專利名稱：從白首烏中提取分離具有抗腫瘤作用的新穎碳－21甾體苷的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及一類新穎的抗腫瘤化合物，尤其是從中藥白首烏中提取分離得到具有抗腫瘤作用的新穎碳-21(C21)甾體苷，適用于抑制腫瘤的生長。
腫瘤是一大類嚴重威脅人民生命和健康的多發(fā)病及常見病，全世界每年有700萬人發(fā)生腫瘤，500萬人被腫瘤奪去生命，現(xiàn)腫瘤患者在1000萬人以上。在我國腫瘤越來越成為嚴重的健康衛(wèi)生問題，解放初期，腫瘤僅占人口死因的第九位或第十位，到70年代，已上升到第三位，目前估計，全國每年腫瘤發(fā)病人數(shù)約160萬，全國每年死于腫瘤病的人數(shù)已達130萬人，并且仍有上升趨勢，其正在超過心血管疾病而成為人口死亡的第一原因。因此，世界各國都高度重視腫瘤的防治研究。
當今，手術治療、放射治療、化學藥物治療仍然是最常用最重要的腫瘤治療手段，其中的化學藥物治療雖然發(fā)展歷史較短，卻在腫瘤的綜合治療上發(fā)揮越來越重要的作用，并且對于某些腫瘤，如絨毛膜上皮癌、急性淋巴細胞性白血病等已取得相當高的治愈率。但是化學藥物治療存在著很大的缺點，這主要是現(xiàn)有的抗腫瘤藥物對腫瘤細胞的選擇性抑制不強、全身用藥毒性較大、且大部分具有免疫抑制作用，這在一定程度上限制了它的使用。因此，尋找研究高效低毒、結構新型的抗腫瘤藥物仍是一項極為緊迫而重要的全球性課題。
本發(fā)明的目的是根據(jù)中醫(yī)理論從中藥白首烏中提取分離高效低毒、增強機體免疫、結構新穎的具有抗腫瘤作用的新穎C21甾體苷。
本發(fā)明從中藥白首烏中提取分離具有抗腫瘤作用的新穎C21甾體苷，分離得到4種新穎的C21甾體苷為耳葉牛皮消苷A、耳葉牛皮消苷B、白首烏新苷A、白首烏新苷B以及包含有這4種新穎C21的甾體苷的混合物白首烏總苷B(CGB)，4種新穎的C21甾體苷是具有下式的化學結構式，其中R為糖鏈。 耳葉牛皮消苷A的化學結構其中R為β-D-葡萄吡喃糖基-(1→4)-α-L-磁麻吡喃糖基-(1→4)-β-D-磁麻吡喃糖基-(1→4)-β-D-夾竹桃吡喃糖基-(1→4)-β-D-磁麻吡喃糖苷。
耳葉牛皮消苷B的化學結構其中R為β-D-葡萄吡喃糖基-(1→4)-β-D-磁麻吡喃糖基-(1→4)-β-D-夾竹桃吡喃糖基-(1→4)-β-D-洋地黃毒吡喃糖基-(1→4)-β-D-磁麻吡喃糖苷。
白首烏新苷A的化學結構其中R為β-D-葡萄吡喃糖基-(1→4)-β-D-磁麻吡喃糖基-(1→4)-β-D-夾竹桃吡喃糖基-(1→4)-β-D-磁麻吡喃糖苷。
白首烏新苷B的化學結構其中R為β-D-葡萄吡喃糖基-(1→4)-β-D-夾竹桃吡喃糖基-(1→4)-β-D-洋地黃毒吡喃糖基-(1→4)-β-D-磁麻吡喃糖苷。
中藥白首烏系蘿摩科(Asclepiadaceae)鵝絨藤屬植物耳葉牛皮消(Cynanchum auriculatum Royle ex Wight)、隔山牛皮消(C.wifordii Hemsl)及戟葉牛皮消(C.bangei Decne)等植物的塊根，具有養(yǎng)血益肝、固腎益精、強筋健骨等功效?，F(xiàn)代藥理研究表明白首烏含有的C21甾體苷有抗腫瘤和免疫增強作用。
本發(fā)明提供的新穎的C21甾體苷以及包含有新穎的C21甾體苷的混合物白首烏總苷B，它們是從白首烏(耳葉牛皮消的塊根)經(jīng)乙醇等醇類作為提取溶劑，濃縮所得的浸膏經(jīng)大孔樹脂柱層析分離，收集乙醇洗脫液，濃縮得到的白首烏總苷，経硅膠柱層析分離，用薄層層析檢查層析流份，具有相同單一斑點的流份合并，濃縮，分得白首烏總苷B。其中的流份2再經(jīng)Rp-18低壓柱或HPLC(高效液相色譜)分離和純化，分得耳葉牛皮消苷A、耳葉牛皮消苷B、白首烏新苷A、白首烏新苷B。
通過酸水解以及紫外光譜儀、紅外光譜儀、高分辨快速原子轟擊質(zhì)譜儀、核磁共振氫譜儀、核磁共振碳譜儀、異核多量子相關譜儀，異核多鍵相關譜儀等光譜分析技術，4種C21甾體苷的化學結構已被解明，分別為告達亭(caudatin)-β-D-葡萄吡喃糖基-(1→4)-α-L-磁麻吡喃糖基-(1→4)-β-D-磁麻吡喃糖基-(1→4)-β-D-夾竹桃吡喃糖基-(1→4)-β-D-磁麻吡喃糖苷；告達亭-β-D-葡萄吡喃糖基-(1→4)-β-D-磁麻吡喃糖基-(1→4)-β-D-夾竹桃吡喃糖基-(1→4)-β-D-洋地黃毒吡喃糖基-(1→4)-β-D-磁麻吡喃糖苷；告達亭-β-D-葡萄吡喃糖基-(1→4)-β-D-磁麻吡喃糖基-(1→4)-β-D-夾竹桃吡喃糖基-(1→4)-β-D-磁麻吡喃糖苷；告達亭-β-D-葡萄吡喃糖基-(1→4)-β-D-夾竹桃吡喃糖基-(1→4)-β-D-洋地黃毒吡喃糖基-(1→4)-β-D-磁麻吡喃糖苷。并分別命名為耳葉牛皮消苷A(auriculoside A，I)、耳葉牛皮消苷B(auriculoside B，II)、白首烏新苷A(cynanauriculoside A，III)、白首烏新苷B(cynanauriculoside B，IV)。
本發(fā)明與現(xiàn)有技術相比，具有高效低毒、抗腫瘤、增強機體免疫作用，是天然資源中提取分離作為抗腫瘤的新藥。這些新穎的C21甾體苷以及包含有這些新穎的C21甾體苷的組合物白首烏總苷B對人前列腺癌細胞PC3，人肺癌細胞PAA、人宮頸癌細胞Hela，大腸癌細胞Hcc-8693具有明顯的抑制作用，并能誘導Hela細胞的凋亡，在動物體內(nèi)抗癌試驗中，對小鼠移植性腫瘤S180肉瘤及EC腹水癌實體瘤亦有明顯的抑制作用。研究開發(fā)抗腫瘤新藥，給腫瘤患者帶來福音，具有重要的科學和實際價值，并且司以產(chǎn)生較大的社會效益和經(jīng)濟效益。
生物活性對本發(fā)明中的CGB和四個化合物進行了體內(nèi)外抗腫瘤活性的評價實驗。
一.白首烏C21甾體苷的體外抗腫瘤作用1.方法1.1生長曲線的測定在24孔細胞培養(yǎng)板上加入一定密度的細胞混懸液，1.0ml/孔；培養(yǎng)一天后加入不同濃度的藥物，1.0ml/孔，均設三復孔。于加藥同時及加藥后不同時間，用0.25％的胰酶液消化，收集細胞，于細胞計數(shù)板上計數(shù)，以每ml細胞數(shù)為縱坐標、時間為橫坐標畫出細胞生長曲線。
1.2 MTT顯色測定法在96孔細胞培養(yǎng)板上加一定密度的細胞混懸液，100μl/孔；培養(yǎng)一天(細胞貼壁)后加入不同濃度的藥物，100μl/孔，均設四復孔，另設對照孔(只加細胞，不加藥物)和調(diào)零孔(只加培養(yǎng)液，不含細胞和藥物)。在37℃，5％CO2，飽和濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4d，取出，加入1.0mg/ml的MTT100μl/孔；繼續(xù)培養(yǎng)2小時后，傾去各孔內(nèi)液體，再加入0.04N鹽酸異丙醇150μl/孔，于37℃放置1小時后，以酶標儀在570nm處測各孔吸收度。
1.3蛋白質(zhì)含量測定法在24孔細胞培養(yǎng)板上加入一定密度的細胞混懸液，1.0ml/孔；培養(yǎng)一天后，加入不同濃度的藥物，于培養(yǎng)箱(37℃，5％CO2)中培養(yǎng)四天后。傾去各孔內(nèi)液體，經(jīng)0.25％胰酶消化，PBS沖洗，離心收集細胞，加0.3NNaOH 0.5ml，于100℃水浴加熱30min后，取0.2ml加2ml考馬氏亮藍溶液，在754分光光度計595nm處測吸收度。
1.4細胞形態(tài)學觀察將Hela細胞接種于蓋玻片上，給藥組同時加藥，培養(yǎng)四天后，取出蓋玻片以HE染色法染色，在光鏡下觀察并拍照。
1.5數(shù)據(jù)統(tǒng)計IC50(半數(shù)抑制濃度)用NDST程序計算。
2.結果2.1 CGB和化合物I對PAA細胞生長的影響用不同濃度的CGB和化合物I處理PAA細胞，可見PAA細胞的生長均受到抑制，且呈濃度和時間依賴性。150μg/ml的CGB和150μg/ml的化合物I對PAA細胞具有明顯的細胞毒作用(
圖1，圖2)。
2.2CGB和化合物I、II、III、IV對體外培養(yǎng)的腫瘤細胞的影響用MTT法觀察了CGB以及化合物I、II、III、IV對體外培養(yǎng)的人大腸癌Hce-8693、人前列腺癌細胞PC3、人肺癌細胞PAA和人宮頸癌細胞Hela四種實體瘤細胞的影響，結果表明CGB和化合物I、II、III、IV對腫瘤細胞有較強的細胞毒作用(表1、2、3、4、5)。
表1 CGB對四種人癌細胞株的細胞毒作用
表2化合物I的細胞毒作用
表3化合物II的細胞毒作用
表4化合物III的細胞毒作用
表5化合物IV的細胞毒作用
2.3 CGB和化合物I對Hela細胞蛋白含量的影響用不同濃度的CGB和化合物I分別處理Hela細胞96小時后，細胞的蛋白含量不同程度地減少，蛋白質(zhì)減少率隨著CGB和化合物I濃度的增加而增加(表6)。各濃度組間差異用統(tǒng)計學方法檢驗，P(0.05，表明抑制作用呈濃度依賴性。
表6 CGB及化合物I對Hela細胞蛋白質(zhì)含量的影響
2.4 CGB和化合物I對Hela細胞形態(tài)的影響細胞形態(tài)學觀察表明，未經(jīng)藥物處理的細胞生長旺盛，呈多邊形，經(jīng)CGB和化合物I處理的細胞生長明顯受抑，細胞變圓，核固縮、濃聚(圖3)。
二.CGB的體內(nèi)抗腫瘤作用1.方法1.1對小鼠肉瘤S180的治療作用取接種后10天生長良好的荷瘤小鼠，按常規(guī)方法無菌分離S180瘤組織，按瘤生理鹽水＝1∶3勻漿，接種于18～22g的ICR小鼠腋部皮下(0.2ml/鼠)，于接種24小時后隨機分組，分口服和腹腔兩種途徑給藥，每日1次，共1次，天后處死動物，稱體重、瘤重，計算藥物的抑瘤率。
1.2對小鼠EC腹水癌實體瘤結果種后8天生長良好的荷瘤小鼠，無菌抽取腹水，用生理鹽水10倍稀釋，接種于18～22g的ICR小鼠腋部皮下(0.2ml/鼠)，于接種24h后隨機分組，分口服和腹腔兩種途徑給藥，每日1次，共10次，11天后處死動物，稱體重、瘤重，計算藥物的抑瘤率。
2.結果三批實驗的結果(表7)表明，口服和腹腔給藥均可明顯抑制S180肉瘤和EC腹水癌實體瘤的生長。
表7CGB對小鼠移植性腫瘤S180肉瘤和EC實體瘤的抑制作用藥物瘤株給藥途徑劑量(mg/kg)抑瘤率(％)20 35.1口服40 39.7CGB S180 80 47.7腹腔20 35.140 43.120 22.4EC 腹腔40 29.280 44.3三.毒性試驗CGB小鼠口服半數(shù)致死量為4890mg/kg實例1制備白首烏總苷B白首烏干燥塊根10kg粉碎后，以甲醇回流提取3次，每次2小時，合并提取液，減壓回收溶劑，得乙醇提取物。該提取物用氯仿水浴加熱2小時，冷卻后過濾，減壓回收氯仿，得氯仿提取物。再將氯仿提取物傾入正己烷中，加熱回流2次，每次半小時，得正己烷不溶部分，即白首烏總苷。將白首烏總苷進行硅膠柱層析，以氯仿—乙醇進行梯度洗脫，用薄層層析檢查層析流份，具有相同單一斑點的流份合并，濃縮，分得白首烏總苷B。
白首烏總苷B 淡黃棕色粉末。Lieberman-Burchard和Keller-Killiani反應均呈陽性，示皆為含2-去氧糖的甾體化合物。白首烏總苷B的高效液相色譜圖見圖4。
實例2制備耳葉牛皮消苷A白首烏干燥塊根10kg粉碎后，以甲醇回流提取3次，每次2小時，合并提取液，減壓回收溶劑，得乙醇提取物。該提取物用氯仿水浴加熱2小時，冷卻后過濾，減壓回收氯仿，得氯仿提取物。再將氯仿提取物傾入正己烷中，加熱回流2次，每次半小時，得正己烷不溶部分。將正己烷不溶部分進行硅膠柱層析，以氯仿—乙醇進行梯度洗脫，用薄層層析檢查層析流份，具有相同單一斑點的流份合并，濃縮，分得流份1、2、3、4、5，將其中流份2經(jīng)HPLC(MeOHH2O)分離、純化，得到耳葉牛皮消苷A。
耳葉牛皮消苷A白色無定型粉末。mp151-154℃。[α]D28＝-32.1°-(C＝0.04，EtOH)。 UVλmaxethanolnm(logε)222.5(4.05).IRνmaxKBr.cm-13449，2971，2935，1713，1645，1225，1165.HR-FAB-MS m/z1227.6495[(C62H100O24-H)-，理論值1227.6526]。FAB-MSm/z 1251[M+Na]+，1071[1251-H2O-glc]+，761[M+1-H2O-glc-cym-cym]+，617[761-ole]+，473[617-cym]+。1H NMR、13C NMR和HMBC數(shù)據(jù)見表8。
表8.化合物1的1H，13C NMR和HMBC數(shù)據(jù)苷元部分13C NMR1H NMR HMBC1α 39.0(t)1.09-1.12，m C-2，C-101β 1.77-1.83，m2α 29.9(t)1.77-1.83，m C-1，C-32β 2.00-2.14，m3 77.7(d)3.85，m C-2，C-5，Sa-C-14α 39.3(t)1.78，m C-3，C-54β 2.41，m5 139.4(s)6 119.2(d) 5.28，br sC-8，C-107α 34.9(t)2.017β 2.12，m C-8，C-98 74.3(s)[5.04，br s(OH)] C-8，C-9，C-149 44.6(d)1.72，br d(12.9) C-8，C-10，C-1110 37.1(s)11α 25.1(t)2.14，m C-9，C-10，C-1211β 2.25，m12 72.6(d)5.03，m C-11，C-13，C-17，C-1′13 58.0(s)14 89.5(s)[6.12，s(OH)]15 33.9(t)2.07，m C-14，C-16，C-17，C-1816α 33.0(t)2.02，m C-13，C-14，C-15，C-17，16β 3.25，m17 92.4(s)[6.44，s(OH)] C-13，C-17，C-2018 10.8(q)1.97，s C-12，C-13，C-14，C-1719 18.2(q)1.31，s C-1，C-9，C-1020 209.5(s)21 27.6(q)2.50，d(0.8) C-201′166.0(s)2′114.2(d) 5.85，s C-1′，C-3′，C-4′，C-7′3′165.5(s)4′38.2(d)2.41，m C-7′C-5′，C-6′5′21.0(q)0.94，d(7.6) C-3′，C-4′，C-6′，C-7′6′20.9(q)0.96，d(7.6) C-3′，C-4′，C-5′，C-7′7′16.5(q)2.26，s C-2′，C-3′，C-4′
表8續(xù)糖部分13CNMR1HNMR HMBCD-cym.Sa-C1 96.5(d)5.27，br d(11.3) C3，Sa-C2Sa-C2 37.5(t)1.89，m；2.32，m Sa-C1，Sa-C3Sa-C3 78.1(d)4.07，br s Sa-C1，Sa-C5Sa-C4 83.4(d)3.51，m Sa-C3，Sa-C5，Sa-C6，Sb-C1Sa-C5 69.1(d)4.22，m Sa-C1，Sa-C6Sa-C6 18.7(q)1.38，d(6.5) Sa-C4，Sa-C5Sa-3-OCH358.9(q)3.60，d(0.9) Sa-C3D-ole.Sb-C1 101.9(d) 4.66，br d(9.7) Sa-C4，Sb-C2Sb-C2 37.2(t)1.63，m；2.25，m Sb-C1，Sb-C3Sb-C3 78.7(d)4.20，m Sb-C1，Sb-C4，Sb-C5Sb-C4 83.1(d)3.44，m Sb-C3，Sb-C5，Sb-C6，Sc-C1Sb-C5 71.9(d)3.46，dd(2.3，9.1) Sb-C1，Sb-C6Sb-C6 18.7(q)1.38，d(6.5) Sb-C4，Sb-C5Sb-3-OCH356.5(q)3.33，d(0.8) Sb-C3D-cym.Sc-C1 100.5(d) 5.11，br d(9.7) Sb-C4，Sc-C2Sc-C2 37.5(t)1.78，m；2.29，m Sc-C1，Sc-C3Sc-C3 77.8(d)3.99，m Sc-C4，Sc-C4Sc-C4 81.7(d)3.36，br d(8.95) Sc-C3，Sc-C5，Sc-C6，Sd-C1Sc-C5 69.0(d)4.16，m Sc-C1，Sc-C6Sc-C6 18.6(q)1.37，d(6.5) Sc-C4，Sc-C5Sc-3-OCH359.0(q)3.55，d(0.9) Sc-C3L-cym.Sd-C1 97.4(d)5.06，br d(2.6) Sc-C4，Sd-C2，Sd-C5Sd-C2 34.9(t)1.78，m；2.32，m Sd-C1，Sd-C3Sd-C3 73.7(d)3.96，m Sd-C1，Sd-C4，Sd-C5Sd-C4 79.1(d)3.42，dd(2.7，9.1) Sd-C3，Sd-C5，Sd-C6，Se-C1Sd-C5 64.8(d)4.80，dq(6.5，7.6) Sd-C1，Sd-C3，Sd-C4，Sd-C6Sd-C6 18.4(q)1.50，d(6.0) Sd-C4，Sd-C5Sd-3-OCH357.1(q)3.49，d(0.8) Sd-C3D-glc.Se-C1 102.3(d) 5.01，br d(7.7) Sd-C-4，Se-C-5Se-C2 75.4(d)3.98，m Se-C1，Se-C3Se-C3 78.5(d)4.23，m Se-C1，Se-C2，Se-C4Se-C4 72.1(d)4.20，m Se-C3，Se-C5，Se-C6Se-C5 79.2(d)3.99，m Se-C4，Se-C6Se-C-6 63.0(t) 4.37，dd(5.4，11.6) Se-C4，Se-C54.56，br d(11.6) Se-C4
實例3制備耳葉牛皮消苷B白首烏干燥塊根10kg粉碎后，以甲醇回流提取3次，每次2小時，合并提取液，減壓回收溶劑，得乙醇提取物。該提取物用氯仿水浴加熱2小時，冷卻后過濾，減壓回收氯仿，得氯仿提取物。再將氯仿提取物傾入正己烷中，加熱回流2次，每次半小時，得正己烷不溶部分。將正己烷不溶部分進行硅膠柱層析，以氯仿—乙醇進行梯度洗脫，用薄層層析檢查層析流份，具有相同單一斑點的流份合并，濃縮，分得流份1、2、3、4、5，將其中流份2經(jīng)HPLC(MeOHH2O)分離、純化，得到耳葉牛皮消苷B。
耳葉牛皮消苷B白色無定型粉末。mp141-146℃。[α]D28＝+4.4°(C＝0.16，EtOH)。UVλmaxethanolnm(logε)222.5(4.04).IRνmaxKBrcm-13447，2971，2935，1712，1646，1225，1164.HR-FAB-MS m/z1213.6337[(C61H98O24-H)-，理論值1213.6370]。FAB-MSm/z 1237[M+Na]+，909[M+1-glc-cym]+，765[909-glc-cym-ole]+，473[M+1 chain-H2O]+，473[617-cym]+。1H NMR、13C NMR和HMBC數(shù)據(jù)見表9。
表9.化合物2的1H，13C NMR和HMBC數(shù)據(jù)苷元部分13C NMR1H NMR HMBC1α 39.0(t)1.12，m C2，C91β 1.70，m C2，C9，C102α 29.9(t)1.71，m C1，C32β 2.14，m C1，C3，C103 77.7(d)3.83，m Sa-C14α 39.3(t)1.71，m C2，C5，C104β 2.44，m C2，C5，C6，C105 139.4(s)6 119.2(d) 5.24，br sC8，C107α 34.8(t)2.03，m C5，C6，C8，C97β 2.44，m8 74.3(s)[5.00，s(OH)] C8，C9，C149 44.6(d)1.67，br d(12.9) C10，C14，C1910 36.8(s)11α 25.1(t)2.10，m C8，C9，C10，C1211β 2.21，m12 72.6(d)5.01，br d(11.4) C11，C13，C17，C18，C′113 58.0(s)14 89.5(s)[6.12，s(OH)]15 33.9(t)2.03，m C13，C14，C16，C1716α 33.0(t)2.06，m C13，C14，C15，C1716β 3.24，m17 92.4(s)[6.42，s(OH)] C13，C17，C2018 10.7(q)1.97，s C12，C13，C14，C1719 18.7(q)1.30，s C1，C5，C9，C1020 209.4(s)21 27.6(q)2.48，s C20C-1′ 166.0(s)C-2′ 114.2(d) 5.85，s C1′，C3′，C4′，C7′C-3′ 165.4(s)C-4′ 38.2(d)2.40，m C7′C-5′ 21.0(q)0.94，d(7.0) C3′，C4′，C6′，C7′C-6′ 20.9(q)0.96，d(7.6) C3′，C4′，C5′，C7′C-7′ 16.5(q)2.27，s C3′，C4′，C6′
表9續(xù)糖部分Sa-C1 96.4(d)5.45，br d(9.3) C-3，Sa-C2Sa-C2 37.4(t)1.78，m；2.27，mSa-C1，Sa-C3Sa-C3 78.2(d)3.97，m Sa-C1，Sa-C5Sa-C4 82.6(d)3.37，br d(9.7) Sa-C3，Sa-C5，Sa-C6，Sb-C1Sa-C5 68.6(d)4.23-4.26，mSa-C1，Sa-C6Sa-C6 18.7(q)1.41，br d(4.9) Sa-C4，Sa-C5Sa-3-OCH357.5(q)3.45，s Sa-C3D-digit.Sb-C1 98.4(d)5.21，br d(10.4)Sa-C4，Sb-C2Sb-C2 37.4(t)1.78，m；2.27，mSb-C1，Sb-C3Sb-C3 69.1(d)4.12-4.25，mSb-C4，Sb-C5Sb-C4 83.2(d)3.50，m Sb-C3，Sb-C5，Sb-C6，Sc-C1Sb-C5 67.6(d)4.23-4.26，mSb-C1，Sb-C6Sb-C6 18.7(q)1.37，br d(4.3) Sb-C4，Sb-C5D-ole.Sc-C1 102.0(d) 4.64，br d(9.8) Sb-C4，Sc-C2Sc-C2 37.8(t)1.64，m；2.24，mSc-C1，Sc-C3Sc-C3 78.4(d)3.97，m Sc-C1，Sc-C4，Sc-C5Sc-C4 83.2(d)3.46，br d(9.3) Sc-C3，Sc-C5，Sc-C6，Sd-C1Sc-C5 71.8(d)3.45，d(6.3)Sc-C1，Sc-C6Sc-C6 18.7(q)1.37，d(4.3)Sc-C4，Sc-C5Sc-3-OCH358.7(q)3.49，s Sc-C3D-cym.Sd-C1 99.8(d)5.14，br d(9.4) Sc-C4，Sd-C2，Sd-C5Sd-C2 37.4(t)1.78，m；2.27，mSd-C1，Sd-C3Sd-C3 77.7(d)3.97，m Sd-C1，Sd-C4，Sd-C5Sd-C4 83.4(d)3.65，br d(9.8) Sd-C3，Sd-C5，Sd-C6，Se-C1Sd-C5 69.7(d)4.15，m Sd-C1，Sd-C6Sd-C6 18.7(q)1.62，d(ca.6) Sd-C4，Sd-C5Sd-3-OCH358.9(q)3.53，s Sd-C3D-glc.Se-C1 106.6(d) 4.90，br d(ca.7)Sd-C4，Se-C5Se-C2 75.4(d)3.97，m Se-C1，Se-C3Se-C3 78.4(d)4.14，m Se-C1，Se-C2，Se-C4Se-C4 71.9(d)4.12，m Se-C3，Se-C5Se-C5 78.8(d)4.03，m Se-C1，Se-C4，Se-C6Se-C6 63.1(t)4.37，m Se-C4，Se-C54.56，br d(7.3) Se-C4
實例4制備白首烏新苷A白首烏干燥塊根10kg粉碎后，以甲醇回流提取3次，每次2小時，合并提取液，減壓回收溶劑，得乙醇提取物。該提取物用氯仿水浴加熱2小時，冷卻后過濾，減壓回收氯仿，得氯仿提取物。再將氯仿提取物傾入正己烷中，加熱回流2次，每次半小時，得正己烷不溶部分。將正己烷不溶部分進行硅膠柱層析，以氯仿-乙醇進行梯度洗脫，用薄層層析檢查層析流份，具有相同單一斑點的流份合并，濃縮，分得流份1、2、3、4、5，將其中流份2經(jīng)HPLC(MeOHH2O)分離、純化，得到白首烏新苷A。
白首烏新苷A白色無定型粉末。mp172-176℃。α]D28＝0°(C＝0.80，EtOH)。UVλmaxethanolnm(1ogε)221.5(4.05).IRνmaxKBrcm-13448，2969，2935，1713，1646，1226，1166.HR-FAB-MS m/z1083.5739([C55H88O21-H]-，理論值1083.5740)。FAB-MSm/z 1091[M+Li]+，911[1091-H2O-glc]+，617[M+1-H2O-glc-cym-ole]+，473[617-H2O-glc-cym-ole-cym]+。1H NMR、13C NMR和HMBC數(shù)據(jù)見表10。
表10.化合物3的1H，13C NMR和HMBC數(shù)據(jù)苷元部分13C NMR1H NMR HMBC1α 39.0(t) 1.17，m C2，C9，C101β 1.82，m C2，C9，C102α 29.9(t) 1.82，m；C10，C1，C3；2β 2.13，m C10，C1377.7(d) 3.87，m Sa-C14α 39.3(t) 1.82，m C2，C5，C6，C104β 2.53，dd(4.7，12.0) C2，C5，C6，C105139.4(s)6119.3(d)5.26，br s C8，C107α 34.8(t) 2.15，m C8，C9，C5，C67β 2.45，m C8，C9，C5，C6874.3(s) [5.07，s(OH)]C7，C8，C9，C14944.6(d) 1.75，t(10.5)C10，C19，C1410 37.3(s)11α 25.1(t) 2.15 C8，C9，C10，C1211β 2.20 C8，C9，C10，C1212 72.6(d) 5.04，dd(4.1，11.7) C11，C13，C17，C18，C′113 58.0(s)14 89.5(s) [6.13，s(OH)]C8，C14，C1515α33.9(t) 2.15，m C815β2.45，m C816α33.0(t) 2.13，m C14，C15，C2016β3.29，m C14，C15，C2017 92.4(s) [6.45，s(OH)]C13，C17，C2018 10.8(q) 1.98，s C13，C12，C14，C1719 18.2(q) 1.32，s C1，C5，C9，C1020 209.5(s)21 27.6(q) 2.50，d(0.9) C17，C20C-1′166.0(s)C-2′114.2(d)5.58，s C1′，C3′，C4′，C7′C-3′165.4(s)C-4′38.2(d) 2.45，m C3′，C5′，C6′C-5′21.0(q) 0.93，d(7.6) C4′，C6 ′C-6′20 9(q) 0.96，d(7.0) C4′，C5′C-7′16.5(q) 2.27，s C2′，C3′，C4′
表10續(xù)糖部分13C NMR1H NMRHMBCD-cym.Sa-C1 96.4(d)5.26，br d(8.0)C3，Sa-C2Sa-C2 37.4(t)2.33，m；1.82，m Sa-C1，Sa-C3Sa-C3 78.8(d)4.25，mSa-C1，Sa-C4，Sa-C5，Sa-C4 83.6(d)3.49，mSa-C3，Sa-C5，Sa-C6，Sb-C1Sa-C5 69.0(d)4.21，mSa-C1，Sa-C4，Sa-C6Sa-C6 18.7(q)1.43，d(5.9) Sa-C4，Sa-C5Sa-3-OCH357.5(q)3.51，d(1.0) Sa-C3D-ole.Sb-C1 102.0(d) 4.69，br d(9.7)Sa-C4，Sb-C2Sb-C2 37.8(t)2.33，m；1.78，m Sb-C1，Sb-C3Sb-C3 78.2(d)4.10，mSb-C1，Sb-C4Sb-C4 82.7(d)3.47，mSb-C1，Sb-C5，Sb-C6，Sc-C1Sb-C5 71.8(d)3.48，mSb-C1，Sb-C6Sb-C6 18.7(q)1.41，d(5.3) Sb-C4，Sb-C5Sb-3-OCH358.7(q)3.52，d(1.0) Sh-C3D-cym.Sc-C1 98.4(d)5.25，br d(7.6)Sb-C4，Sc-C2Sc-C2 36.8(t)2.33，m；1.78，m Sc-C1，Sc-C3Sc-C3 77.9(d)4.19，mSc-C1，Sc-C4，Sc C5Sc-C4 83.2(d)3.68，dd(2.8，9.6) Sc-C1，Sc-C5，Sc-C6，Sd-C1Sc-C5 69.7(d)4.28，mSc-C6，Sc-C4，Sc-C1Sc-C6 18.7(q)1.62，d(6.0) Sc-C4，Sc-C5Sc-3-OCH358.9(q)3.56，d(1.0) Sc-C3D-glcSd-C1 106.6(d) 4.93，br d(7.7)Sc-C4，Sd-C5Sd-C2 75.4(d)3.98，mSd-C1，Sd-C3Sd-C3 78.5(d)4.23，mSd-C2，Sd-C4Sd-C4 71.9(d)4.17，mSd-C3，Sd-C5，Sd-C6Sd-C5 78.4(d)3.98，mSd-C4，Sd-C6Sd-C6 63.1(t)4.40，dd(5.5，11.6)Sd-C4，Sd-C54.54，dd(2.1，11.6)Sd-C4
實例5制備白首烏新苷B白首烏干燥塊根10kg粉碎后，以甲醇回流提取3次，每次2小時，合并提取液，減壓回收溶劑，得乙醇提取物。該提取物用氯仿水浴加熱2小時，冷卻后過濾，減壓回收氯仿，得氯仿提取物。再將氯仿提取物傾入正己烷中，加熱回流2次，每次半小時，得正己烷不溶部分。將正己烷不溶部分進行硅膠柱層析，以氯仿-乙醇進行梯度洗脫，用薄層層析檢查層析流份，具有相同單一斑點的流份合并，濃縮，分得流份1、2、3、4、5，將其中流份2經(jīng)HPLC(MeOHH2O)分離、純化，得到白首烏新苷B。
白首烏新苷B白色無定型粉末。[α]D28＝11.2°(C＝0.50，EtOH)。UVλmaxethanolnm(logε)221.5(4.02)。IRνmaxKBrcm-13446，2971，2935，1713，1646，1225，1165。HR-FAB-MS m/z1069.5499([C54H86O21-H]-，理論值1069.5583)。FAB-MSm/z 1093[M+Na]+，909[M+1-glc]+，765[M+1-glc-cym]+，635[M+1-glc-cym-digit]+，473[M+1-sugar chain-H2O]+。1H NMR、13C NMR、HMQC和HMBC數(shù)據(jù)見表11。
表11.化合物4的1H，13C NMR和HMBC數(shù)據(jù)苷元部分13C NMR1H NMR HMBC1α 39.0(t)1.11，m C2，C91β 1.82，m C2，C9，C102α 29.9(t)1.82，m C1，C3232.12C1，C3，C103 77.7(d)3.85，m Sa-C14α 39.3(d)1.82，m C2，C5，C10432.25，m C2，C5，C6，C105 139.4(s)6 119.2(d) 5.26，br s C8，C107α 34.8(t)2.15，m C5，C6，C8，C97β2.45，m8 74.3(s)9 44.6(d)1.72，br d(10.8)C10，C14，C1910 37.4(s)11α 25.1(t)2.10，m C8，C9，C10，C1211β 2.13，m12 72.6(d)5.03，dd(ca.4，12) C11，C13，C17，C18，C＇-113 58.0(s)14 89.5(s)15α33.8(t)2.15，m C13，C14，C16，C1715β 2.45，m16α33.0(t)2.13，m C13，C14，C15，C1716β 3.25，m17 92.4(s)18 10.7(q)1.97C12，C13，C14，C1719 18.7(q)1.30，s C1，C5，C9，C10，20 209.4(s)21 27.6(q)2.49，s C1′，C3′，C4′，C7′1′166.0(s)2′114.2(d) 5.85，s C7′3′165.4(s)4′38.2(d)2.45，m C3′，C4′，C5′，C7′5′21.0(q)0.94，d(6.7)C3′，C4′，C6′6′20.9(q)0.96，d(7.5)C3′，C4′，C5′7′16.5(q)2.26，s C2′，C3′，C4′
表11續(xù)糖部分13C NMR1H NMR HMBCD-cym.Sa-C1 96.4(d)5.46，br d(9.2) C-3，Sa-C2Sa-C2 36.8(t)1.70-1.75，m；2.42，m Sa-C1，Sa-C3Sa-C3 78.2(d)3.25-3.75，m Sa-C1，Sa-C5Sa-C4 83.1(d)3.37，d(7.2) Sa-C3，Sa-C5，Sa-C6，Sb-C1Sa-C5 68.6(d)4.29，m Sa-C1，Sa-C6Sa-C6 18.7(q)1.37，d(4.2) Sa-C4，Sa-C5Sa-3-OCH359.0(q)3.52，s Sa-C3D-digit.Sb-C1 99.8(d)5.15，br d(8.9) Sa-C4，Sb-C2Sb-C2 38.2(t)1.70-1.75，m；2.32，m Sb-C1，Sb-C3Sb-C3 69.1(d)4.14-4.20，m Sb-C1，Sb-C5Sb-C4 83.8(d)3.70，br d(8.8) Sb-C3，Sb-C5，Sb-C6，Sc-C1Sb-C5 67.5(d)4.14-4.20，m Sb-C1，Sb-C6Sb-C6 18.9(q)1.42，d(5.3) Sb-C4，Sb-C5D-ole.Sc-C1 101.9(d) 4.67，br d(9.4) Sb-C4，Sc-C2Sc-C2 36.8(t)1.54-1.62，m；2.39-2.46，mSc-C1，Sc-C3Sc-C3 79.3(d)3.75-4.25，m Sc-C1，Sc-C5Sc-C4 83.3(d)3.50，br d(9.5) Sc-C3，Sc-C5，Sc-C6，Sd-C1Sc-C5 72.1(d)3.50，m Sc-C1，Sc-C6Sc-C6 18.5(q)1.42，d(5.3) Sc-C4，Sc-C5Sc-3-OCH359.0(q)3.56 Sb-C3D-glc.Sd-C1 104.5(d) 5.10，br d(ca.10) Sc-C4，Sd-C5Sd-C2 75.7(d)3.93-3.98，m Sd-C1，Sd-C3Sd-C3 78.4(d)4.14-4.20，m Sd-C2，Sd-C4Sd-C4 72.0(d)4.14-4.20，m Sd-C3，Sd-C5Sd-C5 78.7(d)4.14-4.20，m Sd-C4，Sd-C6Sd-C6 63.1(t)4.33，m4.51，br d(11.6) Sd-C4，Sd-C5，Sd-C4，Sd-C5
化合物I、II、III和IV的酸水解取化合物I、II、III和IV各30mg分別溶于3ml的0.1N H2SO4甲醇中，加熱回流半小時，減壓除去甲醇，以飽和Ba(OH)2溶液中和，過濾，除去沉淀，濾液減壓濃縮至干，然后用柱層析(硅膠10g，CHCl3∶MeOH＝200∶1→100∶1→60∶1→10∶1)分離，得到化合物V和糖的混合物?；衔颲UV(EtOH)λmax(logε)221.0(4.20)nm，IR(KBr)νmax3446，2971，2935，1713，1680，1646cm-1，1HNMR、13CNMR、1H-1H COSEY(氫-氫相關譜)和HMBC數(shù)據(jù)見表12，經(jīng)薄層層析檢查，化合物V與告達庭標準品Rf值一致。
表12.化合物5的1H，13C NMR，1H-1H COSEY和HMBC數(shù)據(jù)13C NMR1H NMR2H-1H HMBC1α39.8(t)1.17，m C-2H，C-9HC2，C9，C101β 1.76，m C2，C9，C102α31.7(t)1.80，m C-3H C1，C3，C102β 2.32，br d(6.8) C1，C103α73.20(d) 3.51，m C-2H Sa-C14α42.8(t)1.88，m C-3H C2，C5，C6，C104β 2.32，m C2，C5，C6，C105 140.5(s)6 119.2(d) 5.36，br s C-7H C8，C107 34.2(t)2.19，m C-6H C5，C6，C8，C98 74.9(s) C8，C9，C149 45.2(d)1.57，br d(3.1) C-11H C10，C14，C1910 38.0(s)11α25.5(t)1.70-1.77，mC-9H，C-12H C8，C9，C10，C1211β 1.93-1.95，m C8，C9，C10，C1212 72.6(d)4.55，dd(4.3，11.8) C-11H C11，C13，C17，C18，C′113 58.6(s)14 89.9(s)15α 34.2(t)1.93-1.95，mC-16H C815β 2.00-2.07，m C816α 33.3(t)1.70-1.77，mC-15H C14，C15，C2016β 2.92，ddd(4.9，9.7，12.6) C14，C15，C2017 92.9(s) C13，C17，C2018 10.5(q)1.55，s C13，C12，C14，C1719 18.6(q)1.19，s C1，C5，C9，C1020 209.0(s)21 27.6(q)2.22，s C201′167.4(s)2′114.2(d) 5.58，s C-7′HC1′，C3′，C4′，C7′3′165.4(s)4′39.4(d)2.46，qq(6.8) C5′，6′HC3′，C5′，C6′5′21.3(q)2.13，d(6.7)C-4′HC4′，C6′6′21.4(q)1.13，d(6.7)C-4′HC4′，C6′7′16.7(q)2.16，d(1.2)C-2′HC2′，C3′，C4′
權利要求
1.從中藥白首烏中提取分離具有抗腫瘤作用的新穎碳-21甾體苷，其特征在于分離得到4種新穎的碳-21甾體苷為耳葉牛皮消苷A、耳葉牛皮消苷B、白首烏新苷A、白首烏新苷B以及包含有這4種新穎的碳-21甾體苷的混合物—白首烏總苷B，4種新穎的碳-21甾體苷是具有下式的化學結構式，其中R為糖鏈。
2.根據(jù)權利要求1所述的新穎碳-21甾體苷，其特征在于耳葉牛皮消苷A中，R為β-D-葡萄吡喃糖基-(1→4)-α-L-磁麻吡喃糖基-(1→4)-β-D-磁麻吡喃糖基-(1→4)-β-D-夾竹桃吡喃糖基(1→4)-β-D-磁麻吡喃糖苷。
3.根據(jù)權利要求1所述的新穎碳-21甾體苷，其特征在于耳葉牛皮消苷B中，R為β-D-葡萄吡喃糖基-(1→4)-β-D-磁麻吡喃糖基-(1→4)-β-D-夾竹桃吡喃糖基-(1→4)-β-D-洋地黃毒吡喃糖基-(1→4)-β-D-磁麻吡喃糖苷。
4.根據(jù)權利要求1所述的新穎碳-21甾體苷，，其特征在于白首烏新苷A中，R為β-D-葡萄吡喃糖基-(1→4)-β-D-磁麻吡喃糖基-(1→4)-β-D-夾竹桃吡喃糖基-(1→4)-β-D-磁麻吡喃糖苷。
5.根據(jù)權利要求1所述的新穎碳-21甾體苷，，其特征在于白首烏新苷B中，R為β-D-葡萄吡喃糖基-(1→4)-β-D-夾竹桃吡喃糖基-(1→4)-β-D-洋地黃毒吡喃糖基-(1→4)-β-D-磁麻吡喃糖苷。
6.根據(jù)權利要求1所述的混合物，其特征在于白首烏總苷B是包含有耳葉牛皮消苷A、耳葉牛皮消苷B、白首烏新苷A、白首烏新苷B這4種新穎的碳-21甾體苷
7.根據(jù)權利要求1所述的化合物以及混合物，其特征在于對四種人癌細胞株的細胞毒活性。
8.根據(jù)權利要求1所述的化合物以及混合物，其特征在于誘導人宮頸癌細胞Hela等的凋亡作用。
9.根據(jù)權利要求1所述的混合物-白首烏總苷B，其特征在于對小鼠移植性腫瘤S180肉瘤、EC腹水癌實體瘤的抑制作用。
10.根據(jù)權利要求1所述的化合物，其抗腫瘤有效量的與藥學上可接受的載體所組成的藥物組合物。
11.根據(jù)權利要求1所述的混合物—白首烏總苷B，其抗腫瘤有效量的與藥學上可接受的載體所組成的藥物組合物。
全文摘要
本發(fā)明公開提示了一類新穎的抗腫瘤化合物,特別是用于抑制人癌細胞生長的4種碳－21甾體苷以及包含有這4種碳－21甾體苷的混合物。從白首烏中分離的4種碳－21甾體苷,被分別命名為:耳葉牛皮消苷A、耳葉牛皮消苷B、白首烏新苷A、白首烏新苷B。包含有這4種碳－21甾體苷的混合物被定名為白首烏總苷B。它們對體外培養(yǎng)的人癌細胞株有抑制作用;能誘導人宮頸癌細胞Hela的凋亡。白首烏總苷B對小鼠移植性腫瘤有抑制作用。它們是有效的抗腫瘤藥物。
文檔編號A61P35/00GK1342654SQ0013636
公開日2002年4月3日 申請日期2000年12月16日 優(yōu)先權日2000年12月16日
發(fā)明者張如松, 葉益萍 申請人:浙江省醫(yī)學科學院, 浙江普發(fā)科技開發(fā)中心