yīng)答，在免疫后第20天可在1/2560的稀釋血清中檢測(cè)到。此外，可以微膠囊形式施用更大劑量的類毒素而不降低應(yīng)答幅度，而使用50μg劑量的可溶性類毒素則不行。事實(shí)上，測(cè)量微膠囊達(dá)到的釋放表明，微膠囊的釋放水平使得可以施用4-5倍劑量而不產(chǎn)生很強(qiáng)的局部麻痹，因此導(dǎo)致顯著增強(qiáng)的免疫作用。在第二(表5)和第三次免疫(表6)以后，此佐劑活性甚至更為顯著。
第二次免疫后的第20天，施用50μg微膠囊化類毒素的小鼠比施用最佳劑量可溶性類毒素的小鼠的IgG抗毒素免疫應(yīng)答高512倍。進(jìn)一步，要用最佳劑量的可溶性類毒素進(jìn)行第3次免疫，才能將針對(duì)毒素的抗體應(yīng)答水平提高到與用100μg微膠囊化類腸毒素單獨(dú)一次免疫后所觀察到的相等的水平。實(shí)驗(yàn)室常用的蛋白抗原也記載過相等的佐劑活性，例如半抗原化的鑰孔血蘭素和流感病毒疫苗。實(shí)例2微膠囊皮下施用產(chǎn)生的佐劑效應(yīng)發(fā)現(xiàn)目前的傳遞系統(tǒng)在肌肉或皮下(SC)注射后具有活性。如表7所示，這是通過直接比較對(duì)幾組小鼠作IP和SC注射后免疫應(yīng)答的時(shí)間進(jìn)程和水平而進(jìn)行研究的。
沿著小鼠背上四個(gè)位點(diǎn)通過SC注射施用100μg微球體類腸毒素，所刺激的IgG抗毒素應(yīng)答峰值與IP注射后觀察到的相當(dāng)，觀察到抗毒素抗體出現(xiàn)的動(dòng)力學(xué)有些遲滯。然而，仍選到了非常高的抗體水平，這證實(shí)在除腹膜以外的地方注射也是可行的。如表8所示，在第2次免疫之后，IP和SC途經(jīng)的峰值滴度再一次相當(dāng)，盡管SC途徑的應(yīng)答遲滯仍然是明顯的。2．由微膠囊化產(chǎn)生的佐劑效應(yīng)的機(jī)理實(shí)例1．微膠囊化產(chǎn)生的佐劑效應(yīng)不是聚合物固有的佐劑活性的結(jié)果在研究1-10μm DL-PLG微球體介導(dǎo)針對(duì)包囊抗原的增強(qiáng)的體液免疫應(yīng)答的機(jī)理時(shí)，必須考慮3種可能的機(jī)制。首先，其長期的慢性釋放(貯存)與未包囊抗原的一次大劑量相比較，可能對(duì)增強(qiáng)免疫起作用，第二，我們的實(shí)驗(yàn)已經(jīng)表明，這種大小范圍的微球體很容易被處理和展示抗原的細(xì)胞所吞噬。因此，還必須考慮較大劑量的非降解抗原的直接定靶傳遞的效果，即將它們傳遞到負(fù)責(zé)啟動(dòng)針對(duì)T細(xì)胞依賴抗原免疫應(yīng)答的細(xì)胞。第三，微囊通過它們以類似于細(xì)菌脂多糖或胞壁酰二肽等佐劑的方式活化免疫系統(tǒng)細(xì)胞的能力、可能具有固有的免疫增強(qiáng)活性。通過這后一種機(jī)理增強(qiáng)免疫的特點(diǎn)是由該佐劑與抗原同時(shí)施用時(shí)表達(dá)的。
為了測(cè)定微球體是否具有通過這些顆粒非特異性活化免疫系統(tǒng)的能力而介異的天然佐劑效果，將針對(duì)100μg微膠囊化的類腸毒素的抗體應(yīng)答與施用等劑量的與不含抗原的對(duì)照微球體混合的類腸毒素后誘導(dǎo)的抗體應(yīng)答相比較。如表9所示，對(duì)10只BALB/C小鼠的一些組，通過IP注射施用各種形式的抗原，通過終點(diǎn)滴定RIA，測(cè)定血漿中IgM和IgG特異于腸毒素的抗體應(yīng)答。
由最佳劑量可溶性類腸毒素(25μg)的快速濃注產(chǎn)生的血漿抗體應(yīng)答水平很低，其特征是由第10天的峰值為800的IgM滴度和第20天的峰值為800的IgG滴度組成。而施用等劑量的微囊類腸毒素對(duì)于IgM和IgG同型體都誘導(dǎo)很強(qiáng)的應(yīng)答，并在免疫30天后還保持上升。將可溶性類腸毒素和其重量、大小和組成都與包囊抗原相同的對(duì)照微球體一起施用，所誘導(dǎo)的血漿抗毒素應(yīng)答并不顯著高于通過單用可溶性抗原誘導(dǎo)的水平。在對(duì)照微球體之前1天或之后1、2或5天施用可溶性抗原，也不改變此結(jié)果。因此，這些數(shù)據(jù)表明，施用在1-10μm DL-PLG微球體中的抗原時(shí)表現(xiàn)的免疫增強(qiáng)作用并不是由于微球體天然具有活化免疫系統(tǒng)的能力的結(jié)果。相反，這些數(shù)據(jù)與貯存效應(yīng)，抗原至展示抗原的副衛(wèi)細(xì)胞的定靶傳遞或這兩種機(jī)理的結(jié)合是一致的。實(shí)例2、延滯1-10μm微膠囊的抗原釋放速率可提高抗體應(yīng)答水平及延遲峰值應(yīng)答的時(shí)間制備四種抗原釋放速率不同的含類腸毒素的微膠囊，比較它們?cè)贗P注射后誘導(dǎo)血漿抗毒素應(yīng)答的能力。在此次研究中，微膠囊的抗原釋放速率是兩種機(jī)理的函數(shù)通過外壁基質(zhì)上孔的擴(kuò)散及外壁基質(zhì)的水解(生物腐蝕)。批號(hào)為#605-026-1和#514-140-1的產(chǎn)品具有不同的穿過孔的初始釋放速率，第二階段的釋放則是其通過水解而降解的函數(shù)。與此相反，批號(hào)為#697-143-2和#928-060-00的產(chǎn)品具有緊密而均勻的外壁基質(zhì)，很少有穿過孔的釋放，它們的釋放基本上是外壁水解速率的函數(shù)。然而，后兩批產(chǎn)品中組成微膠囊的丙交酯與乙交酯的比例不同，85∶15DL-PLG對(duì)水解具有更大的抗性，這導(dǎo)致類腸毒素的釋放速率更慢。
由批號(hào)為#605-026-1(48小時(shí)時(shí)釋放60％)的產(chǎn)品誘導(dǎo)的免疫應(yīng)答在第20天達(dá)到峰值為6400的IgG滴度(表10)。批號(hào)為#514-140-1的產(chǎn)品(在48小時(shí)時(shí)釋放30％)刺激的IgG抗體也在第20天達(dá)到峰值，但在第20和30天所出現(xiàn)的濃度更高。
用批號(hào)為#697-143-2的產(chǎn)品(在48小時(shí)時(shí)釋放10％)進(jìn)行免疫，結(jié)果是在第30和45天達(dá)到IgG抗體的峰值水平，而且比早期釋放的任一批號(hào)所誘導(dǎo)的都高得多(102,400)。通過用丙交酯與乙交酯比例為85∶15來進(jìn)一步延遲抗原釋放速率，批號(hào)為#928-060-00(在48小時(shí)時(shí)釋放0％)的產(chǎn)品，將峰值抗體水平延遲到45和60天，但沒有觀察到進(jìn)一步的免疫增強(qiáng)作用。
這些結(jié)果與延遲和維持抗原釋放能刺激更高的抗體應(yīng)答是一致的。然而，由這些不同微球體誘導(dǎo)的應(yīng)答模式的某些方面表明，貯存效應(yīng)并不是免疫增強(qiáng)的唯一機(jī)理。初始釋放愈快，則峰值抗體滴度愈低。此結(jié)果與下面的模式是一致的即在最初48小時(shí)內(nèi)通過越孔擴(kuò)散釋放的抗原，其效應(yīng)并不比施用可溶性抗原更強(qiáng)。顯著延遲釋放的啟動(dòng)，使得巨噬細(xì)胞有時(shí)間含噬微球體，因此能對(duì)抗原進(jìn)行有效的處理和展示，而所產(chǎn)生應(yīng)答的高度由傳至展示細(xì)胞中的抗原量確定。然而，如果抗原釋放的延遲越過了所有抗原都傳至展示細(xì)胞中的時(shí)間點(diǎn)，則不會(huì)使應(yīng)答導(dǎo)致進(jìn)一步增強(qiáng)，而只會(huì)延遲峰水平。2．在一次性注射后疫苗按預(yù)定加強(qiáng)方式由微膠囊的搏動(dòng)釋放當(dāng)一個(gè)人通過注射接受若干疫苗中的任一種時(shí)，為了誘導(dǎo)出良好的免疫應(yīng)答，還需要施用2到3次或更多次疫苗。一般說來，第一次注射是為了提供初級(jí)應(yīng)答，第2次注射是為了提供次級(jí)應(yīng)答，第3次注射是為了提供三級(jí)應(yīng)答。需要進(jìn)行多次注射，因?yàn)闉榱舜碳ず軓?qiáng)的免疫應(yīng)答，需要使抗原與免疫系統(tǒng)細(xì)胞進(jìn)行重復(fù)的作用。因此，病人在接受第一天疫苗注射后，他為了得到保護(hù)作用，就必須多次回到醫(yī)生那兒接受第二次、第三次及其后的注射，而病人卻經(jīng)常再也不回到醫(yī)生那兒去接受繼后的注射。
注射入患者體內(nèi)的疫苗制劑可能由抗原和佐劑組成。例如，可使抗原與明礬結(jié)合。在第一次注射時(shí)，使用抗原/佐劑結(jié)合物是很重要的，因?yàn)樽魟┠軒椭碳っ庖邞?yīng)答。在第二次和第三次注射時(shí)，抗原的施用將改善身體對(duì)抗原的免疫應(yīng)答。但在第二次和第三次以及隨后的施用中，不一定需要佐劑。
Alza Corporation描述了為刺激免疫應(yīng)答而使抗原和免疫增強(qiáng)劑(佐劑)持續(xù)釋放的方法(US4455142)。本發(fā)明與Alza的專利至少在兩個(gè)重要的方面不同。首先，不需要免疫增強(qiáng)劑來提高免疫應(yīng)答，第二，抗原并不是從傳遞系統(tǒng)中持續(xù)釋放。
本發(fā)明涉及將疫苗(抗原)配制于微膠囊中(或微球體)，從而使抗原囊包在可生物降解的聚合物中，例如聚(DL-丙交酯-共-乙交酯)。更具體地說，制備了不同的微膠囊疫苗，然后將它們混合在一起，使得注射一次本發(fā)明的膠囊疫苗混合物，就能改善初級(jí)免疫應(yīng)答，然后在后面的時(shí)間點(diǎn)上以搏動(dòng)方式釋放抗原，以產(chǎn)生二級(jí)、三級(jí)及其后的應(yīng)答。
微囊混合物由小的和大微囊組成。小的微囊小于10微米，優(yōu)選小于5μm，最好選1-5μm，它們能增強(qiáng)初級(jí)應(yīng)答(不需要佐劑)，因?yàn)樾∥⒛夷苡行У乇痪奘杉?xì)胞識(shí)別和攝取。然后，巨噬細(xì)胞內(nèi)的微囊釋放抗原，這些抗原隨后被加工并展示于巨噬細(xì)胞的表面，以產(chǎn)生初級(jí)應(yīng)答。較大的微囊大于5μm，最好大于10μm，但不能大到不能通過例如注射施用的地步，最好小于250μm，它們用不同的聚合物制備，使得它們以不同的速率被生物降解，并因此以搏動(dòng)方式釋放抗原。
根據(jù)本發(fā)明，用于初級(jí)應(yīng)答的抗原微膠囊組合物基本上與用于二級(jí)、三級(jí)及隨后應(yīng)答的抗原微囊組合物一樣。也就是說，抗原被囊包在同一類的可生物降解的聚合物中?？乖⒛业拇笮『筒﹦?dòng)釋放性質(zhì)然后使針對(duì)抗原的免疫應(yīng)答達(dá)到最強(qiáng)。
優(yōu)選的可生物降解的聚合物是那些降解速率可僅僅通過改變其單體比例就能變化的聚合物，別如，聚(DL-丙交酯-共-乙交酯)，使得用于二級(jí)應(yīng)答的抗原微囊比用于隨后的抗原微囊生物降解更快，以提供抗原的搏動(dòng)釋放。
總之，通過控制由基本相同組合物組成的微囊的大小，能夠使針對(duì)抗原的免疫應(yīng)答達(dá)到最強(qiáng)。另一重要的問題是，抗原微囊混合物中應(yīng)具有一些小的微囊(小于10μm的微囊，最好小于5μm，以1-5μm為好)，以使初級(jí)應(yīng)答達(dá)到最強(qiáng)。使用具有免疫增強(qiáng)作用的傳遞系統(tǒng)，例如小的微囊，在企圖誘導(dǎo)針對(duì)免疫原性較低的化合物的免疫應(yīng)答時(shí)更為重要，這些化合物有例如殺死的疫苗、亞基疫苗、低分子量疫苗如肽等等。實(shí)例1共同施用游離和微膠囊化的疫苗研究了一株日本腦炎病毒疫苗(Biken)。所用病毒是大阪大學(xué)微生物疾病研究基金會(huì)(Suita,Osaka,Japan)的產(chǎn)品。生產(chǎn)者推薦了一種三劑量的免疫系列法，疫苗的2次劑量以1-2周的間隔施用，第三次劑量在第1次免疫1個(gè)月后施用。我們對(duì)用日本腦炎(JE)疫苗采取標(biāo)準(zhǔn)的三劑量法對(duì)小鼠免疫后的抗病毒免疫應(yīng)答，和一次性施用由一份未包囊疫苗和兩份包囊疫苗組成的JE疫苗對(duì)小鼠免疫的抗病毒應(yīng)答作了比較。JE微囊大于10μm。通過ELISA檢測(cè)法，檢測(cè)針對(duì)JE疫苗的血清抗體滴度。從而比較通過這兩種方法用JE疫苗免疫小鼠的結(jié)果。ELISA法能通過JE疫苗組分的特異性檢測(cè)血清抗體的存在與否，但它不能檢測(cè)血清中的中和病毒的抗體水平。因此，通過病毒細(xì)胞致病效應(yīng)(CPE)抑制檢測(cè)法和病毒噬斑減少檢測(cè)法測(cè)定抗體的病毒中和活性。在此給出了這些檢測(cè)結(jié)果。
對(duì)四個(gè)實(shí)驗(yàn)組進(jìn)行了研究，該四個(gè)實(shí)驗(yàn)組由下述組成(1)未接受免疫的未處理對(duì)照小鼠；(2)在第0天接受3.0mg JE疫苗(未包囊)的小鼠，(3)在第0、14和42天接受3.0mgJE疫苗(未包囊)的小鼠(標(biāo)準(zhǔn)程予)、(4)在第0天接受3.0mg JE疫苗(未包囊)和3.0mg JE疫苗(膠囊化)的小鼠。未處理對(duì)照組提供了免疫動(dòng)物可與之作比較的病毒中和滴度的背景，在第0天接受一次3.0mg劑量JE疫苗的動(dòng)物也提供了中和滴度的背景，接受未包囊及包囊疫苗的動(dòng)物可與之進(jìn)行比較。這種比較提供的證據(jù)表明包囊疫苗的施用擴(kuò)大了單獨(dú)一次3.0mg劑量的未包囊疫苗的免疫能力。接受3次劑量的未包囊疫苗的動(dòng)物所提供的對(duì)照，包囊疫苗組可與之進(jìn)行比較，從而確證由未包襄和包囊組成的疫苗單獨(dú)一次注射，能產(chǎn)生與標(biāo)準(zhǔn)的三劑量免疫法差不多的活性。
在第21,49和77天從每個(gè)實(shí)驗(yàn)組的10只動(dòng)物中抽取血清樣品，測(cè)試它們對(duì)于JE病毒的標(biāo)準(zhǔn)攻擊(100TCID50)誘導(dǎo)的細(xì)胞致病效應(yīng)的抑制能力。表11給出了CPE抑制檢測(cè)法的結(jié)果，以能夠抑制50％病毒CPE的最高血清稀釋度表示。如表中所示，在任一測(cè)試點(diǎn)上，未處理的對(duì)照動(dòng)物(第一組)的血清沒有顯著的病毒中和活性。在0天接受單獨(dú)一次3.0mg劑量JE疫苗的10只動(dòng)物(笫2組)中，有一只沒有產(chǎn)生任何可測(cè)出的病毒中和抗體。剩下的九只小鼠中，選到的最高滴度是254，這是在第49天達(dá)到的。這一實(shí)驗(yàn)組在第49天的抗病毒滴度的幾何平均值達(dá)到最高峰。在接受了劑量疫苗標(biāo)準(zhǔn)免疫的10只動(dòng)物中(第3組)，有8只在第49-77天的抗體活性降低。在第40-77天，這一組滴度的幾何平均值下降了50％以上。接受包囊JE疫苗的所有10只動(dòng)物(第4組)都產(chǎn)生了血清抗病毒活性。在第21-77天，這一組的滴度的幾何平均值上升。這一組在第49天達(dá)到的平均滴度比第3劑量疫苗組(第3組)低得多(P=0.006)；然而，滴度在第49-77天持續(xù)上升，這一點(diǎn)與3劑量疫苗組剛好相反。在第77天的樣品中，這兩組的平均滴度沒有顯著差別(P=0.75)。這一現(xiàn)象表明，包囊疫苗組在第77天達(dá)到的血清抗病毒滴度可與之比擬。與3劑量疫苗組(第3組)不同，接受包囊疫苗的動(dòng)物(第4組)在所有檢查的時(shí)間點(diǎn)上，其血清都持續(xù)表現(xiàn)出病毒中和活性的上升。與標(biāo)準(zhǔn)疫苗處理組相反，在第49-77天，接受包囊JE疫苗的小鼠的平均血清中和滴度上升兩倍。接受微膠囊疫苗的小鼠在第21天的平均抗病毒滴度，與在0天接受單次劑量JE疫苗的小鼠在第21天的平均滴度沒有顯著差別(P=0.12)；然而，在第49天和77天，這兩組的平均滴度有顯著不同(分別為P=0.03和P=0.03)。這些數(shù)據(jù)表明，通過施用單獨(dú)一次劑量的包囊JE疫苗所達(dá)到的血清病毒中和滴度，與通過標(biāo)準(zhǔn)疫苗施用法所產(chǎn)生的相似。雖然，本研究中采用的賦形劑制劑達(dá)到的抗病毒滴度并不象標(biāo)準(zhǔn)疫苗上升得那樣快。但血清中的中和抗體活性達(dá)到的滴度確實(shí)可與用標(biāo)準(zhǔn)的三劑量疫苗法所達(dá)到的相比擬。
為了進(jìn)一步證實(shí)這些結(jié)果，將每個(gè)實(shí)驗(yàn)組的每份等體積血清樣品進(jìn)行混合以得到合并的樣品。將這些樣品交給一個(gè)獨(dú)立的實(shí)驗(yàn)室以測(cè)定其抗病毒活性。通過用JE病毒標(biāo)準(zhǔn)攻擊的噬斑減少檢測(cè)法測(cè)試這些樣品。表12給出了這些測(cè)定結(jié)果，證實(shí)了上面所述的發(fā)現(xiàn)。雖然，接受包囊疫苗的動(dòng)物達(dá)到滴度峰值不象標(biāo)準(zhǔn)疫苗組那樣快，但包囊疫苗誘導(dǎo)的中和病毒的抗體活性確實(shí)能與之相比擬。進(jìn)一步，包囊疫苗在一個(gè)更長的時(shí)間段上維持比標(biāo)準(zhǔn)疫苗更高的抗病毒滴度。這些結(jié)果進(jìn)一步支持了這一結(jié)論單次施用微膠囊化的疫苗產(chǎn)生的結(jié)果可與三劑量標(biāo)準(zhǔn)疫苗法產(chǎn)生的相比擬。實(shí)例2小于10微米和大于10微米疫苗微膠囊的共同施用共聚物微囊傳遞系統(tǒng)的一個(gè)優(yōu)點(diǎn)是它們能夠控制所滲入物質(zhì)釋放的時(shí)間和/或速率。對(duì)于疫苗來說，將能夠以這樣的方式使抗原按計(jì)劃釋放，使得一次施用后達(dá)到最高的抗體應(yīng)答。搏動(dòng)釋放是一種可以采用的釋放方式，預(yù)期它能夠改善針對(duì)疫苗的抗體應(yīng)答(類似于傳統(tǒng)的加強(qiáng)劑免疫法。
通過下述方式研究了采用搏動(dòng)釋放的可能性對(duì)各組小鼠皮下施用100μg類腸毒素，實(shí)驗(yàn)組包括1-10μm組(50∶50DL-PLG；1.51％重量的類腸毒素)，20-125mm組(50∶50DL-PLG；0.64％重量的類腸毒素)，或前兩種微膠囊的混合組，每一大小范圍中所含的類腸毒素是等量的。以10天間隔對(duì)各組小鼠抽血，采用固相吸收的腸毒素，用同型特異性放射免疫檢測(cè)法通過終點(diǎn)滴定測(cè)定血漿中的IgG應(yīng)答(圖1)。在施用1-10μm類腸毒素微膠囊后在第10天檢測(cè)到血漿IgG應(yīng)答，在笫30和40天滴度上升到最高值102,400，到第60天下降至25,600。與此相反，施用20-125μm微膠囊后，對(duì)于類毒素的應(yīng)答延遲至第30天，然后在第50和60天滴度上升至51,200。同時(shí)以1-10和20-125μm微膠囊施用等量的類毒素產(chǎn)生的IgG應(yīng)答，在最初30天基本上與單獨(dú)施用1-10μm微膠囊刺激的相同。然而，從第40天起，在同時(shí)接受1-10加上20-125μm微膠囊的小鼠中測(cè)量到的應(yīng)答穩(wěn)步上升，在第60天的滴度達(dá)到819,200。此水平比通過單獨(dú)施用這兩種大小所誘導(dǎo)的應(yīng)答之和高得多。
通過一起施用1-10和20-125μm含有類腸毒素的微膠囊得到的抗體應(yīng)答，與抗原的兩期(搏動(dòng))釋放是一致的。第一次搏動(dòng)是由于組織細(xì)胞對(duì)1-10μm顆粒的迅速吞噬和加速降解導(dǎo)致的，由于高濃度抗原有效地進(jìn)入這些副衛(wèi)細(xì)胞，更有可能是由于它們的活化，從而導(dǎo)致增強(qiáng)的初級(jí)免疫應(yīng)答。第二期抗原釋放是由于20-125μm微膠囊的在物降解導(dǎo)致的，它們由于太大而不能被吞噬細(xì)胞所吞食。第二次搏動(dòng)將抗原釋放至已引發(fā)的宿主中，刺激一種記憶性免疫應(yīng)答。因此，利用50∶50 DL-PLG共聚物，能夠構(gòu)建一種一次注射疫苗的傳遞系統(tǒng)，它能夠加強(qiáng)抗體應(yīng)答(1-10μm微膠囊)，它還能傳遞一種定時(shí)的和長持繼期的輔助加強(qiáng)劑免疫(20-125μm微膠囊)。此外，通過改變共聚物的比例，能夠制備甚至更遲釋放的制劑，從而能提供第三甚至第四次加強(qiáng)作用，而不需要額外的注射。
因此，本發(fā)明的可注射微膠囊可以通過多種途徑用于接種。在這些途徑中，包括多次注射小的微囊，以1-5μm的為好，它可被巨噬細(xì)胞吞食并不需使用免疫增強(qiáng)劑，以及游離抗原與微囊形式的微膠囊化抗原(直徑為10μm或更大)的組合，前者誘導(dǎo)初級(jí)應(yīng)答，后者通過博動(dòng)抗原釋放以加強(qiáng)二級(jí)和三級(jí)應(yīng)答，從而通過一次施用提供免疫作用。另外，還可使用小微膠和大微囊的組合物，前者負(fù)責(zé)初級(jí)應(yīng)答，后者負(fù)責(zé)二級(jí)及隨后的應(yīng)答，從而既不需要免疫增強(qiáng)劑，也無需進(jìn)行多次注射。B 口服施用疫苗微膠囊實(shí)例1．口服施用含有TNP-KLH的微球體同時(shí)誘導(dǎo)對(duì)TNP的循環(huán)和粘膜抗體應(yīng)答用50∶50 DL-PLG作為賦形劑，制備含有半抗原化的蛋白抗原三硝苯基-鑰孔血藍(lán)素(TNP-KLH)的微膠囊。根據(jù)大小分離這些微膠囊，選擇直徑為1-5μm范圍的進(jìn)行評(píng)價(jià)。這些微膠囊含有0.2％重量的抗原。通過連續(xù)4天由胃管施用在碳酸氫鹽緩沖的滅菌自來水中的0.5ml 10mg/ml的懸浮液(10μg抗原)，測(cè)定它們?cè)谕淌澈笞鳛橛行У目乖瓊鬟f系統(tǒng)的能力。為了進(jìn)行比較。對(duì)另一組小鼠用0.5ml 20μg/ml未包囊的TNP-KLH溶液作平行的口服免疫。對(duì)照小鼠僅僅口服施用稀釋液。
在最后免疫后的第14和28天，由每組5只綁縛小鼠中收集血清、唾液和腸分泌物。通過同型特異性的放射免疫檢測(cè)法測(cè)試這些樣品，測(cè)定IgM、IgG和IgA周型特異于TNP的和總的抗體的水平(表13)。唾液和腸分泌物樣品中的抗體幾乎全都是IgA類的。這些結(jié)果與前面的研究是一致的。并提供證據(jù)表明，用來收集這些分泌物的方法不會(huì)導(dǎo)致血清的污染。沒有一種免疫方法顯著改變?nèi)我粶y(cè)試體液中的總的免疫球蛋白水平。在模仿免疫的對(duì)照小鼠中，在血清中檢測(cè)到天然產(chǎn)生的抗TNP的IgM和IgG同型抗體，在血清和腸分泌物中檢測(cè)到IgA同型抗體，它們的水平雖低，但是可以檢測(cè)到。然而，連續(xù)3天以相等劑量施用30μg微膠囊化的TNP-KLH后，在免疫后的第14天，在分泌物中出現(xiàn)大量抗原特異性的IgA抗體，在血清中出現(xiàn)所有的同型體(見表13最后一行)。這些抗體水平在第28天進(jìn)一步上升。與此相反，口服施用同樣數(shù)量的未包囊抗原，在所有的測(cè)試體液中，都不能誘導(dǎo)任一同型體的特異性抗體。
這些結(jié)果在好幾方面值得注意。首先，在血清和粘膜分泌物中誘導(dǎo)出大量抗原特異性的IgA抗體，此應(yīng)答在常用的全身免疫法之后是很弱或沒有的。因此，可期望此免疫方法在粘膜上導(dǎo)致顯著增強(qiáng)的免疫作用，而粘膜正是許多細(xì)菌和病毒病原體的入口或病理位點(diǎn)。第二，微膠囊化的抗原制劑在口服施用時(shí)是一種有效的免疫原，而同樣量的未包囊抗原卻不是。因此，微膠囊化導(dǎo)致效率急劇地上升，這是由于對(duì)派伊爾氏淋巴集結(jié)的定靶傳遞和增加攝入的結(jié)果。第三，免疫應(yīng)答的誘導(dǎo)期似乎具有一個(gè)長的時(shí)間。雖然在無佐劑時(shí)用蛋白抗原進(jìn)行全身免疫的特征是抗體在7-14天內(nèi)出現(xiàn)峰值，但口服施用含有抗原的微膠囊誘導(dǎo)的應(yīng)答在第28天比第14天更高。這一結(jié)果表明，外壁物質(zhì)的生物腐蝕和抗原釋放是在一較長的時(shí)期內(nèi)一直發(fā)生的，因此，誘導(dǎo)的應(yīng)答延緩期更長。實(shí)例2口服施用含有SEB類毒素的微膠囊同時(shí)誘導(dǎo)循環(huán)和粘膜的抗SEB類毒素抗體上述結(jié)果表明(a)微膠囊化產(chǎn)生了很強(qiáng)的佐劑活性，(b)直徑小于5μm的微囊進(jìn)入派伊爾氏淋巴集結(jié)后傳播到隔膜淋巴和脾，這一現(xiàn)象提示，通過用摻入合適大小的可生物降解微膠囊中的疫苗進(jìn)行口服免疫以誘導(dǎo)全身免疫應(yīng)答是可行的。這種可能性得到如下實(shí)驗(yàn)的證實(shí)用100μg可溶形式或在微膠囊(用50∶50 DL-PLG作為賦形劑)中的葡萄球菌類腸毒素B對(duì)幾組小鼠免疫。這些小鼠以30天的間隔三次通過胃管施用可溶性或微膠囊化的類毒素，每次免疫后第10和20天收集血漿樣品。表14中的數(shù)據(jù)給出了在第一、第二和第三次口服免疫后20天的時(shí)間點(diǎn)上，血漿中IgM和IgG抗毒素應(yīng)答的終點(diǎn)滴度。
接受摻入微膠囊疫苗的小鼠，在每次免疫后特異于毒素的血漿抗體呈現(xiàn)穩(wěn)步的上升，而可溶性類腸毒素?zé)o此效果。此實(shí)驗(yàn)與上述表4、5和6的實(shí)驗(yàn)一樣操作并行實(shí)驗(yàn)，而且使用同樣批號(hào)的微膠囊產(chǎn)品。因此，這些數(shù)據(jù)直接證實(shí)，對(duì)于誘導(dǎo)血清的抗毒素應(yīng)答來說，用微膠囊化的葡萄球菌類腸毒素B比以最佳劑量非腸道注射可溶性類腸毒素更加有效。
在同組小鼠中檢查分泌IgA應(yīng)答。這一批號(hào)的含有類腸毒素的微膠囊的特點(diǎn)(即其大小范圍的不均一性，從小于1微米至大約10微米)，可能使得部分微膠囊固定在派伊爾氏淋巴集結(jié)中時(shí)就釋放類毒素。因此，在第三次口服免疫后第10和20天，收集唾液和腸洗液樣品，檢測(cè)其中的毒素特異性的IgA同型抗體(表15)。與口服施用可溶性類毒素時(shí)不能激發(fā)應(yīng)答相反，吞食等量的摻入在微膠囊中的類毒素疫苗，在唾液和腸分泌物二者中都能導(dǎo)致顯著的抗類毒素的SIgA應(yīng)答。應(yīng)當(dāng)指出，來自每只小鼠的腸分泌物在收集時(shí)稀釋到總量為5ml。雖然很難確定這樣稀釋收集的材料其稀釋因子究竟是多大，但可以有把握地假設(shè)，在圍繞腸壁的粘液中，SIgA濃度至少比測(cè)定值高出10倍以上，而在本文的測(cè)定中還并未計(jì)算這一點(diǎn)。
這些數(shù)據(jù)清楚地證實(shí)了微膠囊化類腸毒素口服施用時(shí)在腸和較遠(yuǎn)的粘膜位點(diǎn)處誘導(dǎo)抗毒素SIgA應(yīng)答的有效性。進(jìn)一步，通過使用直徑范圍在小于1至10μm的混合微膠囊，有可能同時(shí)誘導(dǎo)這種粘膜應(yīng)答和較強(qiáng)的循環(huán)抗體應(yīng)答。這表明通過使用微膠囊化技術(shù)，可使大量疫苗制成更加有效而且方便施用的產(chǎn)品。C、氣管內(nèi)施用疫苗微膠囊實(shí)例1、氣管內(nèi)施用含有SEB類毒素的微膠囊來同時(shí)誘導(dǎo)循環(huán)和粘膜抗毒素抗體類似于胃腸道中派伊爾氏淋巴集結(jié)的濾泡淋巴集結(jié)也存在于其它解剖學(xué)位置的與粘膜相關(guān)的類淋巴組織中，例如呼吸道。其功能與派伊爾氏淋巴集結(jié)相似，吸收肺膜中的物質(zhì)，并作為誘導(dǎo)以大量SIgA為特征的抗體應(yīng)答的位點(diǎn)。研究了通過與支氣管相關(guān)的類淋巴組織進(jìn)行免疫的可行性。對(duì)幾組小鼠的氣管中直接施用50ml.PBS.其中含有50μg微膠囊化或未包囊的SEB類毒素。在免疫后的第10、20、30和40天，收集血漿、唾液、腸洗液和支氣管泡洗液樣品。
檢測(cè)血漿樣品中的抗毒素特異性抗體揭示，施用游離的SEB類毒素不會(huì)誘導(dǎo)出任何同型抗體的可測(cè)出的應(yīng)答(表16)。與此相反，氣管由滴注等劑量微膠囊化的SEB疫苗誘導(dǎo)出毒素特異性的所有同型抗體。此應(yīng)答在第30天達(dá)到最高水平，并一直維持到第40天。IgM、IgG和IgA的滴度分別為400,51,300和400。
與在血漿中觀察到的應(yīng)答相似，微膠囊化類毒素在支氣管泡洗液中誘導(dǎo)出了毒素特異性的抗體，但未包囊的疫苗則沒有(表17)。與血漿中的應(yīng)答相比較，支氣管分泌物中的抗毒素抗體出現(xiàn)的動(dòng)力學(xué)有些延遲，在第20天，只測(cè)出IgG同型體的應(yīng)答，而且與最終達(dá)到的最高水平比較還很低。然而，在第30天，IgG和IgA抗毒抗體達(dá)到最高滴度(分別為1280和320)，并一直維持到第40天。用此免疫法未在支氣管泡洗液中檢測(cè)到IgM類抗體，此結(jié)果與下述現(xiàn)象是一致的，即在肺中不存在分泌IgM的漿細(xì)包，并且此大分子抗體不能通過分子量限度大約為200,000的毛細(xì)肺泡膜由血清中滲出。
這些數(shù)據(jù)證實(shí)，微膠囊化能在將抗原施用至呼吸道中以后，產(chǎn)生針對(duì)SEB類毒素抗原的免疫應(yīng)答，而未包囊的抗原都無此效果。在循環(huán)和浸潤呼吸道的分泌物二者中都可觀察到這種應(yīng)答。應(yīng)當(dāng)注意，此免疫法對(duì)于誘導(dǎo)出IgA類抗體是有效的。此抗體被認(rèn)為是在上呼吸道中的局部合成產(chǎn)物，該區(qū)域不受到IgG類抗體的保護(hù)，IgG只從循環(huán)血液中進(jìn)入較低的肺部。因此，通過氣溶膠的吸入，用微膠囊化抗原進(jìn)行氣管內(nèi)免疫。將是一種誘導(dǎo)保護(hù)上呼吸道抗體的有效方式。D．通過混合的免疫途徑施用疫苗微膠囊在人和動(dòng)物中已經(jīng)發(fā)明，使全身免疫與抗原的粘膜接觸相結(jié)合，對(duì)于促進(jìn)粘膜免疫應(yīng)答來說比其他任何結(jié)合都更加有效(N.F.Pierce，和J.L.Gowans.“大鼠中針對(duì)霍亂類毒素的腸免疫應(yīng)答的細(xì)胞動(dòng)力學(xué)”，J.Exp.Med.142:1550,1975)。三組小鼠用100μg微膠囊化的SEB類毒素通過IP免疫引發(fā)，30天后通過IP，口服或IT途徑，用100μg微膠囊化的SEB類毒素進(jìn)行攻擊。這項(xiàng)實(shí)驗(yàn)是為了直接確定，對(duì)于所誘導(dǎo)的SIgA的水平來說，用微膠囊化的抗原進(jìn)行混合免疫是否更加有利。
在微膠囊化加強(qiáng)劑免疫后20天，收集血漿、腸洗液和支氣管泡洗液樣品，通過終點(diǎn)滴定放射免疫檢測(cè)法，測(cè)定抗SEB毒素的同型抗體的水平和分布(表18)。在血漿和分泌物樣品中，IP引發(fā)的小鼠通過IP加強(qiáng)后，出現(xiàn)高水平的抗毒素的IgG抗體，但對(duì)于在任何測(cè)試體液中誘導(dǎo)可測(cè)出的IgA抗體來說則完全無效。與此相反，通過口服或IT途徑用微膠囊化的SEB類毒素作第二次免疫后，能有效地加強(qiáng)血漿中特異性IgG抗體的水平(每組中進(jìn)行第二次免疫前的滴度是51200)，在腸和支氣管泡洗液中也能誘導(dǎo)高水平sIgA抗體的出現(xiàn)。對(duì)IP誘發(fā)的小鼠進(jìn)行口服加強(qiáng)，能誘導(dǎo)在腸分泌物中分泌抗SEB毒素的sIgA抗體，其水平可與需要三步口服免疫的相比擬(表18與表15相比較)。對(duì)先經(jīng)IP免疫的小鼠進(jìn)行氣管內(nèi)加強(qiáng)，對(duì)于誘導(dǎo)傳播性粘膜應(yīng)答尤其有效，并在支氣管泡和腸分泌物兩種樣品中，都同時(shí)誘導(dǎo)高水平IgG和sIgA抗體的出現(xiàn)。
這些結(jié)果對(duì)于針對(duì)許多通過定位于呼吸道的急性傳染而施加其病理效應(yīng)的傳染媒介進(jìn)行免疫來說尤其重要。存在于呼吸道中的抗體來自兩種不同的來源。在浸潤鼻咽和支氣管樹的粘液中，主要成分是分泌IgA(C.A.Soutar，“正常人呼吸道中含有免疫球蛋白的漿細(xì)胞和其它細(xì)胞的分布及其中所含免疫球蛋白的類別”，Thorax31:58,1976；H.B.Kaltreider和M.K.L.Chan，“得自不同水平犬呼吸道液體中類另特異性的免疫球蛋白組成”，J.Immunol.116:423,1976)，它們是局部漿細(xì)胞的產(chǎn)物，這些細(xì)胞位于上呼吸道的固有層中。與鼻咽和支氣管樹相反，細(xì)支氣管和肺泡中主要含有IgG，它是由循環(huán)血液通過滲出作用被動(dòng)產(chǎn)生的(H.Y.Reynolds,H.H.Newball，“通過人肺的灌洗得到的蛋白質(zhì)和呼吸細(xì)胞的分析”J.Lab.Clin.Med.84:559,1974)。因此，肺部的有效保護(hù)既需要循環(huán)IgG又需要粘膜sIgA抗體。
這些數(shù)據(jù)表明，對(duì)于同時(shí)誘導(dǎo)循環(huán)和粘膜抗體應(yīng)答來說，用微囊化抗原進(jìn)行混合途徑免疫將證明是最有效的。雖然在本文報(bào)導(dǎo)的實(shí)驗(yàn)中，所檢查的不同的引發(fā)和加強(qiáng)步驟都需要施用微膠囊化的抗原，但有可能使用微膠囊傳遞系統(tǒng)提供的可控制的博動(dòng)釋放中的靈活性，來設(shè)計(jì)單獨(dú)一次施用的方法，它將同時(shí)刺激最強(qiáng)的全身和分泌免疫作用。例如，在一次拜訪醫(yī)生的過程中，就可通過注射和吞食兩種途徑施用微膠囊化的抗原。通過改變兩種劑量中丙交酯與乙交酯的比例，全身施用的劑量在幾天內(nèi)就能釋放以引發(fā)免疫系統(tǒng)，而第二(口服)劑量則在較遲的時(shí)候由派伊爾氏淋巴集結(jié)中釋放，以刺激加強(qiáng)的粘膜應(yīng)答。Ⅳ．藥物的吸收下述實(shí)例表明，小的微膠囊(小于5μm，優(yōu)選1-5μm)除了抗原之外，還能改善藥物至體內(nèi)的吸收。苯壬四烯酯，即(AII-E)-9-(4-甲氧基-2,3,6-三甲基)苯基-3,7-二甲基-2,4,8-壬四烯酸，乙基酯)被用微膠囊包在50∶50聚(DL-丙交酯-共-乙交酯)中。微膠囊直徑為0.5-4μm,含有37.2％重量的etretinate。這些etretinate微膠囊及未包囊的etretinate，用在水中的1％重量的Tween80作為載體通過口服管飼法喂給小鼠。只喂給50mg etretinate/Kg的獨(dú)單一次劑量。以一定的時(shí)間間隔收集服藥小鼠的血液，利用高效層析法定量測(cè)定此血液血清中的苯壬四烯酯和/或其代謝物(表19)。結(jié)果表明，用etretinate微膠囊處理的小鼠，其苯壬四烯酯的血液水平比用未包囊苯壬四烯酯處理的小鼠高很多。與小于5μm的疫苗微膠囊相似，相信此微膠囊是通過胃腸道中類淋巴組織(派伊爾氏淋巴集結(jié))將苯壬四烯酯帶到血流中去的。這一相同的方法也應(yīng)當(dāng)選用于提高其它藥物的吸收，尤其可以發(fā)揮其作用的是傳遞生物藥物制品，例如肽、蛋白質(zhì)、核酸等等。
表1 口服施藥后香豆素-6 85∶15 DL-PLG微球體穿透入并通過派伊爾氏淋巴集結(jié)
表2 口服施藥后香豆素-6 85∶15 DL-PLG微球體遷移進(jìn)入和通過腸系膜的淋巴結(jié)
表3 在口服施藥后，由與腸相關(guān)的類淋巴組織的派伊爾氏淋巴集結(jié)定靶吸收的1至10μm微球體與多種賦形劑
表4 對(duì)于有微膠囊包裹的依可溶的葡萄球菌腸毒素B為轉(zhuǎn)移的初級(jí)抗毒素應(yīng)答
表5 對(duì)于有微膠囊包裹的依可溶的葡萄球菌腸毒素B為轉(zhuǎn)移的次級(jí)抗毒素應(yīng)答
表6 對(duì)于微膠囊包裹的依可溶的葡萄球菌腸毒素B為轉(zhuǎn)移的第三級(jí)抗毒素應(yīng)答
表7 由多種非腸道的免疫途徑誘導(dǎo)的初級(jí)全身抗毒素應(yīng)答
表8 由多種非腸道的免疫途徑誘導(dǎo)的次級(jí)全身抗毒素應(yīng)答
表9 微球體不具有內(nèi)在的佐劑活性
表10 由非腸道的免疫作用μm微球體以不同速度釋放的抗原誘導(dǎo)的全身抗毒素應(yīng)答
表11 從JE疫苗免疫研究中得到的在血清樣本上CPE抑制作用測(cè)定的結(jié)果
aGMT=幾何平均滴定度表12 由JE疫苗免疫研究中在匯集的血清樣本上進(jìn)行的空斑-減數(shù)測(cè)定得到的結(jié)果血清稀釋至組別處理天數(shù)50％終點(diǎn)80％終點(diǎn)1a對(duì)照物0 ＜10 ＜101 對(duì)照物 14 ＜10 ＜101 對(duì)照物 21 ＜10 ＜10對(duì)照物 42 ＜10 ＜10對(duì)照物 49 ＜10 ＜10對(duì)照物 84 ＜10 ＜102b未包膠囊的JE 0 ＜10 ＜102 未包膠囊的JE 14160 202 未包交囊的JE 21NDCND2 未包膠囊的JE 42320 802 未包膠囊的JE 49320 402 未包膠囊的JE 84640 1603d未包膠囊的JE 0 ＜10 ＜103 未包膠囊的JE 14160 403 未但膠囊的JE 21 2,560 6403 未包膠囊的JE 42 1,280 6403 未包膠囊的JE 49 5,1202,5603 未包膠囊的JE 84 2,5601,2804e包微膠囊的JE 0 ＜10 ＜104 包微膠囊的JE 14160 204 包微膠囊的JE 21320 804 包微膠囊的JE 42 5,120 6404 包微膠囊的JE 49 5,120 6404 包微膠囊的JE 84 10,0002,560a未處理的對(duì)照物b在0天接受3.0mg未包膠囊的JE疫苗IP的動(dòng)物CND=未測(cè)定的(樣品量不足)d在0.14和42天接受3.0mg未包膠囊的JE疫苗IP的動(dòng)物e在0天接受3.0mg未包膠囊的和3.0mg微膠囊的JE疫苗IP的動(dòng)物。
表13 通過用微膠囊的TNP-KLH的口服免疫作用誘導(dǎo)在BALB/C小鼠血清粘膜分泌物中的TNP-特異抗體
表14 在用可溶的或微膠囊的(50∶50 DL-PLG)葡萄球菌類毒素的初級(jí)、次級(jí)和第三級(jí)口服免疫作用之后第20天的血漿IgM和IgG抗毒素水平
第15 在用可溶的或包微膠囊的腸內(nèi)類毒素的口服免疫作用的第三級(jí)口服免疫作用之后的第10和20天在小鼠唾液和腸液中的毒素一特異IgA抗體
第16 通過用可溶的或包微囊的葡萄球菌腸毒素B的類毒素的氣管內(nèi)免疫作用誘導(dǎo)的血清抗毒素抗體水平
表17 通過用可溶的或包微膠囊的葡萄球菌腸毒素B的類毒素氣管內(nèi)免疫作用誘導(dǎo)的支氣管-肺泡的洗滌物抗體水平
表18 應(yīng)用包微膠囊的SEB類毒素的免疫作用原始記錄通過混合途徑在多種生物流體中誘導(dǎo)的抗-SEB毒素抗體的應(yīng)答
表19 在用包微膠囊的和未包膠囊的Etretinate口服投藥之后在小鼠血清中的Etretinate的濃度
權(quán)利要求
1．一種配制用于傳送生物活性劑至動(dòng)物體與粘膜相關(guān)的淋巴網(wǎng)狀內(nèi)皮細(xì)胞組織的組合物的方法，該方法包括將有效量的上述藥劑包封在可生物相容的賦形劑膠囊中以形成其大小為小于約10微米的和可以應(yīng)用從包括通過鼻的、非胃腸道的、直腸的和眼的一組步驟中挑選出的一種步驟進(jìn)行施藥的微膠囊，因而治療量的上述微膠囊可到達(dá)所說的與粘膜相關(guān)的淋巴網(wǎng)狀內(nèi)皮細(xì)胞組織并被吸收。
2．根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中的施藥步驟還可進(jìn)一步包括由口腔吸入。
3．根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中所說的藥劑是從包括藥物、養(yǎng)分、免疫調(diào)節(jié)劑、淋巴因子、單核因子(monokine)、細(xì)胞激動(dòng)素(cytokine)、抗原和變應(yīng)原的藥劑組中挑選出的。
4．根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中所說的膠囊的大小是在約1微米至約10微米之間。
5．根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中所說的膠囊的大小范圍是在約5微米至10微米之間因此這種微膠囊可保持在所說的與粘膜相關(guān)的淋巴網(wǎng)狀內(nèi)皮細(xì)胞組織中。
6．根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中所說的微膠囊的大小為小于約5微米因此所說的微膠囊可穿過所說的與粘膜相關(guān)的淋巴網(wǎng)狀內(nèi)皮細(xì)胞組織。
7．根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中所說的微膠囊的大小在約1微米至約5微米之間因此所說的微膠囊可穿過所說的與粘膜相關(guān)的淋巴網(wǎng)狀內(nèi)皮細(xì)胞組織。
8．根據(jù)權(quán)利要求5的方法，其中所說的生物活性劑是一種抗原以提供所說的動(dòng)物的粘膜免疫性。
9．根據(jù)權(quán)利要求5的方法，其中所說的生物活性劑是一種變應(yīng)原以提供所說的動(dòng)物的粘膜免疫性。
10．根據(jù)權(quán)利要求6的方法，其中所說的生物活性劑是一種抗原以提供所說的動(dòng)物的全身免疫性。
11．根據(jù)權(quán)利要求6的方法，其中所說的生物活性劑是一種變應(yīng)原以提供所說的動(dòng)物的全身免疫性。
12．根據(jù)權(quán)利要求3的方法，其中所說的微膠囊由許多其大小為小于約5微米的第一種微膠囊和許多其大小在約5微米至約10微米之間的第二種微膠囊組成，而且其中將所說的第一種和第二種微膠囊的混合物施用于所說的動(dòng)物以提供全身免疫性和粘膜免疫性。
13．根據(jù)權(quán)利要求12的方法，其中所說的第一種微膠囊其大小在約1微米至約5微米之間。
14．根據(jù)權(quán)利要求3的方法，其中所說的微膠囊其大小為小于約5微米因此所說的膠囊可以穿過所說的與粘膜相關(guān)的淋巴網(wǎng)狀內(nèi)皮細(xì)胞組織。
15．根據(jù)權(quán)利要求14的方法，其中所說的微膠囊的大小在約1微米至約5微米之間。
16．一種配制用于使動(dòng)物免疫的組合物的方法，包括將有效量的第一種游離的生物活性劑與含有第二種生物活性劑的并具有一種可生物相容的賦形劑包壁物質(zhì)的微膠囊相混合，其中所說的微膠囊其大小為大于約10微米而且其中所說的第一生物活性劑提供了初次免疫學(xué)的應(yīng)答而所說的微膠以搏動(dòng)方式釋放出所說的第二種生物活性劑以增強(qiáng)后繼的免疫學(xué)應(yīng)答。
17．根據(jù)權(quán)利要求16的方法，其中至少有一種所說的生物活性劑是從由一種抗原、變應(yīng)原、淋巴因子、單核因子(monokine)、細(xì)胞激動(dòng)素(cytokine)和免疫調(diào)節(jié)劑組成的藥劑組中挑選出來。
18．一種配制用于增加動(dòng)物的免疫反應(yīng)的組合物的方法，該方法包括將有效量的具有其大小為小于約10微米并含有第一種生物活性劑的第一種可生物相容的微膠囊與具有其大小為大于約10微米的并含有第二種生物活性劑的第二種可生物相容的微膠囊相混合，所說的第一種微膠囊提供了初次的免疫學(xué)應(yīng)答而所說的第二種微膠囊以搏動(dòng)方式釋放所說的第二種藥劑以增強(qiáng)后繼的免疫學(xué)應(yīng)答。
19．根據(jù)權(quán)利要求18的方法，其中第一種微膠囊具有的大小在約1微米至約10微米之間。
20．根據(jù)權(quán)利要求18的方法，其中至少一種所說的生物活性劑是從包括一種抗原、變應(yīng)原、淋巴因子、單核因子(momokine)。細(xì)胞激動(dòng)素(cytokine)和免疫調(diào)節(jié)劑的藥劑組中挑選出的。
21．一種配制提供動(dòng)物體內(nèi)全身的免疫性的組合物的方法，該方法包括將有效量的一種抗原包封在一種可生物相容的賦形劑膠囊中以形成其大小為約小于5微米并可用口服的方式施用于動(dòng)物的微膠囊。
22．根據(jù)權(quán)利要求21的方法，其中所說的微膠囊的大小在約為1微米至約5微米之間。
23．一種配制提供動(dòng)物體內(nèi)的全身免疫性的組合物的方法，該方法包括將有效量的一種抗原包封在可生物相容的賦形劑膠囊中以形成其大小為小于約5微米并可通過鼻腔的途徑施用于動(dòng)物的微膠囊。
24．根據(jù)權(quán)利要求23的方法，其中所說的微膠囊的大小在約1微米至約5微米之間。
25．一種提供動(dòng)物體的全身免疫性的方法，該方法包括配制可用于將有效量的一種抗原包封在一種可生物相容的賦形劑膠囊中以形成微膠囊的組合物，所形成的微膠囊具有其大小為小于約5微米并可通過口腔吸入而施用于所說的動(dòng)物。
26．根據(jù)權(quán)利要求25的方法，其中所說的微膠囊的大小在約1微米至約5微米之間。
27．一種配制用于提供動(dòng)物體全身免疫性的組合物的方法，該方法包括將有效量的一種抗原包封在一種可生物相容的賦形劑膠囊中以形成其大小為小于約5微米并可以通過直腸施用于所說的動(dòng)物的微膠囊。
28．根據(jù)權(quán)利要求27的方法，其中所說的微膠囊其大小在約1微米至約5微米之間。
29．一種配制用于提供動(dòng)物體全身免疫性的組合物的方法，該方法包括將有效量的一種抗原包封在一種可生物相容的賦形劑膠囊中以形成其大小為小于約5微米并可通過眼的途徑施用于所說的動(dòng)物的微膠囊。
30．根據(jù)權(quán)利要求29的方法，其中所說的膠囊其大小在約1微米至約5微米之間。
31．一種配制用于提供動(dòng)物體粘膜免疫性的組合物的方法，該方法包括將有效量的一種抗原包封在一種可生物相容的賦形劑膠囊中以形成其大小在約5微米至約10微米之間的能通過口服施用于所說的動(dòng)物的微膠囊。
32．一種配制用于提供動(dòng)物體粘膜免疫性的組合物的方法，該方法包括將有效量的一種抗原包封在一種可生物相容的賦形劑膠囊中以形成其大小在約5微米至約10微米之間的能通過鼻的途徑施用于所說的動(dòng)物的微膠囊。
33．一種配制用于提供動(dòng)物體粘膜免疫性的組合物的方法，該方法包括將有效量的一種抗原包封在一種可生物相容的賦形劑膠囊中以形成其大小在約5微米至約10微米之間并能通過口腔吸入而施用于所說的動(dòng)物的微膠囊。
34．一種配制用于提供動(dòng)物體粘膜免疫性的組合物的方法，該方法包括將有效量的一種抗原包封在一種可生物相容的賦形劑膠囊中以形成其大小在約5微米至約10微米之間并能通過直腸施用于所說的動(dòng)物的微膠囊。
35．一種配制用于提供動(dòng)物體粘膜免疫性的組合物的方法，該方法包括將有效量的一種抗原包封在一種可生物相容的賦形劑膠囊中以形成其大小在約5微米至約10微米之間并能通過眼的途徑施用于所說的動(dòng)物的微膠囊。
36．一種配制用于提供動(dòng)物體全身的和粘膜的免疫性的組合物的方法，該方法包括將許多含有抗原而大小為小于約5微米的第一種微膠囊和許多含有抗原而大小在約5微米與約10微米之間的第二種微膠囊相混合從而將上述第一種和第二種微膠囊的上述混合物輸送到所說的動(dòng)物體中而提供了動(dòng)物的全身免疫性和粘膜免疫性。
37．根據(jù)權(quán)利要求36的方法，其中所說的混合物可以用從包括口服施藥、鼻腔施藥、口腔吸入施藥、直腸施藥和眼睛施藥的一組步驟中選出的一種步驟進(jìn)行施藥。
38．根據(jù)權(quán)利要求36的方法，其中所說的第一種微膠囊的大小在約1微米至5微米之間。
39．一種制備用于增強(qiáng)動(dòng)物的免疫應(yīng)答的組合物的方法，該方法包括將有效量的第一種、游離單體的生物活性劑和含有第二種生物活性劑并具有可生物相容的賦形劑壁的微膠囊加在一起的步驟以形成一種混合物，將此種混合物施用于動(dòng)物體，其中所說的第一種藥劑提供一種初次應(yīng)答而其中所說的微膠囊以搏動(dòng)方式釋放所說的第二種藥劑以增強(qiáng)后繼的應(yīng)答。
40．根據(jù)權(quán)利要求39的方法，其中至少一種所說的生物活性劑是一種抗原。
41．根據(jù)權(quán)利要求39的方法，其中至少一種所說的生物活性劑是一種變應(yīng)原。
42．一種用于將生物活性劑傳送至動(dòng)物與粘膜相關(guān)的淋巴網(wǎng)狀內(nèi)皮細(xì)胞組織的組合物。該組合物包括將一種有效量的上述藥劑裝入一種可生物相容的賦形劑膠囊中以形成其大小為小于約10微米而且能用選自下述一組步驟中的一種步驟施藥的微膠囊，這組步驟包括鼻腔的、非胃腸道的、直腸的、眼睛的和口腔吸入的步驟。
43．根據(jù)權(quán)利要求42的組合物，其中所說的微膠囊的大小在約1微米至約10微米之間。
44．根據(jù)權(quán)利要求42的組合物，其中所說的藥劑是選自以一種藥物、養(yǎng)分、免疫調(diào)節(jié)劑、淋巴因子、單核因子(monokine)、細(xì)胞激動(dòng)素(cytokine)、抗原和變應(yīng)原組成的一組藥劑。
45．根據(jù)權(quán)利要求42的組合物，其中所說的微膠囊的大小范圍在約5微米至約10微米之間，因此所說的微膠囊可以在所說的與粘膜相關(guān)的淋巴網(wǎng)狀內(nèi)皮細(xì)胞組織中停留。
46．根據(jù)權(quán)利要求42的組合物，其中所說的微膠囊的大小為小于約5微米因此所說的微膠囊可穿過所說的與粘膜相關(guān)的淋巴網(wǎng)狀內(nèi)皮細(xì)胞組織。
47．根據(jù)權(quán)利要求46的組合物，其中所說的微膠囊的大小在約1微米至約5微米之間。
48．根據(jù)權(quán)利要求44的組合物，其中所說的微膠囊包括由許多其大小為小于約5微米的第一種微膠囊和許多其大小在約5微米至約10微米之間的第二種微膠囊組成的一種混合物以提供對(duì)所說的動(dòng)物的全身免疫性和粘膜免疫性。
49．根據(jù)權(quán)利要求48的組合物，其中所說的第一種微膠囊的大小在約1微米至約5微米之間。
50．一種用于增強(qiáng)動(dòng)物的免疫應(yīng)答的組合物，該組合物包括第一種可提供初次應(yīng)答的游離生物活性劑和含有用搏動(dòng)方式釋放以增強(qiáng)后繼應(yīng)答的第二種生物活性劑并具有一種可生物相容的賦形劑壁的微膠囊的混合物。
51．根據(jù)權(quán)利要求50的組合物，其中所說的第一種和第二種藥劑是一種抗原。
52．根據(jù)權(quán)利要求50的組合物，其中所說的第一種和第二種藥劑是一種變應(yīng)原。
53．根據(jù)權(quán)利要求50的組合物，其中至少一種所說的藥劑是一種抗原。
54．根據(jù)權(quán)利要求50的組合物，其中至少一種所說的藥劑是一種變應(yīng)原。
55．根據(jù)權(quán)利要求50的組合物，其中至少一種所說的藥劑是一種淋巴因子。
56．根據(jù)權(quán)利要求50的組合物，其中至少一種所說的藥劑是一種細(xì)胞激動(dòng)素(cytokine)。
57．根據(jù)權(quán)利要求50的組合物，其中至少一種所說的藥劑是一種單核因子(monokine)。
58．根據(jù)權(quán)利要求50的組合物，其中至少一種所說的藥劑是一種免疫調(diào)節(jié)劑。
59．根據(jù)權(quán)利要求50的組合物，其中所說的微膠囊大小為大于約1微米。
60．根據(jù)權(quán)利要求50的組合物，其中所說的微膠囊其大小在約1微米至約10微米之間。
61．根據(jù)權(quán)利要求50的組合物，其中所說的微膠囊其大小為大于約10微米。
62．一種用于提供動(dòng)物體全身免疫性的組合物，該組合物包括將有效量的生物活性劑包封在一種可生物相容的賦形劑膠囊中以形成其大小為直徑在約1微米至約10微米之間的微膠囊。
63．根據(jù)權(quán)利要求62的組合物，其中所說的生物活性劑是從由一種抗原、變應(yīng)原、淋巴因子、單核因子(monokine)和免疫調(diào)節(jié)劑組成的藥劑組中挑選出的。
64．一種用于將生物活性劑傳送至動(dòng)物的與粘膜相關(guān)的淋巴網(wǎng)狀內(nèi)皮細(xì)胞組織的組合物，該組合物包括許多其大小為小于約5微米的第一種微膠囊和許多其大小在約5微米至10微米之間的第二種微膠囊的混合物以用于提供對(duì)所說的動(dòng)物的全身免疫性和粘膜免疫性。
65．根據(jù)權(quán)利要求64的組合物，其中所說的第一種微膠囊的大小在約1微米至5微米之間。
66．一種用于增強(qiáng)動(dòng)物的免疫應(yīng)答的組合物，該組合物包括由提供初次應(yīng)答的第一種、游離的生物活性劑和具有可生物相容的賦形劑壁并含有可用搏動(dòng)方式釋放以增強(qiáng)后繼的應(yīng)答的第二種生物活性劑的微膠囊組成的混合物。
67．根據(jù)權(quán)利要求66的組合物，其中所說的第一種和第二種藥劑是一種抗原。
68．根據(jù)權(quán)利要求66的組合物，其中所說的第一種和第二種藥劑是一種變應(yīng)原。
69．根據(jù)權(quán)利要求66的組合物，其中至少一種藥劑是從由一種抗原、變應(yīng)原、淋巴因子、細(xì)胞激動(dòng)素(cytokine)、單核因子(monokine)和免疫調(diào)節(jié)劑組成的藥劑組中挑選出的。
70．一種組合物的應(yīng)用，該應(yīng)用包括將包含含有有效量生物活性成分的可生物相容的賦形劑以及其直徑為10微米或小于10微米的微膠囊的該組合物用于制備供動(dòng)物的腸胃外施用的一種藥物。
71．根據(jù)權(quán)利要求70的應(yīng)用，其中所述的動(dòng)物腸胃外施用是指經(jīng)過注射施用。
72．根據(jù)權(quán)利要求71的應(yīng)用，其中所述的動(dòng)物是人類。
73．一種組合物的應(yīng)用，該應(yīng)用包括將包含含有有效量生物活性成分的可生物相容的賦形劑以及其直徑為10微米或小于10微米的微膠囊的該組合物用于制造供施用于動(dòng)物的MALT的一種藥物。
74．根據(jù)權(quán)利要求73的應(yīng)用，其中所述的施用是經(jīng)鼻的施用。
75．根據(jù)權(quán)利要求73的應(yīng)用，其中所述的施用是經(jīng)口腔吸入施用。
76．根據(jù)權(quán)利要求73的應(yīng)用，其中所述的施用是經(jīng)直腸的施用。
77．根據(jù)權(quán)利要求73的應(yīng)用，其中所述的施用是經(jīng)眼睛的施用。
78．根據(jù)權(quán)利要求73的應(yīng)用，其中所述的MALT不包括派伊爾氏淋巴集結(jié)。
79．根據(jù)權(quán)利要求78的應(yīng)用，其中所述的被施用的動(dòng)物是人類。
80．一種組合物的應(yīng)用，該應(yīng)用包括將包含含有有效量藥物的可生物相容的賦形劑、以及其直徑為10微米或小于10微米的微膠囊的該組合物用于制造可經(jīng)口腔施用于動(dòng)物以增加藥物的生物有效性的一種藥物。
81．根據(jù)權(quán)利要求80的應(yīng)用，其中所述的微膠囊的直徑為1至5微米。
82．根據(jù)權(quán)利要求80的應(yīng)用，其中所述的動(dòng)物是人類。
全文摘要
一種將生物活性劑傳送給動(dòng)物的方法和可在這種方法中應(yīng)用的組合物,這種方法需要的步驟是:將有效量的藥劑包封在可生物相容的賦形劑中以形成其大小為約10微米或小于約10微米的微膠囊并將有效量的微膠囊施用于動(dòng)物。得到一種搏動(dòng)方式的應(yīng)答,及粘膜和全身的免疫性。
文檔編號(hào)A61K9/56GK1308937SQ00133019
公開日2001年8月22日 申請(qǐng)日期2000年10月21日 優(yōu)先權(quán)日1988年3月18日
發(fā)明者托馬斯·R·泰斯, 約翰·H·埃爾德里奇, 理查德·M·吉利, 杰伊·K·斯塔斯 申請(qǐng)人:Uab研究基金會(huì), 南方研究所