專利名稱：短鏈化多核苷酸及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及作為醫(yī)藥品特別有效的短鏈化多核苷酸及其制備方法。具體來講，本發(fā)明是以合成的短鏈化多核苷酸或其鹽中的2’-5’磷酸二酯鍵占全部磷酸二酯鍵的3％以下，即，對應(yīng)于所有磷酸二酯鍵的磷酸基團(tuán)，從3’位轉(zhuǎn)移到2’位的磷酸基團(tuán)的比例(磷酸位移率)在3％以下為特征的短鏈化多核苷酸或其鹽，以及它們的制備方法。
背景技術(shù)：
聚肌苷酸·聚胞苷酸，即，以聚[I]·聚[C]為代表的多核苷酸是本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的化合物，由于其具備干擾素誘導(dǎo)作用和免疫活性作用等，所以，對其作為肝炎治療劑和癌治療劑使用的可能性進(jìn)行了研究。
多核苷酸的藥理作用與其鏈長有關(guān)，鏈越長，其干擾素誘導(dǎo)作用等越強(qiáng)。但是，反過來考慮，鏈越長顯現(xiàn)出的毒性也越強(qiáng)。
最近，嘗試對多核苷酸進(jìn)行水解，將獲得的合成的短鏈化多核苷酸封入象陽離子脂質(zhì)體那樣的可將藥物移入細(xì)胞內(nèi)的有效載體中的方法，這樣不僅能夠維持多核苷酸的有效藥理作用，還可減弱毒性(例如，PCT WO 99/20283號、PCTWO 99/48531號)。
但是眾所周知，如果象以上所述那樣通過水解而使多核苷酸短鏈化，則在短鏈化的同時(shí)因?yàn)閭涡D(zhuǎn)機(jī)理而使部分磷酸基團(tuán)從3’位轉(zhuǎn)移2’位發(fā)生分子內(nèi)位移(參考《蛋白質(zhì)、核酸、酶》Vol.40，No.10，pp1323-1332(1995))。其結(jié)果是，短鏈化多核苷酸分子內(nèi)的部分3’-5’磷酸二酯鍵被2’-5’磷酸二酯鍵置換。這種磷酸基團(tuán)的位移現(xiàn)象是否會影響到藥理作用等目前還不清楚。
發(fā)明的揭示本發(fā)明的目的是提供作為醫(yī)藥品有效且安全的短鏈化多核苷酸及其鹽，以及其短鏈化雙鏈多核苷酸及其鹽。
本發(fā)明者們經(jīng)過認(rèn)真研究后發(fā)現(xiàn)了在短鏈化反應(yīng)時(shí)生成的2’-5’磷酸二酯鍵僅在一定比例以下的短鏈化多核苷酸及其鹽中，解決了上述問題，從而完成了本發(fā)明。
本發(fā)明之一是短鏈化多核苷酸或鹽，其特征是，2’-5’磷酸二酯鍵占所有磷酸二酯鍵的3％以下，更好是2％以下。
此外，本發(fā)明還涉及上述2’-5’磷酸二酯鍵占所有磷酸二酯鍵的3％以下，更好是2％以下的短鏈化多核苷酸或其鹽中，由可形成雙鏈的2個(gè)短鏈化多核苷酸或其鹽構(gòu)成的雙鏈短鏈化多核苷酸或其鹽。本發(fā)明進(jìn)一步涉及包含以可將藥物移入細(xì)胞內(nèi)的有效載體和上述2’-5’磷酸二酯鍵占所有磷酸二酯鍵的3％以下的短鏈化多核苷酸或其鹽，或和可形成雙鏈的2個(gè)短鏈化多核苷酸或其鹽形成的具有雙鏈的短鏈化多核苷酸或鹽為必須構(gòu)成組分的復(fù)合體的組合物。
本發(fā)明的多核苷酸是各種核苷酸通過磷酸二酯鍵發(fā)生直鏈聚合反應(yīng)形成的化合物，核苷酸數(shù)大約在20個(gè)以上，可以是天然的也可以是合成的。具體例子包括聚肌苷酸(即，聚(I))或其類似物、聚胞苷酸(即，聚(C))或其類似物、聚腺苷酸(即，聚(A))或其類似物、或聚尿苷酸(即，聚(U))或其類似物。
聚肌苷酸類似物是全部或部分肌苷酸經(jīng)過化學(xué)修飾而獲得的均聚物，或肌苷酸和其他核苷酸的共聚物。例如，聚(7-脫氮肌苷酸)、聚(2’-疊氮肌苷酸)。聚胞苷酸類似物是全部或部分胞苷酸經(jīng)過化學(xué)修飾而獲得的均聚物，或胞苷酸和其他核苷酸的共聚物。例如，聚(5-溴胞苷酸)、聚(2-硫代胞苷酸)、聚(胞苷酸-5’-硫代磷酸)、聚(胞苷酸、尿苷酸)、聚(胞苷酸、4-硫代尿苷酸)、聚(1-乙烯基胞苷酸)。聚腺苷酸類似物和聚尿苷酸類似物也是如此。其中，適合于本發(fā)明的是聚肌苷酸和聚胞苷酸。
本發(fā)明的短鏈化多核苷酸的平均鏈長一般為0.1k bases～1kbases(base堿基的個(gè)數(shù)，1k bases表示1000個(gè)堿基，以下將“base(s)”簡稱為“b”)，較好是200b～800b，更好為300b～600b。該平均鏈長如下面的試驗(yàn)例5所述，可以通過凝膠滲透色譜法(gel permeation chromatography，以下稱為“GPC法”)容易地確定。
本發(fā)明的短鏈化多核苷酸的磷酸位移率一般在3％以下，較好在2％以下或0.1％～2％，更好是在1％以下或0.1％～1％。
多核苷酸的磷酸基團(tuán)從3’位向2’位轉(zhuǎn)移可通過下面的試驗(yàn)例6所述的方法容易地確認(rèn)。即，用核酸酶P1選擇性地對3’-5’磷酸二酯鍵進(jìn)行水解，使多核苷酸分解為核苷、核苷酸及寡核苷酸后，再用堿性磷酸酶選擇性地對末端的磷酸基團(tuán)進(jìn)行水解，使全部核苷酸轉(zhuǎn)變?yōu)楹塑?。另一方面，具有未被核酸酶P1分解的2’-5’磷酸二酯鍵的寡核苷酸即使用堿性磷酸酶處理，其分子內(nèi)的2’-5’磷酸二酯鍵也不會被水解，所以不能夠分解為核苷。用液相色譜法對核苷和寡核苷酸(大部分為二聚體)進(jìn)行定量，求得磷酸的位移率。
本發(fā)明的可形成雙鏈的2個(gè)短鏈化多核苷酸包括聚肌苷酸和聚胞苷酸、聚腺苷酸和聚尿苷酸、聚肌苷酸類似物和聚胞苷酸、聚肌苷酸和聚胞苷酸類似物、聚肌苷酸類似物和聚胞苷酸類似物、聚腺苷酸類似物和聚尿苷酸、聚腺苷酸和聚尿苷酸類似物、聚腺苷酸類似物和聚尿苷酸類似物。因此，由可形成雙鏈的2個(gè)短鏈化多核苷酸形成的具有雙鏈的短鏈化多核苷酸包括聚肌苷酸·聚胞苷酸、聚腺苷酸·聚尿苷酸、聚肌苷酸類似物·聚胞苷酸、聚肌苷酸·聚胞苷酸類似物、聚肌苷酸類似物·聚胞苷酸類似物、聚腺苷酸類似物·聚尿苷酸、聚腺苷酸·聚尿苷酸類似物、聚腺苷酸類似物·聚尿苷酸類似物。其中，聚肌苷酸·聚胞苷酸是適合于本發(fā)明的具有雙鏈的短鏈化多核苷酸。
上述具有雙鏈的短鏈化多核苷酸的平均鏈長可以認(rèn)為是全部短鏈化多核苷酸的平均鏈長。該平均鏈長作為具有雙鏈的短鏈化多核苷酸的外觀平均鏈長可用堿基對的個(gè)數(shù)表示。因此，上述具有雙鏈的短鏈化多核苷酸的平均鏈長一般為0.1k bp～1k bp(bp堿基對的個(gè)數(shù)，1k bp為1000個(gè)堿基對)，較好為200bp～800bp，更好為300bp～600bp。
本發(fā)明的短鏈化多核苷酸鹽及具有雙鏈的短鏈化多核苷酸鹽只要是醫(yī)藥上允許的鹽，對其無特別限定。例如，鈉鹽和鉀鹽。
可將藥物移入細(xì)胞內(nèi)的有效載體可采用帶有正電荷的載體，其具體例子包括聚-L-賴氨酸等陽離子性聚合物和Lipofectin、Lipofectamine、Lipofectace、DMRIE-C等陽離子脂質(zhì)體，還包括PCT WO 94/19314號公報(bào)揭示的被認(rèn)為是同一類的載體。例如，以具有以下結(jié)構(gòu)式[I]的2-O-(2-二乙基氨基乙基)氨基甲?；?1，3-O-二油酰基甘油 和磷脂(例如，磷脂酰膽堿、磷脂酰乙醇胺、卵磷脂、大豆磷脂、它們的氫化磷脂)為必須構(gòu)成組分的藥物載體。
上述陽離子脂質(zhì)體帶有正電荷，與帶有負(fù)電荷的多核苷酸或寡核苷酸形成靜電復(fù)合體，該復(fù)合體和細(xì)胞膜融合的同時(shí)，多核苷酸或寡核苷酸被移入細(xì)胞內(nèi)。這種復(fù)合體被稱為“l(fā)ipoplex”。
以下對本發(fā)明的短鏈化多核苷酸的制備方法進(jìn)行詳細(xì)說明。例如，在適當(dāng)?shù)膒H范圍內(nèi)和適當(dāng)?shù)臏囟确秶鷥?nèi)使作為起始原料的多核苷酸溶液加熱水解就可制得。此時(shí)，水溶液的pH以在7以上的堿性為宜，更好是pH7～10。此外，如果考慮到短鏈化反應(yīng)的速度和堿基部分的穩(wěn)定性，pH更好為8～9。另一方面，從堿基的穩(wěn)定性考慮，反應(yīng)溫度應(yīng)在20～110℃的范圍內(nèi)，更好是在40～100℃。但是，考慮到足夠的水解速度和堿基部分的穩(wěn)定性，反應(yīng)溫度最好在50～90℃的范圍內(nèi)。
更具體來講，例如，將多核苷酸攪拌溶解于水，如注射用水、注射用蒸餾水或生理鹽水中，用緩沖液或pH調(diào)節(jié)劑將pH值調(diào)整為8～9。然后，在50～90℃的反應(yīng)溫度范圍內(nèi)，一邊監(jiān)控平均鏈長和磷酸的位移率，一邊進(jìn)行0.5～60小時(shí)的加熱水解，就能夠制得磷酸位移率較低、且具有0.1kb～1kb的平均鏈長的短鏈化多核苷酸。
pH的調(diào)整可采用醫(yī)藥上允許的添加劑，例如，緩沖液或pH調(diào)節(jié)劑。具體例子包括氨基乙酸(別名甘氨酸)、三羥基甲基氨基甲烷(別名Tris)、碳酸鈉、碳酸氫鈉(別名重堿)、氫氧化鈉、二乙醇胺、三乙醇胺等緩沖液和pH調(diào)節(jié)劑。對它們的種類、組合和濃度等無任何限定。
如果對反應(yīng)液進(jìn)行透析處理或活性炭處理等，能夠?qū)误w和不需要的鹽、雜質(zhì)、短鏈化生成的反應(yīng)副產(chǎn)品排出到反應(yīng)系統(tǒng)外。
此外，在適當(dāng)?shù)膒H范圍內(nèi)和適當(dāng)?shù)臏囟确秶鷥?nèi)，以多核苷酸溶液為起始原料，用磷酸二酯酶也可制得本發(fā)明的短鏈化多核苷酸。此時(shí)反應(yīng)液的pH一般在4～9的范圍內(nèi)，更好是5～8的范圍內(nèi)。此外，考慮到反應(yīng)時(shí)的磷酸位移，pH值最好在6～7的范圍內(nèi)。另一方面，考慮到酶的性質(zhì)，反應(yīng)溫度一般在20～60℃的范圍內(nèi)，更好是在25～50℃的范圍內(nèi)。但是，要獲得足夠的水解速度，避免酶反應(yīng)以外的熱對水解的影響，且不引發(fā)磷酸基團(tuán)的位移，反應(yīng)溫度最好在30～40℃的范圍內(nèi)。
更具體來講，在多核苷酸中加水(注射用水、注射用蒸餾水和生理鹽水等)攪拌并溶解。如有需要，添加緩沖液和pH調(diào)節(jié)劑來調(diào)整pH值。然后，加入核酸酶P1等磷酸二酯酶，在30～40℃的反應(yīng)溫度范圍內(nèi)，一邊監(jiān)控平均鏈長和磷酸位移率，一邊進(jìn)行短鏈化反應(yīng)，制得磷酸位移較少、且具有0.1kb～1kb的平均鏈長的短鏈化多核苷酸。對酶的濃度和反應(yīng)條件等無任何限定。
如果對反應(yīng)液進(jìn)行乙醇沉淀、透析處理和活性炭處理等，能夠?qū)误w、不需要的鹽、雜質(zhì)、短鏈化反應(yīng)生成的副產(chǎn)品等排除到反應(yīng)系統(tǒng)外。
通過適當(dāng)?shù)哪し蛛x能夠?qū)Χ替溁嗪塑账徇M(jìn)行精制。例如，以分離出本發(fā)明的平均鏈長為0.1kb～1kb的短鏈化多核苷酸為目的，可采用超濾膜等。對該濾膜的材質(zhì)或孔徑等無任何限定。
作為起始原料的多核苷酸可以是天然的也可以是合成的，對鹽的種類和鏈長也無特別限定。天然的多核苷酸包括tRNA和聚腺苷酸。合成的聚核苷酸能夠由以聚核苷酸磷酸化酶為代表的RNA合成酶和其固定化酶制得。此外，作為干擾素誘導(dǎo)劑的市售的聚肌苷酸鈉鹽和聚胞苷酸鈉鹽等也可作為起始原料使用。
在適當(dāng)?shù)娜芤?例如，含有0.15M NaCl的10mM的Tris-鹽酸緩沖液(pH7))中，混入以上獲得的磷酸位移率較低的短鏈化多核苷酸中可形成雙鏈的2個(gè)短鏈化多核苷酸，能夠獲得本發(fā)明的具有雙鏈的短鏈化多核苷酸，此外，利用常規(guī)方法進(jìn)行退火也能夠獲得。退火的方法包括將含有可形成雙鏈的2個(gè)短鏈化多核苷酸的溶液升溫至70～80℃，再慢慢冷卻的方法。
此外，可以對以上獲得的磷酸位移率較低的短鏈化多核苷酸或具有雙鏈的短鏈化多核苷酸進(jìn)行冷凍干燥處理，這樣就能夠制得可長期保存的冷凍干燥品。冷凍干燥處理可采用常規(guī)方法進(jìn)行。例如，對在上述條件下獲得的短鏈化多核苷酸溶液進(jìn)行過濾滅菌處理后，將濾液注入經(jīng)過熱空氣滅菌處理的金屬容器中，在-40℃～-20℃的棚溫下進(jìn)行1～4小時(shí)的預(yù)冷，一次干燥后，在15～30℃的棚溫下減壓進(jìn)行二次干燥(時(shí)間為10～50小時(shí)左右)，就能夠獲得冷凍干燥品。一般，在上述冷凍干燥品中添加適當(dāng)?shù)娜芤?注射用水、注射用蒸餾水、生理鹽水、麥芽糖溶液和葡萄糖溶液等)使其溶解就可使用。
本發(fā)明的組合物，即，包含以可將藥物移入細(xì)胞內(nèi)的有效載體和2’-5’磷酸二酯鍵占所有磷酸二酯鍵的3％以下的短鏈化多核苷酸、可形成雙鏈的2個(gè)短鏈化多核苷酸或由可形成雙鏈的2個(gè)短鏈化多核苷酸形成的具有雙鏈的短鏈化多核苷酸為必須構(gòu)成組分的復(fù)合體(以下稱為“本復(fù)合體”)的組合物能夠通過和脂質(zhì)體的常規(guī)制備方法同樣的方法制得。具體來講，在可將藥物移入細(xì)胞內(nèi)的有效載體，例如陽離子脂質(zhì)體或其原料(例如，2-O-(2-二乙基氨基乙基)氨基甲?；?1，3-O-二油?；视偷雀视脱苌锛傲字?中加入水(注射用水、注射用蒸餾水和生理鹽水等)，攪拌混合后，用適當(dāng)?shù)姆稚C(jī)，例如，均質(zhì)混合機(jī)、均化機(jī)、超聲波分散機(jī)、超聲波均化機(jī)、高壓乳化分散機(jī)、Microfluidizer(商品名)、Nanomizer(商品名)、De Bee 2000(商品名)、Ultimizer(商品名)、Manton-Gaulin型高壓均化機(jī)進(jìn)行分散處理。然后，在該脂質(zhì)分散液中加入本發(fā)明的短鏈化多核苷酸或具有雙鏈的短鏈化多核苷酸，再次用適當(dāng)?shù)姆稚C(jī)進(jìn)行分散處理，獲得本復(fù)合體之后，進(jìn)行過濾滅菌等滅菌處理，就能夠制得作為注射劑的本發(fā)明組合物。在制備時(shí)的適當(dāng)步驟中還可添加其他任意的添加劑，對其無特別限定。此外，預(yù)先混合可將藥物移入細(xì)胞內(nèi)的有效載體，例如，陽離子脂質(zhì)體或其原料(例如，2-O-(2-二乙基氨基乙基)氨基甲?；?1，3-O-二油?；视偷雀视脱苌锛傲字?和本發(fā)明的短鏈化多核苷酸或具有雙鏈的短鏈化多核苷酸，然后在該混合物中加入水，同時(shí)進(jìn)行分散處理。此外，上述各種制備方法中，還可包括適當(dāng)?shù)拇址稚⒉襟E。
此外，可以對以上獲得的本發(fā)明的組合物進(jìn)行冷凍干燥處理，這樣就能夠制得可長期保存的本發(fā)明組合物的冷凍干燥制劑。冷凍干燥處理可采用常規(guī)方法進(jìn)行。例如，在上述分散處理后進(jìn)行過濾滅菌處理，然后將所得本發(fā)明組合物定量地分別注入小瓶中。在-40℃～-20℃的條件下進(jìn)行約2～3小時(shí)的預(yù)冷，然后在約0～10℃的減壓條件下進(jìn)行一次干燥，再在約15～25℃的減壓條件下進(jìn)行二次干燥，進(jìn)行冷凍干燥。接著，一般用氮?dú)獾榷栊詺怏w置換掉小瓶內(nèi)部的空氣，加蓋后就可獲得本發(fā)明組合物的冷凍干燥制劑。
一般，用任何適當(dāng)?shù)娜芤簩Ρ景l(fā)明組合物的冷凍干燥制劑進(jìn)行再溶解就可使用。進(jìn)行再溶解時(shí)，可采用注射用水、注射用蒸餾水、生理鹽水、麥芽糖溶液、葡萄糖溶液和其他普通的輸液等。
本發(fā)明組合物及其冷凍干燥制劑可作為藥物制劑使用。作為藥物制劑的本發(fā)明組合物及其冷凍干燥制劑能夠發(fā)揮出多核苷酸所具有的藥理作用。因此，該藥物制劑的具體例子包括干擾素誘導(dǎo)劑、免疫活化劑、細(xì)胞內(nèi)核酸酶活化劑、癌治療劑或預(yù)防劑、肝炎治療劑或預(yù)防劑。
實(shí)施發(fā)明的最佳方式例舉實(shí)施例和試驗(yàn)例對本發(fā)明進(jìn)行更為詳細(xì)的說明，但本發(fā)明并不僅限于這些實(shí)施例和試驗(yàn)例中。
參考例1在8g肌苷-5’-二磷酸三鈉鹽及1g氯化鎂中加入500mL 0.1M的甘氨酸-氫氧化鈉緩沖液，攪拌溶解。然后，添加6N的氫氧化鈉將pH值調(diào)整到9.3，于38℃靜置1小時(shí)。再添加1mL多核苷酸磷酸化酶溶液，于38℃反應(yīng)18小時(shí)。接著，在上述反應(yīng)液中加入25mL 0.2M的乙二胺四乙酸使反應(yīng)停止，再加入10mL飽和食鹽水和500mL無水乙醇，使聚肌苷酸(1973 b)沉淀。
參考例2在10g胞苷-5’-二磷酸三鈉鹽及3g氯化錳中加入約1L 0.2M的碳酸氫鈉-氫氧化鈉緩沖液，攪拌溶解。然后，添加6N的氫氧化鈉將pH值調(diào)整到9.8，于36℃靜置1小時(shí)。接著，添加2mL精制的多核苷酸磷酸化酶溶液，于36℃反應(yīng)24小時(shí)。再添加50mL 0.2M的乙二胺四乙酸使反應(yīng)停止，最后在反應(yīng)液中加入20mL飽和食鹽水和1L無水乙醇，使聚胞苷酸(3300 b)沉淀。
實(shí)施例1對參考例1獲得的聚肌苷酸進(jìn)行離心分離，在沉淀物中加入500mL注射用水進(jìn)行再溶解，然后進(jìn)行透析處理。用活性炭對透析內(nèi)液進(jìn)行處理后，通過過濾除去活性炭，再在濾液中加入6N的氫氧化鈉，將pH值調(diào)整為8.5。接著，于70℃進(jìn)行8小時(shí)的加熱水解使該聚肌苷酸短鏈化，再用活性炭對上述短鏈化多核苷酸進(jìn)行處理，過濾除去活性炭后，進(jìn)行透析處理。對透析內(nèi)液過濾滅菌后，用常規(guī)方法對濾液進(jìn)行冷凍干燥處理，獲得1.9g磷酸位移率較低的本發(fā)明的短鏈化多核苷酸(聚肌苷酸鈉鹽)的冷凍干燥制品(磷酸位移率為0.2％，平均鏈長為360 b)。
實(shí)施例2對參考例2獲得的聚胞苷酸進(jìn)行離心分離，在沉淀物中加入500mL注射用水進(jìn)行再溶解，然后進(jìn)行透析處理。用活性炭對透析內(nèi)液進(jìn)行處理后，通過過濾除去活性炭，再在濾液中加入6N的氫氧化鈉，將pH值調(diào)整為9.0。接著，于80℃進(jìn)行4小時(shí)的加熱水解使該聚胞苷酸短鏈化，再用活性炭對上述短鏈化多核苷酸進(jìn)行處理，過濾除去活性炭后，進(jìn)行透析處理。對透析內(nèi)液過濾滅菌后，用常規(guī)方法對濾液進(jìn)行冷凍干燥處理，獲得2.7g磷酸位移率較低的本發(fā)明的短鏈化多核苷酸(聚胞苷酸鈉鹽)的冷凍干燥制品(磷酸位移率為0.1％，平均鏈長為318 b)。
實(shí)施例3在1g聚胞苷酸鈉鹽(S020，w(沉降系數(shù))7.2，生化學(xué)工業(yè)株式會社制)中加入200mL 0.1M的Tris-鹽酸緩沖液(pH8.0)，攪拌溶解后，一邊用試驗(yàn)例5記載的方法監(jiān)控平均鏈長，一邊于60℃進(jìn)行48小時(shí)的加熱水解使該聚腺苷酸短鏈化，再用活性炭對上述短鏈化多核苷酸進(jìn)行處理，通過常規(guī)方法對透析內(nèi)液進(jìn)行冷凍干燥處理，獲得0.3g磷酸位移率較低的本發(fā)明的短鏈化多核苷酸(聚腺苷酸鈉鹽)的冷凍干燥制品(磷酸位移率為1.9％，平均鏈長為154 b)。
實(shí)施例4在1g聚尿苷酸鈉鹽(S020，w(沉降系數(shù))6.5，生化學(xué)工業(yè)株式會社制)中加入200mL 0.2M的甘氨酸-氫氧化鈉緩沖液(pH9.0)，攪拌溶解后，一邊用試驗(yàn)例5記載的方法監(jiān)控平均鏈長，一邊于60℃進(jìn)行25小時(shí)的加熱水解使該聚尿苷酸短鏈化。對上述短鏈化多核苷酸進(jìn)行透析處理后，通過常規(guī)方法對透析內(nèi)液進(jìn)行冷凍干燥處理，獲得0.2g磷酸位移率較低的本發(fā)明的短鏈化多核苷酸(聚尿苷酸鈉鹽)的冷凍干燥制品(磷酸位移率為1.2％，平均鏈長為108 b)。
實(shí)施例5在250mg聚肌苷酸鈉鹽(S020，w(沉降系數(shù))8.8，Yamasa醬油株式會社制)中加入50mL 0.1M的Tris-鹽酸緩沖液(pH8.0)，攪拌溶解后，在50～120℃的適當(dāng)?shù)亩替溁瘻囟认聦ι鲜鋈芤哼M(jìn)行加熱，然后一邊用試驗(yàn)例5記載的方法監(jiān)控平均鏈長，一邊對任意鏈長的聚肌苷酸進(jìn)行取樣，其結(jié)果如表1所示。分別對所得試樣溶液進(jìn)行透析后，通過常規(guī)方法進(jìn)行冷凍干燥處理，獲得各種冷凍干燥制品。
表1

實(shí)施例6在250mg聚胞苷酸鈉鹽(S020，w(沉降系數(shù))8.6，Yamasa醬油株式會社制)中加入50mL 0.1M的Tris-鹽酸緩沖液(pH9.0)，攪拌溶解后，在55～120℃的適當(dāng)?shù)亩替溁瘻囟认聦ι鲜鋈芤哼M(jìn)行加熱，然后一邊用試驗(yàn)例5記載的方法監(jiān)控平均鏈長，一邊對任意鏈長的聚胞苷酸進(jìn)行取樣，其結(jié)果如表2所示。分別對所得試樣溶液進(jìn)行透析后，通過常規(guī)方法進(jìn)行冷凍干燥處理，獲得各種冷凍干燥制品。
表2

從上述實(shí)施例5和實(shí)施例6可明顯看出，使市售的聚肌苷酸鈉鹽及聚胞苷酸鈉鹽短鏈化時(shí)，在55℃以下的短鏈化溫度下，不能夠進(jìn)行充分的水解。因此，即使短鏈化時(shí)間超過約50小時(shí)，平均鏈長還是超過1kb。另一方面，由于將短鏈化溫度設(shè)定在120℃的試樣及將短鏈化溫度設(shè)定在90℃的試樣的水解反應(yīng)速度過快，所以很難對短鏈化進(jìn)行控制。特別是短鏈化溫度為120℃時(shí)，在1～1.5小時(shí)的短鏈化時(shí)間內(nèi)可將多核苷酸分解至接近寡核苷酸的程度。此外，還可確認(rèn)該試樣的磷酸位移率較高，堿基部分也出現(xiàn)了分解。
實(shí)施例7在100mg聚腺苷酸鈉鹽(S020，w(沉降系數(shù))7.2，生化學(xué)工業(yè)株式會社制)中加入100mL 0.1M的Tris-鹽酸緩沖液(pH7.0)，溶解后，在該溶液中加入核酸酶P1(來源于青霉，生化學(xué)工業(yè)株式會社制)，然后一邊用試驗(yàn)例5記載的方法監(jiān)控平均鏈長，一邊于25℃進(jìn)行3小時(shí)的孵化，使該聚腺苷酸短鏈化(磷酸位移率為0.1％，平均鏈長為287 b)。
實(shí)施例8在1g尿苷-5’-二磷酸三鈉鹽及0.3g氯化錳中加入約100mL 0.2M的碳酸氫鈉-氫氧化鈉緩沖液，攪拌溶解。然后，添加1N的氫氧化鈉將pH值調(diào)整到9.5后，再添加0.2mL多核苷酸磷酸化酶溶液，一邊用試驗(yàn)例5記載的方法監(jiān)控平均鏈長，一邊于25℃進(jìn)行10小時(shí)的反應(yīng)。接著，在上述反應(yīng)液中加入5mL 0.2M的乙二胺四乙酸使反應(yīng)停止，再加入2mL飽和食鹽水和100mL乙醇，使聚尿苷酸(549 b)沉淀。對所得聚尿苷酸進(jìn)行離心分離，在沉淀物中加入50mL注射用水進(jìn)行再溶解后再進(jìn)行透析處理。然后，在透析內(nèi)液中加入1N的氫氧化鈉，將pH值調(diào)整到8.5，于80℃進(jìn)行30分鐘的加熱水解調(diào)節(jié)該聚尿苷酸的鏈長。最后，用超濾膜對上述短鏈化多核苷酸溶液進(jìn)行膜分離，在調(diào)節(jié)鏈長分布的同時(shí)除去不需要的鹽、短鏈化反應(yīng)時(shí)生成的副產(chǎn)品等(磷酸位移率為0.1％，平均鏈長為485 b)。
實(shí)施例9在1g 2-O-(2-二乙基氨基乙基)氨基甲酰基-1，3-O-二油?；视秃?g精制卵磷脂中加入溶有40g麥芽糖的100mL注射用水，攪拌混合后，用均化機(jī)進(jìn)行5分鐘的分散處理，獲得陽離子脂質(zhì)體(載體)的粗分散液。然后，用實(shí)驗(yàn)室用小型乳化分散機(jī)對該粗分散液進(jìn)行1小時(shí)的分散處理，獲得陽離子脂質(zhì)體溶液。在攪拌下緩緩地在該陽離子脂質(zhì)體溶液中加入約50mL分別含有200mg實(shí)施例1及實(shí)施例2制得的磷酸位移率較低的短鏈化聚肌苷酸鈉鹽及聚胞苷酸鈉鹽的水溶液后，用實(shí)驗(yàn)室用小型乳化分散機(jī)對該水溶液進(jìn)行2小時(shí)的分散處理，最后用注射用水定容至400mL，獲得含有本復(fù)合體的組合物。對該含有本復(fù)合體的組合物進(jìn)行過濾滅菌處理后，將其1mL一份分別注入小瓶中，然后按照常規(guī)方法制成冷凍干燥制劑。用注射用水重組冷凍干燥制劑，使其為1mL時(shí)的本復(fù)合體的平均粒徑為133nm(光子相關(guān)法)。
實(shí)施例10在50g 2-O-(2-二乙基氨基乙基)氨基甲?；?1，3-O-二油?；视秃?5g大豆磷脂中加入溶有1kg蔗糖的3L注射用水，攪拌混合后，用Manton-Gaulin型高壓均化機(jī)進(jìn)行30分鐘的分散處理，再用注射用水定容至5L，獲得陽離子脂質(zhì)體(載體)的分散液。然后，在攪拌下緩緩地在該陽離子脂質(zhì)體溶液中加入約2L分別含有1g實(shí)施例1及實(shí)施例2制得的磷酸位移率較低的短鏈化聚肌苷酸鈉鹽及聚胞苷酸鈉鹽的水溶液，再用1N的鹽酸將pH值調(diào)整為5.5。接著，再次用Manton-Gaulin型高壓均化機(jī)進(jìn)行1小時(shí)的分散處理，最后用注射用水定容至10L，獲得含有本復(fù)合體的組合物。將含有本復(fù)合體的組合物20mL一份分別注入小瓶中后，按照常規(guī)方法制成冷凍干燥制劑。用注射用水重組冷凍干燥制劑，使其為20mL時(shí)的本復(fù)合體的平均粒徑為158nm(光子相關(guān)法)。
實(shí)施例11在1g 2-O-(2-二乙基氨基乙基)氨基甲?；?1，3-O-二油?；视秃?g卵磷脂中加入溶有40g葡萄糖的100mL注射用水，攪拌混合后，用均化機(jī)進(jìn)行5分鐘的分散處理，再定容至500mL，獲得陽離子脂質(zhì)體(載體)的粗分散液。接著，用實(shí)驗(yàn)室用小型乳化分散機(jī)對粗分散液進(jìn)行1小時(shí)的分散處理，獲得陽離子脂質(zhì)體溶液。將所得溶液10mL一份分別注入小瓶中，按照常規(guī)方法進(jìn)行冷凍干燥。在該冷凍干燥品中加入10mL分別含有5mg實(shí)施例1、2或5、6獲得的磷酸位移率較低的短鏈化聚肌苷酸鈉鹽和聚胞苷酸鈉鹽，以及市售的聚肌苷酸鈉鹽(S020，w(沉降系數(shù))8.8，Yamasa醬油株式會社制)和聚胞苷酸鈉鹽(S020.w(沉降系數(shù))8.6，Yamasa醬油株式會社制)的水溶液，然后，用探針型超聲波分散機(jī)進(jìn)行10分鐘的分散處理，獲得含有本復(fù)合體的組合物。
實(shí)施例12攪拌下混合1mL分別含有100μg實(shí)施例3及4獲得的磷酸位移率較低的短鏈化聚腺苷酸鈉鹽和聚尿苷酸鈉鹽的水溶液及2mL含有2mg市售Lipofectin(商品名)的水溶液，然后用探針型超聲波分散機(jī)進(jìn)行15分鐘的分散處理，獲得含有本復(fù)合體的組合物。
實(shí)施例13在約200mg聚肌苷酸鈉鹽(S020.w(沉降系數(shù))8.8，Yamasa醬油株式會社制)中加入0.2M的乙酸-乙酸鈉緩沖液(pH5.2)，攪拌溶解后，加熱至80℃，然后，一邊用試驗(yàn)例6記載的方法對磷酸位移率進(jìn)行監(jiān)控，一邊對具有任意的磷酸位移率的聚肌苷酸進(jìn)行取樣。接著，在硼酸緩沖液(pH 8.5)中將具有各種磷酸位移率的聚肌苷酸加熱至60℃，再用試驗(yàn)例5記載的方法一邊監(jiān)控鏈長一邊使聚肌苷酸短鏈化，使其平均鏈長達(dá)到200±50 b，其結(jié)果如表3所示。分別對所得短鏈化聚肌苷酸溶液進(jìn)行透析處理后，按照常規(guī)方法進(jìn)行冷凍干燥處理，獲得冷凍干燥品。
表3

實(shí)施例14在約200mg聚胞苷酸鈉鹽(S020，w(沉降系數(shù))8.6，Yamasa醬油株式會社制)中加入0.2M的乙酸-乙酸鈉緩沖液(pH5.2)，攪拌溶解后，加熱至80℃，然后，一邊用試驗(yàn)例6記載的方法對磷酸位移率進(jìn)行監(jiān)控，一邊對具有任意的磷酸位移率的聚胞苷酸進(jìn)行取樣。接著，在硼酸緩沖液(pH8.5)中將具有各種磷酸位移率的聚胞苷酸加熱至70℃，再用試驗(yàn)例5記載的方法一邊監(jiān)控鏈長一邊使聚胞苷酸短鏈化，使其平均鏈長達(dá)到200±50 b，其結(jié)果如表4所示。分別對所得短鏈化聚胞苷酸溶液進(jìn)行透析處理后，按照常規(guī)方法進(jìn)行冷凍干燥處理，獲得冷凍干燥品。
表4

實(shí)施例15具有雙鏈的短鏈化多核苷酸分別調(diào)制由實(shí)施例1、2、13及14獲得的磷酸位移率為0.7％的聚肌苷酸和磷酸位移率為1.2％的聚胞苷酸組合而成的具有雙鏈的短鏈化多核苷酸(雙鏈RNA)，磷酸位移率為2.0％的聚肌苷酸和磷酸位移率為1.9％的聚胞苷酸組合而成的具有雙鏈的短鏈化多核苷酸(雙鏈RNA)，磷酸位移率為2.8％的聚肌苷酸和磷酸位移率為2.7％的聚胞苷酸組合而成的具有雙鏈的短鏈化多核苷酸(雙鏈RNA)。將各聚肌苷酸鈉鹽和聚胞苷酸鈉鹽溶于Tris-鹽酸緩沖液(pH7，含有0.15M的氯化鈉)，于80℃加熱5分鐘后，慢慢冷卻就可獲得各種具有雙鏈的短鏈化多核苷酸。
比較例1(對應(yīng)于實(shí)施例1的以往制法-1)在5mg聚肌苷酸鈉鹽(S020，w(沉降系數(shù))8.8，Yamasa醬油株式會社制)中注入10mL注射用水，攪拌溶解后，在該溶液中加入10mL甲酰胺，于80℃加熱5小時(shí)(磷酸位移率為8.9％，平均鏈長為628 b)。
比較例2(對應(yīng)于實(shí)施例2的以往制法-1)在5mg聚胞苷酸鈉鹽(S020，w(沉降系數(shù))8.6，Yamasa醬油株式會社制)中注入10mL注射用水，攪拌溶解后，在該溶液中加入10mL甲酰胺，于80℃加熱5小時(shí)(磷酸位移率為4.2％，平均鏈長為751 b)。
比較例3(對應(yīng)于實(shí)施例1的以往制法-2)在5mg聚肌苷酸鈉鹽(S020，w(沉降系數(shù))8.8，Yamasa醬油株式會社制)中注入10mL注射用水，攪拌溶解后，于90℃對該溶液進(jìn)行8小時(shí)的加熱(磷酸位移率為7.1％，平均鏈長為213 b)。
比較例4(對應(yīng)于實(shí)施例2的以往制法-2)在5mg聚胞苷酸鈉鹽(S020，w(沉降系數(shù))8.6，Yamasa醬油株式會社制)中注入10mL注射用水，攪拌溶解后，于90℃對該溶液進(jìn)行12小時(shí)的加熱(磷酸位移率為4.2％，平均鏈長為289 b)。
比較例5調(diào)制分別由實(shí)施例13和14獲得的磷酸位移率為4.2％的聚肌苷酸和磷酸位移率為3.8％的聚胞苷酸組合而成的具有雙鏈的短鏈化多核苷酸(雙鏈RNA)。將作為多核苷酸的聚肌苷酸鈉鹽和聚胞苷酸鈉鹽溶于Tris-鹽酸緩沖液(pH7，含有0.15M的氯化鈉)，于80℃加熱5分鐘后，慢慢冷卻就可獲得該具有雙鏈的短鏈化多核苷酸。
試驗(yàn)例1平均鏈長對藥理活性的影響根據(jù)對HeLa S3癌細(xì)胞的細(xì)胞增殖抑制作用(體外)對實(shí)施例9的組合物的藥理活性進(jìn)行評估。進(jìn)行實(shí)驗(yàn)時(shí)，將HeLa S3癌細(xì)胞以104細(xì)胞/孔的密度接種在96孔的滴定板中進(jìn)行24小時(shí)或更長時(shí)間的培養(yǎng)，確認(rèn)細(xì)胞充分附著在板中后，添加該組合物，繼續(xù)進(jìn)行培養(yǎng)。在CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)3天后，用MTT法測定存活細(xì)胞數(shù)，再用下式算出細(xì)胞增殖抑制率，其結(jié)果如表5所示。
細(xì)胞增殖抑制率(％)＝(復(fù)合體處理群的吸光度值/對照群的吸光度)×100
表5

(a)聚肌苷酸鈉鹽(Yamasa醬油株式會社制)(b)聚胞苷酸鈉鹽(Yamasa醬油株式會社制)如表5所示，各組合物對作為癌細(xì)胞株的HeLa S3的細(xì)胞增殖抑制作用和平均鏈長有很大關(guān)系。表5中，一般作為干擾素誘導(dǎo)劑使用的1000 b以上的長鏈聚肌苷酸·聚胞苷酸顯現(xiàn)出最強(qiáng)的增殖抑制作用，本發(fā)明的平均鏈長在0.1kb～1kb范圍內(nèi)的磷酸位移率較低的短鏈化聚肌苷酸·聚胞苷酸雖然略低，但也保持了足夠強(qiáng)的增殖抑制作用。此外，當(dāng)平均鏈長不足100 b時(shí)細(xì)胞增殖抑制作用急劇下降，接近寡核苷酸程度的多核苷酸幾乎不顯現(xiàn)活性。
試驗(yàn)例2對骨髓細(xì)胞的影響對骨髓毒性進(jìn)行研究作為毒性評估。對ddY小鼠(雄性，8周)靜脈注射市售的聚肌苷酸鈉鹽(S020，w(沉降系數(shù))8.8，Yamasa醬油株式會社制)和聚胞苷酸鈉鹽(S020，w(沉降系數(shù))8.6，Yamasa醬油株式會社制)，以及實(shí)施例5和6中的磷酸位移率較低的聚肌苷酸、聚胞苷酸中平均鏈長分別為982 b和907 b的多核苷酸，第2天從大腿骨處抽取骨髓細(xì)胞。用新亞甲藍(lán)和吉姆薩對細(xì)胞進(jìn)行染色，測定網(wǎng)織紅細(xì)胞和成熟紅細(xì)胞，其結(jié)果如表6所示。表6的骨髓毒性是指網(wǎng)織紅細(xì)胞數(shù)和全部紅細(xì)胞數(shù)之比，由下式定義。此外，*標(biāo)記為顯著性水平p＜0.01，表示試驗(yàn)群和靜脈內(nèi)注射了無多核苷酸的載體的對照群的顯著性差異(Dunnett的多重比較法)。
骨髓毒性＝(網(wǎng)織紅細(xì)胞數(shù)/網(wǎng)織紅細(xì)胞數(shù)＋成熟紅細(xì)胞數(shù))表6

(a)聚肌苷酸鈉鹽(Yamasa醬油株式會社制)(b)聚胞苷酸鈉鹽(Yamasa醬油株式會社制)從表6可看出，一般作為干擾素誘導(dǎo)劑使用的平均鏈長超過1000 b的長鏈聚肌苷酸·聚胞苷酸的投藥量即使只有1mg/kg，其對應(yīng)于對照群的變化也達(dá)到了39％，而本發(fā)明的平均鏈長在0.1kb～1kb范圍內(nèi)的磷酸位移率較低的短鏈化聚肌苷酸·聚胞苷酸的投藥量即使是前述的25倍，和對照群相比也未顯現(xiàn)出顯著性差異。從上述結(jié)果可知，聚肌苷酸·聚胞苷酸的毒性和藥理活性一樣，和平均鏈長有極大的關(guān)系，這樣就完全意外地發(fā)現(xiàn)本發(fā)明的短鏈化多核苷酸能夠大幅度地緩解毒性。
試驗(yàn)例3對A431癌細(xì)胞的細(xì)胞增殖抑制作用(體外)(平均鏈長200±50b)使用實(shí)施例13和14的磷酸位移率為0.7～4.2％的聚肌苷酸和磷酸位移率為1.2～3.8％的聚胞苷酸、實(shí)施例1和2的短鏈化聚肌苷酸和聚胞苷酸，與實(shí)施例11同樣操作獲得組合物。將A431癌細(xì)胞以104細(xì)胞/孔的密度接種在96孔的滴定板中進(jìn)行5小時(shí)以上的培養(yǎng)，確認(rèn)細(xì)胞充分附著在板中后，添加該組合物，繼續(xù)進(jìn)行培養(yǎng)，在二氧化碳培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)3天后，用MTT法測定存活細(xì)胞數(shù)，再用前述式1求得細(xì)胞增殖抑制率，由細(xì)胞增殖抑制率算出對應(yīng)于50％的細(xì)胞增殖抑制率的聚肌苷酸鈉鹽和聚胞苷酸鈉鹽的合計(jì)濃度(IC50值)，其結(jié)果如表7所示。
表7

從表7可看出，該組合物對癌細(xì)胞A431的細(xì)胞增殖抑制作用和磷酸位移率有很大的關(guān)系。即，不論是聚肌苷酸還是聚胞苷酸，從3’位轉(zhuǎn)移到2’位的磷酸基團(tuán)越多，顯現(xiàn)出越弱的增殖抑制作用。值得注意的是，本發(fā)明的磷酸位移率較低的短鏈化聚肌苷酸、短鏈化聚胞苷酸(磷酸位移率在3％以下，特別好的在2％以下)的組合對細(xì)胞的增殖抑制作用大幅度增強(qiáng)。此外，磷酸位移率為3％，特別是超過2％的聚肌苷酸和聚胞苷酸的組合雖然有協(xié)同作用，但增殖抑制作用有減弱的趨勢。例如，表7中，磷酸位移率為2.0％和1.9％的聚肌苷酸和聚胞苷酸的組合和同樣的磷酸位移率為2.8％及2.7％或4.2％及3.8％的聚肌苷酸和聚胞苷酸的組合相比，IC50之比提高12倍或47倍。極為意外地發(fā)現(xiàn)，以3’位轉(zhuǎn)移到2’位的磷酸位移率為3％，特別是2％為界，藥理活性有了急劇提高。
試驗(yàn)例4 因磷酸位移而造成的熔解溫度(Tm)和藥理活性的變化在溫度上升到特定溫度時(shí)，雙鏈RNA被分解為單鏈RNA。由于該溫度因包含在RNA中的堿基種類的不同而顯現(xiàn)出特定值，所以該溫度為雙鏈RNA的熔解溫度，一般被稱為Tm值。在對該Tm值進(jìn)行測定時(shí)可采用各種方法，但本實(shí)施例使用最普通的吸光光度法對實(shí)施例15及比較例5的雙鏈RNA的Tm值進(jìn)行測定，其結(jié)果如表8所示。此外，同樣記錄在表8中的IC50值是試驗(yàn)例3的測定結(jié)果。
表8

各組合物的磷酸位移率約為0～4％的聚肌苷酸·聚胞苷酸的Tm值測定結(jié)果無明顯差異(一般作為干擾素誘導(dǎo)劑使用的長鏈聚肌苷酸·聚胞苷酸的Tm值為61℃)。即，由磷酸位移率約為0～4％的聚肌苷酸·聚胞苷酸獲得了以雙鏈RNA為特征的雙重螺旋結(jié)構(gòu)。但是，從試驗(yàn)例3可知，由于以2％～3％的磷酸位移率為界的多核苷酸的藥理活性提高4倍～50倍不等，所以意外地發(fā)現(xiàn)作為聚肌苷酸·聚胞苷酸的主要藥效的免疫活性作用和抗癌作用不僅受雙鏈RNA的雙重螺旋結(jié)構(gòu)的影響，還受磷酸基團(tuán)的位移率的影響。而且，從3’位轉(zhuǎn)移到2’位的磷酸基團(tuán)的位移率在2％～3％的范圍內(nèi)時(shí)，其藥理活性急劇提高。
試驗(yàn)例5 短鏈化多核苷酸的平均鏈長的測定(GPC法)在以下的凝膠滲透層析(GPC)的操作條件下，用1mg/mL的多核苷酸水溶液進(jìn)行試驗(yàn)，求得平均鏈長。
GPC操作條件檢測波長UV 260nm柱 Tosoh-TSKgel G5000PWXL 7.8mmφ×300mm流動(dòng)相 含有7M尿素的50mM的Tris-鹽酸緩沖液(pH7.5)流速0.5mL/min.
尺寸標(biāo)記RNA Ladder(1770 b，1520 b，1280 b，780 b，530b，400 b，280 b，155 b)(Gibco BRL株式會社制)
試驗(yàn)例6 磷酸位移率的測定在1mg/mL的多核苷酸水溶液1mL中加入3.2mL的500U/mL的核酸酶P1(來源于青霉，生化學(xué)工業(yè)株式會社制)，再加入水稀釋至5mL。將該水溶液放置在37℃的熱水浴中使反應(yīng)進(jìn)行1小時(shí)后，加水至10mL。從該反應(yīng)液中取出3.2mL，在其中加入0.1U/mL的堿性磷酸酶(來源于牛仔的小腸，生化學(xué)工業(yè)株式會社制)水溶液0.8mL后，在37℃的熱水浴中使反應(yīng)進(jìn)行30分鐘，再對該溶液進(jìn)行適當(dāng)?shù)南♂?，按照以下的液相色譜法的操作條件進(jìn)行試驗(yàn)，對含有2’-5’磷酸二酯鍵的二聚體進(jìn)行定量，測定磷酸位移率。
液相色譜法操作條件檢測波長UV 260nm柱 資生堂Capcell pack C18 UG1205μm 4.6mmφ×250mm流動(dòng)相 含有5mM硫酸氫四丁基銨的50mM磷酸緩沖液(pH8)和甲醇的混合液(95∶5)流速1mL/min.
權(quán)利要求
1.短鏈化多核苷酸或其鹽，其特征在于，2’-5’磷酸二酯鍵占所有磷酸二酯鍵的3％以下。
2.如權(quán)利要求1所述的短鏈化多核苷酸或其鹽，其中，多核苷酸為聚肌苷酸或其類似物、聚胞苷酸或其類似物、聚腺苷酸或其類似物、或聚尿苷酸或其類似物。
3.如權(quán)利要求1或2所述的短鏈化多核苷酸或其鹽，其中，所述短鏈化多核苷酸或鹽的平均鏈長在0.1k bases～1k bases的范圍內(nèi)。
4.具有雙鏈的多核苷酸或其鹽，其特征在于，由權(quán)利要求1～3的任一項(xiàng)所述的短鏈化多核苷酸或其鹽中，可形成雙鏈的2個(gè)短鏈化多核苷酸或鹽形成。
5.如權(quán)利要求4所述的具有雙鏈的多核苷酸或其鹽，其中，可形成雙鏈的2個(gè)短鏈化多核苷酸選自聚肌苷酸·聚胞苷酸、聚腺苷酸·聚尿苷酸、聚肌苷酸類似物·聚胞苷酸、聚肌苷酸·聚胞苷酸類似物、聚肌苷酸類似物·聚胞苷酸類似物、聚腺苷酸類似物·聚尿苷酸、聚腺苷酸·聚尿苷酸類似物、聚腺苷酸類似物·聚尿苷酸類似物。
6.權(quán)利要求1～3的任一項(xiàng)所述的短鏈化多核苷酸或其鹽的制法，其特征在于，在pH值為7～10的溶液中，在20～110℃的溫度條件下，使多核苷酸或其鹽短鏈化。
7.如權(quán)利要求1～3的任一項(xiàng)所述的短鏈化多核苷酸或其鹽，其特征還在于，多核苷酸或其鹽通過磷酸二酯酶短鏈化。
8.含有復(fù)合體的組合物，其特征在于，所述復(fù)合體以可將藥物移入細(xì)胞內(nèi)的有效載體和權(quán)利要求1～3的任一項(xiàng)所述的短鏈化多核苷酸或其鹽，或權(quán)利要求4或5所述的具有雙鏈的短鏈化多核苷酸或其鹽為必須構(gòu)成組分。
9.如權(quán)利要求8所述的組合物，其中，可將藥物移入細(xì)胞內(nèi)的有效載體為帶有正電荷的載體。
10.如權(quán)利要求9所述的組合物，其中，帶有正電荷的載體為陽離子脂質(zhì)體。
11.如權(quán)利要求8所述的組合物，其中，可將藥物移入細(xì)胞內(nèi)的有效載體以2-o-(2-二乙基氨基乙基)氨基甲酰基-1，3-o-二油酰基甘油和磷脂為必須構(gòu)成組分。
12.如權(quán)利要求8～11的任一項(xiàng)所述的組合物，其中，所述組合物為藥劑。
13.如權(quán)利要求12所述的組合物，其中，所述藥劑為干擾素誘導(dǎo)劑、免疫活性劑、細(xì)胞內(nèi)核酸酶活性劑、癌治療劑或預(yù)防劑、肝炎治療劑或預(yù)防劑。
全文摘要
本發(fā)明的目的是提供作為醫(yī)藥品特別有用的短鏈化多核苷酸或含有短鏈化多核苷酸的醫(yī)藥組合物。本發(fā)明的短鏈化多核苷酸或其鹽、以及含有其中任1種的醫(yī)藥組合物的特征是,2’－5’磷酸二酯鍵占所有磷酸二酯鍵的3%以下。
文檔編號A61P43/00GK1340055SQ00803787
公開日2002年3月13日 申請日期2000年2月14日 優(yōu)先權(quán)日1999年2月15日
發(fā)明者松山伸二, 石山幸一, 關(guān)純造, 大木忠明 申請人:日本新藥株式會社