專利名稱：抗體用于抗癌接種的用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及針對人細胞膜抗原的抗體用于制備抗癌接種的藥物組合物的用途。
隨著雜交瘤技術(shù)的發(fā)現(xiàn)，使得抗絕大多數(shù)各種抗原的單克隆抗體(MAB)的產(chǎn)生成為可能。一般應(yīng)用于所有生物學(xué)問題的該項技術(shù)在癌癥研究中也起著重要作用。在過去的20年中已經(jīng)生產(chǎn)出針對多種與腫瘤相關(guān)抗原(TAA)的MAB。TAA是在腫瘤細胞的細胞膜上優(yōu)勢表達并且因此而與非惡性組織區(qū)分的結(jié)構(gòu)。因此，它們被認為是以特異性MAB或從這些MAB衍生的衍生物為基礎(chǔ)的診斷或治療應(yīng)用的靶物。
針對TAA的MAB直接治療應(yīng)用以被動免疫治療為基礎(chǔ)，即一種MAB或一種衍生物以合適的量對癌癥患者全身施用，并且只要生物體中的濃度足夠高就具有治療效果。這樣的藥劑的生物半衰期取決于它們的結(jié)構(gòu)，并且只有幾小時至幾天。因此需要反復(fù)施用。但是，如果使用異種抗體(例如鼠類MAB)，這導(dǎo)致不期望的免疫反應(yīng)，其能導(dǎo)致中和可能的治療作用并導(dǎo)致有害的副作用(過敏性休克)。因此，這樣的免疫治療只能施用有限一段時間。
癌癥免疫治療的另一種方法以癌癥患者的免疫系統(tǒng)的選擇性激活為基礎(chǔ)，這樣來對抗惡性細胞對于惡性細胞使用各種各樣類型的癌癥疫苗。這些包括用自身或異源腫瘤細胞接種，用經(jīng)化學(xué)修飾或經(jīng)基因技術(shù)修飾的自身或異源腫瘤細胞接種，用TAA或利用化學(xué)或基因技術(shù)方法產(chǎn)生的分離的TAA接種，用從中衍生的肽接種，以及，最近，也用編碼TAA的DNA或從中衍生的結(jié)構(gòu)接種等。另一種方法以用于抗癌接種的抗-特應(yīng)抗體的應(yīng)用為基礎(chǔ)。合適的抗-特應(yīng)抗體可以是免疫學(xué)模擬物TAA。作為異源蛋白質(zhì)(例如鼠類抗體，山羊抗體等)，它們在對人接種之后誘導(dǎo)強的免疫反應(yīng)-與正常人免疫腫瘤抗原相反，后者因為結(jié)構(gòu)本身，經(jīng)常只是有低程度的免疫原性。因此，抗-特應(yīng)抗體可以作為腫瘤抗原的免疫原取代物用于接種。
與在自動特異性癌癥免疫治療中使用抗-腫瘤抗體的被動免疫治療相反，即使非常小量的一種合適的疫苗原理上足以誘導(dǎo)持續(xù)數(shù)月或數(shù)年的免疫性，并且如果其弱則可以通過反復(fù)接種來加強。此外，自動免疫法使得誘導(dǎo)體液以及細胞免疫，它們的共同作用可以導(dǎo)致有效保護。
總之，到現(xiàn)在為止描述的抗體或者它們的衍生物用于抗癌的免疫治療的用途基本上以兩個原理為基礎(chǔ)-使用針對TAA的抗體或者它們的衍生物被動治療。
-使用針對具有抗TAA的特異性的抗體的獨特型的抗體或者它們的衍生物自動免疫接種(接種)。
在各種各樣TAA的發(fā)現(xiàn)和接下來的表征過程之中，發(fā)現(xiàn)它們對于癌癥細胞具有重要的功能。它們使得退化細胞表現(xiàn)出惡性表型的性質(zhì)特征，例如提高的粘著能力，這在建立轉(zhuǎn)移中起著重要的作用。但是，在某些階段，這樣的抗原也可以在正常細胞上表達，在那里它們負責(zé)這些細胞的正常功能。非窮舉地，下面列出這樣的抗原的一些實例-N-CAM(神經(jīng)元細胞粘著分子)，其經(jīng)常在神經(jīng)元源的腫瘤上表達并且其影響同嗜性粘著(細胞生物學(xué)雜志(J，Cell.Biol.)118(1992)，937)。
-路易斯Y糖抗原，在大多數(shù)上皮源的腫瘤上存在，但是其在上皮組織胎發(fā)育過程中也起著重要作用。已經(jīng)證明，肺癌中該抗原的表達與不好的預(yù)后密切相關(guān)，因為路易斯Y陽性癌細胞明顯具有更高的轉(zhuǎn)移潛力(N.Engl.J.Med.327(1992)，14)。
-CEA(癌胚抗原)，其經(jīng)常在胃腸道的上皮腫瘤上存在并且其已經(jīng)被鑒定為自身粘著分子(細胞(Cell)57(1989)，327)。
-Ep-CAM(上皮細胞粘著分子)，其幾乎在所有的上皮源的腫瘤上表達，但是其也在大量正常上皮上存在。其已經(jīng)被表征為自身-粘著分子而且因此分類為泛-上皮粘著抗原(細胞生物學(xué)雜志(J，Cell.Biol.)125(1994)，437)。
本發(fā)明解決的技術(shù)問題是提供有效預(yù)防或治療癌癥疾病的另外的方式和方法。
這些問題通過權(quán)利要求書中描述特征的實施方案來解決。
因此，本發(fā)明涉及針對人細胞膜抗原的抗體制備預(yù)防和/或治療性抗癌癥接種的藥物組合物的用途。在本說明書中，術(shù)語“細胞膜抗原”涉及在細胞的細胞膜上存在的結(jié)構(gòu)。這些特別包括受體，例如運鐵蛋白受體，或者其它分子，例如E鈣粘著蛋白或Ep-CAM。
在一個優(yōu)選的實施方案中，這樣一種細胞膜抗原是腫瘤-相關(guān)抗原。在本說明書中，術(shù)語“腫瘤-相關(guān)抗原”指腫瘤細胞占優(yōu)勢存在的結(jié)構(gòu)，因此使區(qū)分于非惡性組織。優(yōu)選地，這樣的腫瘤-相關(guān)抗原位于腫瘤細胞的細胞膜上或中。但是這不排除這樣的抗原也在非-退化細胞上存在的可能性。所述腫瘤-相關(guān)抗原可以是例如多肽，特別是糖基化蛋白質(zhì)，或者多肽的糖基化形式。也可以代表一種腫瘤-相關(guān)抗原的其它結(jié)構(gòu)是例如糖脂。這些包括，例如神經(jīng)節(jié)苷脂，例如GM2。此外，腫瘤-相關(guān)抗原可以通過可以為癌細胞的特征的細胞膜的脂質(zhì)成分的變化來表示。
腫瘤-相關(guān)抗原的實施例是N-CAM，路易斯Y糖抗原，CEA和Ep-CAM，上文已經(jīng)提到過。其它實施例是Siayl Tn糖，Globo H糖，神經(jīng)節(jié)苷脂，例如GD2/GD3/GM2，前列腺特異性抗原(PSA)，CA125，CA19-9，CA15-3，TAG-72，EGF受體，Her2/Neu受體，p97，CD20和CD21。針對所有這些抗原的單克隆抗體是可得到的。其它腫瘤-相關(guān)抗原描述于，例如，DeVita等(編著，“癌癥的生物學(xué)治療”(Biological Therapy ofCancer)第2版，第3章腫瘤抗原生物學(xué)(Biology of TumorAntigens)，Lippincott公司，ISBN0-397-51416-6(1995))。
術(shù)語“抗體”涉及所有可能類型的抗體，特別涉及多克隆或單克隆抗體，還涉及通過化學(xué)，生物化學(xué)或基因技術(shù)方法產(chǎn)生的抗體。產(chǎn)生這樣的分子的方法對于本領(lǐng)域技術(shù)人員是公知的。產(chǎn)生所述抗體的方法不是重要的。只有對于細胞膜抗原的相關(guān)表位的結(jié)合特異性是重要的。優(yōu)選地，使用單克隆抗體，最優(yōu)選動物源的單克隆抗體，特別是鼠源。特別優(yōu)選的是使用鼠類單克隆抗體HE-2，其可以如所述產(chǎn)生，或者具有和HE2一樣的好的結(jié)合特異性的抗體。在本發(fā)明含義中，術(shù)語“抗體”也包括抗體的片段和衍生物，其中這些片段或衍生物識別TAA。通過這些抗體的結(jié)合區(qū)，即通過它們的獨特型，確定用合適的針對TAA的抗體接種誘導(dǎo)的治療有效的免疫應(yīng)答。因此，原理上也可以使用這些抗體的片段或衍生物代替完整抗體來成功接種，只要這些衍生物仍然包含各起始抗體的獨特型。作為實例，不是限制性的，可以列出F(ab)’2片段，F(xiàn)(ab)’片段，F(xiàn)v片段，其可以通過公知的生物學(xué)方法(酶解)或者通過分子生物學(xué)公知的方法產(chǎn)生。其它的實例是抗體的衍生物，其可以根據(jù)公知的化學(xué)，生物化學(xué)或基因技術(shù)方法產(chǎn)生。在本說明書中，術(shù)語“衍生物”，特別地，還包括可以通過抗體(抗體片段)與可以增強免疫應(yīng)答的分子的化學(xué)鍵合產(chǎn)生的產(chǎn)物，所述分子是例如破傷風(fēng)類毒素，假單孢菌外毒素，脂質(zhì)A的衍生物，GM-CSF，IL-2，或者通過抗體(抗體片段)與脂質(zhì)的化學(xué)鍵合以更好地摻入脂質(zhì)體制劑中。術(shù)語“衍生物”也包括抗體(抗體片段)與可以增強免疫應(yīng)答的多肽的融合蛋白，其已經(jīng)用基因技術(shù)產(chǎn)生出來，所述多肽例如GM-CSF，IL-2，IL-12，C3d等。根據(jù)本發(fā)明所述抗體當(dāng)然也可以相互組合使用。這意味著可以施用識別不同膜抗原或相同膜抗原的不同表位的兩個或多個抗體?？梢酝瑫r(一起或分開)或依次施用不同抗體。癌細胞經(jīng)常在相同時間表達幾種TAA，對于這些TAA，接種用合適的抗體是可得到的或者可以產(chǎn)生。為了獲得增強的或可能協(xié)同的誘導(dǎo)的免疫應(yīng)答的效果并且使抗原陰性變體的選擇的潛在危險最小化以及為了對抗可能的腫瘤細胞異質(zhì)性，同時使用兩種或多種合適的抗體或者它們的片段或衍生物的組合接種可能是有利的。
在本發(fā)明說明書中，術(shù)語“接種”指自動免疫接種，即由于(例如皮下，皮內(nèi)，肌內(nèi)，可能還有口服，鼻)施用少量的一種合適的免疫原制劑中的一種抗原(被接種個體識別作為外來的并且因此是免疫原性的一種物質(zhì))而誘導(dǎo)特異性免疫應(yīng)答。因此為了建立起抗該抗原的一種特異性免疫應(yīng)答，將該抗原用作免疫系統(tǒng)的“引發(fā)劑”。原則上，所需抗原的量可以非常小(一些疫苗每接種劑量只含有大約5-10微克抗原)。
自動免疫接種的特征在于劑量-效果曲線在寬范圍內(nèi)只極小依賴于施用的抗原的量。這意味著免疫應(yīng)答在寬范圍劑量內(nèi)大體上相同。作為結(jié)論，在接種情況下，期望的效果，即免疫應(yīng)答的誘導(dǎo)，使用非常小量的抗原就已經(jīng)可以實現(xiàn)。但是也可以以可比較的方式使用大得多的量的抗原實現(xiàn)。當(dāng)然一般期望使用盡可能低劑量，特別是著眼于副作用，材料的消耗等來說，這對于接種來說是重要的。
在本發(fā)明的意義中，原理上可以以治療意義和預(yù)防意義(這是使用所有抗微生物疫苗的情況)進行接種。這指根據(jù)本發(fā)明的抗癌癥接種可以理解為治療和預(yù)防兩種應(yīng)用。因此，任選地，通過對沒有患有癌癥的個體接種，可能實現(xiàn)抗癌癥疾病發(fā)生的預(yù)防保護作用?？梢詫ζ涫┯眠@樣的預(yù)防接種的個體是具有發(fā)生癌癥疾病的增加的危險的個體，但是該應(yīng)用不局限于這樣的個體。
根據(jù)本發(fā)明的用途大大不同于迄今為止已知的并且早期描述過的治療癌癥的抗體治療應(yīng)用的基礎(chǔ)可能性并且?guī)眍A(yù)想不到的有效治療。
抗TAA抗體的結(jié)合區(qū)可以代表根據(jù)“鎖和鑰匙”原理的各TAA的結(jié)合表位的結(jié)構(gòu)互補圖。這指這樣一種抗體在其獨特型中具有其定向抵抗的TAA表位的結(jié)構(gòu)信息。因此，如果用抗TAA的合適的免疫原抗體(例如用抗TAA鼠類MAB)對癌癥患者接種，則在患者體內(nèi)產(chǎn)生抗體，其部分針對用作疫苗的抗體的獨特型，并且其可以根據(jù)“鎖和鑰匙”原理在結(jié)構(gòu)上模擬TAA的表位。這意味著由于這樣的接種，也就是說，在癌癥患者體內(nèi)產(chǎn)生TAA表位的可溶性變體，其作為自動誘導(dǎo)的自身抗體一樣在長期內(nèi)有效并且以合適的間隔通過反復(fù)接種可以加強其滴度。
在一個優(yōu)選的實施方案中，人細胞膜抗原是在粘著過程中起作用的結(jié)構(gòu)。在本說明書中，粘著過程優(yōu)選是細胞-細胞-相互作用，其中涉及細胞表面上的配體或受體。因此，粘著分子是起著細胞-細胞-相互作用功能的細胞表面上的配體或受體。這樣的粘著分子的一個亞組是自身-粘著分子。這些具有能結(jié)合其自身的性質(zhì)。
用針對TAA的抗體接種而誘導(dǎo)的免疫應(yīng)答的生理效果自然取決于各TAA的功能。例如，如果TAA具有受體粘著腫瘤細胞的功能，特別是對于血管系統(tǒng)的內(nèi)皮細胞上的配體(這樣的性質(zhì)對于腫瘤細胞從血管系統(tǒng)中出來散播和在組織中滯留形成轉(zhuǎn)移的能力是重要的)，通過用針對該TAA的合適的抗體接種降低該粘著能力，因為誘導(dǎo)的抗體，因為它們模擬可溶形式的TAA，其將競爭TAA與其配體的相互作用，在循環(huán)和組織中將永久性存在。
一般來說，根據(jù)上述解釋，通過用抗TAA的合適的抗體接種可能實現(xiàn)，所述抗體對于腫瘤細胞的惡性有功能，誘導(dǎo)的免疫應(yīng)答干擾其與其配體的相互作用中的TAA的功能，并且阻礙和防止該相互作用。這意味著癌癥細胞不能或不足以表達對于惡性表型重要的性質(zhì)，這使得可能減緩或中止疾病的發(fā)展，并且抑制轉(zhuǎn)移的發(fā)展，特別是在早期階段。
在另一個優(yōu)選的實施方案中，細胞膜抗原能自身粘著，即該抗原的一些表位負責(zé)與另一個細胞上相同抗原的同嗜性粘著結(jié)合。這樣的抗原的例子特別是N-CAM(神經(jīng)細胞粘著分子)，CEA(癌胚抗原)和Ep-CAM(上皮細胞粘著分子)。針對在該功能中涉及的自身粘著抗原的表位的抗體如上所述可以包含與這樣一個表位互補的結(jié)構(gòu)信息。通過用這樣的抗體接種，因此有可能如上所述誘導(dǎo)在結(jié)合反應(yīng)中具有這種自身粘著性質(zhì)的抗體的形成。這意味著這樣誘導(dǎo)的抗體接著可以結(jié)合所述自身粘著抗原，因為在這樣一種情況下，受體和配體是相同的。因此，有可能通過用針對自身粘著抗原的合適的抗體對癌癥患者接種來誘導(dǎo)免疫應(yīng)答，其中所述免疫應(yīng)答接著直接結(jié)合腫瘤細胞，從而引發(fā)各種治療作用。一方面，對惡性細胞重要的自身粘著的能力被阻斷，另一方面，人效應(yīng)子功能，例如互補-依賴性溶解和/或由于細胞毒性效應(yīng)子細胞的激活的溶解，可以通過被誘導(dǎo)的抗體與腫瘤細胞的結(jié)合而引發(fā)，所述結(jié)合導(dǎo)致腫瘤細胞的破壞。
通過上述所有的機理和作用，可以抑制新的轉(zhuǎn)移的形成，并且由于用抗TAA的合適的抗體對腫瘤患者接種而使疾病的擴散至少減緩。在疾病的早期，例如在原發(fā)腫瘤成功手術(shù)之后(輔助階段)，由于這樣的接種而防止保留擴散的腫瘤細胞將它們自身建立為新的轉(zhuǎn)移病灶。這使得延長不復(fù)發(fā)的存活期并且因此延長這樣的患者的總的壽命。任選地，由于這樣的接種和以合適的間隔進行的加強免疫而可能獲得抗轉(zhuǎn)移形成的延長壽命的保護作用。特別令人感興趣的是用針對自身粘著TAA的合適的抗體對癌癥患者接種，如上所述，因為在這些情況下，由于被誘導(dǎo)的免疫應(yīng)答在腫瘤細胞上另外的直接進攻而可能實現(xiàn)增強的治療效果。
在另一個優(yōu)選的實施方案中，根據(jù)本發(fā)明的應(yīng)用制備的藥物組合物除去該抗體含有至少一種在疫苗制劑中通常使用的佐劑。這樣的佐劑有可能增強免疫應(yīng)答。作為佐劑的實施例，但是不局限于此，可以列出下面的物質(zhì)氫氧化鋁(Alu凝膠)，脂多糖的衍生物，BacillusCalmette Guerin(BCG)，脂質(zhì)體制劑，有另外的抗原的制劑，針對該所述抗原免疫系統(tǒng)已經(jīng)產(chǎn)生了強的免疫應(yīng)答，例如破傷風(fēng)類毒素，假單孢菌外毒素，或者流感病毒的成分，任選地在脂質(zhì)體制劑之中，生物佐劑，例如粒細胞巨噬細胞刺激因子(GM-CSF)，白細胞介素2(IL-2)或γ干擾素(IFNγ)。
在另一個優(yōu)選的實施方案中，根據(jù)本發(fā)明的應(yīng)用制備的藥物組合物適合以0.01至4毫克抗體的劑量，優(yōu)選0.5毫克抗體的劑量用于接種。
可以通過單次施用上述劑量進行接種。但是，優(yōu)選通過反復(fù)施用進行接種。反復(fù)的次數(shù)在每年1至12次的范圍內(nèi)，更優(yōu)選在每年4至8次的范圍內(nèi)。劑量可以保持相同或者可以減少。
可以以有規(guī)律的間隔進行加強接種，原則上，終身加強。合適的間隔是6至24個月的范圍內(nèi)，并且可以通過監(jiān)測誘導(dǎo)的抗體的滴度來確定(只要誘導(dǎo)的抗體的滴度明顯降低就應(yīng)該進行加強接種)。
根據(jù)本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的方法可以進行抗體的施用。優(yōu)選地，含有抗體的藥物組合物適合皮下，皮內(nèi)或肌內(nèi)施用。
本發(fā)明進一步涉及識別腫瘤-相關(guān)抗原的抗體在抗癌癥疾病的接種中的用途，并且涉及通過接種來治療癌癥疾病的方法，其中以足以接種的量對患者施用識別TAA的一種或多種抗體。對于定義和優(yōu)選的實施方案，和與根據(jù)本發(fā)明的用途相關(guān)的上述的一樣。
針對TAA的抗體或者它們的衍生物或片段作為疫苗的用途實質(zhì)性地不同于這樣的抗-TAA抗體用于被動免疫治療的已知應(yīng)用。與被動抗體免疫治療相比，根據(jù)本發(fā)明的用途的幾個主要優(yōu)點總結(jié)如下用于癌癥被動免疫治療的針對TAA的抗體-高劑量(大于等于100毫克/靜脈內(nèi)輸入)-由于有效物質(zhì)的消除而帶來短的效果-由于免疫原性而帶來的不期望的異種抗體-治療的持續(xù)時間受到限制，特別是在異種抗體的情況下，由于誘導(dǎo)免疫應(yīng)答和反復(fù)施用情況下引起的過敏反應(yīng)的危險用于抗癌癥的預(yù)防性和/或治療性接種的針對TAA的抗體-低劑量(小于1毫克/接種；皮下，皮內(nèi)或肌內(nèi)注射)-直接誘導(dǎo)的免疫應(yīng)答的長期持續(xù)作用-因為該效果以免疫原性為基礎(chǔ)而帶來不期望的異種抗體-治療的持續(xù)時間沒有局限性(加強免疫總是可能的)下面將描述實驗，其證明用針對自身粘著TAA Ep-CAM的一些鼠類MAB(HE2)接種或者用其F(ab)’2片段接種，直接導(dǎo)致在表達該抗原的人腫瘤細胞上選擇性結(jié)合的抗體的誘導(dǎo)。作為實例而非任何限制，這證明，通過用針對自身粘著TAA的合適的抗體或者用它們的至少包含起始抗體的獨特型的衍生物接種誘導(dǎo)可以在癌癥疾病中具有治療作用的免疫應(yīng)答。
為了該目的，根據(jù)描述的雜交瘤技術(shù)的標(biāo)準方法(參見，例如，H.Zola.單克隆抗體技術(shù)手冊.CRC出版社，Inc.ISBN0-8493-6476-0；1988)產(chǎn)生鼠類單克隆抗體HE2。根據(jù)標(biāo)準方法用人結(jié)腸癌細胞免疫Balb/c小鼠。脾細胞與小鼠黑素瘤細胞系P3X63Ag8融合，篩選產(chǎn)生選擇性結(jié)合人結(jié)腸癌細胞但是不結(jié)合黑素瘤細胞的抗體的雜交瘤。最后篩選分泌IgG2a/K抗體的雜交瘤。例如，通過使用已知的抗-Ep-CAM抗體(KS1-4)作為比較，使用來自KATO III胃癌細胞的膜制劑的蛋白質(zhì)印跡分析，可以證明該抗體(HE2)結(jié)合Ep-CAM。MAB HE2的可變區(qū)的氨基酸序列如下重鏈Q(jìng)VQLQQSGAELVRPGTSVKVSCKASGYAFTNYLIEWVKQRPGQGLEWIGVINPGSGGTNYNEKFKGKATLTADKSSSTAYMQLSSLTSDDSAVYFCARDGPWFAYWGQGTLVTVSA(SEQ ID NO1)輕鏈NIVMTQSPKSMSMSVGERVTLTCKASENVVTYVSWYQQKPEQSPKLLIYGASNRYTGVPDRFTGSGSATDFTLTISSVQAEDLADYHCGQGYSYPYTFGGGTKLEIK (SEQID NO.2)


如下圖1說明體外MAB HE2對小細胞肺癌系SW2的自身粘著的抑制。
圖2說明體外沒有MAB HE2的影響的人小細胞肺癌系SW2的自身粘著作為圖1所示實驗的對照。
圖3說明根據(jù)ELISA測定的用HE2的F(ab)’2片段對山羊接種之后誘導(dǎo)的抗HE2的抗體免疫應(yīng)答。
圖4說明根據(jù)細胞-ELISA測定的用HE2的F(ab)’2片段對山羊接種之后誘導(dǎo)的抗Ep-CAM陽性人胃癌細胞(KatoIII)的抗體免疫應(yīng)答。
圖5說明根據(jù)細胞-ELISA測定的用HE2的F(ab)’2片段對山羊接種之后不存在抗Ep-CAM陰性人黑素瘤細胞(WM9)的抗體免疫應(yīng)答，以對于圖4所示實驗的對照進行。
圖6說明根據(jù)細胞-ELISA測定的用HE2的F(ab)’2片段對山羊接種的山羊血清的親和純化的抗體級分對Ep-CAM陽性人胃癌細胞(KatoIII)的結(jié)合。
圖7說明根據(jù)細胞-ELISA測定的自用HE2的F(ab)’2片段接種的山羊血清的親和純化的抗體級分對Ep-CAM陰性人黑素瘤細胞(WM9)的結(jié)合的不存在，以對于圖6所示實驗的對照進行。
圖8說明根據(jù)ELISA測定的用吸附于氫氧化鋁的0.5毫克HE2對獼猴接種之后誘導(dǎo)抗HE2的抗體免疫應(yīng)答。
圖9說明根據(jù)細胞-ELISA測定的用吸附于氫氧化鋁的0.5毫克HE2對獼猴接種之后誘導(dǎo)抗Ep-CAM陽性人胃癌細胞(KatoIII)的抗體免疫應(yīng)答。
圖10說明根據(jù)ELISA測定，與用吸附于氫氧化鋁的0.5毫克HE2對一組獼猴接種之后獼猴的毒性研究相關(guān)的檢測的抗HE2抗體免疫應(yīng)答的誘導(dǎo)，以及用沒有抗原(空白對照劑)的氫氧化鋁制劑處理另一組獼猴之后不存在抗HE2的免疫應(yīng)答。
圖11舉例說明根據(jù)細胞-ELISA測定的與用HE2的獼猴毒性研究相關(guān)的檢測的抗Ep-CAM陽性人胃癌細胞(KatoIII)的抗體免疫應(yīng)答的誘導(dǎo)。
圖12說明根據(jù)細胞-ELISA測定的，用吸附于氫氧化鋁的0.5毫克HE2對患有腸癌的患者反復(fù)接種之后抗Ep-CAM陽性人胃癌細胞(KatoIII)的抗體免疫應(yīng)答的誘導(dǎo)。
圖13說明根據(jù)細胞溶解實驗測定的，用吸附于氫氧化鋁的0.5毫克HE2對患有腸癌的患者反復(fù)接種之后抗Ep-CAM陽性人胃癌細胞(KatoIII)的血清細胞毒性的誘導(dǎo)。
下面的實施例是為了進一步詳細描述本發(fā)明而不應(yīng)該是對其的限制為了證明鼠類MAB HE2與同嗜性結(jié)合中涉及的自身粘著抗原Ep-CAM的表位結(jié)合，研究了HE2對人細胞系SW2的自身粘著的能力的影響。此小細胞肺癌細胞系趨向于在前面的一次接種之后幾小時之內(nèi)在體外培養(yǎng)基中形成細胞簇。實施例1中可以看到對該實驗的描述。如圖1和2所示，通過加入HE2，在很大程度上被預(yù)防抑制細胞簇的形成。這證明HE2與該膜蛋白質(zhì)的同嗜性結(jié)合中涉及的Ep-CAM的表位結(jié)合。
為了能研究對用鼠類MAB HE2的F(ab)’2片段接種的直接體液免疫應(yīng)答，用該片段免疫山羊。根據(jù)公知方法和用胃蛋白酶裂解HE2所述制備該片段，并純化。實施例2中描述了山羊的免疫。
首先，與前血清(pre-serum)相比較，對回收并合并的山羊免疫血清研究針對MAB HE2的免疫球蛋白，以測定被接種的山羊的總的免疫應(yīng)答。借助于ELISA測試進行該項研究，其實驗描述在實施例3中給出。圖3中給出該項實驗的結(jié)果由于用MAB HE2的F(ab)’2片段接種，山羊產(chǎn)生了對其的強的免疫應(yīng)答，而在前血清中沒有發(fā)現(xiàn)抗HE2抗體。
下面研究是否可能檢測山羊免疫血清中的與表達TAA的人癌細胞結(jié)合的免疫球蛋白，MAB HE2針對所述TAA(Ep-CAM)。為了該目的，使用了胃癌細胞系KATO III。也試驗了與不表達Ep-CAM(WM9黑素瘤細胞)的人細胞系的結(jié)合作為對照。借助于細胞-ELISA(cell-ELISA)測試進行該項研究。其實驗描述在實施例4中給出。圖4和5中給出該項實驗的結(jié)果山羊免疫血清含有與Ep-CAM陽性KATO細胞強結(jié)合的免疫球蛋白，而對于Ep-CAM陰性WM9細胞沒有檢測到結(jié)合。前血清不含有與這些細胞結(jié)合的抗體。這個非常出人意料的結(jié)果證明通過用HE2-F(ab)’2片段接種產(chǎn)生的抗體確實能將它們自身再次與表達HE2識別的TAA的細胞結(jié)合。結(jié)果，自身粘著的TAA的功能可以轉(zhuǎn)移給通過用HE2接種產(chǎn)生的抗體，如同前面已經(jīng)詳細描述的。
為了證明由于用HE2的F(ab)’2片段接種而在山羊中產(chǎn)生的針對此MAB的獨特型的抗體確實是與KATO細胞結(jié)合的那些，借助于原理如(美國國家科學(xué)院院刊81(1984)，216)所述的免疫親和色譜法的順序從山羊免疫血清特異性純化這些誘導(dǎo)的抗體的抗獨特型部分。純化步驟的順序也總結(jié)于實施例中。
再次對這些親和純化的山羊抗體測定它們與Ep-CAM陽性KATO細胞以及對Ep-CAM陰性WM9細胞的結(jié)合。其實驗描述在實施例6中給出。圖6和7中給出了這些實驗的結(jié)果針對HE2的獨特型的山羊IgG與Ep-CAM陽性KATO細胞強結(jié)合，而非特異性山羊IgG幾乎不結(jié)合。但是，親和純化的特異性山羊IgG與Ep-CAM陰性WM9細胞的結(jié)合與非特異性山羊IgG沒有不同。因此證明由于用HE2的F(ab)’2片段接種而直接產(chǎn)生的并且針對該抗體的獨特型的抗體的級分包含與表達HE2識別的TAA的癌細胞結(jié)合的抗體。通過該實驗，也結(jié)論性地證明通過用HE2接種誘導(dǎo)的抗Ep-CAM陽性細胞的抗體不是在一些公開出版物(參見，例如Cancer Immunol.Immunother.42(1996)，81-87)中設(shè)定的雙自身獨特型網(wǎng)絡(luò)級聯(lián)的結(jié)果，因為這樣的抗獨特型抗體(Ab3)根本不能通過在Ab1(＝HE2)柱上親和層析而純化，因為根據(jù)獨特型網(wǎng)絡(luò)，它們不能結(jié)合Ab1而只能結(jié)合Ab2。
著眼于用HE2的F(ab)’2片段免疫山羊的上述結(jié)果，為了證實與人緊密相關(guān)的物種中的免疫學(xué)結(jié)果，也使用獼猴進行了接種研究。對于這些實驗，使用完整鼠類MAB HE2作為免疫原。假設(shè)作為大的異種蛋白質(zhì)的鼠類Fc部分也增強抗獨特型的免疫應(yīng)答(載體作用)。為了避免可能的局部副作用，使用氫氧化鋁作為溫和佐劑。實施例7描述了用于這些接種實驗的制劑的制備。
在4只獼猴的背部皮下注射實施例7中描述的制劑(每次接種0.5毫克HE2＝0.5毫升，以4星期的間隔施用兩次)。為了回收血清，在幾個時間點采取血液。
首先，在ELISA中測定抗HE2的免疫應(yīng)答。實施例8中給出了該項實驗的描述。如圖8所示，在第29天就已經(jīng)測到抗HE2的抗體的顯著滴度。
此外研究了通過該接種是否誘導(dǎo)與KATO III細胞結(jié)合的抗體。對于這些試驗，使用了細胞-ELISA。實施例9中給出了實驗描述。如圖9所示，所有的動物在第29天就已經(jīng)誘導(dǎo)了與Ep-CAM陽性KatoIII腫瘤細胞結(jié)合的抗體。
下面與使用獼猴的毒性研究相關(guān)用吸附于氫氧化鋁的HE2對4只動物接種。另外4只獼猴接受了氫氧化鋁作為空白對照劑。實施例10和11描述了該制劑的制備。總之，在獼猴的背部皮下注射四次0.5毫升各各制劑(有效物質(zhì)或空白對照劑)(第1，15，29和57天)。為了回收血清，在開始研究之前和在處理期間不同的時間點取血。
也是首先在ELISA中測定抗HE2的免疫應(yīng)答。實施例8中給出了實驗描述。如圖10所示，在一次接種之后所有4只HE2組的獼猴就已經(jīng)產(chǎn)生了明顯的抗HE2的體液免疫應(yīng)答，通過第二次接種進一步加強，而空白對照劑組的獼猴抗HE2抗體的滴度沒有表現(xiàn)出任何增加。
通過HE2組的獼猴的第43天的血清的免疫親和純化進一步證實這些發(fā)現(xiàn)。實施例12給出了該實驗描述。如下面表中所示，在第43天，所有4只獼猴在它們的血清中都產(chǎn)生了強的抗HE2的IgG免疫應(yīng)答(再次免疫應(yīng)答)，而IgM部分比得上前血清。
也研究了抗Ep-CAM陽性Kato III細胞的抗體的誘導(dǎo)。再次使用細胞-ELISA用于這些試驗。實施例9給出了該實驗描述。如圖11例示的，在第29天，HE2組的獼猴就已經(jīng)產(chǎn)生了抗Kato III細胞的抗體。
從山羊和獼猴的上述接種結(jié)果來看，在一些情況下，下面用吸附于氫氧化鋁的MAB HE2對有轉(zhuǎn)移的腸癌患者(Dukes D)接種。實施例7描述了該制劑的制備?？傊?，上限用0.5毫升的該制劑(相當(dāng)于0.5毫克HE2)對患者皮下注射四次(第1，50，78，114)。在每一次接種之前和在第28天為了回收血清而取血。首先，研究通過接種是否誘導(dǎo)了結(jié)合KATO III細胞的抗體。對于這些試驗再次使用細胞-ELISA。實施例9中給出了實驗描述。如圖12給出了這些實驗的結(jié)果。由于接種，該癌癥患者體內(nèi)明顯誘導(dǎo)了高滴度的結(jié)合KATO III細胞的抗體。
而且，研究了用HE2接種誘導(dǎo)的抗體是否離體介導(dǎo)抗KATO III癌細胞的細胞毒性作用。為了該目的，為了證明誘導(dǎo)的抗體介導(dǎo)補體-依賴性裂解，將KATO III細胞與該癌癥患者的前-和免疫血清一起孵育。實施例13中給出了實驗描述。
圖13給出了結(jié)果。用HE2接種誘導(dǎo)的抗體通過自身患者血清中補體-依賴性溶解顯然能破壞Ep-CAM陽性Kato III細胞。
上述實驗例示性證明，用抗自身粘著TAA的合適的抗體，例如Ep-CAM，或者其和各起始抗體具有相同的獨特型的衍生物接種引發(fā)體液免疫應(yīng)答，其在表達該自身粘著TAA的腫瘤細胞上選擇性結(jié)合。這種誘導(dǎo)的抗體可以表現(xiàn)出抗這樣的腫瘤細胞的細胞毒性潛力。用這樣的抗體接種因此可以導(dǎo)致對癌癥疾病的治療效果。
實施例使用的材料微量滴定板用于ELISA的Immuno Plate F96 MaxiSorp(Nunc)用于細胞-ELISA的Cell Culture Cluster(Costar；Cat.Nr.3598)細胞系SW2人小細胞肺癌系，Ep-CAM陽性KATO III人胃癌細胞系，Ep-CAM陽性(ATCC HTB 103)WM9人黑素瘤細胞系，Ep-CAM陰性偶聯(lián)緩沖液 0.1M碳酸氫鈉0.5M氯化鈉pH值8.0純化緩沖液APBS def0.2M氯化鈉pH值7.2純化緩沖液B0.1M甘氨酸/HCl0.2M氯化鈉pH值2.9培養(yǎng)基ARPMI1640+2g/l碳酸氫鈉100U/ml青霉素G100微克/ml硫酸鏈霉素4mM谷氨酰胺10％胎牛血清(熱滅活)結(jié)合緩沖液 15mM碳酸鈉35mM碳酸氫鈉3Mm NaN3
pH值9.6PBS缺陷(PBS deficient)138mM氯化鈉1.5mM磷酸二氫鉀2.7mM氯化鉀6.5mM磷酸氫二鈉pH值7.2固定溶液 0.1％的生理氯化鈉溶液中的戊二醛洗滌緩沖液A2％氯化鈉0.2％Triton X-100在PBS缺陷中洗滌緩沖液B0.05％PBS缺陷中的Tween20封閉緩沖液A5％胎牛血清(熱滅活)在PBS缺陷中封閉緩沖液B1％牛血清白蛋白0.1％NaN3在PBS缺陷中稀釋緩沖液A2％胎牛血清(熱滅活)在PBS缺陷中稀釋緩沖液BPBS缺陷染色緩沖液24.3mM檸檬酸51.4mM磷酸氫二鈉pH值5.0底物 40毫克鄰-苯二胺二鹽酸鹽100毫升染色緩沖液20微升H2O2(30％)終止溶液 4N硫酸實施例1將體外培養(yǎng)的SW2細胞離心并且將沉淀懸浮于培養(yǎng)基A中，并且調(diào)節(jié)到7×104細胞/毫升。在LabTek腔室中，0.1毫升的PBSdef與0.3毫升的細胞懸浮液混合或者0.1毫升的PBSdef與40微克HE2混合，然后與0.3毫升的細胞懸浮液混合(HE2的終濃度是100微克/毫升)。就在細胞懸浮液作為最后的成分加入之前，用移液管分開細胞?；旌虾罅⒓丛诘怪蔑@微鏡(放大100倍)中對各細胞懸浮液照相。接著，在37℃/5％CO2下將細胞懸浮液培養(yǎng)4小時后再次照相。
實施例2各自使用3毫升不充分PBS中1.5毫克F(ab)’2片段與3毫升弗氏完全佐劑(Difco)一起在多個位點皮內(nèi)接種兩只山羊。在第8天，和第1天一樣給與第一次加強接種，但是用弗氏不完全佐劑(Difco)。在第29天，以同樣的方式給與第二次加強接種。但是，沒有加入佐劑。在開始接種之前和第54天取血以回收血清用于產(chǎn)生的免疫應(yīng)答的分析。
實施例3在37℃下在微量滴定板的孔中將100微升等份的MAB HE2(在結(jié)合緩沖液中的10微克/毫升溶液)培養(yǎng)1小時。用洗滌緩沖液A將平板沖洗6次之后，向各孔中加入200微升封閉緩沖液A，并且將平板在37℃下培養(yǎng)30分鐘。如上所述沖洗平板之后，在37℃下在1∶100至1∶1000000在稀釋緩沖液A中稀釋的稀釋液中將待測定山羊血清100微升等份孵育1小時。如上所述沖洗平板之后，以在稀釋緩沖液A中1∶1000的稀釋度向各孔中加入100微升過氧化物酶-偶聯(lián)的兔抗-山羊-Ig抗體(Zymed)并且在37℃下培養(yǎng)30分鐘。平板用洗滌緩沖液A洗滌四次并且用染色緩沖液洗滌兩次。通過向各孔中加入100微升特異性底物來檢測抗體的結(jié)合，并且在大約10分鐘之后通過加入50微升中止溶液來中止染色反應(yīng)。通過在490nm(參考測定的波長是620nm)處測定光密度(OD)進行評價。
實施例4在+4℃下，以濃度為2×106細胞/毫升在培養(yǎng)基A中將含有100微升細胞懸浮液的待測細胞系的微量滴定板的控培養(yǎng)過夜。吸取上清液之后，室溫下每孔50微升固定液將平板培養(yǎng)5分鐘。吸取上清液之后，向每個孔中加入200微升封閉緩沖液B，并且在37℃下將平板孵育1小時。200微升洗滌緩沖液B洗滌兩次之后，以在稀釋緩沖液B中稀釋1∶10至1∶100在37℃下將100微升等份的待測定山羊血清孵育1小時。用100微升冰冷卻洗滌緩沖液B洗滌平板兩次之后，以在稀釋緩沖液A中稀釋1∶1000加入100微升過氧化物酶-偶聯(lián)的兔抗-山羊-Ig抗體(Zymed)并且在37℃下孵育45分鐘。用100微升冰冷卻洗滌緩沖液B洗滌平板三次。通過在每孔中加入100微升特異性底物來檢測抗體的結(jié)合，并且在大約10分鐘之后通過加入50微升中止溶液來終止染色反應(yīng)。通過在490nm(參考測定的波長是620nm)處測定光密度(OD)進行評價。
實施例5純化原理描述于美國國家科學(xué)院院刊81216，1984并且概括如下在第一步中，根據(jù)公知方法在DEAE陰離子交換柱上進行山羊血清中含有的總的IgG的純化。接著，針對HE2的F(ab)’2片段的恒定區(qū)的山羊抗體與免疫親和柱(CH-Sepharose4B，Pharmacia)結(jié)合，其中無關(guān)的鼠類IgG2a與所述免疫親和柱偶聯(lián)，而抗-獨特型山羊抗體的級分不與該柱結(jié)合。因此，在最后步驟中，該免疫親和層析的流通物與偶聯(lián)有HE2的免疫親和柱(CH-Sepharose4B，Pharmacia)結(jié)合。用pH2.8的緩沖液(0.1M甘氨酸/鹽酸)洗脫與該柱特異性結(jié)合的級分并且中和。用這種方法獲得的山羊IgG級分針對HE2的獨特型。
實施例6基本上用與實施例4描述的相同的方法進行該細胞-ELISA。不使用血清稀釋液，取而代之的是分別使用濃度為100微克/毫升至0.031微克/毫升的免疫親和-純化的山羊IgG和非特異性純化的山羊IgG。
實施例7室溫滅菌條件下小心將0.83毫升Alu-Gel的懸浮液(Serva提供的Alu-Gel S，2％懸浮液，品質(zhì)度用于疫苗制備的佐劑)與0.5毫升的于pH5.5PBS中的10毫克/毫升HE2和3.67毫升PBSdef一起攪拌1小時(HE2的終濃度1毫克/毫升；Alu-Gel S0.33％)。然后，以0.5毫升等份將該懸浮液滅菌裝入注射瓶中。
實施例8基本上用與實施例3描述的相同的方法進行該ELISA，除了使用過氧化物酶-偶聯(lián)的山羊-抗-人-Ig抗體(Zymed)來檢測結(jié)合的獼猴抗體。使用該試劑可以以和人抗體一樣的方法檢測獼猴抗體，因為人抗體和獼猴抗體的恒定區(qū)的序列同源性是大約98％。
實施例9基本上用與實施例4描述的相同的方法進行該細胞-ELISA，除了使用過氧化物酶-偶聯(lián)的山羊-抗-人-Ig抗體(Zymed)來檢測結(jié)合該細胞的獼猴抗體(或人抗體)。使用過氧化物酶-偶聯(lián)的山羊-抗-小鼠-IgG抗體(Zymed)來檢測鼠類HE2作為對照。
實施例10滅菌條件下，3.5毫升的HE2溶液(10毫克/毫升，于PBSdef.中，pH＝5.5中)與0.35毫升硫柳汞溶液(10毫克/毫升；Sigma)以及和27.25毫升生理鹽水混合，并且小心攪拌下加入到3.9毫升氫氧化鋁懸浮液(3％水溶液；Alhydrogel，Superfos Biosector，Denmark)中。然后在滅菌條件下將用這種方法獲得的0.6毫升懸浮液裝入去熱原玻璃管中，用帶有鋁蓋的橡膠塞密封。
實施例11用與實施例10描述的相同的方法制備空白對照制劑，除了使用0.35毫升生理氯化鈉溶液代替抗體溶液和3.5毫升PBDdef pH＝5.5和代替硫柳汞溶液。
實施例121克CH-Sepharose4B(Pharmacia)懸浮于30毫升1mM鹽酸中15分鐘。然后用1升1mM鹽酸和接著用200毫升偶聯(lián)緩沖液在燒結(jié)玻璃AG3過濾器上洗滌該凝膠。對大約0.5升偶聯(lián)緩沖液透析10毫克HE2(原種溶液10毫克/毫升)。在密封的容器中該溶液與凝膠懸浮液混合。凝膠緩沖液的比例1∶2導(dǎo)致懸浮液適合偶聯(lián)。室溫下將該懸浮液攪拌5.5小時。接著，通過用3×30毫升偶聯(lián)緩沖液洗滌來去除過量的配體。通過在室溫下與1M乙醇胺孵育1小時封閉留下的反應(yīng)基團。然后在室溫下將凝膠與0.1M Tris-HCl緩沖液pH＝8攪拌1小時。最后，用變化pH的緩沖液將凝膠洗滌3個循環(huán)。各循環(huán)包括0.1M乙酸鈉緩沖液pH4和0.5M氯化鈉，接著0.1M Tris-HCl緩沖液pH＝8和0.5M氯化鈉。凝膠在4℃下保存。
根據(jù)下面的說明進行自獼猴的血清的針對HE2的抗體級分的免疫親和純化在FPLC系統(tǒng)(Pharmacia)上進行免疫親和純化。將根據(jù)上述說明獲得的1毫升凝膠裝入PharmaciaHR5/5柱。用純化緩沖液A以1∶10稀釋0.5毫升血清。以1毫升/分鐘的速度將該溶液從柱頂部泵入并且用純化緩沖液A洗滌直到再次達到檢測器的UV基線(280nm)。然后用純化緩沖液B洗脫結(jié)合的免疫球蛋白，并且在用0.5M磷酸氫二鈉解吸之后立即中和該級分，并且加入0.02％NaN3。在大小排阻色譜柱(SEC，Zorbax250GF)上分析用該方法純化的50微升抗體級分，并且定量測定IgG和IgM部分。對于SEC，使用220mM磷酸緩沖液-H7+10％乙腈作為洗脫液。人IgG和人IgM作為SEC標(biāo)準，為了建立標(biāo)準校正曲線(峰面積對濃度)對它們以幾個濃度各自進行層析。使用標(biāo)準曲線通過線性回歸進行來自獼猴的親和純化抗體級分中IgG和IgM濃度的計算。濃度以每毫升使用的獼猴的血清的微克數(shù)計(微克/毫升)。
實施例13在進行該試驗的前一天，將KATO III細胞轉(zhuǎn)移到新鮮培養(yǎng)基A中并且在37℃/5％CO2下保存在細胞培養(yǎng)瓶中。第2天，第一次用51鉻標(biāo)記細胞。在37℃/5％CO2下，800微升培養(yǎng)基A中與100μCi Na251CrO4一起孵育5×106細胞。接著，用培養(yǎng)基A洗滌細胞，并且調(diào)節(jié)到2.5×105細胞/毫升的密度。將100微升等份的該細胞懸浮液移取到微量滴定板的孔中。加入100微升等份的待測定患者血清并且在37℃/5％CO2下孵育3小時(為了避免傷害互補物的活性，該血清在-80℃下保存，只是為了該測定而解凍)。使用Skatron-Harvesting-Press回收上清液，并且在γ-計數(shù)器中測定。作為結(jié)果，獲得“實驗釋放”的值。為了測定“總釋放”，如上所述處理細胞，其中用2％SDS，50mM碳酸鈉和10mM EDTA代替血清。通過用培養(yǎng)基A代替血清獲得“自發(fā)釋放”的值。如下計算結(jié)果％裂解＝(實驗釋放-自發(fā)釋放)/(總釋放-自發(fā)釋放)×100該試驗進行3次，并且指出單個結(jié)果的平均值和標(biāo)準偏差。
權(quán)利要求
1.針對人細胞膜抗原的抗體制備用于抗癌癥的預(yù)防性和/或治療性接種的藥物組合物的用途。
2.權(quán)利要求1的用途，其中細胞膜抗原是腫瘤-相關(guān)抗原。
3.權(quán)利要求1或2的用途，其中細胞膜抗原在粘著過程中起作用。
4.權(quán)利要求1-3任一項的用途，其中細胞膜抗原是上皮細胞的抗原。
5.權(quán)利要求1-4任一項的用途，其中細胞膜抗原能自身粘著。
6.權(quán)利要求5的用途，其中細胞膜抗原是Ep-CAM，N-CAM或CEA。
7.權(quán)利要求1-6任一項的用途，其中抗體是動物來源的。
8.權(quán)利要求1-7任一項的用途，其中抗體是單克隆抗體。
9.權(quán)利要求8的用途，其中抗體是鼠類單克隆抗體HE2。
10.權(quán)利要求1-8任一項的用途，其中抗體具有和抗體HE2一樣好的結(jié)合特異性。
11.權(quán)利要求1-10任一項的用途，其中針對不同細胞膜抗原或抗一種膜抗原的不同表位的兩種或多種抗體彼此組合使用。
12.權(quán)利要求1-11任一項的用途，其中藥物組合物還進一步包括至少一種疫苗佐劑。
13.權(quán)利要求1-12任一項的用途，其中藥物組合物適合以0.01至4毫克抗體范圍內(nèi)的劑量施用抗體。
14.權(quán)利要求1-13任一項的用途，其中藥物組合物適合通過皮下，皮內(nèi)或肌內(nèi)注射施用。
全文摘要
本發(fā)明涉及針對人細胞膜抗原的抗體用于抗癌接種的用途。
文檔編號A61K39/00GK1344167SQ00802764
公開日2002年4月10日 申請日期2000年1月12日 優(yōu)先權(quán)日1999年1月13日
發(fā)明者H·艾克特, H·羅比尼爾 申請人:伊格尼昂癌癥治療研發(fā)股份公司