專利名稱：S－亞硝基硫醇作為治療循環(huán)機(jī)能障礙的藥劑的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及具有血管舒張效果的青霉胺或谷胱甘肽的新型S-亞硝基硫醇衍生物，該衍生物可抑制血小板的凝集并因此適合用于制備治療循環(huán)系統(tǒng)機(jī)能障礙的藥物，特別是治療心血管水平的機(jī)能障礙。
此外據(jù)介紹，從醫(yī)學(xué)觀點(diǎn)來看，含有S-亞硝基硫醇基團(tuán)的特定衍生物具有有益的特性，因?yàn)樗鼈兡軌蛟谏矬w中釋放NO。
Radomski等在《英國(guó)藥理學(xué)雜志(Br.J.Pharmacol.)》(1992)107，745-749中描述了S-亞硝基谷胱甘肽(GSNO)化合物能夠抑制血小板的活性。
Golino等在《循環(huán)研究(Circulation Research)》71，No 6(1992)中描述了S-亞硝基半胱氨酸因其抗血栓形成作用而能夠抑制血小板的活性。
Smith等在Met.Find.Exp.Cline.Pharmacy.(1994)，16，5中描述了GSNO可產(chǎn)生較強(qiáng)的小動(dòng)脈松弛效果。
WO95/12394描述了肽的S-亞硝基加合物的用途，其中S-亞硝基-N-乙?；嗝拱?SNAP)可用作抗外傷引起的血管發(fā)炎保護(hù)劑。
WO95/07691描述了不同S-亞硝基硫醇，特別是GSNO，在治療和預(yù)防血小板作用和受損傷血管表面形成血栓中的用途。
WO93/09806描述了S-亞硝基化蛋白質(zhì)或氨基酸殘基，其能夠釋放NO，具有松弛肌肉系統(tǒng)的作用和對(duì)血小板凝集的抑制作用。
EP-B1-412699描述了具有以下通式的S-亞硝基硫醇 以及其作為抗心血管疾病、特別是抗高血壓治療劑和作為治療心絞痛藥劑的用途。屬于所說結(jié)構(gòu)式范圍內(nèi)的可能的化合物數(shù)量是巨大的并且說明書中僅直接描述了數(shù)十種產(chǎn)物。此外，僅公開了關(guān)于它們總體血管舒張效果的數(shù)據(jù)，而關(guān)于對(duì)血小板的活性只字未提。
上述文獻(xiàn)中描述的S-亞硝基硫醇本身并不能解決治療血管疾病、特別是心血管疾病中的所有復(fù)雜問題。因此，亟待開發(fā)更有潛力和更有效的新化合物。
此外，本發(fā)明的目的涉及新化合物在制備治療與循環(huán)系統(tǒng)機(jī)能障礙有關(guān)疾病、特別是心血管疾病的藥物中的用途。發(fā)明詳述本發(fā)明的化合物是青霉胺或谷胱甘肽的S-亞硝基硫醇衍生物及其藥用鹽，所說的化合物具有以下通式(I) 其中A和B是苯基或一起形成構(gòu)成六元環(huán)的殘基-CH2-Q-CH2-，其中Q表示氧原子、硫原子或基團(tuán)N-R3，其中R3是氫或C1-C4烷基；R1是?；鶜埢?，其可以是C1-C5脂族酰基，或者是通過其非氨基酸羧基連接的谷氨酸的殘基；R2是羥基或通過肽鍵連接的甘氨酸殘基；前提條件是如果R1是脂族?；鶜埢瑒tR2是羥基，并且如果R1是谷氨酸的殘基，則R2是甘氨酸殘基。
因此，本發(fā)明的化合物對(duì)應(yīng)于以下通式(II)或(III)或其藥用鹽 其中A和B具有如上所述的含義，并且R4是C1-C4烷基。
屬于本發(fā)明化合物的優(yōu)選實(shí)例如下N-乙酰基-2-氨基-2-[4-(4-S-亞硝基巰基四氫吡喃)乙酸(1)； N-乙?；?2-氨基-2-[4-(4-S-亞硝基巰基-1-甲基哌啶)]乙酸(2)； N-乙?；?2-氨基-3-芐基-3-S-亞硝基巰基-4-苯基-丁酸(2)； N[N-γ-L-谷氨?；?2-氨基-2-(4-(4-S-亞硝基巰基)四氫吡喃))乙酰基]-甘氨酸(4) N[N-γ-L-谷氨?；?2-氨基-2-(4-(4-S-亞硝基巰基-1-甲基-哌啶))乙?；鵠-甘氨酸(5) N[N-γ-L-谷氨?；?2-氨基-3-芐基-3-(-S-亞硝基巰基)-4-苯基丁?；鵠-甘氨酸(6)。 對(duì)熟悉本領(lǐng)域的技術(shù)人員來說，本發(fā)明化合物顯然包括手性中心，從而通過這個(gè)手性中心可以區(qū)分可能的異構(gòu)體和/或其混合物。應(yīng)當(dāng)理解，無論是異構(gòu)體混合物還是純異構(gòu)體，都屬于本發(fā)明的目的。后者可以由異構(gòu)體的混合物通過本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的常規(guī)技術(shù)或者通過也是本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的不對(duì)稱合成來獲得。
本發(fā)明的化合物可以按不同的方式來獲得，并且根據(jù)其基本結(jié)構(gòu)來選擇具體的方式。
例如，可以按照以下路徑所示的步驟順序獲得通式(II)的化合物
即從氨基酸的鹽酸化物開始，其可以根據(jù)已知的方法(例如參見DE-A-3023830和DE-A-2801849)來獲得，接著通過常規(guī)技術(shù)將氨基酸的氮基團(tuán)?；?，例如通過酰基氯，并且最后一步將亞硝基引入到硫醇的硫上，這也通過使用常規(guī)技術(shù)。
關(guān)于通式(III)的化合物，它們可以按照以下路徑所示的步驟順序來獲得 即從如上相同的氨基酸鹽酸化物開始，接著通過形成對(duì)甲基芐基的硫醚來保護(hù)巰基。接著通過已知的Boc技術(shù)保護(hù)氨基酸的氮，之后通過已知技術(shù)在固相中與其余的谷氨酸和甘氨酸(氨基酸的C-末端)形成三肽(例如參見Barany，G.等，肽(The Peptides)，2，1，Gross，E.Meienhofer，Eds.Academic Press，NY(1980)；Stewart，J.M.等，固相肽合成(Solid Phase Peptide Synthesis)Freeman，San Francisco，CA(1969)；Bodanszky，M.等，肽合成(Peptide Synthesis)第2版，Wiley，NY(1976))。
三肽的形成包括以下步驟a)以叔丁氧羰基(Boc)衍生物的形式，將氨基酸C-末端甘氨酸(Gly)結(jié)合到對(duì)甲基芐基羥(hydryl)胺/聚苯乙烯樹脂上；b)用三氟乙酸除去Boc基團(tuán)并且中和；c)摻入中間體保護(hù)的改性氨基酸；d)通過茚三酮評(píng)價(jià)偶聯(lián)反應(yīng)(Kaiser，E.等，分析生物化學(xué)(Anal.Biochem.)，34，595(1970))；e)對(duì)摻入作為Boc-衍生物或芐基保護(hù)的(Boc-Glu-OBzl)的殘余的γ-谷氨酸(γ-Glu)重復(fù)以上步驟；f)用無水HF酸解，使三肽脫保護(hù)并且從樹脂上釋放出來；g)純化并且表征最終產(chǎn)物。
當(dāng)三肽形成之后，進(jìn)行最后一步，將從其保護(hù)基團(tuán)中釋放出來的巰基亞硝基化。
所進(jìn)行的試驗(yàn)證明本發(fā)明的新型S-亞硝基化化合物具有血管舒張活性，該活性至少可與GSNO相當(dāng)，并且在某些情形中遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過GSNO。此外，它們對(duì)血小板凝集具有抑制效果，這種效果也類似或超過GSNO，在某些情形中明顯優(yōu)于后者。
這使得本發(fā)明的化合物可以非常有效地用于制造具有血管舒張和抗血栓形成效果的藥物，用以治療循環(huán)系統(tǒng)的機(jī)能障礙，特別是心血管和冠狀水平的機(jī)能障礙。
所以，可以通過使用常規(guī)藥學(xué)技術(shù)，使用通式(I)的化合物及其藥用鹽來制備可以按不同方式施用的藥物。
作為實(shí)施例，它們可以諸如片劑、膠囊、糖漿和懸浮液的藥物制劑形式口服給藥。以諸如溶液或乳液等形式非腸道給藥。它們還可以乳膏、香膏劑、香脂等的形式局部施用，并且經(jīng)皮給藥，例如通過使用貼片或繃帶。它們還可以作為栓劑直接在直腸中施用。制劑中可以含有生理學(xué)可接受的載體、賦形劑、活化劑、螯合劑、穩(wěn)定劑等。當(dāng)注射使用時(shí)，它們可以摻加生理學(xué)可接受的緩沖劑、增溶劑或等滲劑。日劑量可以根據(jù)患者的具體癥狀、年齡、體重、具體的給藥方式等來改變，并且成人的日正常劑量可以為0.1-500 mg，并且可以僅一次施用或者在一天內(nèi)分成幾份施用。
在工作實(shí)施例中(見下頁)將詳細(xì)描述獲得通式(I)各種化合物的適宜過程，在這些實(shí)施例的基礎(chǔ)上，通過適當(dāng)改進(jìn)本發(fā)明的工作實(shí)施例來獲得本發(fā)明沒有直接例舉的化合物屬于本領(lǐng)域技術(shù)人員的常識(shí)。
所以，本發(fā)明的工作實(shí)施例不應(yīng)當(dāng)理解為是對(duì)本發(fā)明范圍的限制，而僅僅是一種進(jìn)一步的詳細(xì)解釋，其引導(dǎo)本領(lǐng)域技術(shù)人員更深刻地理解本發(fā)明。
PyAOP7-氮雜苯并三唑-1-基-氧三(吡咯烷)鏻的六氟磷酸鹽TBuOH叔丁醇TFA 三氟乙酸起始氨基酸的鹽酸化物按德國(guó)專利申請(qǐng)DE-A-3023830和DE-A-2801849所述的方法合成。
核磁共振光譜在Varian Gemini-200設(shè)備上實(shí)現(xiàn)。
在1H-NMR光譜中，指出用以形成光譜的工作頻率和所用溶劑。信號(hào)的位置以δ(ppm)來表示，使用溶劑質(zhì)子的信號(hào)作為參比。氯仿的參比值為7.24ppm，氘二甲基亞砜的參比值為2.49ppm。在括號(hào)內(nèi)指出相當(dāng)于通過電子積分測(cè)定的各個(gè)信號(hào)的質(zhì)子數(shù)，并且使用以下簡(jiǎn)寫表示信號(hào)的類型s(單峰)，d(二重峰)，t(三重峰)，dd(雙二重峰)，sb(單寬峰)，sc(單復(fù)合峰)，d.e.D2O(在添加幾滴氘水后光譜確認(rèn)期間消失)。
在13C-MNR光譜中，指出各個(gè)光譜的工作頻率和溶劑。信號(hào)的位置以δ(ppm)來表示，使用溶劑質(zhì)子的信號(hào)作為參比。氯仿的參比值為77.00ppm，氘二甲基亞砜的參比值為39.50ppm。
此外，使用附加質(zhì)子試驗(yàn)(Attached Proton Test(APT))來完成核磁共振實(shí)驗(yàn)。
通過HPLC分析確定樣品純度在如下條件下進(jìn)行A-總梯度柱RP-C18，Symmetry 150×3.9 mm，5μ，100A流動(dòng)相H2O＋H3PO40.1％/CH3CN＋5％H2O＋0.1％H3PO4溫度室溫流速1mL/min注射體積10μLB-無梯度淋洗柱RP-C18，Symmetry 150×3.9 mm，5μ，100A流動(dòng)相50％H2O＋H3PO40.1％至50％CH3CN＋5％H2O＋0.1％H3PO4溫度室溫流速1mL/min注射體積10μL在三肽的制備中，使用制備型色譜和HPLC技術(shù)來純化粗產(chǎn)物并且通過質(zhì)譜法和氨基酸分析來證實(shí)識(shí)別產(chǎn)物。三肽的純度通過HPLC在以下條件下分析Nucleosyl，C18柱250×4mm，120A，10μm；流速1mL/min； 洗脫劑A＝H2O(+0.045％TFA)至B＝CH3CN(+0.036％TFA)。
紫外光譜(UV)通過使用Shimadazu UV-160A分光光度計(jì)來得到。對(duì)每種化合物，指出波長(zhǎng)(λ)按nm計(jì)，和分子吸收(ε)按cm-1mol-1L計(jì)。
對(duì)高壓液相色譜法(HPLC)，使用紫外線光電二極管Hewlett-Packard 1040 A檢測(cè)器。實(shí)施例1制備N-乙?；?2-氨基-2-[4-(4-S-亞硝基巰基四氫吡喃)]乙酸(1) 步驟1) 在250mL裝有磁力攪拌器的玻璃燒瓶中，加入4.0g(17.6mmol)2-氨基-2-(4-(4-巰基四氫吡喃))乙酸的鹽酸化物和60mL0.5N氫氧化鉀溶液。之后加入3.07g(21.8mmol)無水碳酸鉀和60mLMeCN。將混合物在冰浴中冷卻，并且逐滴加入1.42mL(19.7mmol)溶于25mL MeCN中的乙酰氯。滴加完畢，加入0.5N氫氧化鉀直至pH 9-10。將該混合物在室溫下攪拌2小時(shí)。之后加入2N鹽酸直至pH＝6，并且減壓除去溶劑。將獲得的固體經(jīng)五氧化二磷真空干燥，并且懸浮于150mL純EtOH中并在室溫下攪拌。過濾出不溶物并且用純EtOH洗滌。減壓除去溶劑。獲得3.98g粗制中間產(chǎn)物N-乙酰基-2-氨基-2-[4-(4-巰基四氫吡喃)]乙酸，經(jīng)多次反相制備型色譜制備，獲得80mg純度90％的產(chǎn)物(HPLC梯度A，λ＝205nm)。
1H-NMR(200 Mhz，DMSO-d6)7.40(1H，d，J＝10Hz，NH)，4.13(1H，d，J＝10Hz，CH)，3.75-3.50(4H，s.c.，CH2)，1.90-1.80(4H，s.c.，CH2)，1.65(3H，s，CH3).
13C-NMR(50Mhz，DMSO-d6)171.50(CO-N)，168.90(CO)，63.69(CH2)，63.27(CH2)，62.80(CH)，49.18(C)，37.58(CH2)，36.12(CH2)，23.01(CH3).
步驟2) 將80mg(0.34mmol)N-乙?；?2-氨基-2-(4-(4-巰基四氫吡喃))乙酸溶解于4000μL MeOH中，之后加入500μL 1N HCl溶液和136μL 5M NaNO2溶液。將所得溶液在超聲浴中處理1分鐘，之后加入50μL 10N NaOH和14μL H2O。
從所得的溶液中，分離出470μL的等分部分A，并且向剩余部分添加充足的水，冷凍并且凍干，獲得190mg吸濕性固體B，其略微潮濕。
HPLC(梯度A)λ220nm餾分A的純度68％λ339nm餾分A的純度95％。
餾分B的NMR數(shù)據(jù)
1H-NMR(200Mhz，DMSO-d6)8.OO-7.50(1H，s.c.，NH)，4.50-4.00(1H，s.c.，CH)，3.80-3.40(4H，s.c.，CH2)，2.40-1.80(4H，s.c.，CH2)，1.88(3H，s，CH3).
13C-NMR(50Mhz，DMSO-d6)173.00(CO)，169.52(CO)，67.69(CH2-O)，63.45(CH)，53.78(C)，32.17(CH2)，22.80(CH3).
實(shí)施例2制備N-乙?；?2-氨基-2-[4-(4-S-亞硝基巰基-1-甲基哌啶)]乙酸⑵ 步驟1) 在250mL裝有磁力攪拌器的玻璃燒瓶中，加入3.69g(13mmol)2-氨基-2-[4-(4-巰基-1-甲基哌啶)]乙酸二鹽酸化物和30mL0.5N氫氧化鉀溶液。之后加入2.2g(16mmol)無水碳酸鉀和30mLMeCN。將混合物在冰浴中冷卻，并且逐滴加入1.0mL(14mmol)溶于10mL MeCN中的乙酰氯。滴加完畢，加入0.5N氫氧化鉀直至pH9-10。將該混合物在室溫下攪拌2小時(shí)。之后加入2N鹽酸直至pH＝6，并且減壓除去溶劑。將獲得的固體經(jīng)五氧化二磷真空干燥，并且將干燥的固體懸浮于100mL純EtOH中并且在室溫下攪拌。過濾出不溶殘余物并且用純EtOH洗滌。減壓除去溶劑。獲得2.8g粗制中間產(chǎn)物N-乙?；?2-氨基-2-[4-(4-巰基-1-甲基哌啶)]乙酸，經(jīng)多次反相制備型色譜制備，獲得0.5g純度99％的產(chǎn)物(HPLC梯度A，λ＝205nm)。
1H-NMR(200Mhz，DMSO-d6)8.35(1H，d，J＝10Hz，NH)，4.43(1H，d，J＝10Hz，CH)，3.35-3.00(4H，s.c.，CH2)，2.70(3H，s，CH3)，2.20-1.90(4H，s.c.，CH2)，1.85(3H，s，CH3).
13C-NMR(50Mhz，DMSO-d6)170.55(CO-N)，170.05(CO)，61.77(CH)，49.33(CH2)，49.28(CH2)，46.38(C)，42.26(CH3)，33.05(CH2)，33.14(CH2)，22.42(CH3).
步驟2) 將50mg(0.20mmol)N-乙?；?2-氨基-2-[4-(4-巰基-1-甲基哌啶)]乙酸溶解于800μL 1N HCl中，之后加入80μL 5M NaNO2溶液。將所得溶液在超聲浴中處理1分鐘，之后加入80μL 10N NaOH和40μL H2O。
從所得的溶液中，分離出100μL的等分部分A并且將剩余部分冷凍并且凍干，獲得190mg固體B。
HPLC(梯度A)λ220nm餾分A的純度90％，餾分B的純度93％λ334nm餾分A的純度98％，餾分B的純度98％餾分B的NMR數(shù)據(jù)1H-NMR(200 Mhz，D2O)4.71(1H，s，CH)，2.70-2.20(8H，sc，CH2)，1.95(3H，s.，CH3-N)，1.71(3H，s，CH3-CO).
13C-NMR(50Mhz，D2O)172.51(CO)，171.52(CO)，61.08(CH)，58.18(C)，48.09(CH2-N)，48.01(CH2-N)，42.18(CH3-N)，30.44(CH2)，29.85(CH2)，20.17(CH3-CO).
實(shí)施例3制備N-乙?；?2-氨基-3-芐基-3-S-亞硝基巰基-4-苯基-丁酸(3)
步驟1) 在100mL裝有磁力攪拌器的玻璃燒瓶中，加入2.0g(5.9mmol)2-氨基-3-芐基-3-巰基-4-苯基-丁酸和20mL 0.5N氫氧化鉀溶液。之后加入1.0g(7.2mmol)無水碳酸鉀和20mL MeCN。將混合物在冰浴中冷卻，并且逐滴加入0.5mL(6.5mmol)溶于8mL MeCN中的乙酰氯。滴加完畢，加入0.5N氫氧化鉀直至pH12-13。將該混合物在室溫下攪拌2小時(shí)。之后加入2N鹽酸直至pH＝6，并且減壓除去溶劑。將獲得的粗產(chǎn)物懸浮于100mL純EtOH中并且在室溫下攪拌。過濾出不溶殘余物并且用純EtOH洗滌。減壓除去溶劑。將殘余物在水中重結(jié)晶。過濾不溶部分并且棄掉。將濾液冷凍并且凍干，獲得1.64g中間產(chǎn)物，N-乙酰基-2-氨基-3-芐基-3-巰基-4-苯基-丁酸，產(chǎn)率81％。
1H-NMR(200Mhz，DMSO-d6)7.68(1H，d，J＝8Hz，NH)，7.35-7.05(10H，sc，CHar)，4.36(1H，d，J＝8Hz，CH)，3.42-3.02(2H，sc，CH2-Car)，2.95-2.55(2H，sc，CH2)，1.82(3H，s，CH3)13C-NMR(50Mhz，DMSO-d6)172.94(CO-N)，169.08(CO)，138.55(Car)，138.16(Car)，132.36(2CHar)，131.89(2CHar)，127.78(2CHar)，127.53(2CHar)，126.44(CHar)，126.26(CHar)，60.16(CH)，55.62(C)，43.70(CH2)，42.94(CH2)，23.14(CH3).
步驟2) 將0.62g(1.8mmol)N-乙?；?2-氨基-3-芐基-3-巰基-4-苯基-丁酸溶解于25mL MeOH中，之后加入25mL 1N HCl和250mgNaNO2的25mL水溶液。將所得溶液在室溫下攪拌35分鐘，過濾并且用水洗滌。在P2O5的存在下減壓干燥后，獲得0.33g固體。
HPLC(無梯度淋洗B)λ220nm純度91％λ342nm純度100％。
1H-NMR(200Mhz，DMSO-d6)8.77(1H，d，J＝10Hz，NH)，7.28-7.00(10H，sc，CHar)，5.33(1H，d，J＝10Hz，CH)，4.12-3.90(2H，sc，CH2)，3.88-3.38(2H，sc，CH2)，1.86(3H，s，CH3)13C-NMR(50Mhz，DMSO-d6)171.55(CO-N)，169.67(CO-O)，135.51(Car)，135.27(Car)，131.52(CHar)，131.41(CHar)，128.15(CHar)，128.05(CHar)，127.04(CHar)，65.13(CH)，56.11(CH)，40.91(CH2)，40.15(CH2)，22.29(CH3).
實(shí)施例4制備N[N-γ-L-谷氨酰基-2-氨基-2-(4-(4-S-亞硝基巰基)四氫吡喃))乙?；鵠-甘氨酸(4) 步驟1) 在250mL裝有磁力攪拌器的玻璃燒瓶中，將5.8g(25.5mmol)2-氨基-2-(4-(4-巰基四氫吡喃))乙酸鹽酸化物、4.7g(25.5mmol)α-溴-對(duì)二甲苯和100mL H2O/EtOH的3∶1混合物混合。加入11mL三乙胺，建立氬氣環(huán)境，并且將混合物在室溫下攪拌18小時(shí)。再加入50mL 3∶1的H2O/EtOH并且將混合物再攪拌2小時(shí)。過濾所得的懸浮液并且用100mL水和50mL EtOH洗滌。獲得固體，減壓干燥。在固體上添加300mL濃鹽酸，并且減壓除去溶劑。再次重復(fù)該酸處理過程，獲得固體，將其減壓干燥。獲得1.59g所需的中間產(chǎn)物。
1H-NMR(200Mhz，DMSO-d6)8.80-8.30(3H，sb，H3N+)，7.26(2H，d，J＝8Hz，CHar)，7.12(2H，d，J＝8Hz，CHar)，4.03(1H，s，CH-N)，3.85-3.55(6H，sc，CH2-Car，CH2-O)，2.26(3H，s，CH3)，2.05-1.08(4H，sc，CH2).
13C-NMR(50Mhz，DMSO-d6)168.98(CO)，136.64(Car)，133.80(Car)，129.55(CHar)，129.29(CHar)，62.36(CH2-O)，59.85(CH-N)，49.15(C)32.03(CH2)，31.19(CH2)，30.84(CH2)，20.69(CH3).
步驟2) 將1004mg 2-氨基-2-(4-(4-(對(duì)甲基芐基巰基)四氫吡喃))乙酸的鹽酸化物(3.029mmol)懸浮于20mL的2∶1 tBuOH/H2O中，并且加入5％NaOH直至pH＝9。之后加入3當(dāng)量的Boc2O，并且讓混合物反應(yīng)30分鐘，之后再次將pH調(diào)整至pH＝9。反應(yīng)再延長(zhǎng)30分鐘，并且再次校正pH。通過使用薄層色譜法(TLC)與起始氨基酸比較證實(shí)反應(yīng)已完成。
通過用50mL己烷連續(xù)兩次萃取來分離產(chǎn)物，并且用pH＝2的1NHCl處理水相。之后進(jìn)行三次萃取，每次用60ml AcOEt。將AcOEt溶液用無水MgSO4干燥，并且通過蒸發(fā)除去溶劑之后，將產(chǎn)物再溶解于DCM中并且再次蒸發(fā)。該步驟再重復(fù)兩次，獲得1191mg(3.015mmol)N-Boc保護(hù)的中間產(chǎn)物。
該中間產(chǎn)物表征為a)TLC，用CHCl3/MeOH/AcOH 85∶10∶5作為流動(dòng)相。El Rf＝0.48，沒有觀察到起始原料的信號(hào)。
b)HPLC，10％-100％MeCN梯度淋洗30分鐘＋100％MeCN無梯度淋洗5分鐘。所得純度為96％(220nm)。
c)通過FAB技術(shù)的質(zhì)譜M計(jì)算＝395，(M＋H+)實(shí)驗(yàn)＝396.0d)NMR(CDCl3)7.18(2H，d，J＝8Hz)7.09(2H，d，J＝8Hz)，5.54(1H，d，J＝11.2Hz)，4.44(1H，d，J＝8.3Hz)，3.69(1H，d，J＝11.2Hz)，3.57(1H，d，J＝11.2Hz)，3.75-3.98(4H，sb)，2.32(3H，s)，1.26-2.19(4H，sb)，1.46(9H，s).
步驟3)通過固相合成技術(shù)制備三肽，由1595mg Boc-Gly-OCH2-Pam-樹脂(Neosystem，參考號(hào)RP00801)開始，其取代度為0.63mmol/g。操作規(guī)模為1.005mmol。
添加剩余氨基的基本方法如下1)用DCM洗滌5次，每次0.5分鐘，使樹脂溶漲；2)用存在于DCM中的40％TFA除去Boc基團(tuán)，1×1分鐘＋1×20分鐘；3)用DCM洗滌，5×0.5分鐘；4)通過茚三酮測(cè)試；5)用DMF洗滌，3×1分鐘；6)偶聯(lián)1.5小時(shí)；7)用DMF洗滌，3×1分鐘；8)用DCM洗滌，5×0.5分鐘；9)通過茚三酮測(cè)試。
當(dāng)最后一步通過茚三酮測(cè)試呈陽性時(shí)，重復(fù)步驟5-8進(jìn)行重偶聯(lián)。
使用6當(dāng)量DIEA、3當(dāng)量Boc-氨基酸和3當(dāng)量活化劑實(shí)現(xiàn)偶聯(lián)，此時(shí)活化劑是PyAOp(7-氮雜苯并三唑-1-基-氧三(吡咯烷)鏻的六氟磷酸鹽)。對(duì)于偶聯(lián)γ-Glu，使用Boc-Glu-(α-OBzl)。
中止偶聯(lián)程序，用HF/對(duì)甲酚(9∶1)在0℃下將所得的肽基樹脂酸解1小時(shí)。經(jīng)蒸發(fā)后，用無水EtOEt萃取固體殘余物，并且通過用10％AcOH萃取來分離肽。通過蒸發(fā)將體積降低之后，將粗產(chǎn)物凍干并且通過如下方法表征
a)HPLC，5％-65％MeCN梯度淋洗30分鐘。
b)通過電霧化技術(shù)的MSM計(jì)算＝377，(M＋H+)實(shí)驗(yàn)＝378.2。
通過氨基酸分析確定肽的量m＝329mg(0.873mmol)。在所有肽的定量分析中，向待水解樣品中添加Ile(異亮氨酸)的外標(biāo)。
按制備規(guī)模，通過HPLC純化三肽(分兩批)。所用的本系如下-柱C18，Nucleosyl，200×20mm，120，10μm-洗脫劑A＝H2O(+0.1％TFA)，B＝MeCN(+0.1％TFA)-梯度0％無梯度B淋洗40分鐘+0-10％梯度B淋洗40分鐘-流速25ml/分鐘。
獲得總量227mg(0.602mmol)的中間三肽，其表征為a)HPLC，5％-45％MeCN梯度淋洗20分鐘。所得純度為95％(220nm)。隨著逐漸稀釋所施加的樣品，8.4分鐘時(shí)的小峰以相對(duì)的比例降低，直至消失。因此，結(jié)論是其相應(yīng)于三肽的聚集(并且未氧化)，因此被認(rèn)為是有效的產(chǎn)物。
b)電霧化MSM計(jì)算＝377，(M＋H+)實(shí)驗(yàn)＝378.2。
步驟4)向14.2mg(0.38mmol)步驟3所獲得的三肽的800μL 1NHCl溶液中添加76μL 0.5M NaNO2溶液。室溫下在超聲浴中攪拌1分鐘，之后加入80μL 10N NaOH溶液。將所得的溶液冷凍并且凍干，所獲得的固體表征為1H-NMR(200Mhz，DMSO-d6)8.90-8.50(2H，sb，NH)，5.35(1H，d，J＝10Hz，CH)，4.10-3.00(3H，sc，CH2，CH)，1.95-1.65(4H，sc，2CH2).
13C-NMR(50Mhz，DMSO-d6)172.18(CO-N)，171.21(CO-N)，168.40(CO-O)，63.03(CH2)，62.31(C)，59.56(CH)，53.19(CH)，41.20(CH2)，32.94(CH2)，31.71(CH2)，31.41(CH2)，27.12(CH2).HPLC(方法A)λ220nm(純度94％)；λ334nm(純度95％)。UVλ346nm ε(H2O)502cm-1mol-1L實(shí)施例5制備N[N-γ-L-谷氨?；?2-氨基-2-(4-(4-S-亞硝基巰基-1-甲基-哌啶))乙酰基]-甘氨酸(5) 步驟1) 在100mL裝有磁力攪拌器的玻璃燒瓶中，將6.4g(23mmol)2-氨基-2-[4-(4-巰基-l-甲基哌啶)]乙酸的二鹽酸化物、4.3g(23mmol)α-溴-對(duì)二甲苯和40mL H2O/EtOH的1∶1混合物混合。加入13mL三乙胺，建立氬氣環(huán)境，并且將混合物在室溫下攪拌42小時(shí)。從所得溶液中減壓除去溶劑并且向所獲得的粗產(chǎn)物中加入20mL純EtOH。濾出所得的固體，并且連續(xù)用純EtOH和EtOEt洗滌，并且將其減壓干燥。獲得2.11g中間產(chǎn)物2-氨基-2-[4-(4-(對(duì)甲基芐基巰基)-1-甲基哌啶)]乙酸的鹽酸化物。產(chǎn)率29.6％。
在D2O中記錄NMR光譜并且取4.75ppm作為HDO的參照。
1H-NMR(200Mhz，D2O)7.28(2H，d，J＝8Hz，CHar)，7.15(2H，d，J＝8Hz，Char)，3.64-3.74(2H，sc，CH2-Car)，3.62(1H，s，CH-N)，3.4-3.1(4H，sc，CH2-N)，2.76(3H，s，CH3-N)，2.24(3H，s，CH3)，2.15-1.92(4H，sc，CH2).
13C-NMR(50Mhz，D2O)173.15(CO)，141.00(Car)，136.39(Car)，132.58(CHar)，131.95(CHar)，63.57(CH-N)，52.48(CH2)+，50.65(C)，45.66(CH3-N)，34.05(CH2)，32.35(CH2)，31.28(CH2)，22.77(CH3).
步驟2) 由1016mg(2.958mmol)前一步驟獲得的中間體開始，并且按與實(shí)施例4之步驟2所述的方式獲得1016mg(2.490mmol)N-Boc保護(hù)的中間體，其表征為a)CCF(流動(dòng)相CHCl3/MeOH/AcOH 85∶10∶5)。Rf＝0.32，沒有觀察到起始原料的信號(hào)。
b)HPLC，10％-100％MeCN梯度淋洗30分鐘，純度為96％(220nm)。
c)通過FAB技術(shù)的質(zhì)譜M計(jì)算＝408，(M＋H+)實(shí)驗(yàn)＝408.9d)通過電霧化技術(shù)的MS(M＋H+)實(shí)驗(yàn)＝409.3。
步驟3)由794mg上述提及的樹脂開始，使用實(shí)施例4之步驟3所述的方法，獲得三肽中間體。操作規(guī)模為0.5mmol。由于溶解Boc-衍生物困難，在上述的偶聯(lián)反應(yīng)中選擇使用N-甲基嗎啉作為堿(3當(dāng)量)來代替DIEA。在摻入γGlu后，裝配三肽并且通過上述相同的方式酸解破壞肽-樹脂鍵。最后，在10％AcOH中獲得粗產(chǎn)物，之后將其凍干并且定量分析。獲得137mg(0.35lmmol)中間體三肽并且表征為a)HPLC，0％無梯度淋洗10分鐘+5％-65％MeCN淋洗30分鐘?？吹揭宜崛芤褐械淖⑸洚a(chǎn)物首先洗脫出來，這使得必須凍干等分部分以消除酸并且將凍干物重溶解于1mM HCl中。按此方式可以通過色譜觀察肽并且在所用的梯度中于6.8分鐘時(shí)洗脫出來。
b)通過電霧化技術(shù)的MSM計(jì)算＝390，(M＋H+)實(shí)驗(yàn)＝391.2。
按制備規(guī)模，通過HPLC純化粗產(chǎn)物，使用實(shí)施例4中所述的參數(shù)。也施加0％的無梯度B淋洗40分鐘，接著0-10％梯度B淋洗40分鐘。按此方式，獲得107mg(0.274mmol)的產(chǎn)物，其表征為a)HPLC，0％-0％梯度淋洗10分鐘，加上0％-30％梯度淋洗20分鐘。純度94％(220nm)。證實(shí)在8.0分鐘處的附加的峰也對(duì)應(yīng)三肽的聚集，因此為正確產(chǎn)物。
b)通過電霧化的MSM計(jì)算＝390，(M＋H+)實(shí)驗(yàn)＝391.1。
步驟4)由10.0mg(0.026mmol)前述步驟獲得的三肽中間體開始，使用52μL 0.5M NaNO2，按實(shí)施例4之步驟4所述進(jìn)行亞硝基化。所獲得的產(chǎn)物表征為13C-NMR(50Mhz，DMSO-d6)171.57(CO-N)，170.99(CO-N)，170.76(CO-N)，168.20(CO-O)，60.23(C)，59.53(CH)，51.57(CH)，49.02(CH2)，42.20(CH3)，41.59(CH2)，30.49(CH2)，29.75(CH2)，29.31(CH2)，26.05(CH2)HPLC(方法B)λ220nm(純度74％)；λ334nm(純度88％)。
UVλ346nm，ε(H2O)198cm-1mol-1L實(shí)施例6制備N[N-γ-L-谷氨?；?2-胺-3-芐基-3-(-S-亞硝基巰基)-4-苯基丁?；鵠-甘氨酸(6) 步驟1) 在100mL裝有磁力攪拌器的玻璃燒瓶中，將1.25g(3.7mmol)2-氨基-3-芐基-3-巰基-4-苯基丁酸的二鹽酸化物、0.68g(3.7mmol)α-溴-對(duì)二甲苯和40mL H2O/EtOH的1∶1混合物混合。加入1.6mL三乙胺，并且溶解大部分懸浮固體。建立氬氣環(huán)境，并且將混合物在室溫下攪拌24小時(shí)。減壓除去乙醇和部分三乙胺。將所得的水懸浮液過濾并且獲得白色固體。用CH3CN-H2O經(jīng)反相柱色譜法純化。在所得的固體上面添加100mL 1∶1的MeOH/HCl并且減壓除去溶劑。獲得0.5g中間產(chǎn)物2-氨基-3-芐基-3-(4-甲基芐基巰基)-4-苯基丁酸的鹽酸化物。
1H-NMR(200Mhz，DMSO-d6)8.95-8.50(3H，sb，H3N+)，7.45-7.25(10H，sc，CHar)，7.08(2H，d，J＝10Hz，CHar)，6.98(2H，d，J＝10Hz，CHar)，4.05(1H，s，CH-N)，3.55-3.0(4H，sc，CH2-C6H5，CH2-Car)，2.90-2.60(2H，sc，CH2)，2.20(3H，s，CH3)13C-NMR(50Mhz，DMSO-d6)168.70(CO)，136.53(Car)，136.00(Car)，134.94(Car)，132.50(Car)，131.18(CHar)，129.169(CHar)，128.90(CHar)，128.26(CHar)，128.02(CHar)，127.07(CHar)，57.06(CH-N)，53.64(C)42.22(CH2)，41.65(CH2)，31.90(CH2S)，20.48(CH3).
步驟2) 由前面步驟中獲得的兩種餾分開始(純度83％的餾分180mg，純度94％的餾分530mg)，并且按實(shí)施例4之步驟2所述的方式進(jìn)行，獲得733mg(1.45mmol)N-Boc保護(hù)的產(chǎn)物，其表征為a)CCF(流動(dòng)相CHCl3/MeOH/AcOH 85∶10∶5)。Rf＝0.63。
b) HPLC，10％-100％MeCN梯度淋洗30分鐘，100％無梯度淋洗5分鐘，純度為91％(220nm)。
c)EM-MALDI-TOF(質(zhì)譜)二羥基苯甲酸基質(zhì)，M計(jì)算＝505，(M＋H+)實(shí)驗(yàn)＝528.585(M＋Na)d) NMR證實(shí)存在Boc基團(tuán)。
步驟3)由0.43mmol上述提及的樹脂開始，使用實(shí)施例4之步驟3所述的方法，獲得三肽中間體。在酸解步驟之后，分離得到粗產(chǎn)物，其含有14.4mg(29.96μmol)三肽中間體，其表征為
a)HPLC分析，5％-65％梯度淋洗30分鐘，純度大約95％。
b)EM-電霧化M計(jì)算＝487(M＋H+)，M實(shí)驗(yàn)＝488.3。
步驟4)由5.7mg(0.012mmol)前述步驟獲得的三肽中間體開始，使用24μL 0.5M NaNO2，按實(shí)施例4之步驟4所述進(jìn)行亞硝基化。所獲得的產(chǎn)物表征為HPLC(方法A)λ220nm，純度68％；λ334nm，純度86％。
UVλ345nm，ε(H2O)368cm-1mol-1L試驗(yàn)中所用的方法與以下參考文獻(xiàn)中描述的基本上相同。
*Furchgot，R.F.″一氧化氮的研究方法(Methods in nitric oxideresearch)″，F(xiàn)eelisch & Stamier編，John Wiley & Sons，Chichester，England，pp 567-581*Trongvanichnam，K.等，日本藥理學(xué)雜志(Jpn J.Pharmacol.)1996；71167-173*Salas，E.等，歐洲藥理學(xué)雜志(Eur.J.Pharmacol.)1994；25847-55將化合物按5種濃度進(jìn)行試驗(yàn)，以0.001至10mM的濃度范圍，對(duì)每種化合物使用6-9個(gè)動(dòng)脈環(huán)。將獲得的結(jié)果與由S-亞硝基谷胱甘肽(GSNO)獲得的結(jié)果進(jìn)行比較，所說的S-亞硝基谷胱甘肽用作對(duì)照產(chǎn)物。
結(jié)果示于下表1中并且按CE50(有效濃度50)給出，其是各個(gè)受測(cè)試化合物使50％的動(dòng)脈環(huán)產(chǎn)生血管舒張時(shí)的濃度，其中所說的動(dòng)脈環(huán)預(yù)先用1μM去甲腎上腺素收縮。
可以看出，所有受測(cè)試化合物均具有有效的血管舒張活性，其活性類似或超過對(duì)照化合物(GSNO)的活性，并且化合物2的血管舒張活性遠(yuǎn)遠(yuǎn)優(yōu)于對(duì)照產(chǎn)物的活性。實(shí)施例8抑制血小板凝集的體外試驗(yàn)試驗(yàn)中所用的方法與以下參考文獻(xiàn)中描述的基本上相同。
*Loscalzo J.等，″一氧化氮的研究方法(Methods in nitric oxideresearch)″，F(xiàn)eelisch & Stamier編，John Wiley & Sons，Chichester，England.，pp 583-591*Radomski，MW等，英國(guó)藥理學(xué)雜志(Br J.Pharmacol.)1987；92181-187*Salas，E.等，英國(guó)藥理學(xué)雜志(Br.J.Pharmacol.)1994；1121071-1076測(cè)試4種不同濃度的化合物，使用5-23種不同供體的血小板。將所得結(jié)果與由S-亞硝基谷胱甘肽(GSNO)獲得的結(jié)果進(jìn)行比較，所說的S-亞硝基谷胱甘肽用作對(duì)照產(chǎn)物。
結(jié)果示于下表2中并且以CI50(抑制50的濃度)表達(dá)，其是各個(gè)測(cè)試化合物對(duì)用次最大膠原濃度(1μg/mL)獲得的凝集產(chǎn)生50％抑制時(shí)的濃度。
正如表2中看出的，所有測(cè)試化合物對(duì)血小板凝集均具有有效的抑制活性，其活性類似或超過對(duì)照化合物(GSNO)的活性，并且化合物1和5的血小板凝集抑制活性遠(yuǎn)遠(yuǎn)優(yōu)于對(duì)照產(chǎn)物的活性。實(shí)施例9增加血小板內(nèi)GMPc含量的體外試驗(yàn)對(duì)實(shí)施例5獲得的化合物5進(jìn)行體外試驗(yàn)，測(cè)試其在人分離血小板制劑中增加血小板內(nèi)GMPc含量的能力。
本試驗(yàn)中使用的方法與實(shí)施例8中所提及的參考文獻(xiàn)中描述的方法基本上相同。
使用來自5種不同供體的血小板測(cè)試4種不同濃度的化合物。將所得的結(jié)果與GSNO(對(duì)照產(chǎn)物)的結(jié)果及基本值比較。結(jié)果示于下表3中，以pmol/109血小板表達(dá)。
化合物5以與GSNO對(duì)照物類似的方式增加血小板內(nèi)GMP含量。應(yīng)當(dāng)注意對(duì)接近于IC50的值來說，化合物5引發(fā)的GMPc含量低于GSNO當(dāng)其在接近于其IC50的濃度下使用時(shí)引發(fā)的GMPc含量。實(shí)施例10阻滯血小板凝集抑制的體外試驗(yàn)本試驗(yàn)中使用的方法與實(shí)施例8中所提及的參考文獻(xiàn)中描述的方法基本上相同，以及參考文獻(xiàn)*Moro MA等，Pr Nat Acad Sc USA.1996；931480-5。
體外測(cè)試ODQ對(duì)所得產(chǎn)物在人分離血小板制劑中所達(dá)到的血小板凝集抑制作用的阻滯。
測(cè)試3種不同濃度的實(shí)施例5獲得的化合物5，在ODQ(1μM)的存在下或沒有ODQ的存在，使用5種不同供體的血小板。將所得的結(jié)果與GSNO(對(duì)照產(chǎn)物)的結(jié)果及不存在ODQ時(shí)的值比較。結(jié)果示于表4和5并且以最大凝集抑制百分比來表達(dá)。
當(dāng)使用IC50濃度的化合物時(shí)，ODQ(1μM)能夠阻滯GSNO和化合物5的抑制效果。在比IC50高的濃度下，化合物5凝集抑制效果比對(duì)照產(chǎn)物更好地受到阻滯。
權(quán)利要求
1.青霉胺或谷胱甘肽的S-亞硝基硫醇衍生物及其藥用鹽，該化合物具有以下通式(I) 其中A和B是苯基或一起形成構(gòu)成六元環(huán)的殘基-CH2-Q-CH2-，其中Q表示氧原子、硫原子或基團(tuán)N-R3，其中R3是氫或C1-C4烷基；R1是酰基殘基，其可以是C1-C5脂族?；?，或者是通過其非氨基酸羧基連接的谷氨酸的殘基；R2是羥基或通過肽鍵連接的甘氨酸殘基；前提條件是如果R1是脂族酰基殘基，則R2是羥基，并且如果R1是谷氨酸的殘基，則R2是甘氨酸殘基。
2.權(quán)利要求1的S-亞硝基硫醇，其具有以下通式(II) 其中A和B具有如上所述的含義，并且R4是C1-C4烷基。
3.權(quán)利要求1或2任一項(xiàng)的S-亞硝基硫醇，其為N-乙酰基-2-氨基-2-[4-(4-S-亞硝基巰基四氫吡喃)]乙酸(1)。
4.權(quán)利要求1或2任一項(xiàng)的S-亞硝基硫醇，其是N-乙酰基-2-氨基-2-[4-(4-S-亞硝基巰基-1-甲基哌啶)]乙酸(2)。
5.權(quán)利要求1或2任一項(xiàng)的S-亞硝基硫醇，其是N-乙?；?2-氨基-3-芐基-3-S-亞硝基巰基-4-苯基-丁酸(3)。
6.權(quán)利要求1的S-亞硝基硫醇，其具有以下通式(III) 其中A和B具有如上所述的含義。
7.權(quán)利要求1或6任一項(xiàng)的S-亞硝基硫醇，其是N[N-γ-L-谷氨?；?2-氨基-2-(4-(4-S-亞硝基巰基)四氫吡喃))乙酰基]-甘氨酸(4)。
8.權(quán)利要求1或6任一項(xiàng)的S-亞硝基硫醇，其是N[N-γ-L-谷氨?；?2-氨基-2(4-(4-S-亞硝基巰基-1-甲基-哌啶))乙酰基]-甘氨酸(5)。
9.權(quán)利要求1或6任一項(xiàng)的S-亞硝基硫醇，其是N[N-γ-L-谷氨?；?2-氨基-3-芐基-3-(-S-亞硝基巰基)-4-苯基丁酰基]-甘氨酸(6)。
10.上述權(quán)利要求任一項(xiàng)的S-亞硝基硫醇在制備治療循環(huán)系統(tǒng)機(jī)能障礙的藥物中的用途。
11.權(quán)利要求10的用途，用于制備治療心血管系統(tǒng)機(jī)能障礙的藥物。
全文摘要
本發(fā)明涉及通式(I)的衍生自青霉胺或谷胱甘肽的新型S－亞硝基硫醇,其中A和B是苯基或一起形成構(gòu)成六元環(huán)的基團(tuán)－CH
文檔編號(hào)A61P9/10GK1337946SQ00803084
公開日2002年2月27日 申請(qǐng)日期2000年1月19日 優(yōu)先權(quán)日1999年1月27日
發(fā)明者何塞·雷波列斯·莫利納, 愛德華多·薩拉斯·佩雷斯－拉西利亞, 弗朗西斯科·普比爾·科伊, 胡安－安東尼奧·塞爾達(dá)－瑞達(dá)沃茲, 克里斯蒂納·內(nèi)格里·羅弗斯, 莉迪亞·卡韋薩·略倫特, 艾麗西亞·費(fèi)雷爾·西索, 努里亞·特里亞斯·阿德羅埃爾, 馬爾切利·卡爾沃·巴紐斯, 赫蘇斯·繆拉·莫雷諾, 佩德羅·米切萊納·利亞古諾 申請(qǐng)人:雷瑟爾股份有限公司