專利名稱：可溶性受體br43×2和應(yīng)用方法
背景技術(shù)：
在免疫應(yīng)答過程中發(fā)生的細(xì)胞相互作用由幾種細(xì)胞表面受體家族，包括腫瘤壞死因子受體(TNFR)家族的成員所調(diào)節(jié)。該TNFR家族由多種膜內(nèi)在糖蛋白受體組成，其中許多聯(lián)合它們的各自配體調(diào)節(jié)不同的造血細(xì)胞系之間的相互作用(Smith等，細(xì)胞和病毒蛋白質(zhì)的TNF受體超家族激活、共同刺激和死亡(The TNF Receptor Superfamily of Cellular andViral ProteinsActivation，Costimulation and Death)，76959-62，1994；Cosman，干細(xì)胞(Stem Cells)12440-55，1994)。
一個這樣的受體是跨膜激活物及CAML-相互作用物TACI(von Bülow和Bram，科學(xué)(Science)228138-41，1997；和WIPO公開文本W(wǎng)O98/39361)。TACI是一個膜結(jié)合受體，具有一個含兩個富含半胱氨酸假重復(fù)的細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域、一個跨膜域和一個與CAML(鈣調(diào)節(jié)物和親環(huán)蛋白配體)相互作用的細(xì)胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域，TACI是一個膜內(nèi)在蛋白，位于細(xì)胞內(nèi)小泡上，當(dāng)在Jurkat細(xì)胞中超量表達(dá)時是NF-AT激活的輔誘導(dǎo)物。TACI與B細(xì)胞和一種T細(xì)胞亞型相關(guān)。von Bulow和Bram(同上)報道，TACI的配體是未知的。
已發(fā)現(xiàn)本發(fā)明的多肽，即僅具有一個富含半胱氨酸假重復(fù)的TACI同種型(BR43×2)、TACI和相關(guān)的B細(xì)胞蛋白質(zhì)BCMA(Gras等，國際免疫學(xué)(Int.Immunol.)171093-106，1995)，可以結(jié)合目前稱作neutrokineα(WIPO公開文本，WO98/18921)、BlyS(Moore等，科學(xué)，285260-3，1999)、BAFF(Schneider等，實(shí)驗(yàn)醫(yī)學(xué)雜志(J.Exp.Med.)1891747-56，1999)、TALL-1(Shu等，白細(xì)胞生物學(xué)雜志(J.Leukoc.Biol.)65680-3，1999)或THANK(Mukhopadhyay等，生物化學(xué)雜志(J.Biol.Chem.)27415978-81，1999)的TNF配體ztnf4。因而，BR43×2、TACI和BCMA對于調(diào)節(jié)ztnf4的活性，尤其是調(diào)節(jié)B細(xì)胞的激活，將是有用的。
為此，本發(fā)明提供用于調(diào)節(jié)ztnf4或其它BR43×2、TACI或BCMA配體的活性的蛋白質(zhì)治療法、相關(guān)的組合物和方法，以及從本文中本領(lǐng)域技術(shù)人員將明了的其它用途。
發(fā)明概述一個方面，本發(fā)明提供在哺乳動物中抑制ztnf4活性的方法，包括施用一定量的選自下組的化合物a)含有BR34×2胞外域的多肽；b)含有TACI胞外域的多肽；c)含有BCMA胞外域的多肽；d)含有SEQ ID NO10的序列的多肽；e)與SEQ ID NO2的多肽特異結(jié)合的抗體或抗體片段；f)與SEQ ID NO4的多肽特異結(jié)合的抗體或抗體片段；g)與SEQ ID NO6的多肽特異結(jié)合的抗體或抗體片段；h)與SEQ ID NO8的多肽特異結(jié)合的抗體或抗體片段；i)與SEQ ID NO10的多肽特異結(jié)合的抗體或抗體片段；k)SEQ ID NO4的多肽；l)SEQ ID NO6的第1-166位氨基酸殘基；和m)SEQ ID NO8的第1-150位氨基酸殘基。
在一個實(shí)施方案中，所述化合物是由通過肽鍵連接在一起的第一部分和第二部分組成的融合蛋白，所述第一部分含有選自下組的多肽a)含有SEQ ID NO8的序列的多肽；b)含有SEQ ID NO2第25-58位氨基酸殘基的多肽；c)含有SEQ ID NO6第34-66位氨基酸殘基的多肽；d)含有SEQ ID NO6第71-104位氨基酸殘基的多肽；e)含有SEQ ID NO6第25-104位氨基酸殘基的多肽；f)含有SEQ ID NO8第8-37位氨基酸殘基的多肽；g)含有SEQ ID NO8第41-88位氨基酸殘基的多肽；h)含有SEQ ID NO8第8-88位氨基酸殘基的多肽；而所述第二部分含有另一多肽。在另一個實(shí)施方案中，該第一部分還含有選自下組的多肽a)SEQ ID NO2第59-120位氨基酸殘基；b)SEQ ID NO6第105-166位氨基酸殘基；和c)SEQ ID NO8第89-150位氨基酸殘基。在另一個實(shí)施方案中，該第一部分選自a)含有BR43×2胞外域的多肽；b)含有TACI胞外域的多肽；和c)含有BCMA胞外域的多肽。在一個相關(guān)實(shí)施方案中，該第一部分選自a)SEQ ID NO4的多肽；b)SEQ ID NO6的第1-154位氨基酸殘基；和c)SEQ ID NO8的第1-48位氨基酸殘基。在另一個相關(guān)實(shí)施方案中，該第二部分是免疫球蛋白的重鏈恒定區(qū)。
在另一個實(shí)施方案中，所述抗體或抗體片段選自a)多克隆抗體；b)鼠單克隆抗體；c)來源于b)的人源化抗體；和d)人單克隆抗體。在一個相關(guān)實(shí)施方案中，該抗體片段選自F(ab’)、F(ab)、Fab’、Fab、Fv、scFv和最小識別單位。在另一個實(shí)施方案中，所述哺乳動物是靈長類動物。
在另一個實(shí)施方案中，所述ztnf4活性與B淋巴細(xì)胞相關(guān)。在另一個有關(guān)的實(shí)施方案中，該ztnf4活性與激活的B淋巴細(xì)胞相關(guān)。在又一實(shí)施方案中，該ztnf4活性與靜息的B淋巴細(xì)胞相關(guān)。在另一個實(shí)施方案中，該ztnf4活性與抗體的產(chǎn)生相關(guān)。在一個有關(guān)的實(shí)施方案中，該抗體的產(chǎn)生與自身免疫病相關(guān)。在一個有關(guān)的實(shí)施方案中，所述自身免疫病是系統(tǒng)性紅斑狼瘡、重癥肌無力、多發(fā)性硬化癥或類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎。在另一個實(shí)施方案中，該ztnf4活性與哮喘、支氣管炎或肺氣腫相關(guān)。在又一實(shí)施方案中，該ztnf4活性與末期腎衰竭相關(guān)。在又一實(shí)施方案中，該ztnf4活性與腎疾病相關(guān)。在一個有關(guān)的實(shí)施方案中，該腎疾病是腎小球腎炎、脈管炎、腎炎或腎盂腎炎。在又一實(shí)施方案中，該腎疾病與腎瘤、多發(fā)性骨髓瘤、淋巴瘤、輕鏈神經(jīng)病(light chain neuropathy)或淀粉樣變相關(guān)。在另一個實(shí)施方案中，該ztnf4活性與效應(yīng)T細(xì)胞相關(guān)。在一個有關(guān)的實(shí)施方案中，該ztnf4活性與調(diào)節(jié)免疫應(yīng)答相關(guān)。在又一實(shí)施方案中，該活性與免疫抑制相關(guān)。在又一實(shí)施方案中，免疫抑制與移植排斥、移植物抗宿主疾病或炎癥相關(guān)。在另一個實(shí)施方案中，該活性與自身免疫病相關(guān)。在一個有關(guān)的實(shí)施方案中，該自身免疫病是胰島素依賴性糖尿病或Crohn氏病。在另一個實(shí)施方案中，該ztnf4活性與炎癥相關(guān)。在一個有關(guān)的實(shí)施方案中，該炎癥與關(guān)節(jié)疼痛、腫脹、貧血、敗血癥性休克相關(guān)。在另一個方面，本發(fā)明提供用于抑制BR34×2、TACI或BCMA受體-配體嚙合(receptor-ligand engagement)的方法，包括施用一定量的上述化合物。在另一個實(shí)施方案中，該BR34×2、TACI或BCMA受體-配體嚙合與B淋巴細(xì)胞相關(guān)。在另一個有關(guān)的實(shí)施方案中，該BR34×2、TACI或BCMA受體-配體嚙合與激活的B淋巴細(xì)胞相關(guān)。在又一實(shí)施方案中，該BR34×2、TACI或BCMA受體-配體嚙合與靜息的B淋巴細(xì)胞相關(guān)。
在另一個實(shí)施方案中，該BR34×2、TACI或BCMA受體-配體嚙合與抗體的產(chǎn)生相關(guān)。在一個有關(guān)的實(shí)施方案中，該抗體的產(chǎn)生與自身免疫病相關(guān)。在一個有關(guān)的實(shí)施方案中，該所述自身免疫病是系統(tǒng)性紅斑狼瘡、重癥肌無力、多發(fā)性硬化癥或類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎。在另一個實(shí)施方案中，該BR34×2、TACI或BCMA受體-配體嚙合與哮喘、支氣管炎或肺氣腫相關(guān)。在又一實(shí)施方案中，該BR34×2、TACI或BCMA受體-配體嚙合與末期腎衰竭相關(guān)。在又一實(shí)施方案中，該BR34×2、TACI或BCMA受體-配體嚙合與腎疾病相關(guān)。在一個有關(guān)的實(shí)施方案中，該腎疾病是腎小球性腎炎、脈管炎、腎炎或腎盂腎炎。在又一實(shí)施方案中，該腎疾病與腎瘤、多發(fā)性骨髓瘤、淋巴瘤、輕鏈神經(jīng)病或淀粉樣變相關(guān)。在另一個實(shí)施方案中，該BR34×2、TACI或BCMA受體-配體嚙合與效應(yīng)T細(xì)胞相關(guān)。在一個有關(guān)的實(shí)施方案中，該BR34×2、TACI或BCMA受體-配體嚙合與免疫應(yīng)答的調(diào)節(jié)相關(guān)。在又一實(shí)施方案中，該活性與免疫抑制相關(guān)。在又一實(shí)施方案中，免疫抑制與移植排斥、移植物抗宿主疾病或炎癥相關(guān)。在另一個實(shí)施方案中，該活性與自身免疫病相關(guān)。在一個有關(guān)的實(shí)施方案中，該自身免疫病是胰島素依賴性糖尿病或Crohn氏病。在另一個實(shí)施方案中，該BR34×2、TACI或BCMA受體-配體嚙合與炎癥相關(guān)。在一個有關(guān)的實(shí)施方案中，該炎癥與關(guān)節(jié)疼痛、腫脹、貧血、敗血癥性休克相關(guān)。
在另一個方面，本發(fā)明提供編碼SEQ ID NO2的多肽的分離多核苷酸分子。還提供SEQ ID NO1的分離多核苷酸分子。在一個有關(guān)實(shí)施方案中，提供含有以下可操作地連接的元件的表達(dá)載體轉(zhuǎn)錄啟動子、以上描述的多核苷酸分子和轉(zhuǎn)錄終止子。在另一個實(shí)施方案中，該表達(dá)載體還含有可操作地與所述多核苷酸分子連接的分泌性受體-配體嚙合序列。本發(fā)明還提供其中導(dǎo)入了上述表達(dá)載體的培養(yǎng)細(xì)胞，其中所述培養(yǎng)細(xì)胞表達(dá)所述多核苷酸片段所編碼的所述多肽。本發(fā)明還提供制備多肽的方法，包括培養(yǎng)其中已導(dǎo)入了上述表達(dá)載體的細(xì)胞；籍此所述細(xì)胞表達(dá)所述多核苷酸分子編碼的所述多肽；和回收所述表達(dá)多肽。本發(fā)明還提供具有SEQ ID NO2的序列的分離多肽。在一個有關(guān)的實(shí)施方案中，該多肽與可藥用載體(vehicle)組合在一起。
附圖簡述

圖1顯示了BR34×2、TACI(vonBülow和Bram，同上)(SEQ ID NO6)、BCMA(Gfas等，同上)(SEQ ID NO6)和BR43×1(SEQ ID NO7)之間的多氨基酸序列比對。圖中標(biāo)出了該富含半胱氨酸假重復(fù)和跨膜結(jié)構(gòu)域。
圖2顯示了可溶性I125-ztnf4與穩(wěn)定的BHK轉(zhuǎn)染子所表達(dá)的TACI和BCMA結(jié)合的斯卡查德圖分析。
圖3A顯示了ztnf4輔助激活人B淋巴細(xì)胞以增殖并分泌免疫球蛋白。
圖3B顯示了培養(yǎng)9天后，從有IL4或IL4+IL5時用可溶性ztnf4刺激的B細(xì)胞獲得的上清液中，所測量到的IgM和IgG水平。
圖4顯示了在存在IL-4的情況下用可溶性ztnf4或?qū)φ盏鞍?泛素)體外刺激5天的人外周血B細(xì)胞。測試了純化的TACI-Ig、BCMA-Ig和對照Fc對ztnf4特異性增殖的抑制。
圖5A顯示了從產(chǎn)生SLE特性的ztnf4轉(zhuǎn)基因動物獲得的結(jié)果。
圖5B顯示了用針對CD5、CD4和CD8的抗體染色的ztnf4轉(zhuǎn)基因動物的淋巴結(jié)、脾和胸腺細(xì)胞。
圖5C顯示了6-23周齡轉(zhuǎn)基因ztnf4動物的血清中總的IgM、IgG和IgE水平。
圖5D顯示了在ztnf4轉(zhuǎn)基因動物的腎切片中所鑒定到的腎小球中淀粉樣沉積和腎小球膜增厚。
圖5E顯示了ztnf4轉(zhuǎn)基因小鼠中的效應(yīng)T細(xì)胞。
圖6A和B顯示了從ZNBWF1小鼠和MRL/lpr/lpr小鼠血清中獲得的與SLE的發(fā)生相關(guān)的ztnf4水平升高。
圖7顯示了在研究期間出現(xiàn)蛋白尿的NZBWF1小鼠的百分?jǐn)?shù)。
圖8顯示了與ZNBWF1和MRL/lpr/lpr小鼠的血清相比，通過ELISA測定的ztnf4轉(zhuǎn)基因小鼠和對照同窩出生幼仔的抗dsDNA水平。
通過參考以下詳細(xì)說明書，本發(fā)明的這些和其它方面將是明顯的。發(fā)明詳述在闡述本發(fā)明之前，闡明下文中用到的某些術(shù)語的定義可能對于本發(fā)明的理解將是有幫助的。
親和標(biāo)記物在本文中用于指能夠與第二多肽結(jié)合從而為該第二多肽的純化或檢測作準(zhǔn)備，或?yàn)樵摰诙嚯呐c基質(zhì)的結(jié)合提供位點(diǎn)的多肽片段。原則上，任何可以獲得其抗體或其它特異性結(jié)合劑的肽或蛋白質(zhì)均可以用作親和標(biāo)記物。親和標(biāo)記物包括聚組氨酸序列、A蛋白(Nilsson等，EMBO J.41075，1985；Nilsson等，酶學(xué)方法(Methods Enzymol.)1983，1991)、谷胱苷肽S-轉(zhuǎn)移酶(Smith和Johnson，基因(Gene)6731，1988)、Glu-Glu親和標(biāo)記物(Grussenmeyer等，美國國家科學(xué)院院刊(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)827952-4，1985)、P物質(zhì)、FlagTM肽(Hopp等，生物技術(shù)(Biotechnology)61204-10，1988)、鏈霉親和素結(jié)合肽、或其它抗原表位或結(jié)合域。一般參見Ford等，蛋白質(zhì)表達(dá)和純化(Protein Expression and Purification)295-107，1991。編碼親和標(biāo)記物的DNA可以從供應(yīng)商處獲得(例如PharmaciaBiotech，Piscataway，NJ)。
等位變體是指占據(jù)同一個染色體座位的一個基因的兩種或多種不同形式中的任意一種。等位變異通過突變自然發(fā)生，并可導(dǎo)致種群內(nèi)的表型多態(tài)現(xiàn)象。基因突變可以是沉默的(在編碼的多肽中沒有變化)，也可編碼具有改變的氨基酸序列的多肽。術(shù)語“等位變體”在本文中還用于指由一個基因的等位變體編碼的蛋白質(zhì)。也包括由于等位變異而與參考氨基酸序列不同的來自同一物種的相同蛋白質(zhì)。等位變異是指在編碼指定蛋白質(zhì)的基因中個體之間天然存在的差異。
氨基端和羧基端在本文中用以指示多肽和蛋白質(zhì)中的位置。在上下文允許的地方，對于多肽或蛋白質(zhì)的一個特定序列或部分這些術(shù)語用以指示鄰近或相對位置。例如，在一個蛋白質(zhì)中位于一個參考序列羧基端的某個序列，其位置與該參考序列的羧基端接近，但不一定位于該完整蛋白質(zhì)的羧基端。
互補(bǔ)物/抗互補(bǔ)物對(complement/anti-complement pair)；是指在適當(dāng)條件下形成一個非共價連接的穩(wěn)定對的不相同部分。例如，生物素和抗生物素蛋白(或鏈霉親和素)是一個互補(bǔ)物/抗互補(bǔ)物對的原型成員。其它典型的互補(bǔ)物/抗互補(bǔ)物對包括受體/配體對、抗體/抗原(或半抗原或表位)對、有義/反義多核苷酸對等等。當(dāng)期望該互補(bǔ)物/抗互補(bǔ)物對隨后發(fā)生解離時，該互補(bǔ)物/抗互補(bǔ)物對優(yōu)選具有＜10-9M的結(jié)合親和力。
重疊群是指具有一段與另一個多核苷酸毗連的相同或互補(bǔ)序列的多核苷酸。毗連序列被稱為與一段指定的多核苷酸序列完全地或沿該多核苷酸的部分序列“重疊”。例如，多核苷酸序列5’-ATGGCTTAGCTT-3’的代表性重疊群是5’-TAGCTTgagtct-3’和3’-gtcgacTACCGA-5’。
多核苷酸分子的互補(bǔ)物是指與參考序列相比具有互補(bǔ)的堿基和相反取向的多核苷酸分子。例如，序列5’ATGCACGGG3’與5’CCCGTGCAT3’互補(bǔ)。
簡并核苷酸序列或簡并序列是指(與編碼多肽的參考多核苷酸分子相比)包括了一個或多個簡并密碼子的核苷酸序列。簡并密碼子含有不同的核苷酸三聯(lián)體，但編碼相同的氨基酸殘基(例如，GAU和GAC三聯(lián)體均編碼Asp)。
表達(dá)載體線性或環(huán)狀DNA分子，其含有與為其轉(zhuǎn)錄提供條件的其它片段可操作連接并編碼目的多肽的片段。這些其它片段可以包括啟動子與終止子序列、和任選的一個或多個復(fù)制原點(diǎn)、一個或多個選擇標(biāo)記、增強(qiáng)子、聚腺苷酸化信號等等。表達(dá)載體一般來源于質(zhì)?；虿《綝NA，或可以同時含有兩者的元件。
同種型是指可以由不同基因或由相同基因通過不同拼接產(chǎn)生的一種蛋白質(zhì)的不同形式。在某些情況中，同種型在運(yùn)輸活性、發(fā)育中的表達(dá)時間、組織分布、細(xì)胞內(nèi)定位或這些性質(zhì)的組合上不同。
分離的多核苷酸是指該多核苷酸已從其天然遺傳環(huán)境中被取出，并因此不含有其它外來的或不想要的編碼序列，而且其以適合在遺傳工程蛋白質(zhì)生產(chǎn)系統(tǒng)中應(yīng)用的形式存在。這些分離的分子是那些從其天然環(huán)境中分離出來的分子，包括cDNA和基因組克隆。本發(fā)明的分離DNA分子不含有通常與其相連的其它基因，但可以包括天然存在的5’和3’非翻譯區(qū)例如啟動子和終止子。相連區(qū)域的鑒定對于本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員是明了的(見例如，Dynan和Tijan，自然316774-78，1985)。
分離的多肽或蛋白質(zhì)是在非其天然環(huán)境的情況下，例如在脫離血液和動物組織的情況下存在的多肽或蛋白質(zhì)。在一種優(yōu)選形式中，該分離的多肽基本不含有其它多肽，尤其是動物來源的其它多肽。優(yōu)選提供高度純化形式的多肽，即純度大于95％，更優(yōu)選純度大于99％的多肽。當(dāng)在本文中使用時，該術(shù)語“分離的”并不排除存在另一種物理形式的相同多肽，例如二聚體或其它的糖基化或衍生形式。
可操作地連接當(dāng)應(yīng)用于核苷酸片段時，術(shù)語“可操作地連接”指這些片段被排列起來，以致它們可以為了預(yù)期的目的，例如在啟動子中起始轉(zhuǎn)錄并沿著編碼片段向終止子前進(jìn)，而協(xié)調(diào)地發(fā)揮功能。
直向同源物(ortholog)是指從一個物種獲得的多肽或蛋白質(zhì)，其是另一個物種的多肽或蛋白質(zhì)的功能對應(yīng)物。直向同源物之間的序列差異是物種形成的結(jié)果。
多核苷酸是指從5’向3’末端進(jìn)行閱讀的脫氧核糖核苷酸或核糖核苷酸堿基的單鏈或雙鏈聚合物。多核苷酸包括RNA和DNA，并且可以是從天然來源分離的、體外合成的、或是從天然和合成分子的組合制備的。多核苷酸的大小以堿基對(縮寫“bp”)、核苷酸(“nt”)或千堿基(“kb”)表示。在上下文允許時，后兩個術(shù)語可以描述單鏈或雙鏈多核苷酸。當(dāng)該術(shù)語應(yīng)用于雙鏈分子時，其用以指整個長度，并應(yīng)理解為與術(shù)語“堿基對”相同。本領(lǐng)域技術(shù)人員會知曉，雙鏈多核苷酸的兩條鏈可以在長度上稍有不同，并且它們的末端可以由于酶切的緣故而是交錯的；因此在雙鏈多核苷酸分子中并非所有核苷酸都是配對的。這些非配對末端一般長度不超過20個nt。
多肽是通過肽鍵連接起來的氨基酸殘基的聚合物，而不論其是天然產(chǎn)生的還是合成產(chǎn)生的。少于大約10個氨基酸殘基的多肽通常被稱作“肽”。
啟動子是指含有提供用于RNA聚合酶的結(jié)合和轉(zhuǎn)錄起始的DNA序列的基因部分。啟動子序列通常但并不總是存在于基因的5’非編碼區(qū)中。
蛋白質(zhì)是含有一或多條多肽鏈的大分子。蛋白質(zhì)還可以含有非肽成分，例如糖基。可以通過產(chǎn)生蛋白質(zhì)的細(xì)胞向蛋白質(zhì)添加糖和其它非肽取代基，而且這些糖和其它非肽取代基隨著細(xì)胞類型的不同而改變。蛋白質(zhì)在本文中根據(jù)其氨基酸主鏈結(jié)構(gòu)來定義；一般說來取代基例如糖基并不指明，但可以存在。
受體與生物活性分子(“配體”)結(jié)合并介導(dǎo)配體對細(xì)胞的作用的細(xì)胞相關(guān)蛋白質(zhì)，或該蛋白質(zhì)的多肽亞基。配體與受體的結(jié)合導(dǎo)致受體的變化(并在某些情況中，導(dǎo)致受體的多聚化，即相同或不同的受體亞基的連接)，從而引起受體的一個或多個效應(yīng)域和細(xì)胞內(nèi)的一個或多個其它分子之間發(fā)生相互作用。這些相互作用接著導(dǎo)致該細(xì)胞代謝的改變。與受體-配體相互作用連接的代謝事件包括基因轉(zhuǎn)錄、磷酸化、去磷酸化、細(xì)胞增殖、環(huán)AMP產(chǎn)生的增加、細(xì)胞鈣的轉(zhuǎn)移、膜脂的轉(zhuǎn)移、細(xì)胞粘附、肌醇脂的水解和磷脂的水解。BR43×2具有TNF受體的特性，本文將對此作更為詳細(xì)的討論。
分泌信號序列編碼如下多肽(“分泌肽”)的DNA序列，該多肽作為一個更大多肽的成分指導(dǎo)該更大多肽通過合成該更大多肽的細(xì)胞的分泌途徑。該更大多肽通常在通過該分泌途徑的運(yùn)輸過程中被裂解除去該分泌肽。
可溶性受體不與細(xì)胞膜結(jié)合的受體多肽?？扇苄允荏w最普遍的是缺乏跨膜域和細(xì)胞質(zhì)域的配體結(jié)合受體多肽?？扇苄允荏w可以含有額外的氨基酸殘基，例如為純化該多肽提供條件或?yàn)樵摱嚯呐c基質(zhì)的結(jié)合提供位點(diǎn)的親和標(biāo)記物。許多細(xì)胞表面受體具有天然存在的可溶性對應(yīng)物，該對應(yīng)物經(jīng)蛋白水解產(chǎn)生，或從另外一種拼接形式的mRNA翻譯產(chǎn)生。當(dāng)受體多肽缺乏足夠的跨膜和細(xì)胞內(nèi)多肽片段以分別提供膜錨定或信號轉(zhuǎn)導(dǎo)時，它們被認(rèn)為基本上沒有這些片段。
通過粗略的分析方法(例如凝膠電泳)測定的聚合物的分子量和長度應(yīng)理解為是近似值。當(dāng)該值以“大約”X或“近似”X表示時，所描述的X值應(yīng)理解為準(zhǔn)確至±10％。
本文所引用的所有文獻(xiàn)均以參考文獻(xiàn)的形式完整地并入。
本發(fā)明部分基于對受體TACI的一種同種型，即一個1192bp DNA序列(SEQ ID NO1)和其相應(yīng)多肽序列(SEQ ID NO2)的發(fā)現(xiàn)。該同種型被命名為BR43×2。BR43×2的可溶性形式公開于SEQ ID NO4，該多核苷酸編碼SEQ ID NO3中的可溶性受體。本發(fā)明編碼BR43×2受體的多核苷酸和多肽最初是采用人類RPMI 1788文庫和N-或C-端FLAG-標(biāo)記、生物素-或FITC-標(biāo)記的目前被稱為neutrokineα(WIPOWO98/18921)、Blys(Moore等，同上)、BAFF(Schneider等，同上)、TALL-1(Shu等，同上)或THANK(Mukhopadhyay等，同上)的腫瘤壞死因子配體ztnf4，通過信號誘捕克隆(signal trap cloning)鑒定的，這在本文中有更為詳細(xì)的描述。通過配體結(jié)合鑒定陽性庫，然后將其分解成單個克隆，分離該cDNA并測序。該BR43×2的推導(dǎo)氨基酸序列(顯示于SEQ ID NO2)與已知腫瘤壞死因子受體的比較揭示，BR34×2是TACI的同種型，僅具有一個保守性差的富含半胱氨酸的假重復(fù)。
結(jié)構(gòu)上，該TNF受體家族的特征在于，細(xì)胞外部分由歷史上稱作“富含半胱氨酸的假重復(fù)”的幾個組件構(gòu)成。一個原型TNFR家族成員具有相繼向右排列的4個這樣的假重復(fù)，每一個長大約29-43個殘基。一個典型的假重復(fù)具有6個半胱氨酸殘基。由于盡管它們看上去似乎來源于一個共同的祖先組件，但又并非完全重復(fù)#1、#2、#3和#4假重復(fù)具有相互區(qū)別的特征性序列特征，因此被稱作假重復(fù)。p55 TNF受體的晶體結(jié)構(gòu)顯示，每一個假重復(fù)都相應(yīng)于一個折疊域，而且所有的4個假重復(fù)均折疊成相同的四級結(jié)構(gòu)，并通過二硫鍵在內(nèi)部結(jié)合在一起。
TACI含有兩個富含半胱氨酸的假重復(fù)(von Bülow和Bram，同上)，與該TNF受體家族的其它成員相比第一個在結(jié)構(gòu)上是保守的，而第二個的保守性較差。本發(fā)明的BR43×2同種型缺少TACI的第一個富含半胱氨酸的假重復(fù)，僅保留了第二個保守性較差的重復(fù)單位。
對SEQ ID NO2所示BR43×2的推導(dǎo)氨基酸序列進(jìn)行的序列分析揭示存在一個如下成熟蛋白質(zhì)，該蛋白質(zhì)具有一個含有一富含半胱氨酸假重復(fù)(SEQ ID NO2的第25-58位殘基)的胞外域(SEQ ID NO2的第1-120位殘基)、一個跨膜域(SEQ ID NO2的第121-133位殘基)和一個細(xì)胞質(zhì)域(SEQ ID NO2的第134-247位殘基)。BR34×2的該富含半胱氨酸的假重復(fù)具有6個保守的半胱氨酸殘基(SEQ ID NO2的第25、40、43、47、54和58位殘基)、一個保守的天門冬氨酸殘基(SEQ ID NO2的第34位殘基)和兩個保守的亮氨酸殘基(SEQ ID NO2的第36和37位殘基)，并與TACI(SEQ ID NO6)的第一個富含半胱氨酸的假重復(fù)享有46％的一致性，與BCMA(SEQ ID NO8)的富含半胱氨酸的假重復(fù)享有35％的一致性(圖1)。該富含半胱氨酸假重復(fù)可以用以下基序來表示CX[QEK][QEKNRDHS][QE]X{0-2}[YFW][YFW]DXLLX{2}C[IMLV]XCX{3}CX{6-8}CX{2}[YF]C(SEQ ID NO10)，其中C表示半胱氨酸殘基、Q表示谷氨酰胺殘基、E表示谷氨酸殘基、K表示賴氨酸殘基、N表示天冬酰胺殘基、R表示精氨酸殘基、D表示天門冬氨酸殘基、H表示組氨酸殘基、S表示絲氨酸殘基、Y表示酪氨酸殘基、F表示苯丙氨酸殘基、W表示色氨酸殘基、L表示亮氨酸殘基、I表示異亮氨酸殘基、V表示纈氨酸殘基和X表示除了半胱氨酸之外的任何天然存在的氨基酸殘基。方括號“[]”內(nèi)的氨基酸殘基表示在該位置所允許的氨基酸殘基變異。括號“{}”內(nèi)的數(shù)目表示在該位置所允許的氨基酸殘基數(shù)。
本發(fā)明還提供SEQ ID NO10所給出的長度在32-40個氨基酸殘基的可溶性多肽。
SEQ ID NO4的第1-120位殘基所示可溶性BR43×2受體含有一個富含半胱氨酸假重復(fù)(SEQ ID NO4的第25-58位殘基)，而且缺少SEQID NO2中所示的BR43×2的跨膜和細(xì)胞質(zhì)域。
本領(lǐng)域的技術(shù)人員將明了，這些域的邊界是大約的，其基礎(chǔ)是與已知蛋白質(zhì)的比對和對蛋白質(zhì)折疊的預(yù)測。這些性質(zhì)揭示，由SEQ ID NOs1和3的DNA序列編碼的受體是TNF受體家族的一個成員。
利用預(yù)測可以檢測BR43×2表達(dá)的針對BR43×1的核苷酸探針?biāo)M(jìn)行的mRNA組織分布的Northern印跡和斑點(diǎn)印跡分析，顯示在脾、淋巴結(jié)、CD19+細(xì)胞中有表達(dá)，在混合的淋巴細(xì)胞反應(yīng)細(xì)胞、Daudi和Raji細(xì)胞中有弱表達(dá)。采用逆轉(zhuǎn)錄酶PCR，僅在B細(xì)胞中檢測到BR43×1，而在激活的T細(xì)胞中未檢測到BR43×1，這與以前針對TACI所報道的(von Bülow和Bram，同上)相同。采用與相應(yīng)的TACI序列100％重疊的BR43×2探針，在脾、淋巴結(jié)和小腸、胃、唾液腺、闌尾、肺、骨髓、胎兒的脾、CD19+細(xì)胞和Raji細(xì)胞中檢測到TACI和BR43×2。
采用Northern印跡分析，在小腸、脾、胃、結(jié)腸、闌尾、淋巴結(jié)、氣管和睪丸中檢測到BCMA。在腺淋巴瘤、非霍奇金淋巴瘤和腮腺瘤中也檢測到BCMA，在CD8+、CD19+、MLR細(xì)胞、Daudi、Raji和Hut78細(xì)胞中檢測到微弱的BCMA。
還采用鼠ztnf4(SEQ ID NO19)進(jìn)行了Northern印跡分析，與人類TACI、BCMA和BR43×2相同，鼠ztnf4的表達(dá)主要在脾和胸腺中被檢測到。鼠ztnf4還在肺中表達(dá)，并且在皮膚和心臟中檢測到微弱表達(dá)。
本發(fā)明還提供編碼本文所公開的BR43×2多肽的多核苷酸分子，包括DNA和RNA分子。本領(lǐng)域的技術(shù)人員將很容易明了，鑒于遺傳密碼的簡并性，在這些多核苷酸分子中可以有相當(dāng)大的序列變異。SEQ ID NO11是包括了編碼SEQ ID NO4可溶性BR43×2多肽的所有DNA的一個簡并DNA序列。同樣，SEQ ID NO12是包括了編碼SEQ ID NO2 BR43×2多肽的所有DNA的一個簡并DNA序列。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)明了，通過用U取代T，SEQ ID NO12簡并序列還提供了編碼SEQ ID NO4的所有RNA序列。因此，含有SEQ ID NO11的第1-360位核苷酸、SEQ ID NO12的第1-741位核苷酸、和它們的RNA等同物的編碼BR43×2多肽的多核苷酸是本發(fā)明所考慮到的。表1列出了SEQ ID NOs11和12中使用的單字母密碼，以指示簡并核苷酸的位置。“解析(resolution)”是指由密碼字母所指示的核苷酸。“互補(bǔ)”是指互補(bǔ)核苷酸的密碼。例如Y密碼指示C或T，而它的互補(bǔ)R指示A或G，A與T互補(bǔ)，G與C互補(bǔ)。
表1核苷酸 解析 互補(bǔ) 解析AATTCCGGGGCCTTAARAG YCTYCT RAGMAC KGTKGT MACSCG SCGWAT WATHACT DAGTBCGT VACGVACG BCGTDAGT HACTNACGT NACGT表2列出了SEQ ID NOs11和12中使用的簡并密碼子，其包括了對于一個給定氨基酸的所有可能密碼子。
表2氨基酸 單字母密碼密碼子 簡并密碼子CysC TGC TGTTGYSerS AGC AGT TCA TCC TCG TCTWSNThrT ACA ACC ACG ACTACNProP CCA CCC CCG CCTCCNAlaA GCA GCC GCG GCTGCNGlyG GGA GGC GGG GGTGGNAsnN AAC AATAAYAspD GAC GATGAYGluE GAA GAGGARGlnQ CAA CAGCARHisH CAC CATCAYArgR AGA AGG CGA CGC CGG CGTMGNLysK AAA AAGAARMetM ATGATGIleI ATA ATC ATTATHLeuL CTA CTC CTG CTT TTA TTGYTNValV GTA GTC GTG GTTGTNPheF TTC TTTTTYTyrY TAC TATTAYTrpW TGGTGGTer. TAA TAG TGATRRAsn|Asp BRAYGlu|Gln ZSAR任何 XNNN
本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員都將明了，在確定代表編碼每一個氨基酸的所有可能密碼子的簡并密碼子時，引入了某種多義性。例如，絲氨酸的簡并密碼子(WSN)在某些情況中可編碼精氨酸(AGR)，而精氨酸的簡并密碼子(MGN)在某些情況中編碼絲氨酸(AGY)。在編碼苯丙氨酸和亮氨酸的密碼子之間也存在類似的關(guān)系。因此，該簡并序列所包括的一些多核苷酸可能編碼變異的氨基酸序列，但通過參考SEQ ID NOs2和4的氨基酸序列本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員能夠輕易地鑒別出這些變異序列。按本文所描述的方法能夠很容易地對變異序列的功能性進(jìn)行測試。
本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員還應(yīng)明了，不同的物種會表現(xiàn)出“偏倚密碼子使用”。一般參見Grantham等，核酸研究(Nuc.Acids Res.)81893-912.1980；Haas等，當(dāng)代生物學(xué)(Curr.Biol.)6315-24，1996；Wain-Hobson等，基因(Gene)13355-64，1981；Grosjean和Fiers，基因18199-209，1982；Holm，核酸研究143075-87，1986；Ikemura，分子生物學(xué)雜志(J.Mol.Biol.)158573-97，1982。本文所用術(shù)語“偏倚密碼子使用”或“偏倚密碼子”是本領(lǐng)域的一個術(shù)語，指在某種物種的細(xì)胞中最為頻繁使用的蛋白質(zhì)翻譯密碼子，由此產(chǎn)生對編碼每一種氨基酸的一種或幾種可能密碼子的偏好(見表2)。例如，蘇氨酸(Thr)可以由ACA、ACC、ACG或ACT編碼，但在哺乳動物細(xì)胞中ACC是最為常用的密碼子；在其它物種中，例如昆蟲細(xì)胞、酵母、病毒或細(xì)菌中，可能偏好不同的Thr密碼子。可以通過本領(lǐng)域已知的多種方法將一個特定物種的偏倚密碼子引入本發(fā)明的多核苷酸中。在重組DNA中引入偏倚密碼子序列可以例如通過使蛋白質(zhì)的翻譯在特定細(xì)胞類型或物種中更為有效而增強(qiáng)蛋白質(zhì)的產(chǎn)生。因此，SEQ ID NOs11和12中公開的簡并密碼子序列可以充當(dāng)模板，用于優(yōu)化多核苷酸在本領(lǐng)域常用的和本文所公開的多種細(xì)胞類型和物種中的表達(dá)?？梢詫衅忻艽a子的序列進(jìn)行測試，優(yōu)化其在各種物種中的表達(dá)，并按本文公開的方法測試其功能性。
BR43×2的富含半胱氨酸的假重復(fù)中高度保守的氨基酸可以用作鑒定新家族成員的工具。例如，可以采用逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(RT-PCR)，從獲自各種組織材料或細(xì)胞系的RNA，擴(kuò)增編碼上述細(xì)胞外配體結(jié)合域的序列。尤其是，從BR43×2序列設(shè)計(jì)的高度簡并引物對于該目的是有用的。
在本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案中，分離的多核苷酸將與相似大小的SEQ IDNO3區(qū)域，或其互補(bǔ)序列在嚴(yán)緊條件下雜交。一般地，嚴(yán)緊條件選擇為低于一定離子強(qiáng)度和pH下該特異序列的熱解鏈溫度(Tm)大約5℃。Tm是(在一定的離子強(qiáng)度和pH下)有50％的目標(biāo)序列與完全匹配的探針發(fā)生雜交時的溫度。典型的嚴(yán)緊條件是pH7，鹽濃度高達(dá)大約0.03M，而且溫度至少大約60℃。
正如前面提及的，本發(fā)明的分離多核苷酸包括DNA和RNA。用于分離DNA和RNA的方法是本領(lǐng)域所熟知的。盡管DNA也可以采用來自其它組織的RNA來制備或作為基因組DNA來分離，但一般優(yōu)選從RPMI 1788細(xì)胞、PBMNC、靜息或激活的轉(zhuǎn)染B細(xì)胞或扁桃體組織分離RNA。可以采用鹽酸胍提取，之后通過CsCl梯度離心分離來制備總RNA(Chirgwin等，生物化學(xué)(Biochemistry)1852-94，1979)。采用Aviv和Leder的方法(美國國家科學(xué)院院刊691408-12，1972)，從總RNA制備poly(A)+RNA。采用已知方法從Poly(A)+RNA制備互補(bǔ)DNA(cDNA)。然后通過例如雜交或PCR鑒定并分離編碼BR43×2多肽的多核苷酸。
本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)明了，SEQ ID NOs1和3中公開的序列僅代表該人類基因的一個等位基因，而且可以預(yù)料存在等位變異和其它種拼接。SEQID NOs1和3中所示DNA序列的等位變體，包括那些含有沉默突變的等位變體和那些其中的突變導(dǎo)致氨基酸序列改變的等位變體，均屬于本發(fā)明的范圍之內(nèi)，同樣，SEQ ID NOs2和4的等位變體蛋白質(zhì)也屬于本發(fā)明的范圍。這些序列的等位變體和拼接變體可以根據(jù)本領(lǐng)域已知的標(biāo)準(zhǔn)程序通過探測來自不同個體或組織的cDNA或基因組文庫來克隆。
本發(fā)明還提供與SEQ ID NOs2和4的多肽以及它們的物種直向同源物基本同源的分離的BR43×2多肽。術(shù)語“基本同源”在本文中用以指與SEQ ID NOs2和4中所示序列或它們的直向同源物有50％、優(yōu)選60％、更優(yōu)選至少80％的序列一致性的多肽。這些多肽將更優(yōu)選與SEQ ID NO2或其直向同源物至少90％一致，最優(yōu)選95％或更高一致。序列一致性百分?jǐn)?shù)通過常規(guī)方法測定。見例如Altschul等，Bull.Math.Bio.48603-66，1986和Henikoff和Henikoff，美國國家科學(xué)院院刊8910915-9，1992。簡要地說，采用10的斷缺區(qū)空缺罰分、1的斷缺區(qū)延伸罰分，和表3所顯示的Henikoff和Henikoff(同上)“blosum 62”評分矩陣(氨基酸用標(biāo)準(zhǔn)的單字母密碼表示)，比對兩個氨基酸序列以優(yōu)化比對分?jǐn)?shù)。然后按如下公式計(jì)算一致性百分?jǐn)?shù)
表3A R N D C Q E G H I L K M F P S T W Y VA 4R-1 5N-2 0 6D-2 -2 1 6C 0 -3 -3 -3 9Q-1 1 0 0 -3 5E-1 0 0 2 -4 2 5G 0 -2 0 -1 -3 -2 -2 6H-2 0 1 -1 -3 0 0 -2 8I-1 -3 -3 -3 -1 -3 -3 -4 -3 4L-1 -2 -3 -4 -1 -2 -3 -4 -3 2 4K-1 2 0 -1 -3 1 1 -2 -1 -3 -2 5M-1 -1 -2 -3 -1 0 -2 -3 -2 1 2 -1 5F-2 -3 -3 -3 -2 -3 -3 -3 -1 0 0 -3 0 6P-1 -2 -2 -1 -3 -1 -1 -2 -2 -3 -3 -1 -2 -4 7S 1 -1 1 0 -1 0 0 0 -1 -2 -2 0 -1 -2 -1 4T 0 -1 0 -1 -1 -1 -1 -2 -2 -1 -1 -1 -1 -2 -1 1 5W-3 -3 -4 -4 -2 -2 -3 -2 -2 -3 -2 -3 -1 1 -4 -3 -2 11Y-2 -2 -2 -3 -2 -1 -2 -3 2 -1 -1 -2 -1 3 -3 -2 -2 2 7V 0 -3 -3 -3 -1 -2 -2 -3 -3 3 1 -2 1 -1 -2 -2 0 -3 -1 4多核苷酸分子的序列一致性采用上述公開的比率通過相似方法測定。
基本同源的蛋白質(zhì)和多肽的特征在于具有一個或多個氨基酸替代、缺失或添加。這些改變優(yōu)選在性質(zhì)上是較小的，即保守氨基酸替代(見表4)和其它不顯著影響蛋白質(zhì)或多肽的折疊或活性的替代；小的缺失，典型的是1至大約30個氨基酸的缺失；和小的氨基或羧基端延伸，例如氨基端的甲硫氨酸殘基、不超過大約20-25個殘基的小接頭肽或親和標(biāo)記物。含有親和標(biāo)記物的多肽可以進(jìn)一步在BR43×2多肽和該親和標(biāo)記物之間含有一個蛋白水解切割位點(diǎn)。優(yōu)選的該位點(diǎn)包括凝血酶切割位點(diǎn)和Xa因子切割位點(diǎn)。
表4保守性氨基酸替代堿性的精氨酸賴氨酸組氨酸酸性的谷氨酸天門冬氨酸極性的谷氨酰胺天冬酰胺疏水的亮氨酸異亮氨酸纈氨酸芳香族的 苯丙氨酸色氨酸酪氨酸小的 甘氨酸丙氨酸絲氨酸蘇氨酸甲硫氨酸除了這20個標(biāo)準(zhǔn)氨基酸之外，還可以用非標(biāo)準(zhǔn)氨基酸(例如4-羥脯氨酸，6-N-甲基賴氨酸、2-氨基異丁酸、異纈氨酸和α-甲基絲氨酸)來替代本發(fā)明BR43×2多肽的氨基酸殘基?？梢杂糜邢蘖康姆潜Ｊ匕被帷⒎沁z傳密碼子編碼的氨基酸和人造氨基酸來替代BR43×2多肽的氨基酸殘基。本發(fā)明的蛋白質(zhì)還可以含有非天然存在的氨基酸殘基。
非天然存在的氨基酸包括但不限于反式-3-甲基脯氨酸、2，4-亞甲基脯氨酸、順式-4-羥脯氨酸、反式-4-羥基-脯氨酸、N-甲基甘氨酸、別蘇氨酸、甲基蘇氨酸、羥基乙基半胱氨酸、羥基乙基高半胱氨酸、硝基谷氨酰胺、高谷氨酰胺、六氫吡啶羧酸、叔-亮氨酸、正纈氨酸、2-氮雜苯丙氨酸(2-azaphenylalanine)、3-氮雜-苯丙氨酸、4-氮雜-苯丙氨酸、和4-氟苯丙氨酸。用于將非天然存在的氨基酸殘基摻入蛋白質(zhì)的幾種方法是本領(lǐng)域已知的。例如，可以采用應(yīng)用了化學(xué)氨?；种菩蛅RNA抑制無義突變的一種體外系統(tǒng)。用于合成氨基酸和氨酰化tRNA的方法是本領(lǐng)域已知的。在含有大腸桿菌(E.coli.)S30提取物以及可從商業(yè)途徑獲得的酶和其它試劑的無細(xì)胞系統(tǒng)中，對含有無義突變的質(zhì)粒進(jìn)行轉(zhuǎn)錄和翻譯。通過層析純化蛋白質(zhì)。見例如Robertson等，美國化學(xué)協(xié)會雜志(J.Am.Chem.Soc.)1132722，1991；Ellman等，酶學(xué)方法(MethodsEnzymol.)202301，1991；Chung等，科學(xué)259806-9，1993；和Chung等，美國國家科學(xué)院院刊9010145-9，1993)。在第二種方法中，通過顯微注射突變的mRNA和化學(xué)氨?；囊种菩蛅RNA，在非洲爪蟾卵母細(xì)胞中進(jìn)行翻譯(Turcatti等，生物化學(xué)雜志(J.Biol.Chem.)27119991-8，1996)。在第三種方法中，在缺少待被置換的天然氨基酸(例如苯丙氨酸)但存在期望的非天然存在氨基酸(例如，2-氮雜苯丙氨酸、3-氮雜苯丙氨酸、4-氮雜苯丙氨酸、或4-氟苯丙氨酸)的情況下，培養(yǎng)大腸桿菌細(xì)胞。該非天然氨基酸取代其天然對應(yīng)物摻入蛋白質(zhì)中。見Koide等，生物化學(xué)(Biochem.)337470-6，1994。天然存在的氨基酸殘基可以通過體外化學(xué)修飾轉(zhuǎn)變成非天然存在的種類。化學(xué)修飾可以和定點(diǎn)誘變結(jié)合起來，以進(jìn)一步擴(kuò)展替代的范圍(Wynn和Richards，蛋白質(zhì)科學(xué)(Protein Sci.)2395-403，1993)。
可以用有限數(shù)量的非保守氨基酸、非遺傳密碼編碼的氨基酸、非天然存在的氨基酸、和人造氨基酸替代BR43×2的氨基酸殘基。
本發(fā)明BR43×2多肽中的必需氨基酸可以根據(jù)本領(lǐng)域已知的程序鑒定，例如定點(diǎn)誘變或丙氨酸掃描誘變(Cunningham和Wells，科學(xué)2441081-5，1989)。將單個丙氨酸突變引入該分子的每一個殘基位置，然后測試所獲得的突變分子的生物學(xué)活性(例如提供在免疫應(yīng)答期間B細(xì)胞應(yīng)答的降低、自身抗體產(chǎn)生的抑制或降低)，以鑒定對于該分子的活性關(guān)鍵的氨基酸殘基。也參見Hilton等，生物化學(xué)雜志2714699-708，1996。生物學(xué)相互作用位置即配體結(jié)合部分例如該富含半胱氨酸的假重復(fù)，還可以通過物理分析核磁共振、晶體學(xué)、電子衍射或光親和標(biāo)記等技術(shù)所測定的結(jié)構(gòu)，以及對推測的接觸位置的氨基酸進(jìn)行突變來確定。見例如de Vos等，科學(xué)255306-12，1992；Smith等，分子生物學(xué)雜志(J.Mol.Biol.)224899-904，1992；Wlodaver等，F(xiàn)EBS Lett.30959-64，1992。必需氨基酸的身份還可以從與相關(guān)TNFR家族成員例如TACI和BCMA的同源性的分析推斷出來。
只要保留保守的半胱氨酸、天門冬氨酸和亮氨酸殘基并且不打亂高級結(jié)構(gòu)，還可以在BR43×2的富含半胱氨酸的假重復(fù)中進(jìn)行其它的氨基酸替代。優(yōu)選參考其它的富含半胱氨酸的假重復(fù)的序列來進(jìn)行BR43×2的富含半胱氨酸假重復(fù)中的替代。SEQ ID NO10是一個一般性的富含半胱氨酸假重復(fù)，其顯示了基于這種比對能夠允許的氨基酸替代。在該域中的替代受本文所提及的限制的制約。
采用已知的誘變和篩選方法，例如那些由Reidhaar-Olson和Saueer(科學(xué)24153-7，1988)或Bowie和Sauer(美國國家科學(xué)院院刊862152-6，1989)公開的方法，能夠進(jìn)行多個氨基酸替代并對它們進(jìn)行檢測。簡而言之，這些作者公開了如下方法，該方法用于同時使多肽的兩個或多個位置隨機(jī)化、篩選功能性多肽、之后對誘變多肽測序，以確定在每一個位置所能夠允許的替代譜。其它能夠應(yīng)用的方法包括噬菌體展示(例如Lowman等，生物化學(xué)3010832-7，1991；Ladner等，美國專利5，223，409；Huse，WIPO公開文本W(wǎng)O 92/06204)和區(qū)域定向誘變(region-directed mutagenesis)(Derbyshire等，基因46145，1986；Ner等，DNA 7127，1988)。
按照Stemmer，自然370389-91，1994，Stemmer，美國國家科學(xué)院院刊9110747-51，1994和WIPO公開文本W(wǎng)O 97/20078中所公開的方法，通過DNA改組可以制備本文公開的BR43×2 DNA和多肽序列的變體。簡而言之，通過親本DNA的隨機(jī)片斷化，之后采用PCR進(jìn)行重新組裝，獲得隨機(jī)引入的點(diǎn)突變，然后通過體外同源重組，產(chǎn)生變體DNA。可以通過采用親本DNA家族，例如來自不同物種的等位變體或DNA，改動該技術(shù)，以向該程序中引入額外的可變性。通過選擇合乎需要的突變并同時篩去有害改變，選擇或篩選期望活性，之后進(jìn)行更多輪的誘變和分析，從而可以實(shí)現(xiàn)序列的快速“進(jìn)化”。
以上公開的誘變方法可以和檢測宿主細(xì)胞中克隆誘變多肽活性的大批量自動篩選方法聯(lián)合?？梢詮脑撍拗骷?xì)胞回收編碼活性多肽(例如，提供免疫應(yīng)答期間B細(xì)胞應(yīng)答的降低、自身抗體產(chǎn)生的抑制或降低)的誘變DNA分子，并采用現(xiàn)代裝置對其進(jìn)行快速測序。這些方法使得可以快速地確定目的多肽中各個氨基酸殘基的重要性，并且可以應(yīng)用于未知結(jié)構(gòu)的多肽。
采用以上所討論的方法，本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員能夠鑒定和/或制備多種與SEQ ID NO2的第1-120位殘基或其等位變體基本同源的，并且保留了野生型蛋白質(zhì)的B細(xì)胞抑制特性的多肽。這些多肽可以包括來自腫瘤壞死因子受體超家族其它成員的額外氨基酸或域、或親和標(biāo)記物等等。含有TNFR超家族其它成員的功能域的BR43×2多肽或融合結(jié)構(gòu)，構(gòu)成了表現(xiàn)出改變的B細(xì)胞抑制能力的雜合腫瘤壞死因子受體。
本發(fā)明還提供來自其它物種的對應(yīng)受體和多核苷酸(直向同源物)。這些物種包括但不限于哺乳動物、鳥類、兩棲動物、爬行動物、魚類、昆蟲、和其它脊椎和無脊椎動物種類。尤其有意義的是來自其它哺乳動物物種，包括鼠、豬、綿羊、牛、犬、貓、馬的BR43×2受體和其它靈長類動物的受體?？梢圆捎帽景l(fā)明提供的信息和組合物聯(lián)合常規(guī)的克隆技術(shù)，克隆人類BR43×2受體的直向同源物。例如，可以采用從表達(dá)該受體的組織或細(xì)胞類型獲得的mRNA，克隆cDNA。mRNA的適合來源可以通過使用從本文所公開的序列設(shè)計(jì)的探針探測Northern印跡來鑒定。然后從陽性組織或細(xì)胞系的mRNA制備文庫。然后可以通過各種方法，例如通過用基于本文公開序列的完整或部分人cDNA或一或多套簡并探針進(jìn)行探測，分離編碼受體的cDNA。還可以采用PCR和根據(jù)本文所公開的序列設(shè)計(jì)的引物，克隆cDNA。在再一種方法中，可以采用該cDNA文庫轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染宿主細(xì)胞，并用針對該受體的抗體檢測目的cDNA的表達(dá)。相似的技術(shù)也可以應(yīng)用于分離基因組克隆。
本發(fā)明的受體多肽，包括全長受體多肽、可溶性受體多肽、多肽片段、和融合多肽，均可以根據(jù)常規(guī)技術(shù)在基因工程化宿主細(xì)胞中制備。適合的宿主細(xì)胞是能夠用外源DNA轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染并且能夠培養(yǎng)生長的那些細(xì)胞類型，包括細(xì)菌、真菌細(xì)胞、和培養(yǎng)的高等真核細(xì)胞。優(yōu)選真核細(xì)胞，尤其是多細(xì)胞生物的培養(yǎng)細(xì)胞。用于操作克隆的DNA分子并將外源DNA導(dǎo)入各種宿主細(xì)胞中的技術(shù)公開于Sambrook等，分子克隆實(shí)驗(yàn)室手冊(Molecular CloningA Laboratory Manual)，第二版，Cold SpringHarbor，NY，1989；和Ausubel等編，當(dāng)代分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)指南(CurrentProtocols in Molecular Biology)，John Wiley and Sons，Inc.，NY，1987。
一般地，將編碼BR43×2多肽的DNA序列和其表達(dá)所必需的其它遺傳元件，一般包括轉(zhuǎn)錄啟動子和終止子，在表達(dá)載體中可操作地連接在一起。該載體一般還將含有一個或多個選擇標(biāo)記和一個或多個復(fù)制原點(diǎn)，當(dāng)然本領(lǐng)域技術(shù)人員將明了在某些系統(tǒng)中選擇標(biāo)記可以在不同的載體上提供，而且外源DNA的復(fù)制可以通過整合在宿主細(xì)胞的基因組中來實(shí)現(xiàn)。啟動子、終止子、選擇標(biāo)記、載體和其它元件的選擇是屬于本領(lǐng)域普通技術(shù)水平的常規(guī)設(shè)計(jì)。許多這樣的元件在文獻(xiàn)中均有描述，并且可以通過供應(yīng)商獲得。
為了指導(dǎo)BR43×2多肽進(jìn)入宿主細(xì)胞的分泌途徑，在表達(dá)載體中提供一個分泌信號序列(又稱作信號序列、前導(dǎo)序列、前原序列或前序列)。該分泌信號序列可以是BR43×2多肽的分泌信號序列，或可以來源于另一種分泌蛋白質(zhì)(例如t-PA)或從頭合成。該分泌信號序列以符合正確閱讀框的形式與BR43×2 DNA序列連接，并且所處位置將可以指導(dǎo)新合成的多肽進(jìn)入宿主細(xì)胞的分泌途徑。分泌信號序列通常位于編碼目的多肽的DNA序列的5’端，但某些信號序列可以被放置在目的DNA序列的別處(見例如Welch等，美國專利5,037,743；Holland等，美國專利5,143,830)。
在本發(fā)明中，培養(yǎng)的哺乳動物細(xì)胞是適合的宿主。用于將外源DNA導(dǎo)入哺乳動物宿主細(xì)胞中的方法包括磷酸鈣介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染(Wigler等，細(xì)胞(Cell)14725，1978；Corsaro和Pearson，體細(xì)胞遺傳學(xué)(SomaticCell Genetics)7603，1981；Graham和Van der Eb，病毒學(xué)(virology)52456，1973)、電穿孔(Neumann等，EMBOJ.1841-45，1982)、DEAE-葡聚糖介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染(Ausubel等，同上)、和脂質(zhì)體介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染(Hawley-Nelson等，焦點(diǎn)(Focus)1573，1993；Ciccarone等，焦點(diǎn)1580，1993)。重組多肽在培養(yǎng)的哺乳動物細(xì)胞中的產(chǎn)生公開于，例如Levinson等，美國專利4,713,339；Hagen等，美國專利4,784,950；Palmiter等，美國專利4,579,821；和Ringold，美國專利4,656,134。適合的培養(yǎng)哺乳動物細(xì)胞包括COS-1(ATCC CRL 1650)、COS-7(ATCC CRL1651)、BHK(ATCC CRL 1632)、BHK 570(ATCC CRL 10314)、293(ATCCCRL 1573；Graham等，普通病毒學(xué)雜志(J.Gen.Virol.)3659-72，1977)、Jurkat(ATCC CRL-8129)、BaF3(來源于小鼠骨髓的白介素-3依賴性前淋巴樣細(xì)胞系，見Palacios和Steinmetz，細(xì)胞41727-34，1985；Mathey-Prevot等，分子細(xì)胞生物學(xué)(Mol.Cell Biol.)64133-5，1986)和中國倉鼠卵巢細(xì)胞系(例如CHO-K1；ATCC CCL 61)。其它適合的細(xì)胞系是本領(lǐng)域已知的，可以從公共保藏處例如美國典型培養(yǎng)物保藏中心，Rockville，Maryland獲得。一般地，優(yōu)選強(qiáng)轉(zhuǎn)錄啟動子，例如來自SV-40或巨細(xì)胞病毒的啟動子。見，例如美國專利4,956,288。其它適合的啟動子包括那些來自金屬硫蛋白基因的啟動子(美國專利4,579,821和4,601,978)和腺病毒的主要晚期啟動子。
一般采用藥物篩選來選擇插有外源DNA的培養(yǎng)哺乳動物細(xì)胞。這些細(xì)胞通常被稱作“轉(zhuǎn)染子”。在有選擇劑的情況中培養(yǎng)并能夠?qū)⒛康幕騻鬟f給其后代的細(xì)胞被稱為“穩(wěn)定轉(zhuǎn)染子”。優(yōu)選的選擇標(biāo)記是編碼抗生素新霉素抗性的基因。在存在新霉素類藥物例如G-418或類似物的情況下進(jìn)行篩選。還可以應(yīng)用選擇系統(tǒng)以增加目的基因的表達(dá)水平，該方法稱作“擴(kuò)增”。擴(kuò)增按以下方式進(jìn)行在有低水平的選擇劑的情況下培養(yǎng)轉(zhuǎn)染子、之后增加選擇劑的量，以選擇產(chǎn)生高水平的導(dǎo)入基因產(chǎn)物的細(xì)胞。優(yōu)選的可擴(kuò)增選擇標(biāo)記是賦予氨甲蝶呤抗性的二氫葉酸還原酶。還可以使用其它藥物抗性基因(例如潮霉素抗性、多藥物抗性、嘌呤霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶)?？梢圆捎靡氡硇透淖兊钠渌恍?biāo)記，例如綠色熒光蛋白、或CD4、CD8、I型MHC等細(xì)胞表面蛋白質(zhì)、胎盤堿性磷酸酶，以便通過FACS分揀術(shù)或磁珠分離技術(shù)等手段從未轉(zhuǎn)染細(xì)胞中分揀出轉(zhuǎn)染細(xì)胞。
也可以采用其它高等真核細(xì)胞作為宿主，這包括植物細(xì)胞、昆蟲細(xì)胞和鳥類細(xì)胞。毛根農(nóng)桿菌(Agrobacterium rhizogenes)作為載體用于植物細(xì)胞中基因表達(dá)的綜述參見Sinkar等，生物科學(xué)雜志(J.Biosci.)(Bangalore)1147-58，1987。昆蟲細(xì)胞的轉(zhuǎn)化和外源多肽在其中的產(chǎn)生公開于Guarino等，美國專利5,162,222和WIPO公開文本W(wǎng)O94/06463?？梢杂猛ǔ碓从谲俎ｃy紋夜蛾(Autographa californica)核型多角體病毒(AcNPV)的重組桿狀病毒感染昆蟲細(xì)胞。見King和Possee，桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)實(shí)驗(yàn)室指南(The Baculovirus ExpressionSystemA Laboratory Guide)，London，Chapman&Hall；O’Reilly等，桿狀病毒表達(dá)載體實(shí)驗(yàn)室手冊(Baculovirus Expression VectorsA Laboratory Manual)，紐約，Oxford University Press，1994；和Richardson編，桿狀病毒表達(dá)實(shí)驗(yàn)指南，分子生物學(xué)方法(BaculovirusExpressio Protocols.Methods in Molecular Biology)，Totowa，NJ，Humana Press，1995。制備重組BR43×2桿狀病毒的第二種方法利用Luckow所描述的基于轉(zhuǎn)座子的系統(tǒng)(Luckow等，病毒學(xué)雜志(J.Virol.)674566-79，1993)。該系統(tǒng)利用了轉(zhuǎn)移載體，在Bac-to-BacTM試劑盒(LifeTechnologies，Rockville，MD)中有該系統(tǒng)出售。該系統(tǒng)利用含有Tn7轉(zhuǎn)座子的轉(zhuǎn)移載體pFastBaclTM(Life Technologies)，以使編碼BR43×2多肽的DNA移動至以稱為“桿?！钡拇筚|(zhì)粒形式在大腸桿菌中維持的桿狀病毒基因組中。見Hill-Perkins和Possee，普通病毒學(xué)雜志71971-6，1990；Bonning等，普通病毒學(xué)雜志751551-6，1994；和Chazenbalk和Rapoport，生物化學(xué)雜志2701543-9，1995。此外，轉(zhuǎn)移載體可以包括一個在表達(dá)的BR43×2多肽的C-或N-端帶有編碼表位標(biāo)記物的DNA的符合閱讀框的融合物，所述表位標(biāo)記物例如Glu-Glu標(biāo)記物(Grussenmeyer等，美國國家科學(xué)院院刊827952-4，1985)。采用本領(lǐng)域已知的技術(shù)，將含有BR43×2的轉(zhuǎn)移載體轉(zhuǎn)化至大腸桿菌中，然后篩選含有指示重組桿狀病毒的中斷l(xiāng)acZ基因的桿粒。采用普通技術(shù)分離含有該重組桿狀病毒基因組的桿粒DNA，并用于轉(zhuǎn)染草地夜蛾(Spodopterafrugiperda)的細(xì)胞，例如sf9細(xì)胞。隨后制備表達(dá)BR43×2的重組病毒。通過本領(lǐng)域通常使用的方法制備重組病毒原液。
采用該重組病毒感染宿主細(xì)胞，典型的是來源于秋粘蟲草地夜蛾的細(xì)胞系。一般參見Glick和Pasternak，分子生物技術(shù)重組DNA的原理和應(yīng)用(Molecular BiotechnologyPrinciples and Applications)，ASMPress，Washington，D.C.，1994。另一個適合的細(xì)胞系是來源于粉紋夜蛾(Trichoplusia ni)的High FiveOTM細(xì)胞系(Invitrogen)(美國專利#5,300,435)。采用商業(yè)可獲得的無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)和維持這些細(xì)胞。對于sf9細(xì)胞，適合的培養(yǎng)基是sf900 IITM(Life Technologies)或ESF921TM(Expression Systems)；而對于粉紋夜蛾細(xì)胞，適合的培養(yǎng)基是Ex-cell0405TM(JRH Biosciences，Lenexa，KS)或Express FiveOTM(LifeTechnologies)。使這些細(xì)胞從大約2－5×105個細(xì)胞的接種密度生長至1-2×106個細(xì)胞的密度，此時以0.1-10，更典型的是接近3的感染復(fù)數(shù)(MOI)加入重組病毒原液。在可獲得的實(shí)驗(yàn)室手冊中一般都有該使用程序的描述(King和Possee，同上；O’Reilly等，同上；Richardson，同上)。隨后可以采用本文所描述的方法從上清中純化該BR43×2多肽。
真菌細(xì)胞，包括酵母細(xì)胞，也可以用于本發(fā)明。在這點(diǎn)上尤其有意義的酵母種類包括釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、巴斯德畢赤酵母(Pichia pastoris)和Pichia methanolica。用外源DNA轉(zhuǎn)化釀酒酵母細(xì)胞并從其中制備重組多肽的方法公開于例如Kawasaki，美國專利4,599,311；Kawasaki等，美國專利4,931,373；Brake，美國專利4,870,008；Welch等，美國專利5,037,743；和Murray等，美國專利4,845,075。通過選擇標(biāo)記確定的表型，通常是藥物抗性或在缺乏特定營養(yǎng)物(例如亮氨酸)時的生長能力，選擇轉(zhuǎn)化的細(xì)胞。用于釀酒酵母的一個優(yōu)選載體系統(tǒng)是Kawasaki等公開的POT1載體系統(tǒng)(美國專利4,931,373)，該系統(tǒng)允許通過在含有葡萄糖的培養(yǎng)基中的生長來選擇轉(zhuǎn)化細(xì)胞。用于酵母的適合啟動子和終止子包括那些來自糖酵解酶基因(見例如Kawasaki，美國專利4,599,311；Kingsman等，美國專利4,615,974；和Bitter，美國專利4,977,092)和醇脫氫酶基因的啟動子和終止子。也參見美國專利4,990,446；5,063,154；5,139,936和4,661,454。用于其它酵母，包括多形漢遜酵母(Hansenula polymorpha)、粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)、乳酸克魯維酵母(Kluyveromyceslactis)、脆壁克魯維酵母(Kluyveromyces fragilis)、玉蜀黍黑粉菌(Ustilago maydis)、巴斯德畢赤酵母、Pichia methanolica、季也蒙畢赤酵母(Pichia guillermondii)和Candida maltosa，的轉(zhuǎn)化系統(tǒng)是本領(lǐng)域已知的。見例如Gleeson等，普通微生物學(xué)雜志(J.Gen.Microbiol.)1323459-65，1986和Cregg，美國專利4,882,279?？梢愿鶕?jù)McKnight等，美國專利4,935,349的方法應(yīng)用曲霉屬(Aspergillus)細(xì)胞。Sumino等，美國專利5,162,228公開了用于轉(zhuǎn)化Acremonium chrysogenum的方法。Lambowitz，美國專利4,486,533公開了用于轉(zhuǎn)化鏈孢霉屬(Neurospora)的方法。
例如，Pichia methanolica作為宿主在制備重組蛋白質(zhì)中的應(yīng)用公開于Raymond，美國專利5,716,808；Raymond，美國專利5,736,383；Raymond等，酵母(Yeast)1411-23，1998；和國際公開文本W(wǎng)O 97/17450、WO 97/17451、WO 98/02536和WO 98/02565。用于轉(zhuǎn)化P.methanolica的DNA分子通常制備成雙鏈環(huán)狀質(zhì)粒，并優(yōu)選在轉(zhuǎn)化之前將其線性化。對于在P.methanolica中制備多肽，優(yōu)選質(zhì)粒中的啟動子和終止子是P.methanolica基因，例如P.methanolica的醇利用基因(AUG1或AUG2)的啟動子和終止子。其它有用的啟動子包括二羥丙酮合成酶(DHAS)、甲酸脫氫酶(FMD)和過氧化氫酶(CAT)基因的啟動子。為了有利于該DNA整合至宿主染色體中，優(yōu)選使質(zhì)粒的完整表達(dá)片段在兩個末端被宿主DNA序列所包圍。用于Pichia methanolica的優(yōu)選選擇標(biāo)記是P.mehanolica編碼5-氨基咪唑核苷酸羧化酶(AIRC；EC 4.1.1.21)的ADE2基因，該基因允許ade2宿主細(xì)胞在缺少腺嘌呤的情況下生長。對于大規(guī)模的工業(yè)程序，可能期望使甲醇的使用最小化，這時優(yōu)選采用其中兩個甲醇利用基因(AUG1和AUG2)均已缺失的宿主細(xì)胞。對于分泌蛋白質(zhì)的制備，優(yōu)選液泡蛋白酶(vacuolor protease)基因(PEP4和PRB1)缺陷的宿主細(xì)胞。采用電穿孔促使含有編碼目的多肽的DNA的質(zhì)粒導(dǎo)入P.methanolica細(xì)胞中。優(yōu)選采用具有2.5-4.5kv/cm，優(yōu)選大約3.75kv/cm的場強(qiáng)度，和1-40毫秒，最優(yōu)選大約20毫秒的時間常數(shù)(t)的按指數(shù)規(guī)律衰減的脈沖電場，通過電穿孔轉(zhuǎn)化P.methanolica細(xì)胞。
在本發(fā)明中，原核宿主細(xì)胞，包括大腸桿菌、芽孢桿菌屬和其它屬的菌株，也是有用的宿主細(xì)胞。用于轉(zhuǎn)化這些宿主并在其中表達(dá)克隆的外源DNA序列的技術(shù)是本領(lǐng)域所熟知的(見例如Sambrook等，同上)。當(dāng)在細(xì)菌例如大腸桿菌中表達(dá)BR43×2多肽時，可以將該多肽典型地作為不溶性顆粒保留在細(xì)胞質(zhì)中，或可以通過細(xì)菌分泌序列指導(dǎo)其進(jìn)入周質(zhì)間隙。在前一種情況下，裂解細(xì)胞，并回收這些顆粒，然后采用例如異硫氰酸胍或尿素進(jìn)行變性。之后可以通過稀釋該變性劑，例如通過對尿素溶液以及還原型和氧化型谷胱甘肽的組合物進(jìn)行透析，然后對緩沖鹽溶液透析，使該變性多肽重新折疊并二聚化。在后一種情況中，可以通過如下步驟從周質(zhì)間隙中以可溶性的功能形式回收該多肽破壞細(xì)胞(例如通過超聲或滲透震擾)以釋放出周質(zhì)間隙的內(nèi)容物并回收該蛋白質(zhì)，由此避免了對變性和重折疊的需要。
根據(jù)常規(guī)程序在含有營養(yǎng)物和對于所選宿主細(xì)胞的生長所必需的其它成分的培養(yǎng)基中，培養(yǎng)轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染的宿主細(xì)胞。多種適合培養(yǎng)基，包括已知成分培養(yǎng)基和復(fù)雜培養(yǎng)基，是本領(lǐng)域已知的，并且一般包括碳源、氮源、必需氨基酸、維生素和礦物質(zhì)。如果需要，培養(yǎng)基還可以含有生長因子或血清等成分。生長培養(yǎng)基一般通過例如藥物選擇，或表達(dá)載體上或共轉(zhuǎn)染至宿主細(xì)胞中的選擇標(biāo)記所彌補(bǔ)的必需營養(yǎng)物的缺乏，對含有外來添加DNA的細(xì)胞進(jìn)行選擇。在含有充足碳源、氮源和痕量營養(yǎng)物的培養(yǎng)基中大約25℃-35℃培養(yǎng)P.methanolica細(xì)胞。通過常規(guī)手段，例如振蕩小搖瓶或噴射(sparge)發(fā)酵罐，給液體培養(yǎng)物提供足夠的通氣量。對于P.methanolica，一種優(yōu)選的培養(yǎng)基是YEPD(2％D-葡萄糖、2％BactoTM蛋白胨(Difco Laboratories，Detroit，MI)、1％BactoTM酵母提取物(Difco Laboratories)、0.004％腺嘌呤和0.006％L-亮氨酸)。
表達(dá)的重組BR43×2多肽(或嵌合或融合BR43×2多肽)可以采用分級分離和/或常規(guī)純化方法和介質(zhì)純化。優(yōu)選提供高純度形式的本發(fā)明蛋白質(zhì)或多肽，即大于95％的純度、更優(yōu)選大于99％的純度。硫酸銨沉淀和酸或離液劑提取可以被用于樣品的分級分離。典型的純化步驟可以包括羥基磷灰石、大小排阻、FPLC和反向高效液相層析。適合的陰離子交換介質(zhì)包括葡聚糖、瓊脂糖、纖維素、聚丙烯酰胺、特級硅膠等的衍生物。優(yōu)選PEI、DEAE、QAE和Q的衍生物，尤其優(yōu)選DEAE Fast-FlowSepharose(Pharmacia，Piscataway，NJ)。典型的層析介質(zhì)包括那些用苯基、丁基或辛基衍生的介質(zhì)，例如苯基-Sepharose FF(Pharmacia)、Toyopearl丁基650(Toso Haas，Montgomeryville，PA)、辛基-Sepharosse(Pharmacia)等等；或聚丙烯樹脂，例如Amberchrom CG 71(Toso Haas)等。適合的固相支持物包括玻璃珠、硅基樹脂、纖維素樹脂、瓊脂糖珠、交聯(lián)瓊脂糖珠、聚苯乙烯珠、交聯(lián)聚丙烯酰胺樹脂以及在其使用的條件下不會溶解的同類物質(zhì)。可以用允許蛋白質(zhì)通過氨基、羧基、巰基、羥基和/或糖類部分附著的活性基團(tuán)來修飾這些支持物。偶聯(lián)化學(xué)的例子包括溴化氰活化、N-羥基琥珀亞胺活化、環(huán)氧化物活化、巰基活性、酰肼活化、和用于碳二亞胺偶聯(lián)化學(xué)的羧基和氨基衍生物。這些和其它固相介質(zhì)是本領(lǐng)域所熟知和廣泛應(yīng)用的，并可以從供應(yīng)商處獲得。用于使受體多肽與支持介質(zhì)結(jié)合的方法是本領(lǐng)域所熟知的。具體方法的選擇是一項(xiàng)常規(guī)設(shè)計(jì)，其部分取決于所選支持物的性質(zhì)。見例如親和層析原理和方法(Affinity ChromatographyPrinciple&Methods)，Pharmacia LKB Biotechnology，Uppsala，瑞典，1988。
可以利用其物理性質(zhì)分離本發(fā)明的多肽。例如，可以采用固定化的金屬離子吸附(IMAC)層析純化富含組氨酸的蛋白質(zhì)，包括那些含有聚組氨酸標(biāo)記物的蛋白質(zhì)。簡而言之，首先用二價金屬離子掛載凝膠以形成螯合物(Sulkowski，生物化學(xué)進(jìn)展(Trends in Biochem.)31-7，1985)。富含組氨酸的蛋白質(zhì)將被吸附在該基質(zhì)上，吸附親和力隨著所用金屬離子的不同而不同，然后通過競爭性洗脫、降低pH或使用強(qiáng)鏊合劑將其洗脫下來。其它純化方法包括通過凝集素親和層析和離子交換層析純化糖基化蛋白質(zhì)(酶學(xué)方法，第182卷，“蛋白質(zhì)純化指導(dǎo)(Guide to ProteinPurification)”，M.Deutscher(編)，Acad.Press，San Diego，1990，第529-39頁)。在本發(fā)明的其它實(shí)施方案中，可以構(gòu)建目的多肽與親和標(biāo)記物(例如，麥芽糖結(jié)合蛋白、FLAG-標(biāo)記物(Asp Tyr Lys Asp Asp AspAsp Lys(SEQ ID NO13))、Glu-Glu標(biāo)記物(Glu Glu Tyr Met Pro MetGlu(SEQ ID NO14))、免疫球蛋白域)的融合物，以便于純化。
可以有利地采用蛋白質(zhì)的重折疊(和任選重氧化)過程。優(yōu)選將該蛋白質(zhì)純化至＞80％的純度，更優(yōu)選＞90％的純度，甚至更優(yōu)選＞95％的純度，尤其優(yōu)選該蛋白質(zhì)處于藥用純的狀態(tài)，即就污染的大分子，尤其是其它蛋白質(zhì)和核酸而言純度大于99.9％，而且不含有感染性和致熱性試劑。優(yōu)選地，純化的蛋白質(zhì)基本上不含有其它蛋白質(zhì)，尤其是動物來源的其它蛋白質(zhì)。
BR43×2多肽或其片段也可以通過化學(xué)合成制備。BR43×2多肽可以是單體或多體；糖基化的或非糖基化的；PEG化(pegylated)或非PEG化的；而且可以包括或不包括起始甲硫氨酸殘基。BR43×2多肽的實(shí)例包括長度在32-40個殘基之間，具有符合如下基序的氨基酸序列XXCX[QEK][QEKNRDHS][QE]X{0-2}[YFW][YFW]DXLLX{2}C[IMLV]XCX{3}CX{6-8}CX{2}[YF]CXX(SEQ ID NO10)，并且服從本文所描述的限制的多肽。
BR43×2多肽可以通過全部固相合成、部分固相方法、片段縮合或經(jīng)典的溶液合成方式合成。優(yōu)選通過固相肽合成，例如按Merrifield，美國化學(xué)協(xié)會雜志852149，1963所描述的方法，制備該多肽。該合成用α-氨基端受保護(hù)的氨基酸來進(jìn)行。具有不穩(wěn)定側(cè)鏈的三功能氨基酸也用適合的基團(tuán)保護(hù)起來，以避免在該多肽的組裝期間發(fā)生不需要的化學(xué)反應(yīng)。選擇性地除去該α-氨基保護(hù)基團(tuán)以允許在該氨基端繼續(xù)隨后的反應(yīng)。用于除去該α-氨基保護(hù)基團(tuán)的條件并不除去該側(cè)鏈保護(hù)基團(tuán)。
該α-氨基保護(hù)基團(tuán)是已知在逐步多肽合成領(lǐng)域中有用的那些基團(tuán)。包括酰基類保護(hù)基團(tuán)(例如甲酰基、三氟乙酰基、乙酰基)、芳基類保護(hù)基團(tuán)(例如生物素基)、芳香氨基甲酸酯(urethane)類保護(hù)基團(tuán)(例如芐氧基羰基(Cbz)、取代的芐氧基羰基和9-芴甲氧基羰基(Fmoc))、脂肪族氨基甲酸酯保護(hù)基團(tuán)(例如，t-丁氧基羰基(tBoc)、異丙氧基羰基、環(huán)己基氧基羰基)和烷基類保護(hù)基團(tuán)(例如苯甲基、三苯甲基)。優(yōu)選的保護(hù)基團(tuán)是tBoc和Fmoc。
所選擇的側(cè)鏈保護(hù)基團(tuán)必須在偶聯(lián)期間保持完整，并且在氨基端保護(hù)基團(tuán)的脫保護(hù)期間或在偶聯(lián)情況中不會被除去。該側(cè)鏈保護(hù)基團(tuán)還必須能在合成完成后能夠在不改變最終多肽的反應(yīng)條件下被除去。在tBoc化學(xué)中，三功能氨基酸的側(cè)鏈保護(hù)基團(tuán)大多數(shù)是以苯甲基為基礎(chǔ)的。在Fmoc化學(xué)中，它們大多數(shù)是以叔丁基或三苯甲基為基礎(chǔ)的。
在tBoc化學(xué)中，優(yōu)選的側(cè)鏈保護(hù)基團(tuán)對于精氨酸是甲苯磺?；瑢τ谔扉T冬氨酸是環(huán)己基，對于半胱氨酸是4-甲基芐基(和乙酰氨基甲基)，對于谷氨酸、絲氨酸和蘇氨酸是芐基，對于組氨酸是芐氧基甲基(和二硝基苯基)，對于賴氨酸是2-Cl-芐氧基羰基，對于色氨酸是甲?；?，對于酪氨酸是2-溴芐基。在Fmoc化學(xué)中，優(yōu)選的側(cè)鏈保護(hù)基團(tuán)對于精氨酸是2，2，5，7，8-五甲基苯并二氫吡喃-6-磺?；?Pmc)或2，2，4，6，7-五甲基二氫苯并呋喃-5-磺?；?Pbf)，對于天冬酰胺、半胱氨酸、谷氨酰胺和組氨酸是三苯甲基，對于天門冬氨酸、谷氨酸、絲氨酸、蘇氨酸和酪氨酸是叔丁基，對于賴氨酸和色氨酸是tBoc。
對于磷酸肽的合成，可以直接或在組裝后摻入磷酸基團(tuán)。在直接摻入策略中，絲氨酸、蘇氨酸或酪氨酸上的磷酸基在Fmoc化學(xué)中可以通過甲基、芐基或叔丁基來保護(hù)，而在tBoc化學(xué)中可以通過甲基、芐基或苯基來保護(hù)。在Fmoc化學(xué)中，還可以采用直接摻入沒有對磷酸保護(hù)的磷酸酪氨酸。在組裝后摻入策略中，在固相上用二叔丁基-、二芐基-、或二甲基-N，N’-二異丙基-亞磷酰胺衍生化絲氨酸、蘇氨酸或酪氨酸的未保護(hù)羥基基團(tuán)，然后通過叔丁基氫過氧化物進(jìn)行氧化。
固相合成通常通過α-氨基保護(hù)的(側(cè)鏈保護(hù)的)氨基酸與適合的固相支持物偶聯(lián)從羧基端開始進(jìn)行。當(dāng)與氯甲基、氯三苯甲基或羥甲基樹脂附著時，形成酯鍵，并且所獲多肽將在C端具有游離的羧基基團(tuán)?；蛘?，當(dāng)采用酰胺樹脂例如二苯甲基胺或?qū)Χ郊谆窐渲?對于tBoc化學(xué))和Rink酰胺或PAL樹脂(對于Fmoc化學(xué))時，形成酰胺鍵，而且所獲多肽將在C端具有氨甲酰基。這些樹脂，無論是以聚苯乙烯-或是聚酰胺為基礎(chǔ)的還是聚乙二醇接枝的，帶有或不帶柄或接頭的，以及帶有或不帶有第一個附著氨基酸的，均可以從商業(yè)途徑獲得，它們的制備描述于Stewart等，“固相肽合成(Solid Phase Peptide Synthesis)”(第二版)，(Pierce Chemical公司，Rockford，IL，1984)；和Bayer和Rapp，Chem.Pept.Prot.33，1986；和Atherton等，固相肽合成實(shí)踐方法(Solid Phase Peptide SynthesisAPractical Approach)，IRL Press，Oxford，1989。
采用各種活化劑包括二環(huán)己基碳二亞胺(DCC)、N，N’-二異丙基碳二亞胺(DIPCDI)和羰基二咪唑(CDI)，將C端氨基酸(如果必需的話側(cè)鏈和α-氨基基團(tuán)受到保護(hù))附著在羥甲基樹脂上。該C端氨基酸可以以其銫四甲基銨鹽(cesium tetramethylammonium salt)的形式，或在有三乙基胺(TEA)或二異丙基乙基胺(DIEA)存在時，直接與氯甲基或氯三苯甲基樹脂結(jié)合。第一個氨基酸和酰胺樹脂的結(jié)合與在偶聯(lián)反應(yīng)過程中的酰胺鍵形成相同。
在與樹脂支持物結(jié)合后，依據(jù)保護(hù)化學(xué)(例如tBoc、Fmoc)采用各種試劑去除α-氨基保護(hù)基團(tuán)。Fmoc的去除程度可以在300-320nm或通過電導(dǎo)池監(jiān)測。除去α-氨基保護(hù)基團(tuán)后，將剩余的被保護(hù)氨基酸按要求的序列逐步地進(jìn)行偶聯(lián)，以獲得期望序列。
有多種活化試劑可以用于該偶聯(lián)反應(yīng)，包括DCC、DIPCDI、六氟磷酸2-氯-1，3-二甲基酰亞銨(dimethylimidum)(CIP)、六氟磷酸苯并三唑-1-基-氧-三(二甲基氨基)-膦(BOP)和它的吡咯烷類似物(PyBOP)、六氟磷酸溴-三吡咯烷-膦(PyBrOP)、六氟磷酸O-(苯并三唑-1-基)-1，1，3，3-四甲基脲鎓(uronium)(HBTU)和它的四氟硼酸鹽類似物(TBTU)或它的吡咯烷類似物(HBPyU)、六氟磷酸0-(7-氮雜苯并三唑-1-基)-1，1，3，3-四甲基脲鎓(HATU)和它的四氟硼酸鹽類似物(TATU)或它的吡咯烷類似物(HAPyU)。在偶聯(lián)反應(yīng)中使用的最普通催化添加劑包括4-二甲基氨基吡啶(DMAP)、3-羥基-3，4-二氫-4-氧代-1，2，3-苯并三嗪(HODhbt)、N-羥基苯并三唑(HOBt)和1-羥基-7-氮雜苯并三唑(HOAt)。每一種被保護(hù)的氨基酸均過量使用(＞2.0當(dāng)量)，并且偶聯(lián)常常在N-甲基吡咯烷酮(NMP)或在DMF、CH2Cl2或它們的混合物中進(jìn)行。偶聯(lián)反應(yīng)的完成程度可以通過例如Kaiser等(分析生物化學(xué)(Anal.Biochem.)34595，1970)所描述的茚三酮反應(yīng)在每一個階段進(jìn)行監(jiān)測。
在完成期望肽的完全組裝之后，用帶有適當(dāng)清除劑的試劑裂解肽-樹脂。通常Fmoe肽用帶有清除劑(例如H2O、乙二硫醇(ethanedithiol)、酚和苯硫基甲烷)的TFA進(jìn)行裂解和去保護(hù)。tBoc肽通常采用液體HF在-5℃至0℃作用1-2個小時來進(jìn)行裂解和去保護(hù)，該反應(yīng)使得多肽從樹脂上裂解下來并除去大多數(shù)側(cè)鏈保護(hù)基團(tuán)。清除劑，例如苯甲醚、二甲硫和對甲苯硫酚，通常與液體HF一起使用，以防止在裂解過程中形成的陽離子對多肽中的氨基酸殘基進(jìn)行烷基化和?；?。在HF裂解前需要通過DMF中的哌啶和苯硫基分別將色氨酸的甲?；徒M氨酸的二硝基苯基除去?？梢酝ㄟ^乙酸汞(II)除去半胱氨酸的乙酰氨基甲基，或者是通過碘、三氟乙酸鉈(III)或四氟硼酸銀將其除去并同時將半胱氨酸氧化成胱氨酸。用于tBoc肽裂解和去保護(hù)的其它強(qiáng)酸包括三氟甲磺酸(TFMSA)和三甲基硅烷三氟乙酸酯(TMSOTf)。
本發(fā)明還提供各種其它多肽融合物和含有一個或多個多肽融合物的相關(guān)多聚體蛋白質(zhì)?？梢詫⒖扇苄訠R43×2、TACI或BCMA多肽表達(dá)為帶有一個含有兩個恒定區(qū)結(jié)構(gòu)域但缺少可變區(qū)的免疫球蛋白重鏈恒定區(qū)(典型的是Fc片段)的融合物。制備這些融合物的方法公開于美國專利5,155,027和5,567,584。這些融合物典型的是作為多聚體分子進(jìn)行分泌的，其中Fc部分相互之間形成二硫鍵，而兩個非Ig多肽彼此緊接排列。可以在遺傳工程細(xì)胞中表達(dá)免疫球蛋白-BR43×2(TACI或BCMA)多肽融合物，以產(chǎn)生多種多聚體BR43×2類似物?？梢詫⑤o助功能域與BR43×2(TACI或BCMA)多肽融合，使其導(dǎo)向特定細(xì)胞、組織或高分子。還可以按本文所討論的采用毒素來制備融合物。以此方式，可以將多肽和蛋白質(zhì)定向，用于治療或診斷目的。BR43×2多肽可以和兩個或更多個部分融合，例如用于純化的親和標(biāo)記物和靶向功能域。多肽融合物還可以含有一個或多個切割位點(diǎn)，尤其是在域之間。見，Tuan等，Connect.Tiss.Res.341-9，1996。該類型的融合物還可以用于例如從溶液中親和純化相關(guān)配體、作為體外分析工具、在體外通過特異滴定配體阻斷信號、與細(xì)胞表面配體結(jié)合、或作為BR43×2的體內(nèi)拮抗劑并通過施用阻斷配體的刺激作用。對于在分析試驗(yàn)中的應(yīng)用，可以將該融合蛋白質(zhì)通過Fc區(qū)與支持物結(jié)合，并應(yīng)用在ELISA中。
本發(fā)明還提供用于和親和標(biāo)記物或標(biāo)簽形成融合蛋白的可溶性BR43×2受體和多肽片段。可溶性BR43×2-親和標(biāo)記物融合蛋白可以用于例如鑒定BR43×2配體、以及天然配體的激動劑和拮抗劑。采用標(biāo)記的可溶性BR43×2，通過熒光免疫細(xì)胞計(jì)量術(shù)或免疫組織化學(xué)可鑒定表達(dá)該配體、激動劑或拮抗劑的細(xì)胞。該可溶性融合蛋白在研究該配體在組織或特異細(xì)胞系上的分布，和提供對受體/配體生物學(xué)的理解方面是有用的。
為了純化配體、激動劑或拮抗劑，在有利于受體/配體結(jié)合的條件下(典型的是接近生理的溫度、pH和離子強(qiáng)度)，將BR43×2-Ig融合蛋白加入至含有該配體、激動劑或拮抗劑的樣品中。然后通過與固定在固相支持物(例如不溶性樹脂珠)上的A蛋白質(zhì)混合，分離該受體/配體復(fù)合物。然后采用常規(guī)化學(xué)技術(shù)，例如用鹽或pH梯度，洗脫該配體、激動劑、拮抗劑。在另一個可替代的方法中，將該融合蛋白本身結(jié)合在固相支持物上，并按上述進(jìn)行結(jié)合和洗脫。用于將受體多肽固定在固相支持物上的方法是本領(lǐng)域已知的，這些固相支持物例如瓊脂糖、交聯(lián)瓊脂糖、玻璃、纖維素樹脂、硅基樹脂、聚苯乙烯、交聯(lián)聚丙烯酰胺、或在使用條件下穩(wěn)定的類似材料的顆粒。用于多肽與固相支持物連接的方法是本領(lǐng)域已知的，包括胺類化學(xué)、溴化氰活化、N-羥基琥珀酰亞胺活化、環(huán)氧化物活化、巰基活化、和酰肼活化。所獲介質(zhì)一般被制成柱形，然后將含有配體的液體流過該柱一或多次，以允許配體與該受體多肽結(jié)合。然后采用鹽濃度、離液劑(MnCl2)、或pH的改變破壞配體一受體結(jié)合，以洗脫該配體。
為了指導(dǎo)該可溶性受體導(dǎo)出宿主細(xì)胞，將該可溶性受體DNA與編碼分泌肽如t-PA分泌肽的第二個DNA片段連接在一起。為了有利于該分泌受體域的純化，可以在該受體多肽上融合一個N-或C-端突出片段如親和標(biāo)記物、或可以獲得其抗體或其它特異結(jié)合劑的另一種多肽或蛋白質(zhì)。
表達(dá)本發(fā)明的功能性可溶和膜結(jié)合受體的細(xì)胞可以用于篩選分析試驗(yàn)中。本領(lǐng)域已知多種適合的分析試驗(yàn)。這些試驗(yàn)以檢測靶細(xì)胞中的生物學(xué)應(yīng)答為基礎(chǔ)。與對照值相比代謝上的改變指示測試化合物是否調(diào)節(jié)BR43×2所介導(dǎo)的代謝。一個這樣的分析試驗(yàn)是細(xì)胞增殖分析試驗(yàn)。在有或無測試化合物時培養(yǎng)細(xì)胞，然后通過例如測量含氚胸苷的摻入，或通過基于溴化3-(4，5-二甲基噻唑-2-基)-2，5-二苯基四唑(MTT)的代謝降解的比色分析法，檢測細(xì)胞的增殖(Mosman，免疫學(xué)方法雜志(J.Immunol.Meth.)6555-63，1983)。另一種替代分析方案采用經(jīng)進(jìn)一步改造表達(dá)報道基因的細(xì)胞。將該報道基因與響應(yīng)該受體相連途徑的啟動子元件連接在一起，然后該試驗(yàn)檢測該報道基因的轉(zhuǎn)錄激活。易于在細(xì)胞提取物中分析的許多報道基因是本領(lǐng)域已知，例如大腸桿菌的lacZ、氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶(CAT)和血清效應(yīng)元件(SRE)(見例如Shaw等，細(xì)胞(Cell)56563-72，1989)。優(yōu)選的這類報道基因是螢光素酶基因(de Wet等，分子細(xì)胞生物學(xué)(Mol.Cell Biol.)7725，1987)。螢光素酶基因的表達(dá)可以采用本領(lǐng)域已知的方法通過螢光來檢測(例如Baumgartner等，生物化學(xué)雜志(J.Biol.Chem.)26929094-101，1994；Schenborn和Goiffin，Promega Notes 4111，1993)。螢光素酶活性分析試劑盒可以從商業(yè)途徑獲得，例如從Promega公司，Madison，WI獲得?？梢圆捎迷擃愋偷陌屑?xì)胞系來篩選化學(xué)制品文庫、細(xì)胞條件培養(yǎng)基、真菌培養(yǎng)液、土壤樣品和水樣品等。例如，可以在靶細(xì)胞上對一系列細(xì)胞條件培養(yǎng)基樣品進(jìn)行分析，以鑒定產(chǎn)生配體的細(xì)胞。然后用陽性細(xì)胞制備處于哺乳動物表達(dá)載體中的cDNA文庫，將此cDNA文庫分成多個庫(pool)，轉(zhuǎn)染宿主細(xì)胞并表達(dá)。然后分析來自轉(zhuǎn)染細(xì)胞的培養(yǎng)基樣品，然后再次對這些庫進(jìn)行劃分、再轉(zhuǎn)染、繼代培養(yǎng)，并再次分析陽性細(xì)胞以分離編碼該配體的克隆eDNA。
還可以有利地利用一種使用了結(jié)合配體的受體(或抗體、互補(bǔ)物/抗互補(bǔ)物對的一個成員)或其結(jié)合片段，以及商業(yè)途徑可獲得的生物傳感器裝置(BIAcoreTM，Pharmacia Biosensor，Piscataway，NJ)的分析系統(tǒng)。該受體、抗體、互補(bǔ)物/抗互補(bǔ)物對的成員或片段被固定在受體芯片的表面上。該裝置的應(yīng)用公開于Karlsson，免疫方法雜志145229-40，1991和Cunningham和Wells，分子生物學(xué)雜志(J.Mol.Biol.)234554-63，1993。例如，采用胺或巰基化學(xué)，將BR43×2多肽、片段、抗體或互補(bǔ)物/抗互補(bǔ)物對的成員與流動吸收池中和金箔結(jié)合的葡聚糖纖維共價連接。使測試樣品流經(jīng)該吸收池。如果樣品中存在配體、表位、或相對的互補(bǔ)物/抗互補(bǔ)物對成員時，其將分別與固定化的受體、抗體或成員結(jié)合，造成介質(zhì)折射率的改變，這可以以金箔表面胞質(zhì)團(tuán)共振(surfaceplasmon resonance)的改變來檢測。該系統(tǒng)允許確定結(jié)合和解離速率(on-and off-rates)，由此可以計(jì)算出結(jié)合親和力，并對結(jié)合的化學(xué)計(jì)量進(jìn)行估算。結(jié)合配體的受體多肽還可以用于本領(lǐng)域已知的其它分析系統(tǒng)。這些系統(tǒng)包括用于測定結(jié)合親和力的斯卡查德分析(見Scatchard，Ann.NY Acad.Sci.51660-72，1949)和量熱分析試驗(yàn)(Cunningham等，科學(xué)253545-48，1991；Cunningham等，科學(xué)245821-25，1991)。
圖2顯示了可溶性I125-ztnf4與TACI和BCMA結(jié)合的斯卡查德圖分析，并且在表7中和TNFR家族其它成員的結(jié)合常數(shù)作了比較。
表7
a Hohmann等，生物化學(xué)雜志26414927-34，1989b Manna和Aggarwal，生物化學(xué)雜志27333333-41，1998c Goodwin等，細(xì)胞73447-56，1993d Armitage等，自然35780-82，1992e Shuford等，J.Exp.Med.18647-55，1997作為受體，BR43×2多肽的激活可以通過硅基生物傳感器微生理功能測定儀(microphysiometer)對與受體結(jié)合及隨后的生理學(xué)細(xì)胞反應(yīng)相關(guān)的細(xì)胞外酸化速率或質(zhì)子外排的測量來確定。一個典型裝置是Molecular Devices(Sunnyvale，CA)所制造的CytosensorTMMicrophysiometer。各種細(xì)胞反應(yīng)，例如細(xì)胞增殖、離子轉(zhuǎn)運(yùn)、能量產(chǎn)生、炎癥反應(yīng)、調(diào)節(jié)和受體激活等，均可以通過該方法測量。見例如McConnell等，科學(xué)2571906-12，1992；Pitchford等，酶學(xué)方法22884-108，1997；Arimilli等，免疫學(xué)方法雜志21249-59，1998；VanLiefde等，歐洲藥理學(xué)雜志(Eur.J.Pharmacol.)34687-95，1998。該微生理功能測定儀能夠用于分析粘附或非粘附真核或原核細(xì)胞。通過測量細(xì)胞培養(yǎng)基中一段時間內(nèi)細(xì)胞外的酸化改變，該微生理功能測定儀直接測量了細(xì)胞對各種刺激包括BR43×2多肽的激動劑、配體或拮抗劑的反應(yīng)。優(yōu)選將該微生理功能測定儀用于與不表達(dá)BR43×2多肽的對照真核細(xì)胞進(jìn)行比較測量表達(dá)BR43×2的真核細(xì)胞的反應(yīng)。表達(dá)BR43×2的真核細(xì)胞包含按本文所述通過轉(zhuǎn)染BR43×2產(chǎn)生的響應(yīng)調(diào)節(jié)BR43×2的刺激物的細(xì)胞；或天然表達(dá)BR43×2的細(xì)胞，例如來源于脾臟組織的表達(dá)BR43×2的細(xì)胞。通過細(xì)胞外的酸化改變測量的差異，例如表達(dá)BR43×2的細(xì)胞相對于對照在反應(yīng)上的增加或降低，是對BR43×2所介導(dǎo)的細(xì)胞反應(yīng)的一種直接測量。而且，可以在多種刺激物作用下分析這些BR43×2介導(dǎo)的反應(yīng)。采用該微生理功能測定儀，還提供了一種鑒定BR43×2多肽的激動劑和拮抗劑的方法，包括提供表達(dá)BR43×2多肽的細(xì)胞，在沒有測試化合物的條件下培養(yǎng)該細(xì)胞的第一部分，在有測試化合物的條件下培養(yǎng)該細(xì)胞的第二部分，并檢測該細(xì)胞第二部分相對于該細(xì)胞第一部分在細(xì)胞反應(yīng)上的改變，例如增強(qiáng)或降低。細(xì)胞反應(yīng)的改變表現(xiàn)為可測量的細(xì)胞外酸化速率的改變。采用該方法可以快速鑒定BR43×2多肽的拮抗劑和激動劑。
可溶性BR43×2在研究配體在組織或特異細(xì)胞系上的分布，和提供對受體/配體生物學(xué)的理解方面是有用的。還可以將TNF受體對其配體的特異性用作破壞攜帶配體的靶細(xì)胞的一種機(jī)制。例如，可以將毒性化合物與BR43×2可溶性受體或BR43×2融合物偶聯(lián)。毒性化合物的例子包括失活靶細(xì)胞的放射性藥物；化療劑例如阿霉素、柔紅霉素、氨甲蝶呤和環(huán)磷酰胺；毒素例如篦麻毒素、白喉毒素、假單孢菌外毒素A和相思豆毒蛋白；和細(xì)胞毒性T細(xì)胞表面分子的抗體。
通過FACS分析(流式細(xì)胞計(jì)量和分揀術(shù)(Flow Cytometry andSorting)，Melamed等編，Wiley-Liss，1990；以及免疫熒光和細(xì)胞分揀術(shù)，當(dāng)代免疫學(xué)實(shí)驗(yàn)指南(Immunofluorescence and Cell Sorting.Current Protocols in Immunology)，第1卷，Coligan等編，John Wiley&Son，1997)，已發(fā)現(xiàn)ztnf4(5ng/ml)可以與BR43×2(SEQ ID NO2)、TACI(SEQ ID NO6)、BCMA(SEQ ID NO8)和BR43×1(SEQ ID NO9)結(jié)合。采用FACS分析，F(xiàn)ITC標(biāo)記的可溶性ztnf4還表現(xiàn)出，尤其是與PBMNC、扁桃體細(xì)胞中的B淋巴細(xì)胞，以及與B細(xì)胞淋巴瘤細(xì)胞系(Ra.ji細(xì)胞，伯基特氏人淋巴瘤，ATCC CCL86)、Ramos(伯基特氏淋巴瘤細(xì)胞系，ATCC CRL-1596)、Daudi(伯基特氏人淋巴瘤，ATCC CCL213)和RPMI1788(一種B淋巴細(xì)胞細(xì)胞系，ATCC CCL-156)的特異結(jié)合。未觀察到與HL-60(ATCC一種前髓細(xì)胞，ATCC CCL-240)的結(jié)合。通過用針對B細(xì)胞特異分子包括CD19、IgD、IgM和CD20的抗體進(jìn)行的共染色，驗(yàn)證了與來自PBMNC和扁桃體細(xì)胞的B細(xì)胞的結(jié)合特異性。ztnf4與CD40L的相似性提示存在比所觀察到的更廣的組織分布。例如，采用細(xì)胞因子增殖和T細(xì)胞增殖分析在單核細(xì)胞、樹突細(xì)胞和純化的T細(xì)胞上檢測到ztnf4的親和性，而在檢測的任何其它類型細(xì)胞上均未能檢測到ztnf4的結(jié)合或任何其它的生物學(xué)影響。因此，由該配體和受體導(dǎo)致的對B細(xì)胞的特異性提示，該配體和受體對于自身免疫、B細(xì)胞癌癥、免疫調(diào)節(jié)、IBD和諸如ITCP、重癥肌無力等的任何抗體介導(dǎo)病變、腎疾病、間接T細(xì)胞免疫應(yīng)答、移植排斥、移植物抗宿主疾病的研究和治療是有用的。
在體外，ztnf4表現(xiàn)出對B細(xì)胞的激活，導(dǎo)致B細(xì)胞增殖、抗體產(chǎn)生和激活標(biāo)記的上調(diào)(例如參見下文)。這些作用可能需要IL-4或其它細(xì)胞因子的共刺激，或經(jīng)過B細(xì)胞抗原受體或其它激活B細(xì)胞的細(xì)胞表面受體例如CD40的刺激。其它腫瘤壞死因子配體，例如gp39和TNFβ，也刺激B細(xì)胞增殖。因此，可以在免疫應(yīng)答期間將本發(fā)明的多肽定向以特異調(diào)節(jié)B細(xì)胞應(yīng)答，抑制激活的B細(xì)胞，而不影響其它細(xì)胞群體，這在疾病的治療中是有利的。此外，本發(fā)明的多肽還可以用于調(diào)節(jié)B細(xì)胞發(fā)育、其它細(xì)胞的發(fā)育、抗體的產(chǎn)生和細(xì)胞因子的產(chǎn)生。BR43×2多肽還可以用于誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡和/或細(xì)胞的無變應(yīng)性。本發(fā)明的多肽還可以通過中和ztnf4的增殖作用調(diào)節(jié)T和B細(xì)胞的通訊。可以進(jìn)行生物測定和ELISA以測量在有可溶性BR43×2、TACI和/或BCMA時細(xì)胞對ztnf4的反應(yīng)。其它測定試驗(yàn)包括測量細(xì)胞因子產(chǎn)生的改變作為一種細(xì)胞反應(yīng)量度的那些試驗(yàn)(見例如當(dāng)代免疫學(xué)實(shí)驗(yàn)指南(Current Protocols inImmunology)，John E.Coligan等編，NIH，1996)，以及測量其它的細(xì)胞反應(yīng)，包括抗體同種型、單核細(xì)胞激活、NK細(xì)胞形成、抗原呈遞細(xì)胞的功能、細(xì)胞凋亡的試驗(yàn)。
本發(fā)明的BR43×2多肽可以通過中和ztnf4的作用，用于治療前B細(xì)胞白血病或B細(xì)胞白血病例如漿細(xì)胞白血病、慢性或急性淋巴細(xì)胞白血??；骨髓瘤例如多發(fā)性骨髓瘤、漿細(xì)胞性骨髓瘤、內(nèi)皮細(xì)胞性骨髓瘤和巨細(xì)胞性骨髓瘤；以及淋巴瘤例如與ztnf4多肽的增加相關(guān)的非Hodgkins淋巴瘤。在用于抑制腫瘤發(fā)展和存活的治療方案中可溶性BR43×2將是有用的成分。
Northern印跡分析顯示，CD8+細(xì)胞、單核細(xì)胞、樹細(xì)胞(dendrocyte)、激活的單核細(xì)胞中表達(dá)ztnf4。這提示，在某些自身免疫疾病中，細(xì)胞毒性T細(xì)胞可能通過過量產(chǎn)生ztnf4刺激了B細(xì)胞的產(chǎn)生。選擇性阻斷B淋巴細(xì)胞作用的免疫抑制蛋白質(zhì)在治療疾病中將是有用的。對于幾種自身免疫病而言自體抗體(autoantibody)的產(chǎn)生是很普通的，其促進(jìn)了組織的破壞和疾病的惡化。自體抗體還能夠?qū)е旅庖邚?fù)合物沉積并發(fā)癥的發(fā)生，和引起包括腎衰竭、神經(jīng)痛癥狀和死亡在內(nèi)的許多系統(tǒng)性紅斑狼瘡癥狀。調(diào)節(jié)獨(dú)立于細(xì)胞應(yīng)答的抗體產(chǎn)生在許多疾病狀態(tài)中也是有益的。在類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎中B細(xì)胞還表現(xiàn)出在引起關(guān)節(jié)炎的(arthritogenic)免疫球蛋白的分泌中起作用(Korganow等，免疫(immunity)10451-61，1999)。因而，在重癥肌無力和類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎等自身免疫病的治療中，ztnf4對抗體產(chǎn)生的抑制將是有益的。免疫抑制治療方法，例如選擇性阻斷或中和B淋巴細(xì)胞作用的可溶性BR43×2，將可以用于這些目的。為了驗(yàn)證本發(fā)明的BR43×2可溶性受體多肽的這些能力，采用本領(lǐng)域已知的和本文所描述的分析試驗(yàn)來評價這些BR43×2多肽。
本發(fā)明提供應(yīng)用BR43×2、TACI或BCMA多肽、融合物、抗體、激動劑或拮抗劑選擇性阻斷或中和與終末期腎臟病(其與自身免疫病可能相關(guān)或不相關(guān))相關(guān)的B細(xì)胞作用的方法。這些方法對于治療免疫性腎疾病是有用的。這些方法對于治療與如下疾病相關(guān)的腎小球腎炎也將是有用的，這些疾病例如膜性腎病、IgA腎病或Berger氏疾病、IgM腎病、Goodpasture氏疾病、感染后腎小球腎炎、腎小球膜增生疾病(mesangioproliferative disease)、最小改變腎病綜合征(minimalchange nephrotic syndrome)。對于治療與如下疾病相關(guān)的繼發(fā)性腎小球性腎炎或脈管炎，這些方法還可以作治療性應(yīng)用，這些疾病例如狼瘡、多動脈炎、Henoch-Schonlein病、硬皮病、HIV相關(guān)的疾病、淀粉樣變性病或溶血性尿毒癥綜合征。對于治療與慢性腎盂腎炎、止痛劑濫用、腎鈣沉著癥、其它藥劑引起的腎病、腎結(jié)石、或慢性或急性間質(zhì)性腎炎相關(guān)的間質(zhì)性腎炎或腎盂腎炎，本發(fā)明的這些方法也可以用作治療應(yīng)用的一部分。
本發(fā)明的這些方法還包括應(yīng)用BR43×2、TACI或BCMA多肽、融合物、抗體、激動劑或拮抗劑治療包括腎動脈狹窄或閉塞和膽固醇栓或腎栓在內(nèi)的高血壓疾病或大血管(large vessel)疾病。
本發(fā)明還提供用于診斷和治療腎腫瘤或泌尿道腫瘤(urologicalneoplasm)、多發(fā)性骨髓瘤、淋巴瘤、輕鏈神經(jīng)病或淀粉樣變性病的方法。
本發(fā)明還提供使用BR43×2、TACI或BCMA多肽、融合物、抗體、激動劑或拮抗劑阻斷或抑制激活的B細(xì)胞，以治療哮喘和其它慢性呼吸道疾病例如支氣管炎和肺氣腫的方法。
本發(fā)明還提供使用BR43×2、TACI或BCMA多肽、融合物、抗體、激動劑或拮抗劑抑制或抵消效應(yīng)T細(xì)胞應(yīng)答，用于免疫抑制，尤其是對于移植物抗宿主疾病和移植排斥等的治療的方法。還可以在免疫應(yīng)答的調(diào)節(jié)，尤其是淋巴細(xì)胞的激活和調(diào)節(jié)方面找到其它的用途。BR43×2、TACI或BCMA多肽、融合物、抗體、激動劑或拮抗劑在治療免疫缺陷的療法中將是有用的。BR43×2、TACI或BCMA多肽、融合物、抗體、激動劑或拮抗劑在用于治療諸如胰島素依賴性糖尿病(IDDM)和Crohn氏病等自身免疫病的治療方案中將是有用的。本發(fā)明的方法對于治療慢性炎癥疾病，尤其是減輕關(guān)節(jié)疼痛、腫脹、貧血和其它相關(guān)癥狀，以及治療敗血癥性休克將也具有治療價值。
可溶性BR43×2、TACI或BCMA多肽和融合蛋白對于免疫應(yīng)答的作用可以通過以下方式來測定給經(jīng)抗原免疫并隨后注射過ztnf4的動物使用本發(fā)明的多肽，并根據(jù)本領(lǐng)域的已知方法測量抗體同種型的產(chǎn)生、包括遲發(fā)性過敏反應(yīng)和體外增殖在內(nèi)的B和T細(xì)胞應(yīng)答、和細(xì)胞因子的產(chǎn)生。
因此，本發(fā)明提供在哺乳動物中抑制ztnf4活性的方法，包括給所述動物施用一定量的選自下組的化合物a)SEQ ID NO4的多肽；b)SEQ IDNO8的多肽；c)融合蛋白；d)SEQ ID NO6第1位至166位氨基酸殘基的多肽；e)SEQ ID NO8第1位至150位氨基酸殘基的多肽；f)與SEQ IDNO4的多肽特異結(jié)合的抗體或抗體片段；和g)與SEQ ID NO10的多肽特異結(jié)合的抗體或抗體片段。融合蛋白的例子包括可溶性BR43×2(SEQ IDNO4)、TACI(SEQ ID NO6的第1-166位氨基酸殘基)或BCMA(SEQ IDNO8的第1-150位氨基酸殘基)與另一多肽，優(yōu)選免疫球蛋白重鏈恒定區(qū)Fc片段的融合物。同樣地，本發(fā)明提供抑制BR43×2、TACI或BCMA受體-配體嚙合的方法。
這些方法在ztnf4活性與激活的B淋巴細(xì)胞相關(guān)的地方，以及對于治療前B細(xì)胞或B細(xì)胞癌癥將尤其有用。這些方法在ztnf4活性與抗體的產(chǎn)生，尤其是與自身免疫病例如系統(tǒng)性紅斑性狼瘡、重癥肌無力或類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎相關(guān)的抗體產(chǎn)生相關(guān)的地方也將是有用的。
本發(fā)明還提供BR43×2激動劑和拮抗劑。鑒定為BR43×2激動劑的化合物對于體外和體內(nèi)調(diào)節(jié)靶細(xì)胞的增殖和發(fā)育是有用的。例如，激動劑化合物單獨(dú)或聯(lián)合其它細(xì)胞因子和激素可以用作已知成分細(xì)胞培養(yǎng)基的成分。因此，激動劑在特異調(diào)節(jié)培養(yǎng)中攜帶BR43×2的B淋巴細(xì)胞的生長和/或發(fā)育方面是有用的。激動劑和拮抗劑還可以用于研究B淋巴細(xì)胞的效應(yīng)子功能、尤其是B淋巴細(xì)胞的激活和分化。拮抗劑可以用作研究配體-受體相互作用性質(zhì)的研究試劑。
鑒定為BR43×2拮抗劑的化合物也可用于加強(qiáng)體液免疫應(yīng)答。在對抗感染性疾病包括細(xì)菌、病毒、原生動物和寄生蟲感染中，B細(xì)胞應(yīng)答是重要的?？垢腥拘晕⑸锏目贵w能夠通過結(jié)合抗原使病原體固定，隨后發(fā)生補(bǔ)體介導(dǎo)的溶解或細(xì)胞介導(dǎo)的攻擊。BR43×2拮抗劑將起到增強(qiáng)體液應(yīng)答的作用，并且對于有患感染性疾病危險的個體將是一種有用的治療劑，或可以用作疫苗接種的補(bǔ)充。
本發(fā)明還提供或者與BR43×2多肽，或者與BR43×2多肽結(jié)合的配體結(jié)合的拮抗劑，籍此抑制或消除BR4×2的功能。這些BR43×2拮抗劑將包括抗體；與BR43×2多肽或其配體結(jié)合的寡核苷酸；保留了與該受體結(jié)合的能力但又不導(dǎo)致配體或受體的信號傳導(dǎo)的天然或合成BR43×2配體類似物。這些類似物可以是肽或肽樣化合物。與BR43×2多肽結(jié)合并阻止信號傳導(dǎo)的天然或合成小分子也被認(rèn)為是拮抗劑。因而，BR43×2拮抗劑可以用作治療劑以治療阻斷來自BR43×2受體或配體的信號對治療有益的某些疾病。拮抗劑可以用作研究配體-受體相互作用性質(zhì)的研究試劑。在轉(zhuǎn)化的B細(xì)胞系包括EBV誘導(dǎo)的和自發(fā)的伯基特氏淋巴瘤和幾種B細(xì)胞骨髓瘤上有BR43×2的表達(dá)。在B細(xì)胞淋巴瘤或多發(fā)性骨髓瘤的治療中抑制BR43×2的功能將是有用的。BR43×2可溶性受體或抗體等BR43×2拮抗劑可以在治療上用以調(diào)節(jié)腫瘤的發(fā)展進(jìn)程。
激動劑和拮抗劑的活性可以通過確定受體/配體嚙合效力的活性測定試驗(yàn)來確定。制備表達(dá)BR43×2、并共表達(dá)高水平的NfkB、NFAT-1和AP-1報道基因結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定轉(zhuǎn)染B細(xì)胞系，例如Baf3(一種鼠源前B細(xì)胞系，Palacios和Steinmetz，同上；和Mathey-Prevot等，同上)。還以相似方式在Jurkat和其它B淋巴瘤細(xì)胞系中制備了表達(dá)TACI和BCMA的細(xì)胞系。發(fā)現(xiàn)ztnf4使信號傳導(dǎo)經(jīng)過了這些結(jié)構(gòu)中的報道基因?？扇苄訠R43×2和抗體可以用以測量結(jié)合。
用于分析本發(fā)明蛋白質(zhì)的體內(nèi)方法涉及病毒遞送系統(tǒng)。用于該目的的病毒實(shí)例包括腺病毒、皰疹病毒、痘苗病毒和腺相關(guān)病毒(AAV)。腺病毒是一種雙鏈DNA病毒，是目前用于異源核酸遞送的研究最深入的基因轉(zhuǎn)移載體(綜述參見Becker等，細(xì)胞生物學(xué)方法(Meth.Cell Biol.)43161-89，1994；和Douglas和Curiel，科學(xué)和醫(yī)學(xué)(Science&Medicine)444-53，1997)。腺病毒系統(tǒng)提供了幾個優(yōu)點(diǎn)腺病毒能夠(i)容納相對大的DNA插入片段；(ii)生長至高滴度；(iii)感染廣譜的哺乳動物細(xì)胞類型；并且(iv)與含有不同啟動子的大量可獲得的載體一起使用。而且，由于腺病毒在血流中是穩(wěn)定的，所以能夠通過靜脈注射來施用。
通過缺失腺病毒基因組的各部分，能夠容納較大的異源DNA插入片段(高達(dá)7kb)。這些插入片段可以通過直接連接或通過與共轉(zhuǎn)染的質(zhì)粒同源重組摻入到病毒DNA中。在一個示例性系統(tǒng)中，從病毒載體中缺失了必需E1基因，除非通過宿主細(xì)胞(人293細(xì)胞系是一個示例)提供該E1基因否則該病毒將不會復(fù)制。當(dāng)給完整動物進(jìn)行靜脈內(nèi)施用時，腺病毒主要靶向肝臟。如果腺病毒遞送系統(tǒng)帶有E1基因缺失，則該病毒在宿主細(xì)胞中不能復(fù)制。然而，宿主的組織(例如肝臟)將表達(dá)和加工(如果存在信號序列的話，并分泌)該異源蛋白質(zhì)。在高度血管化的肝臟中分泌的蛋白質(zhì)將進(jìn)入血液循環(huán)，并且能夠確定其對感染動物的作用。
腺病毒系統(tǒng)還可以用于體外產(chǎn)生蛋白質(zhì)。通過在細(xì)胞不會進(jìn)行快速分裂的條件下培養(yǎng)腺病毒感染的非293細(xì)胞，該細(xì)胞能夠在較長的時間內(nèi)產(chǎn)生蛋白質(zhì)。例如，在細(xì)胞工廠中使BHK細(xì)胞生長至匯合，然后將其暴露給編碼目的分泌蛋白質(zhì)的腺病毒載體。然后在允許感染細(xì)胞存活幾周但又不顯著發(fā)生細(xì)胞分裂的無血清條件下培養(yǎng)細(xì)胞。或者，可以在懸浮培養(yǎng)中以相對高的細(xì)胞密度培養(yǎng)腺病毒載體感染的293S細(xì)胞，以產(chǎn)生相當(dāng)多量的蛋白質(zhì)(見Garnier等，細(xì)胞技術(shù)(Cytotechnol.)15145-55，1994)。使用任一種操作，均可以從細(xì)胞培養(yǎng)上清液中重復(fù)分離出表達(dá)的分泌異源蛋白質(zhì)。在感染的293S細(xì)胞的生產(chǎn)操作中，還可以有效地獲得非分泌蛋白質(zhì)。
可以利用建立好的動物模型體內(nèi)測試在某些疾病狀態(tài)中本發(fā)明可溶性BR43×2、TACI或BCMA多肽的有效性。尤其是，可以在許多自身免疫病動物模型，例如用作SLE(系統(tǒng)性紅斑性狼瘡)模型的MRL-lpr/lpr或NZB×NZW F1同類小鼠品系中，體內(nèi)測試可溶性BR43×2、TACI或BCMA多肽和多肽片段。這些動物模型是本領(lǐng)域已知的，見例如自身免疫病模型指南(Autoimmune Disease Models A Guidebook)，Cohen和Miller編，Academic Press。新西蘭黑鼠(NZB)和新西蘭白鼠(NZW)之間的雜交后代出現(xiàn)與人類SLE極為相象的自發(fā)形式SLE。該后代小鼠稱為NZBW，在1月齡時開始產(chǎn)生對抗T細(xì)胞的IgM自體抗體，并且到5-7月齡時，Ig抗DNA自體抗體是主要的免疫球蛋白。多克隆B細(xì)胞的活動過強(qiáng)導(dǎo)致自體抗體的過度產(chǎn)生。這些自體抗體，尤其是針對單鏈DNA的自體抗體的沉積與在臨床上表現(xiàn)為蛋白尿、氮血和腎衰竭死亡的腎小球腎炎的發(fā)生相關(guān)。在自然性SLE感染的小鼠中，腎衰竭是最主要的死亡原因，在NZBW品系中，該過程是慢性和不明顯的。該疾病在雌性中比在雄性中發(fā)展更快而且更為嚴(yán)重，平均存活僅245天，而相比較雄性平均存活406天。盡管許多雌性小鼠到7-9月齡時表現(xiàn)出癥狀(蛋白尿)，但一些會在年齡更小或更大時出現(xiàn)癥狀。在NZBW小鼠中觀察到的致命性免疫腎炎與人類SLE中所觀察到的腎小球性腎炎極為相似，使得該自發(fā)性鼠模型對于測試可能的SLE治療劑具有很大的吸引力(Putterman和Naparstek，自發(fā)性系統(tǒng)性紅斑狼瘡的鼠模型(Murine Models of Spontaneous SystemicLupus Erythematosus)，自身免疫病模型指南，第14章，第217-34頁，1994；Mohan等，免疫學(xué)雜志(J.Immunol.)1541470-80，1995；和Daikh等，免疫學(xué)雜志1593104-08，1997)。給這些小鼠施用可溶性TACI-IG、BR43×2-Ig、BCMA-Ig或其它可溶性融合蛋白質(zhì)，以評價TACI、BR43×2或BCMA改善癥狀和改變病程的有效性，這將在以下實(shí)施例部分進(jìn)行描述。
實(shí)驗(yàn)性變態(tài)反應(yīng)性腦脊髓炎(EAE)的小鼠模型已用作研究免疫所介導(dǎo)疾病的機(jī)制和可能的治療干預(yù)方法的工具。該模型與人類多發(fā)性硬化癥相似，并且由于針對神經(jīng)蛋白例如髓鞘堿性蛋白(MBP)或蛋白脂質(zhì)蛋白(PLP)的T細(xì)胞激活而產(chǎn)生脫髓鞘。用抗原接種導(dǎo)致CD4+、II型MHC限制性T細(xì)胞(Th1)的誘導(dǎo)產(chǎn)生。對產(chǎn)生EAE的方法進(jìn)行修改可以產(chǎn)生該模型的急性、慢性-復(fù)發(fā)或被動傳遞變體形式(Weinberg等，免疫學(xué)雜志1621818-26，1999；Mijaba等，細(xì)胞免疫學(xué)(Cell Immunol.)18694-102。1999；和Glabinski，酶學(xué)方法288182-90，1997)。給這些小鼠施用可溶性TACI-IG、BR43×2-Ig、BCMA-Ig或其它可溶性融合蛋白質(zhì)，以評價TACI、BR43×2或BCMA改善癥狀和改變病程的有效性，這將在以下實(shí)施例部分進(jìn)行描述。
在膠原蛋白誘導(dǎo)的關(guān)節(jié)炎(CIA)模型中，小鼠產(chǎn)生與人類類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎(RA)極為相似的慢性炎癥性關(guān)節(jié)炎。由于CIA與RA具有相似的免疫學(xué)和病理學(xué)特征，所以這使得該模型成為篩選潛在的人類抗炎癥化合物的理想模型。采用該CIA模型的另一個優(yōu)點(diǎn)是發(fā)病機(jī)理是已知的。已經(jīng)鑒定了II型膠原蛋白上的T和B細(xì)胞表位，并且確定了與免疫介導(dǎo)的關(guān)節(jié)炎有關(guān)的各種免疫學(xué)(遲發(fā)型超敏反應(yīng)和抗膠原蛋白抗體)和炎癥(細(xì)胞因子、趨化因子、和基質(zhì)降解酶)參數(shù)，并且這些參數(shù)可以用于評價測試化合物在這些模型中的有效性(Wooley，Curr.Opin.Rheum.3407-20，1999；Williams等，免疫學(xué)(Immunol.)899784-788，1992；Myers等，生命科學(xué)(Life Sci.)611861-78，1997和Wang等，免疫學(xué)928955-959，1995)。給這些小鼠施用可溶性TACI-IG、BR43×2-Ig、BCMA-Ig或其它可溶性融合蛋白質(zhì)，以評價TACI、BR43×2或BCMA改善癥狀和改變病程的有效性，這將在以下實(shí)施例部分進(jìn)行描述。
給小鼠注射卵白蛋白并用在支氣管中引起與哮喘相似的哮喘性反應(yīng)的抗原經(jīng)鼻進(jìn)行再次刺激后，可以產(chǎn)生支氣管感染例如哮喘的模型。給這些小鼠施用可溶性TACI-IG、BR43×2-Ig、BCMA-Ig或其它可溶性融合蛋白質(zhì)，以評價TACI、BR43×2或BCMA改善癥狀和改變病程的有效性，這將在以下實(shí)施例部分進(jìn)行描述。
在體模型的另一個應(yīng)用包括對所述動物進(jìn)行抗原刺激(antigenchallenge)，之后施用可溶性BR43×2(TACI)或其配體ztnf4并測量T和B細(xì)胞應(yīng)答。
T細(xì)胞依賴性和T細(xì)胞不依賴性免疫應(yīng)答可以按Perez-Melgosa等，免疫學(xué)雜志1631123-7，1999中所描述的方法進(jìn)行測量。
可以在接受了規(guī)劃的抗原攻擊(例如，卵白蛋白或膠原蛋白)之后施用了BR43×2、TACI或BCMA多肽或可溶性Ig-融合物的動物中引起免疫應(yīng)答，以測量對B細(xì)胞應(yīng)答的影響。
可以將藥代動力學(xué)研究與放射性標(biāo)記的可溶性BR43×2、TACI或BCMA多肽或融合物聯(lián)合使用，以確定這些多肽在體內(nèi)的分布和半衰期。此外，還可使用動物模型確定體內(nèi)可溶性BR43×2、TACI或BCMA對腫瘤和腫瘤發(fā)展的影響。
本發(fā)明還提供BR43×2、TACI或BCMA多肽作為替代標(biāo)記(survogatemarker)在自身免疫病、腎疾病、B和T細(xì)胞疾病中的應(yīng)用。可以抽取這些患者的血液，然后可以在血液中檢測BR43×2、TACI或BCMA可溶性受體和它們的配體。
本發(fā)明還提供抗體?？梢圆捎美绾心康亩嚯牡谋磉_(dá)載體的產(chǎn)物或從天然來源分離的多肽作為抗原來獲得針對BR43×2或具有SEQ ID NO8氨基酸序列的肽的抗體。與BR43×2或具有SEQ ID NO10氨基酸序列的肽“特異性結(jié)合”的抗體尤其有用。如果抗體與BR43×2多肽或SEQ ID NO8的多肽、肽或表位結(jié)合的結(jié)合親和力(Ka)為106M-1或更高，優(yōu)選107M-1或更高，更優(yōu)選108M-1或更高，最優(yōu)選109M-1或更高，則該抗體被認(rèn)為是特異性結(jié)合?？贵w的結(jié)合親和力可以由本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員通過例如斯卡查德分析(Scatchard，Ann.NY Acad.Sci.51660，1949)容易地確定。適合的抗體包括與BR43×2，尤其是BR43×2的胞外域(SEQ ID NO2的第1-120位氨基酸殘基)結(jié)合的抗體，和那些與具有SEQ ID NO10之氨基酸序列的多肽結(jié)合的抗體。
抗BR43×2抗體可以采用帶有抗原性BR43×2表位的肽和多肽來制備。本發(fā)明帶有抗原性表位的肽和多肽含有SEQ ID NO2中的至少9個，優(yōu)選15至大約30個氨基酸的序列。然而，含有本發(fā)明氨基酸序列更大的部分，如含有30-50個氨基酸，或高達(dá)并包括本發(fā)明多肽之完整氨基酸序列的任何長度的肽或多肽對于誘導(dǎo)與BR43×2結(jié)合的抗體也是有用的。理想的是，對攜帶表位的肽的氨基酸序列進(jìn)行選擇以便在水溶液中提供相當(dāng)大的可溶性(即，該序列包括相對親水的殘基，而優(yōu)選避免疏水殘基)。親水肽可以由本領(lǐng)域的技術(shù)人員從疏水性分布圖預(yù)測，見例如Hopp和Woods(美國國家科學(xué)院院刊(Proc.Nat.Acad.Sci.USA)783824-8，1981)以及Kyte和Doolittle(分子生物學(xué)雜志157105-142，1982)。而且，含有脯氨酸殘基的氨基酸序列對于抗體的產(chǎn)生也可能是期望的。
針對重組BR43×2蛋白質(zhì)或從天然來源分離的BR43×2的多克隆抗體可以采用本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的方法來制備。見，例如Green等，“多克隆抗血清的制備(Production of Polyclonal Antisera)”，免疫化學(xué)實(shí)驗(yàn)指南(Immunochemical Protocols)(Manson編)，第1-5頁(HumanaPress 1992)；和Williams等，“采用質(zhì)粒載體在大腸桿菌中表達(dá)外源蛋白以及特異性多克隆抗體的純化(Expression of foreign proteins inE.coli using plasmid vectors and purificaion of specificpolyclonal antibodies)”，DNA克隆2表達(dá)系統(tǒng)(DNA Cloning2Expression Systems)，第2版，Glover等(編)，第15頁(OxfordUniversity Press 1995)。BR43×2多肽的免疫原性可以通過使用佐劑例如明礬(氫氧化鋁)或弗氏完全或不完全佐劑來增強(qiáng)。對于免疫有用的多肽還包括融合多肽，例如BR43×2或其部分與免疫球蛋白多肽或與麥芽糖結(jié)合蛋白的融合物。多肽免疫原可以是全長分子或其部分。如果該多肽部分是“類半抗原”，則可以將該部分有利地結(jié)合或連接到大分子載體(例如匙孔血藍(lán)蛋白(KIH)、牛血清白蛋白(BSA)、或破傷風(fēng)類毒素)上用于免疫。
盡管多克隆抗體典型的是在動物例如馬、奶牛、狗、雞、大鼠、小鼠、兔、倉鼠、豚鼠、山羊或綿羊上產(chǎn)生的，本發(fā)明的抗BR43×2抗體也可以來源于非人的靈長類動物抗體。用于在狒狒中產(chǎn)生診斷上和治療上有用的抗體的一般技術(shù)可以參見例如Goldenberg等，國際專利申請WO91/11465，和Losman等，國際癌癥雜志(Int.J.Cancer)46310，1990。還可以在轉(zhuǎn)基因動物例如轉(zhuǎn)基因綿羊、奶牛、山羊或豬中產(chǎn)生抗體，并可以在酵母和真菌中以修飾的形式以及在哺乳動物和昆蟲細(xì)胞中表達(dá)抗體。
作為替代方法，可以制備抗BR43×2的單克隆抗體?？梢酝ㄟ^本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的方法獲得針對特異抗原的嚙齒類動物單克隆抗體(見例如Kohler等，自然256495，1975，Coligan等(編)，當(dāng)代免疫學(xué)實(shí)驗(yàn)指南(Current Protocols in Immunology)，第1卷，第2.5.1-2.6.7(John Wiley&Sons 1991)；Pieksley等，“制備針對大腸桿菌中表達(dá)的蛋白質(zhì)的單克隆抗體(Production of monoclonal antibodies againstproteins expressed in E.coli)“，DNA克隆2表達(dá)系統(tǒng)，第2版，Glover等(編)，第93頁(Oxford University Press 1995))。
簡而言之，單克隆抗體可以通過如下步驟獲得給小鼠注射含有BR43×2基因產(chǎn)物的組合物，通過取出血清樣品驗(yàn)證抗體產(chǎn)生的存在，取出脾臟以獲得B淋巴細(xì)胞，將該B淋巴細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞融合以產(chǎn)生雜交瘤，克隆該雜交瘤，選擇產(chǎn)生針對該抗原的抗體的陽性克隆，培養(yǎng)產(chǎn)生針對該抗原的抗體的克隆，并從雜交瘤培養(yǎng)物中分離抗體。
此外，本發(fā)明的抗BR43×2抗體還可以來源于人單克隆抗體。人單克隆抗體是從經(jīng)改造應(yīng)答抗原攻擊產(chǎn)生特異性人類抗體的轉(zhuǎn)基因小鼠中獲得的。在該技術(shù)中，人類重鏈和親鏈座位的元件被引入到來源于含有定向破壞的內(nèi)源性重鏈和親鏈座位的胚胎干細(xì)胞系的小鼠品系中。該轉(zhuǎn)基因小鼠能夠合成特異針對人類抗原的人類抗體，并且該小鼠可以用于制備分泌人類抗體的雜交瘤。用于從轉(zhuǎn)基因小鼠獲得人類抗體的方法描述于例如Green等，Nat.Genet.，713，1994；Lonberg等，自然368856，1994，和Taylor等，Int.Immun.6579，1994。
可以通過各種成熟的技術(shù)從雜交瘤培養(yǎng)物中分離并純化單克隆抗體。這些分離技術(shù)包括A蛋白瓊脂糖凝膠(Sepharose)親和層析、大小排阻層析和離子交換層析(見例如Coligan，第2.7.1-2.7.12頁和第2.9.1-2.9.3頁；Baines等，“免疫球蛋白G(IgG)的純化(Purification ofImmunoglobulin G(IgG))”，分子生物學(xué)方法(Methods in MolecularBiology)，第10卷，第79-104頁(The Humana Press公司，1992))。
對于具體應(yīng)用，可能期望制備抗BR43×2抗體的片段。這些抗體片段可以通過例如該抗體的蛋白水解來獲得。通過常規(guī)方法對完整抗體進(jìn)行胃蛋白酶或木瓜蛋白酶消化，能夠獲得抗體片段。作為一個說明例子，可以通過胃蛋白酶酶切抗體以提供一個表示為F(ab’)2的5S片段，從而產(chǎn)生抗體片段。該片段能夠采用硫醇還原試劑作進(jìn)一步裂解，以產(chǎn)生3.5S的Fab’一價片段。任選地，該裂解反應(yīng)可以采用二硫鍵斷裂產(chǎn)生的巰基的封閉基團(tuán)來進(jìn)行。作為一種替代方法，采用胃蛋白酶進(jìn)行酶解直接產(chǎn)生兩個一價Fab片段和一個Fc片段。這些方法描述于例如Goldenberg，美國專利4,331,647；Nisonoff等，Arch Biochem.Biophys.89230，1960；Porter，Biochem.J.73119，1959；Edelman等，酶學(xué)方法，第1卷，第422頁(Academic Press 1967)；和Coligan，同上。
還可以采用其它裂解抗體的方法，例如分離重鏈以形成一價輕-重鏈片段、進(jìn)一步裂解片段、或其它酶學(xué)、化學(xué)或遺傳學(xué)技術(shù)，只要該片段能與完整抗體所識別的抗原結(jié)合即可。
例如，F(xiàn)v片段含有VH和VL鏈的連接。正如Inbar等，美國國家科學(xué)院院刊692659，1972中所描述的，這種連接可以是非共價的。或者是，這些可變鏈可以通過分子間二硫鍵連接起來，或通過化學(xué)物質(zhì)例如戊二醛形成交聯(lián)(見例如Sandhu，Crit.Rev.Biotech.12437，1992)。
Fv片段可以含有通過肽接頭連接的VH和VL鏈。這些單鏈抗原結(jié)合蛋白質(zhì)(scFv)通過構(gòu)建含有編碼通過一個寡核苷酸連接起來的VH和VL區(qū)的DNA序列的結(jié)構(gòu)基因來制備。將該結(jié)構(gòu)基因插入表達(dá)載體中，隨后將該表達(dá)載體導(dǎo)入宿主細(xì)胞例如大腸桿菌中。該重組宿主細(xì)胞合成一條以接頭肽連接了這兩個V區(qū)的單鏈多肽。制備scFvs的方法描述于例如Whitlow等，方法酶學(xué)方法手冊(MethodsA Companion to Methods inEnzymology)297，1991，也參見Bird等，科學(xué)242423，1988；Ladner等，美國專利4,946,778；Pack等，Bio/Technology 111271，1993；和Sandhu，同上。
作為一個說明例子，可以通過將淋巴細(xì)胞體外暴露于BR43×2多肽，并(例如，通過采用固定化的或標(biāo)記的BR43×2蛋白質(zhì)或肽)選擇噬菌體或相似載體中的抗體展示文庫來獲得scFv。編碼具有潛在BR43×2多肽結(jié)合域的多肽的基因可以通過篩選噬菌體上展示的(噬菌體展示)或細(xì)菌例如大腸桿菌上展示的隨機(jī)肽文庫來獲得?？梢杂卸喾N方法來獲得編碼該多肽的核苷酸序列，例如通過隨機(jī)誘變和隨機(jī)多核苷酸合成來獲得。這些隨機(jī)肽展示文庫可以用于篩選與已知靶標(biāo)相互作用的肽，所述已知靶標(biāo)可以是蛋白質(zhì)或多肽例如配體或受體、生物學(xué)的或合成的大分子、或有機(jī)或無機(jī)物質(zhì)。產(chǎn)生和篩選這些隨機(jī)肽展示文庫的技術(shù)是本領(lǐng)域已知的(Ladner等，美國專利5,223,409；Ladner等，美國專利4,946,778；Ladner等，美國專利5,403,484；Ladner等，美國專利5,571,698；和Kay等，肽和蛋白質(zhì)的噬菌體展示(Phage Display of Peptides andProteins)(Academic Press公司，1996))，并且隨機(jī)肽展示文庫和用于篩選這些文庫的試劑盒都可以從商業(yè)途徑，例如從Clontech(Palo Alto，CA)、Invitrogen公司(San Diego，CA)、New England Biolabs公司(Beverly，MA)、和Pharmacia LKB Biotechnology公司(Piscataway，NJ)獲得。隨機(jī)肽展示文庫可以采用本文所公開的BR43×2序列來篩選，以鑒定與BR43×2結(jié)合的蛋白質(zhì)。
抗體片段的另一種形式是編碼單個互補(bǔ)決定區(qū)(CDR)的肽。CDR肽(“最小識別單元”)可以通過構(gòu)建編碼目的抗體的CDR的基因來獲得。例如可以通過聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)從產(chǎn)生抗體的細(xì)胞的RNA合成該可變區(qū)來制備這些基因(見例如Larrick等，方法酶學(xué)方法手冊2106，1991)；Courtenay-Luck，“單克隆抗體的遺傳操作(Genetic Manipulation ofMonoclonal Antibodies)”，單克隆抗體制備、改造和臨床應(yīng)用(Monoclonal AntibodiesProduction，Engineering and ClinicalApplication)，Ritter等(編)，第166頁(Cambridge University Press1995)；和Ward等，“抗體的遺傳操作和表達(dá)(Genetic Manipulation andExpression of Antibodies)”，單克隆抗體原理和應(yīng)用(MonoclonalAntibodiesPrinciples and Applications)，Birch等(編)，第137頁(Wiley-Liss公司1995))。
作為替代方法，抗BR43×2抗體可以來源于“人源化”單克隆抗體。人源化單克隆抗體是通過將來自小鼠免疫球蛋白重和輕可變鏈的小鼠互補(bǔ)決定區(qū)轉(zhuǎn)移至人類可變區(qū)中產(chǎn)生的。然后在小鼠對應(yīng)部分的構(gòu)架區(qū)中替換成人類抗體的典型殘基。應(yīng)用來源于人源化單克隆抗體的抗體成分避免了與鼠恒定區(qū)的免疫原性相關(guān)的潛在問題?？寺∈竺庖咔虻鞍卓勺儏^(qū)的一般技術(shù)描述于例如Orlandi等，美國國家科學(xué)院院刊863833，1989。制備人源化單克隆抗體的技術(shù)描述于例如Jones等，自然321522，1986；Carter等，美國國家科學(xué)院院刊894285，1992；Sandhu，Crit.Rev.Biotech.12437，1992；Singer等，免疫雜志(J.Immun.)1502844.1993；Sudhir(編)，抗體工程手冊(Antibody Engineering Protocols)(Humana Press公司1995)；Kelley，“工程化治療抗體(EngineeringTherapeutic Antibodies)”，蛋白質(zhì)工程原理和實(shí)踐(ProteinEngineeringPrinciples and Practice)“，Cleland等(編)，第399-434頁(John Wiley&Sons公司，1996)；和Queen等，美國專利5,693,762(1997)。
多克隆抗獨(dú)特型抗體可以采用標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)通過用抗BR43×2的抗體或抗體片段免疫動物來制備。見例如Green等，“多克隆抗血清的制備(Production of Polyclonal Antisera)”，分子生物學(xué)方法免疫化學(xué)實(shí)驗(yàn)指南(Methods in Molecular BiologyImmunochemical Protocols)，Manson(編)，第1-12頁(Humana Press 1992)。也參見Coligan，同上，第2.4.1-2.4.7頁?；蛘撸梢圆捎每笲R43×2的抗體或抗體片段作為免疫原，并利用以上描述的技術(shù)來制備單克隆抗獨(dú)特型抗體。作為另一種替代方法，可以采用上面所描述的技術(shù)制備人源化抗獨(dú)特型抗體或非人靈長類動物的抗獨(dú)特型抗體。制備抗獨(dú)特型抗體的方法描述于例如Irie，美國專利5,208,146；Greene等，美國專利5,637,677；以及Varthakavi和Minocha，普通病毒學(xué)雜志(J.Gen.Virol.)771875，1996。
本文中抗體或多肽還可以直接或間接地與藥物、毒素、放射性核素等結(jié)合，而且這些結(jié)合物可以用于體內(nèi)診斷或治療應(yīng)用。例如，本發(fā)明的多肽或抗體可以用于鑒定或治療表達(dá)相應(yīng)抗互補(bǔ)分子(例如分別是受體或抗原)的組織或器官。更具體地，可以將BR43×2多肽或抗BR43×2抗體、或它們的生物活性片段或部分與可檢測的或細(xì)胞毒性的分子偶聯(lián)，并遞送給具有表達(dá)該抗互補(bǔ)分子的細(xì)胞、組織或器官的哺乳動物。
適合的可檢測分子可以直接或間接地與多肽或抗體連接，它們包括放射性核素、酶、底物、輔因子、抑制物、熒光標(biāo)記、化學(xué)發(fā)光標(biāo)記、磁性顆粒等。適合的細(xì)胞毒性分子可以直接或間接地與多肽或抗體連接，它們包括(例如，直接與多肽或抗體連接的，或通過鏊合部分間接連接的)細(xì)菌或植物的毒素(例如白喉毒素、假單孢菌外毒素、篦麻毒素、相思豆毒蛋白等)，以及治療性放射核素例如碘-131、錸-188或釔-90。多肽或抗體還可以與細(xì)胞毒性藥物例如阿霉素結(jié)合。對于可檢測分子或細(xì)胞毒性分子的間接連接，可以將該可檢測分子或細(xì)胞毒性分子與互補(bǔ)物/抗互補(bǔ)物對的一個成員結(jié)合，而另一個成員與多肽或抗體部分結(jié)合。為了這些目的，生物素/鏈霉親和素是一個典型的互補(bǔ)物/抗互補(bǔ)物對。
可溶性BR43×2多肽或BR43×2的抗體可以直接或間接地與藥物、毒素、放射性核素等結(jié)合，而且這些結(jié)合物可以用于體內(nèi)診斷或治療應(yīng)用。例如，本發(fā)明的多肽或抗體可以用于鑒定或治療表達(dá)相應(yīng)抗互補(bǔ)分子(例如分別是受體或抗原)的組織或器官。更具體地，可以將BR43×2多肽或抗BR43×2抗體、或它們的生物活性片段或部分與可檢測的或細(xì)胞毒性的分子偶聯(lián)，并遞送給具有表達(dá)該抗互補(bǔ)分子的細(xì)胞、組織或器官的哺乳動物。
適合的可檢測分子可以直接或間接地與多肽或抗體連接，它們包括放射性核素、酶、底物、輔因子、抑制物、熒光標(biāo)記、化學(xué)發(fā)光標(biāo)記、磁性顆粒等。適合的細(xì)胞毒性分子可以直接或間接地與多肽或抗體連接，它們包括(例如，直接與多肽或抗體連接的，或通過鏊合部分間接連接的)細(xì)菌或植物的毒素(例如白喉毒素、假單孢菌外毒素、篦麻毒素、相思豆毒蛋白等)，以及治療性放射核素例如碘-131、錸-188或釔-90。多肽或抗體還可以與細(xì)胞毒性藥物例如阿霉素結(jié)合、對于可檢測分子或細(xì)胞毒性分子的間接連接，可以將該可檢測分子或細(xì)胞毒性分子與互補(bǔ)物/抗互補(bǔ)物對的一個成員結(jié)合，而另一個成員與多肽或抗體部分結(jié)合。為了這些目的，生物素/鏈霉親和素是一個典型的互補(bǔ)物/抗互補(bǔ)物對。
這些多肽-毒素融合蛋白或抗體/片段-毒素融合蛋白可以用于定向的細(xì)胞或組織抑制或消融(例如以治療癌細(xì)胞或組織)?；蛘?，如果該多肽具有多個功能域(即，激活域或配體結(jié)合域，加上導(dǎo)向域)，則僅包括該導(dǎo)向域的融合蛋白可適合于指導(dǎo)可檢測分子、細(xì)胞毒性分子或互補(bǔ)分子達(dá)到目的細(xì)胞或組織類型。當(dāng)具有唯一一個該域的融合蛋白包括一個互補(bǔ)分子時，抗互補(bǔ)分子可以與可檢測分子或細(xì)胞毒性分子結(jié)合。因此該域-互補(bǔ)分子融合蛋白代表了用于一般抗互補(bǔ)分子-可檢測/細(xì)胞毒性分子結(jié)合物的細(xì)胞/組織特異性遞送的一般導(dǎo)向載體。本文所描述的生物活性多肽或抗體結(jié)合物可以通過靜脈內(nèi)、動脈內(nèi)或管內(nèi)方式遞送，或可以在期望的作用位置局部引入。
可以制備針對His或FLAGTM標(biāo)記的可溶性BR43×2多肽的抗體。還可以制備針對大腸桿菌所產(chǎn)生的MBP融合蛋白質(zhì)的抗體?；蛘?，這些多肽可以包括帶有人類Ig的融合蛋白。尤其是，可以將含有針對His標(biāo)記的或FLAGTM標(biāo)記的可溶性BR43×2的多肽抗體的抗血清用于通過免疫組織化學(xué)對人或靈長類動物組織進(jìn)行的BR43×2組織分布分析。這些可溶性BR43×2多肽還可以用于免疫小鼠，以便產(chǎn)生針對可溶性人類BR43×2多肽的單克隆抗體。針對可溶性人類BR43×2多肽的單克隆抗體還可以用于模擬配體/受體偶聯(lián)，從而導(dǎo)致該配體/受體對的激活或失活。例如，已經(jīng)闡明，交聯(lián)的抗可溶性CD40單克隆抗體給經(jīng)抗IgM或LPS亞最佳激活的B細(xì)胞提供了刺激信號，從而導(dǎo)致增殖和免疫球蛋白的產(chǎn)生。這些相同單克隆抗體在溶液中使用時可充當(dāng)拮抗劑阻斷受體的激活。BR43×2的單克隆抗體可以用于確定該BR43×2/BR43×2-配體對在通過組織分布研究鑒定的特異細(xì)胞譜系上的分布、調(diào)節(jié)和生物學(xué)相互作用。
本發(fā)明還提供分離和純化的BR43×2、TACI和BCMA多核苷酸探針或引物。這些多核苷酸探針可以是RNA或DNA。DNA可以是cDNA或基因組DNA。多核苷酸探針是單鏈或雙鏈DNA或RNA，一般是合成的寡核苷酸，但也可以從克隆的cDNA或基因組序列產(chǎn)生，并且其一般將含有至少16個核苷酸，更通常為17個核苷酸至25個或更多個核苷酸，有時為40-60個核苷酸，而且在一些情況中是一個相當(dāng)大的部分、區(qū)域或甚至是完整的BR43×2基因或cDNA。探針和引物一般是合成的寡核苷酸，但也可以從克隆的cDNA或基因組序列或它的互補(bǔ)序列產(chǎn)生。盡管可以使用稍短的探針(14-17個核苷酸)，但分析探針一般長至少20個核苷酸。PCR引物長至少5個核苷酸，優(yōu)選15或更多個nt，更優(yōu)選20-30個nt。當(dāng)基因的一個小區(qū)域是分析的靶標(biāo)時，可以使用短的多核苷酸。對于基因的總體分析，多核苷酸探針可以含有完整的外顯子或更多?？梢圆捎帽绢I(lǐng)域熟知的技術(shù)，用可從許多途徑例如Molecular Probes公司(Eugene，OR)和/Amersham公司(Arlington Heights，IL)購買獲得的例如酶、生物素、放射性核素、熒光團(tuán)、化學(xué)發(fā)光物、順磁顆粒等，對探針進(jìn)行標(biāo)記以提供可檢測信號。用于構(gòu)建探針的優(yōu)選區(qū)域包括配體結(jié)合區(qū)、富含半胱氨酸的假重復(fù)、信號序列等。用于制備多核苷酸探針的技術(shù)和雜交技術(shù)是本領(lǐng)域已知的，見例如Ausubel等編，當(dāng)代分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)指南(Current Protocols in Molecular Biology)，John Wiley and Sons公司，NY，1991。
可以在診斷系統(tǒng)中應(yīng)用BR43×2、TACI和BCMA多肽和抗體，以檢測BR43×2、TACI和BCMA以及BR43×2、TACI和BCMA的配體多肽例如ztnf4的存在。來源于這些檢測方法的信息將提供對于BR43×2多肽在多種疾病中的意義的理解，并且將可以在BR43×2水平改變顯著的疾病中用作診斷工具。BR43×2、TACI和BCMA受體多肽水平的改變可能指示了包括癌癥、自身免疫病和感染性疾病在內(nèi)的病理狀況。
在一個基本的分析試驗(yàn)中，在促進(jìn)探針和靶BR43×2、TACI或BCMA RNA種類之間的堿基配對的溫度和離子強(qiáng)度條件下，將單鏈探針分子與分離自生物學(xué)樣品的RNA一起孵育。從雜交的分子中分離出未結(jié)合探針后，檢測雜種分子的量。
成熟的RNA檢測雜交方法包括Northern分析和斑點(diǎn)/狹縫印跡雜交(見例如Ausubel，同上；和Wu等(編)，“RNA水平上的基因表達(dá)分析(Analysis of Gene Expression at the RNA Level)”，基因生物技術(shù)方法(Methods in Gene Biotechnology)，第225-239頁(CRC Press公司，1997))。可以用放射性同位素例如32P或35S對核酸探針進(jìn)行可檢測標(biāo)記。作為替代方法，可以用非放射性雜交方法檢測BR43×2 RNA(見例如Isaac(編)，用非放射性探針分析核酸的實(shí)驗(yàn)操作(Protoeols forNucleic Acid Analysis by Nonradioactive Probes)，Humana Press公司，1993)。典型的是通過生色或化合發(fā)光底物的酶轉(zhuǎn)化，實(shí)現(xiàn)非放射性檢測。說明性的非放射性部分包括生物素、熒光素和地高辛配基。
BR43×2、TACI和BCMA寡核苷酸探針對于體內(nèi)診斷也是有用的。作為一種說明，可以給對象施用18F標(biāo)記的寡核苷酸，并通過正電子發(fā)射斷層掃描進(jìn)行觀察(Tavitian等，自然醫(yī)學(xué)(Nature Medicine)4467，1998)。
許多診斷程序利用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)來增加檢測方法的靈敏度。用于實(shí)施PCR的標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)是熟知的(一般參見Mathew(編)，人類分子遺傳學(xué)實(shí)驗(yàn)手冊(Protocols in Human Molecular Genetics)(HumanaPress公司，1991)；White(編)，PCR操作當(dāng)前方法和應(yīng)用(PCR ProtocolsCurrent Methods and Applications)(Humana Press公司，1993)；Cotter(編)，癌癥的分子診斷(Molecular Diagnosis of Cancer)(Humana Press公司，1996)；Hanausek和Walaszek(編)，腫瘤標(biāo)記手冊(Tumor MarkerProtocols)(Humana Press公司，1998)；Lo(編)，PCR的臨床應(yīng)用(Clinical Applications of PCR)(Humana Press公司，1998)；和Meltzer(編)，生物分析中的PCR(PCR in Bioanalysis)(Humana Press公司，1998))?？梢栽O(shè)計(jì)PCR引物擴(kuò)增編碼特定BR43×2域或基序，例如BR43×2、TACI或BCMA的富含半胱氨酸的假重復(fù)的序列。
用于診斷分析的一種PCR變體是逆轉(zhuǎn)錄酶-PCR(RT-PCR)。在RT-PCR技術(shù)中，從生物樣品分離RNA，逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，并將該cDNA與BR43×2的引物一起孵育(見例如Wu等(編)，“通過PCR快速分離特異cDNA或基因(Rapid Isolation of Specific cDNAs or Genes by PCR)”，基因生物技術(shù)方法，CRC Press公司，第15-28頁，1997)。然后采用標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)進(jìn)行PCR并分析產(chǎn)物。
作為舉例說明，采用例如上述的硫氰酸胍細(xì)胞裂解程序，從生物學(xué)樣品中分離RNA?；蛘?，可以采用固相技術(shù)從細(xì)胞裂解物中分離mRNA。可以采用隨機(jī)寡核苷酸、短的dT同聚物、或BR43×2、TACI或BCMA的反義寡聚物，和該分離的RNA引發(fā)逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)。寡聚dT引物具有擴(kuò)增能夠提供對照靶序列的各種mRNA核苷酸序列的優(yōu)點(diǎn)。采用兩個典型長至少5個堿基的側(cè)翼寡核苷酸引物，通過聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)擴(kuò)增BR43×2、TACI或BCMA序列。
PCR擴(kuò)增產(chǎn)物可以采用各種方法檢測。例如，PCR產(chǎn)物可以通過凝膠電泳分級分離，并通過溴化乙啶染色觀察。或者，可以將分級分離的PCR產(chǎn)物轉(zhuǎn)移到膜上，用可檢測的標(biāo)記BR43×2探針雜交，并通過放射自顯影檢查。其它的可替代方法包括應(yīng)用地高辛配基標(biāo)記的脫氧核糖核酸三磷酸以提供化學(xué)發(fā)光檢測，和應(yīng)用C-TRAK比色分析。
另一種方法是實(shí)時定量PCR(Perkin-Elmer Cetus，Norwalk，Ct.)。使由寡核苷酸和連接的報道及猝滅染料組成的熒光探針在正向和反向引物之間特異退火。利用Taq DNA聚合物的5’內(nèi)切核酸酶活性，將該猝滅染料和報道染料分離，并產(chǎn)生序列特異性信號而且隨著擴(kuò)增的增加該信號增強(qiáng)。可以在PCR反應(yīng)期間持續(xù)地監(jiān)測和定量該熒光強(qiáng)度。
檢測BR43×2、TACI或BCMA表達(dá)的另一種方法是循環(huán)探針技術(shù)(cycling probe technology，CPT)，其中單鏈DNA靶標(biāo)與過量的DNA-RNA-DNA嵌合探針結(jié)合形成復(fù)合物，用RNase H切割該RNA部分，并檢測切割的嵌合探針的存在(見例如Beggs等，臨床微生物學(xué)雜志(J.Clin.Microbiol.)342985，1996；和Bekkaoui等，生物技術(shù)(Biotechniques)20240，1996)。用于檢測BR43×2、TACI或BCMA序列的另一些方法可以利用基于核酸序列的擴(kuò)增(NASBA)、通過交叉雜交進(jìn)行的模板協(xié)同擴(kuò)增(CATCH)和連接酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(LCR)等方法(見例如Marshall等，美國專利5,686,272(1997)；Dyer等，病毒學(xué)方法雜志(J.Virol.Methods)60161，1996；Ehricht等，歐洲生物化學(xué)雜志(Eur.J.Biochem.)243358，1997；和Chadwick等，病毒學(xué)方法雜志7059，1998)。其它標(biāo)準(zhǔn)方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的。
BR43×2、TACI和BCMA的探針和引物還可以用于檢測和定位組織樣品中BR43×2、TACI或BCMA的基因表達(dá)。該原位雜交的方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的(見例如Choo(編)，原位雜交實(shí)驗(yàn)操作(In SituHybridization Protocols)，Humana Press公司，1994；Wu等(編)，“通過放射性原位雜交(RISH)分析細(xì)胞DNA或mRNA的豐度(Ahalysis ofCellular DNA or Abundance of mRNA by Radioactive In SituHybridization(RISH))”，基因生物技術(shù)方法(Methods in GeneBiotechnology)，CRC Press公司，第259-278頁，1997；Wu等(編)，“通過熒光原位雜交定位DNA或mRNA的豐度(Localization of DNA orAbundance of mRNA by Fluorescence In Situ Hybridization(RISH))”，基因生物技術(shù)方法，CRC Press公司，第279-289頁，1997)。
其它的多種診斷方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的(見例如Mathew(編)，人類分子遺傳學(xué)實(shí)驗(yàn)操作(Protocols in Human MolecularGenetics)，Humana Press公司，1991；Coleman和Tsongalis，分子診斷學(xué)(Molecular Diagnostics)，Humana Press公司，1996；和Elles，遺傳性疾病的分子診斷(Molecular Diagnosis of Genetic Diseases)，Humana Press公司，1996)。
此外，這些多核苷酸探針還可以用于與各條染色體上的對應(yīng)序列雜交。BR43×2基因的染色體鑒定和/或作圖可以提供關(guān)于基因功能與疾病的關(guān)系的有用信息。許多作圖技術(shù)是本領(lǐng)域技術(shù)人員可以利用的，例如體細(xì)胞雜種和熒光原位雜交(FISH)作圖。一種優(yōu)選的方法是輻射雜種作圖(radiation hybrid mapping)。輻射雜種作圖是一種開發(fā)用于構(gòu)建哺乳動物染色體的高分辨連續(xù)圖譜的體細(xì)胞遺傳學(xué)技術(shù)(Cox等，科學(xué)250245-50，1990)。部分或全部的基因序列信息使得可以設(shè)計(jì)適合與染色體輻射雜種作圖系列(panels)一起使用的PCR引物?？梢缘玫綇纳虡I(yè)途徑可獲得的覆蓋整個人類基因組的輻射雜種作圖系列，例如Stanford G3 RH系列和GeneBridge 4 RH系列(Research Genetics公司，Huntsville，AL)。這些系列使得能夠?qū)δ康膮^(qū)域中的基因、序列標(biāo)志位點(diǎn)(STSs)和其它非多態(tài)性和多態(tài)性標(biāo)記進(jìn)行基于PCR的快速染色體定位和排序。這包括在新發(fā)現(xiàn)的目的基因和以前已作圖的標(biāo)記之間建立直接成比例的物理距離。基因位置的精確信息能夠應(yīng)用于多個方面，包括1)確定序列是否是已存在的重疊群的部分，并獲得以各種形式例如YAC-、BAC-或cDNA克隆存在的其它周圍遺傳序列，2)為表現(xiàn)出與相同染色體區(qū)域連鎖的可遺傳疾病，提供可能的候選基因，和3)用于交叉參照模式生物例如小鼠，這可能有利于幫助確定特定基因所可能具有的功能。
染色體定位還可以采用STSs來實(shí)現(xiàn)。STS是人類基因組中獨(dú)一無二的一種DNA序列，可以用作特定染色體或染色體區(qū)域的參考點(diǎn)。STS可以通過能夠用于聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)中以在所有其它基因組序列存在的情況下特異檢測該位點(diǎn)的寡核苷酸引物對來確定。由于STS僅以DNA序列為基礎(chǔ)，所以在數(shù)據(jù)庫中，例如序列標(biāo)志位點(diǎn)數(shù)據(jù)庫(dbSTS)，GenBank(National Center for Biological Information，National Institutesof Health，Bethesda，MD，http//www.nebi.nlm.nih.gov)中，能夠?qū)λ鼈冞M(jìn)行完全地描述，并且可以用目的基因序列對它們進(jìn)行檢索以獲得包含在這些短基因組標(biāo)志STS序列中的作圖數(shù)據(jù)。
本發(fā)明還提供用于其它診斷應(yīng)用的試劑。例如，BR43×2基因、含有BR43×2 DNA或RNA的探針、或它們的子序列可以用于確定該BR43×2基因是否存在于特定染色體上，或是否發(fā)生了突變。在BR43×2基因座位處的可檢測到的染色體畸變包括但不限于非整倍性、基因拷貝數(shù)的改變、插入、缺失、限制性位點(diǎn)的改變和重排。這些畸變可以發(fā)生在編碼序列內(nèi)、內(nèi)含子內(nèi)、或包括上游啟動子和調(diào)節(jié)區(qū)域的側(cè)翼序列內(nèi)，而且可以表現(xiàn)為編碼序列內(nèi)的物理改變或基因表達(dá)水平的改變。
一般地，這些診斷方法包括步驟(a)從患者獲得遺傳樣品；(b)將該遺傳樣品與上面所公開的多核苷酸探針或引物，在該多核苷酸將與互補(bǔ)多核苷酸序列雜交的條件下一起孵育，以產(chǎn)生第一反應(yīng)產(chǎn)物；和(iii)將此第一反應(yīng)產(chǎn)物和對照反應(yīng)產(chǎn)物進(jìn)行比較。該第一反應(yīng)產(chǎn)物和該對照反應(yīng)產(chǎn)物之間的差異指示患者的遺傳異常。本發(fā)明所用遺傳樣品包括基因組DNA、cDNA和RNA。該多核苷酸探針或引物可以是RNA或DNA，并且將含有SEQ ID NO3的一部分、SEQ ID NO1的互補(bǔ)序列、或它們的RNA等同物。在這點(diǎn)上適合的分析方法包括本領(lǐng)域人員已知的分子遺傳技術(shù)，例如限制性片段長度多態(tài)性(RFLP)分析、應(yīng)用PCR技術(shù)或連接鏈?zhǔn)椒磻?yīng)的短串聯(lián)重復(fù)(STR)分析(Barany，PCR方法和應(yīng)用(PCR Methods andApplications)15-16，1991)、核糖核酸酶保護(hù)實(shí)驗(yàn)、和本領(lǐng)域已知的其它遺傳連鎖分析技術(shù)(Sambrook等，同上；Ausubel等，同上；Marian，Chest 108255-65，1995)。核糖核酸酶保護(hù)實(shí)驗(yàn)(見例如Ausubel等，同上，第4章)包括用RNA探針與患者的RNA樣品雜交，之后將反應(yīng)產(chǎn)物(RNA-RNA雜交分子)暴露于RNase。RNA的雜交區(qū)域受到保護(hù)而不被消化。在PCR分析試驗(yàn)中，將患者的遺傳樣品與多核苷酸引物對一起孵育，然后擴(kuò)增和回收兩個引物之間的區(qū)域。回收產(chǎn)物大小和數(shù)量的改變指示了患者中存在突變。另一種可以采用的基于PCR的技術(shù)是單鏈構(gòu)象多態(tài)性(SSCP)分析(Hayashi，PCR方法和應(yīng)用，134-8，1991)。
可以采用反義方法學(xué)以抑制BR43×2、TACI或BCMA的基因轉(zhuǎn)錄，以便抑制B細(xì)胞的發(fā)育和與其它細(xì)胞的相互作用。設(shè)計(jì)與BR43×2、TACI或BCMA編碼多核苷酸(例如SEQ ID NO3中所示的多核苷酸)的片段互補(bǔ)的多核苷酸，以便和編碼BR43×2、TACI或BCMA的mRNA結(jié)合并抑制該mRNA的翻譯?？梢圆捎眠@些反義多核苷酸抑制細(xì)胞培養(yǎng)物中或受試對象中的BR43×2、TACI或BCMA編碼基因的表達(dá)。
還可以制備經(jīng)改造表達(dá)BR43×2、TACI或BCMA的的小鼠，稱作“轉(zhuǎn)基因小鼠”，和制備表現(xiàn)出BR43×2、TACI或BCMA功能完全缺失的小鼠，稱作“敲除小鼠”(Snouwaert等，科學(xué)2571083，1992；Lowell等，自然366740-42，1993；Capecchi，科學(xué)2441288-92，1989；Palmiter等，Annu Rev Genet.20465-99，1986)。例如，廣泛地或僅在組織特異性或組織限定性啟動子下超量表達(dá)BR43×2、TACI或BCMA的轉(zhuǎn)基因小鼠可以用于確定超量表達(dá)是否會產(chǎn)生表型。例如，野生型BR43×2、TACI或BCMA多肽、多肽片段或它們的突變體的超量表達(dá)可能改變正常的細(xì)胞過程，導(dǎo)致如下表型，該表型可鑒定與BR43×2、TACI或BCMA的表達(dá)功能性相關(guān)的組織，并且可以指示BR43×2、TACI或BCMA或它們的激動劑或拮抗劑的治療靶標(biāo)。例如，一種改造的優(yōu)選轉(zhuǎn)基因小鼠是超量表達(dá)可溶性BR43×2、TACI或BCMA的轉(zhuǎn)基因小鼠。而且，該超量表達(dá)可以導(dǎo)致顯示與人類疾病相似的表型。相似地，敲除BR43×2、TACI或BCMA的小鼠可以用于確定在體內(nèi)絕對需要BR43×2的部位。敲除小鼠的表型預(yù)示了BR43×2、TACI或BCMA拮抗劑(例如本文所描述的)在體內(nèi)所可能具有的作用?？梢圆捎萌祟怋R43×2、TACI或BCMA的cDNA來分離小鼠BR43×2、TACI或BCMA的mRNA、cDNA和基因組DNA，隨后將它們用于制備敲除小鼠。這些小鼠可以用于研究體內(nèi)系統(tǒng)中BR43×2、TACI或BCMA基因和它們編碼的蛋白質(zhì)，并可以用作相應(yīng)人類疾病的體內(nèi)模型。而且，類似地可以將指向本文所述BR43×2、TACI或BCMA的BR43×2、TACI或BCMA反義多核苷酸或核酶的轉(zhuǎn)基因表達(dá)用于上述的轉(zhuǎn)基因小鼠。
根據(jù)常規(guī)方法，藥用有效量的本發(fā)明BR43×2、TACI或BCMA多肽可以和可藥用載體一起制成用于經(jīng)腸胃外、口、鼻、直腸、局部或經(jīng)皮膚等途徑施用的制劑。制劑還可以包括一或多種稀釋劑、填料、乳化劑、防腐劑、緩沖液、賦形劑等等，并且可以以例如液體、粉末、乳劑、栓劑、脂質(zhì)體、經(jīng)皮貼劑(transdermal patch)和片劑等形式提供。也可以將緩慢或延長釋放系統(tǒng)，包括任何各種生物聚合物(基于生物學(xué)的系統(tǒng))、應(yīng)用脂質(zhì)體的系統(tǒng)、和聚合物遞送系統(tǒng)，和本文所述的組合物一起使用，以提供連續(xù)或長期的BR43×2多肽或拮抗劑源。這些緩釋系統(tǒng)可以應(yīng)用于例如口服、局部和腸胃外用制劑中。術(shù)語“可藥用載體”是指不干擾活性成分生物學(xué)活性的有效性并且對于宿主或患者無毒的載體介質(zhì)。本領(lǐng)域的實(shí)據(jù)人員可以以適當(dāng)方法，并依據(jù)例如公開于Remington藥物科學(xué)和實(shí)踐(RemingtonThe Science and Pratice of Parmacy)(Gennaro編，Mack Publishing公司，Easton PA，第19版，1995年)中的公認(rèn)經(jīng)驗(yàn)，配制本發(fā)明的化合物。
本文所用BR43×2、TACI或BCMA多肽、激動劑或拮抗劑的“藥用有效量”是足以誘導(dǎo)期望生物學(xué)結(jié)果的量。該結(jié)果可以是疾病的病征、癥狀、或病因的減輕，或任何其它期望的生物學(xué)系統(tǒng)改變。例如，BR43×2、TACI或BCMA多肽的有效量將提供癥狀的主觀減輕或臨床醫(yī)師或其它有資格的觀察者指出的客觀可鑒定的改善。例如，BR43×2、TACI或BCMA多肽或可溶性融合物的該有效量將提供免疫應(yīng)答期間B細(xì)胞應(yīng)答的降低、自體抗體產(chǎn)生的抑制或降低、與SLE、MG或RA相關(guān)的癥狀的抑制或減輕。BR43×2、TACI或BCMA的有效量將降低外周血中B細(xì)胞的百分?jǐn)?shù)。該BR43×2、TACI或BCMA多肽的有效量能夠隨著待治療的疾病或癥狀的不同而有很大的變化。待施用的多肽的量和在制劑中的濃度取決于所選擇的載體、施用的途徑、具體多肽的效能、患者的臨床狀況、制劑中該化合物的副作用和穩(wěn)定性。因此，臨床醫(yī)師將依據(jù)對于該治療患者或相似患者的臨床經(jīng)驗(yàn)，采用在制劑中含有適當(dāng)濃度的適當(dāng)配方以及施用的制劑量。這些量將部分取決于待治療的具體疾病、患者的年齡、體重和一般健康情況，以及本領(lǐng)域技術(shù)人員明了的其它因素。典型地一個劑量將在0.1-100mg/kg對象的范圍內(nèi)。對于具體化合物的劑量可以從體外或離體研究以及實(shí)驗(yàn)動物研究來確定。在體外或離體情況下發(fā)現(xiàn)有效的化合物濃度為動物研究提供了指導(dǎo)，其中對劑量進(jìn)行計(jì)算以便在作用位置提供相似濃度。
本發(fā)明進(jìn)一步通過以下非限制性實(shí)施例進(jìn)行說明。
實(shí)施例實(shí)施例1BR43×2的鑒定采用分泌誘捕方法從RPMI陣列文庫(array library)中克隆TACI的工。采用20個96孔板將RPMI 1788(激活的B細(xì)胞系)文庫排成陣列。每個孔中含有大約100個大腸桿菌菌落，每個菌落含有一種cDNA克隆。采用TomTech Quadra 9600在96孔板中小量制備DNA。然后將該分離的DNA集合成120個庫(pool)，每個代表1600個克隆。用這些庫轉(zhuǎn)染Cos-7細(xì)胞，并接種在12孔板中。在92μl無血清DMEM培養(yǎng)基(500ml DMEM中有55mg丙酮酸鈉、146mg L-谷氨酰胺、5mg轉(zhuǎn)鐵蛋白、2.5mg胰島素、1μg硒和5mg胎球蛋白)中將3μl庫DNA和5μl LipofectAMINE混合，室溫孵育30分鐘，之后加入400μl無血清DMEM培養(yǎng)基。將該DNA-LipofectAMINE混合物加在接種于12孔組織培養(yǎng)板中的220,000個Cos-7細(xì)胞/孔上，并在37℃孵育5個小時。孵育后，向每孔加入500μl 20％FBS DMEM培養(yǎng)基(500ml DMEM中有100ml FBS、55mg丙酮酸鈉、146mgL-谷氨酰胺)，并孵育細(xì)胞過夜。
采用生物素化的FLAG標(biāo)記ztnf4進(jìn)行該分泌誘捕篩選。用PBS沖洗所述細(xì)胞并用PBS中的1.8％甲醛固定15分鐘。然后用TNT(H2O中0.1MTris-HCl、0.15M NaCl、和0.05％Tween-20)洗滌細(xì)胞。用PBS中的0.1％Triton-X滲透細(xì)胞15分鐘，之后在TNT中洗滌一次。用TNB(0.1MTris-HCl、0.15M NaCl、和0.5％的封閉試劑)和NEN RenaissanceTSA-Direct試劑盒(NEN，Boston，MA)，根據(jù)廠家說明書封閉細(xì)胞1個小時。用TNT洗滌細(xì)胞，并用抗生物素蛋白封閉15分鐘，然后用生物素(Vector Labs產(chǎn)品號#SP-2001)封閉，之間用TNT進(jìn)行洗滌。細(xì)胞在TNB中和1μg/ml ztnf4/Flag/生物素一起孵育1小時，之后用TNT洗滌一次。然后在TNB中用1∶300鏈霉親和素-HRP(NEN)稀釋物孵育細(xì)胞1個小時，并用TNT洗滌。用在稀釋緩沖液(NEN)中1∶50稀釋的熒光素酪胺試劑檢測雜交，并孵育4.4分鐘，之后用TNT洗滌。用TNT中1∶5稀釋的Veetashield Mounting Media(Vector Labs，Burlingame，CA)保存細(xì)胞。
采用FITC濾光器通過熒光顯微鏡觀察這些細(xì)胞。有12個庫是ztnf4結(jié)合陽性。將D8庫(代表1600個克隆)分解，并分離了單一的ztnf4結(jié)合陽性克隆(D8-1)。測序分析揭示，D8-1克隆含有一個編碼TACI同種型的多肽序列，該序列中TACI的第一個半胱氨酸豐富的假重復(fù)Phe21-Arg67被替換成僅一個氨基酸殘基色氨酸。該同種型被命名為BR43×2，其多核苷酸序列顯示于SEQ ID NO1中。
實(shí)施例2淋巴細(xì)胞和單核細(xì)胞中BR43×1的探測采用逆轉(zhuǎn)錄酶PCR在T和B細(xì)胞及單核細(xì)胞中探測BR43×1的表達(dá)。采用寡核苷酸引物ZC19980(SEQ ID NO15)和ZC19981(SEQ ID NO16)篩選CD19+、CD3+和單核細(xì)胞的cDNA以鑒定BR43。該逆轉(zhuǎn)錄酶反應(yīng)的實(shí)施條件是94℃ 3分鐘；之后30個循環(huán)，每個循環(huán)為94℃ 30秒、68℃ 2分鐘和72℃ 1分鐘；之后72℃延伸7分鐘。僅在B細(xì)胞中檢測到具有預(yù)期大小720bp的條帶，而在激活的T細(xì)胞中沒有檢測到，這與利用抗體對TACI進(jìn)行的分析的報道一致(yon Bulow和Bram，同上)。
實(shí)施例3采用BR43配體ztnf4進(jìn)行的B細(xì)胞增殖分析將含有1×108個采集的冷凍外周血單核細(xì)胞(PBMCs)的小管迅速在37℃水浴中融化，并于50ml管中重懸在25ml B細(xì)胞培養(yǎng)基(Iscove氏修改的Dulbecco培養(yǎng)基、10％熱失活胎牛血清、5％L-谷氨酰胺、5％Pen/Strep)中。采用臺盼藍(lán)(GIBCO BRL，Gaithersburg，MD)測試細(xì)胞的生活力。將10μl Ficoll/Hypaque Plu鋪在細(xì)胞懸浮液下(PharmaciaLKB Biotechnology公司，Piscataway，NJ)，1800rpm離心30分鐘，并在關(guān)閉制動的情況下停止。然后取出界面層，并轉(zhuǎn)移至一個新的50ml管中，用PBS補(bǔ)充至終體積40ml，并在打開制動的情況下1200rpm離心10分鐘。采用臺盼藍(lán)測試分離的B細(xì)胞的生活力。將該B細(xì)胞重懸在B細(xì)胞培養(yǎng)基中，終濃度為1×106個細(xì)胞/ml，并以180μl/孔接種在96孔U型底培養(yǎng)板(Falcon，VWR，Seattle，WA)中。
向這些細(xì)胞加入下列刺激物之一以使終體積達(dá)到200ml/孔單獨(dú)的10倍稀釋形式1mg-1ng/ml的可溶性FLAG標(biāo)記ztnf4-4sCF或ztnf4-4sNF，或者加上稀釋在NaH2CO3(pH9.5)中的10μg/ml抗IgM(羊抗人IgM)(Southern Biotechnology Associates公司，Birmingham，AL)；或者加上10μg/ml抗IgM和10ng/ml重組人類IL4(稀釋在PBS和0.1％BSA中)。此外，還測試了其它細(xì)胞因子例如IL-3和IL-6以及可溶性CD40(sCD40)抗體(Pharmingen，San Diego，CA)。作為對照，細(xì)胞與0.1％牛血清白蛋白(BSA)和PBS、10μg/ml抗IgM或10μg/ml抗IgM和10ng/ml IL4(或其它細(xì)胞因子)一起孵育。然后在保持濕度的孵育器中37℃孵育這些細(xì)胞72個細(xì)胞。收獲前16小時，向所有的孔中加入1μCi3H胸苷。將這些細(xì)胞收集在一個96孔過濾板中(UniFilter GF/C，Packard，Meriden，CT)，在此板上采用細(xì)胞收獲器(Packard)收獲細(xì)胞，并根據(jù)廠家說明書收集。將這些板在55℃干燥20-30分鐘，并用一種不透明的板密封物將孔底封上。向每一個孔中加入0.25ml閃爍液(Microscint-O，Packard)，并采用高計(jì)數(shù)微板閃爍計(jì)數(shù)器(TopCount MicroplateScintillation Counter)(Packard)對該板讀數(shù)。
為了測量在對純化B細(xì)胞進(jìn)行刺激之后響應(yīng)各種B細(xì)胞有絲分裂原IgG產(chǎn)生的誘導(dǎo)，按所描述的方法制備細(xì)胞并孵育9天。收集細(xì)胞上清液以測定IgG的產(chǎn)生。
為了測量在對純化B細(xì)胞進(jìn)行刺激之后響應(yīng)各種B細(xì)胞有絲分裂原細(xì)胞表面標(biāo)記的激活，按上述方法制備細(xì)胞并僅孵育48個小時。通過FACS分析測量細(xì)胞表面標(biāo)記。
表5總結(jié)了用各種B細(xì)胞有絲分裂原刺激的人類純化B細(xì)胞的增殖表5刺激物 增殖系數(shù)ztnf4 1.5ztnf4+IL4 9.9ztnf4+抗IgM+IL415.8觀察到ztnf4與IL4、IL3(10μg/ml)和IL6(10μg/ml)對B細(xì)胞增殖的協(xié)同影響。當(dāng)采用sCD40時觀察到B細(xì)胞信號傳導(dǎo)增加了兩倍。
表6總結(jié)了在對純化B細(xì)胞進(jìn)行刺激之后響應(yīng)各種B細(xì)胞有絲分裂原IgG產(chǎn)生的誘導(dǎo)(ng/ml)。
表6刺激物 對照 ztnf4抗IgM3 7.5抗IgM+IL-4 1332抗IgM+IL-4+IL-5 1045在僅用ztnf4、或與抗IgM或抗IgM+IL-4一起刺激純化的B細(xì)胞之后，觀察到細(xì)胞表面激活標(biāo)記的增加。在存在最佳或次最佳T細(xì)胞有絲分裂原時，對PBMNC的增殖沒有影響。而且，在純化的單核細(xì)胞中響應(yīng)LPS的刺激也沒有觀察到對TNFα產(chǎn)生的影響。
圖3顯示了可溶性ztnf4對人類B淋巴細(xì)胞的共刺激，以使其增殖并分泌免疫球蛋白。圖3A顯示了在單獨(dú)存在IL-4、和存在IL-4及抗IgM、抗CD40或抗CD19時，響應(yīng)可溶性ztnf4(25ng/ml)的刺激，在培養(yǎng)5天后純化的人類外周血B細(xì)胞的增殖。圖3B顯示在培養(yǎng)9天后，從在有IL-4或IL-4+IL-5時可溶性ztnf4刺激的人類B細(xì)胞獲得的上清液中測量到的IgM和IgG水平。
這些結(jié)果提示，可溶性ztnf4是一種B細(xì)胞激活分子，其與其它B細(xì)胞刺激物協(xié)同作用，而單獨(dú)的作用弱?？扇苄詚tnf4促進(jìn)B細(xì)胞的增殖和Ig的產(chǎn)生。粘附分子、共刺激分子和激活受體的上調(diào)提示起到促進(jìn)B細(xì)胞的APC功能的作用。
圖4顯示了在存在10ng/ml IL-4時可溶性ztnf4(25ng/ml)或?qū)φ盏鞍?泛素)在體外5天內(nèi)對人類外周血B細(xì)胞的刺激。測試了純化的TACI-Ig、BCMA-Ig或?qū)φ誇c對可溶性ztnf4特異性增殖的抑制。
實(shí)施例4采用ztnf4結(jié)合選擇TACI和BCMA轉(zhuǎn)化的BHK細(xì)胞通過轉(zhuǎn)染子庫的稀釋克隆選擇表達(dá)高水平TACI蛋白質(zhì)的BHK細(xì)胞。在結(jié)合緩沖液(PBS，2％BSA，0.02％NaN3)中將1μg/ml生物素化ztnf4和轉(zhuǎn)染子細(xì)胞(2×105)一起冰上孵育30分鐘。用結(jié)合緩沖液洗滌細(xì)胞2次，然后與SA-PE(Caltag)(結(jié)合緩沖液中的1∶1000稀釋物)一起在冰上孵育30分鐘。然后在結(jié)合緩沖液中洗滌細(xì)胞2次，并重懸在結(jié)合緩沖液中，然后通過FACS(FACS Vantage，Becton Dickinson)進(jìn)行讀數(shù)。選擇與TNF4具有最高結(jié)合的克隆。
通過用生物素化的ztnf4對表達(dá)BCMA的轉(zhuǎn)染子庫進(jìn)行表面標(biāo)記，選擇表達(dá)高水平BCMA蛋白質(zhì)的BHK細(xì)胞。接著在FACS Vantage(BectonDickinson)上通過鏈霉親和素-藻紅蛋白(SA-PE Caltag Burlingame，CA)無菌分揀FL2中的明亮細(xì)胞。然后篩選ztnf4結(jié)合的這些單集落。
實(shí)施例5組織分布探測人類多組織Northern印跡(MTN I，MTN II和MTN III；Clontech)，以確定人類BR43×2和TACI表達(dá)的組織分布。大約500bp的PCR來源探針(SEQ ID NO21)是采用BR43×2(SEQ ID NO1)作為模板，寡核苷酸ZC20061(SEQ ID NO22)和ZC20062(SEQ ID NO23)作為引物擴(kuò)增的。該序列與TACI的同源區(qū)域一致。該擴(kuò)增按如下進(jìn)行94℃1.0分鐘，1個循環(huán)；94℃30秒、60℃30秒和72℃30秒，30個循環(huán)；之后72℃10分鐘，1個循環(huán)。通過瓊脂糖凝膠電泳觀察該P(yáng)CR產(chǎn)物，并采用凝膠提取試劑盒(Qiagen，Chatsworth，CA)根據(jù)廠家說明書純化該500bp PCR產(chǎn)物。采用MULTIPRIME DNA標(biāo)記試劑盒(Amersham，Arlington Heights，IL)根據(jù)廠家說明書放射性標(biāo)記該探針。采用NUCTRAP推進(jìn)柱(push column)(Stratagene)純化探針。采用EXPRESSHYB(Clontech)溶液預(yù)雜交，并作為Northern印跡的雜交溶液。雜交采用106cpm/ml的標(biāo)記探針65℃過夜進(jìn)行。然后在2×SSC和0.1％SDS中室溫洗滌這些印跡，之后在0.1×SSC和0.1％SDS中50℃洗滌兩次。在脾、淋巴結(jié)和小腸中檢測到大約1.5kb的轉(zhuǎn)錄本。
對人類多組織Northern印跡(MTN I、MTN II和MTN III；Clontech)進(jìn)行探測，以確定人類BCMA表達(dá)的組織分布。大約257bp的PCR來源探針(SEQ ID NO24)是采用Daudi細(xì)胞的cDNA作為模板，寡核苷酸ZC21065(SEQ ID NO25)和ZC21067(SEQ ID NO26)作為引物擴(kuò)增的。該擴(kuò)增按如下進(jìn)行94℃ 1.0分鐘，1個循環(huán)；94℃ 30秒、60℃ 30秒和72℃ 30秒，35個循環(huán)；之后72℃ 10分鐘，1個循環(huán)。通過瓊脂糖凝膠電泳觀察該P(yáng)CR產(chǎn)物，并采用凝膠提取試劑盒(Qiagen，Chatsworth，CA)根據(jù)廠家說明書純化該257bp PCR產(chǎn)物。采用MULTIPRIME DNA標(biāo)記試劑盒(Amersham，Arlington Heights，IL)根據(jù)廠家說明書放射性標(biāo)記該探針。采用NUCTRAP推進(jìn)柱(Stratagene)純化探針。采用EXPRESSHYB(Clontech)溶液預(yù)雜交，并作為Northern印跡的雜交溶液。雜交采用106cpm/ml的標(biāo)記探針65℃過夜進(jìn)行。然后在2×SSC和0.1％SDS中室溫洗滌這些印跡，之后在0.1×SSC和0.1％SDS中50℃洗滌兩次。在胃、小腸、淋巴結(jié)、氣管、脾和睪丸中檢測到大約1.2kb的轉(zhuǎn)錄本。
含有經(jīng)8種管家基因標(biāo)化的來自各種組織的RNA的RNA Master DotBlots(Clontech)也用TACI探針(SEQ ID NO21)或BCMA探針(SEQ IDNO24)按上述進(jìn)行了雜交探測。在脾、淋巴結(jié)、小腸、胃、唾液腺、闌尾、肺、骨髓和胎兒脾中觀察到BR43×2/TACI的表達(dá)。在小腸、脾、胃、結(jié)腸、淋巴結(jié)和闌尾中檢測到BCMA的表達(dá)。
按上述方法用Br43×2/TACI探針(SEQ ID NO21)或BCMA探針(SEQID NO24)探測了人類腫瘤系列印跡V(Invitrogen公司，San Diego，CA)和人類淋巴瘤印跡(Invitrogen)。在非Hodgkin氏淋巴瘤和腮腺腫瘤中發(fā)現(xiàn)相應(yīng)于TACI的一個1.5kb轉(zhuǎn)錄本。在腺淋巴瘤、非Hodgkin氏淋巴瘤和腮腺腫瘤中發(fā)現(xiàn)與BCMA相應(yīng)的一個1.2kb轉(zhuǎn)錄本。
采用異硫氰酸胍(Chirgwin等，生物化學(xué)(Biochemistry)1852-94，1979)及之后的CsCl離心步驟從CD4+、CD8+、CD19+和混合的淋巴細(xì)胞反應(yīng)細(xì)胞(CellPro，Bothell，WA)制備總RNA。采用寡聚d(T)纖維素層析分離Poly(A)+RNA(Aviv和Leder，美國國家科學(xué)院院刊691408-12，1972)。然后按以下進(jìn)行Northern印跡分析。
每種poly A+RNA大約2mg在2.2M甲醛/磷酸鹽緩沖液(50mM Na2HPO4，50mM NaH2PO4，50mm NaOAc，1mM EDTA和2.2M甲醛)中變性，并在甲醛/磷酸鹽緩沖液中通過1.5％瓊脂糖微型凝膠(Stratagene Cloning Systems，La Jolla，CA)電泳分離。將該RNA過夜吸印在nytran濾膜(Schleicher&Schuell，Keene，NH)上，并在STRATALINKERUV交聯(lián)儀(StratageneCloning Systems)中對該濾膜進(jìn)行UV交聯(lián)(1,200 mJoules)，然后在80℃干烤一個小時。
用TACI探針(SEQ ID NO21)或BCMA探針(SEQ ID NO24)探測這些印跡。僅在CD19+細(xì)胞中檢測到代表TACI的1.5kb條帶。在CD8+、CD19+和MLR細(xì)胞中微弱檢測到代表BCMA的1.2kb轉(zhuǎn)錄本。
用來自K-562細(xì)胞(類紅細(xì)胞，ATCC CCL243)、HUT78細(xì)胞(T細(xì)胞，ATCC TIB-161)、Jurkat細(xì)胞(T細(xì)胞)、DAUDI(伯基特氏人類淋巴瘤，Clontech，Palo Alto，CA)、RAJI(伯基特氏人類淋巴瘤，Clontech)和HL60(單核細(xì)胞)的poly(A)RNA制備印跡，在這些印跡上按上述方法進(jìn)行了Northern印跡分析。用TACI探針(SEQ ID NO21)或BCMA探針(SEQ ID NO24)探測這些印跡。在Raji細(xì)胞中檢測到相應(yīng)于TACI的一個1.5kb轉(zhuǎn)錄本。在Daudi、Raji和Hut 78細(xì)胞中檢測到相應(yīng)于BCMA的一個1.2kb轉(zhuǎn)錄本。
采用基于PCR的篩選，鑒定表達(dá)人或鼠TACI和人BCMA的組織。根據(jù)廠家說明書篩選人和鼠Rapid-ScanTM基因表達(dá)系列(OriGeneTechnologies公司，Rockville，MD)。設(shè)計(jì)寡核苷酸引物ZC24200(SEQ IDNO27)和ZC24201(SEQ ID NO28)，以橫跨一個外顯子接合處并產(chǎn)生相應(yīng)于鼠TACI的一個272bp片段。在脾、胸腺、肺、乳房、心臟、肌肉、皮膚、腎上腺、胃、小腸、腦、卵巢、前列腺和胚胎中檢測到表達(dá)。在許多組織中檢測到～500和800bp的其它條帶。
設(shè)計(jì)寡核苷酸引物ZC24198(SEQ ID NO29)和ZC24199(SEQ IDNO30)，以橫跨一個外顯子接合處并產(chǎn)生相應(yīng)于人類TACI的一個204bp片段。在脾、腦、心臟、肝、結(jié)腸、肺、小腸、肌肉、胃、睪丸、胎盤、唾液腺、腎上腺、胰腺、前列腺、外周血淋巴細(xì)胞和骨髓中檢測到表達(dá)。
設(shè)計(jì)寡核苷酸引物ZC24271(SEQ ID NO31)和ZC24272(SEQ IDNO32)，以橫跨一個外顯子接合處并產(chǎn)生相應(yīng)于人類BCMA的一個329bp片段。在腦、脾、結(jié)腸、肺、小腸、胃、卵巢、睪丸、唾液腺、腎上腺、胰腺、前列腺、外周血淋巴細(xì)胞、骨髓和胎兒肝中檢測到表達(dá)。
設(shè)計(jì)寡核苷酸引物ZC24495(SEQ ID NO33)和ZC24496(SEQ IDNO34)以橫跨一個外顯子接合處，產(chǎn)生相應(yīng)于鼠BCMA的一個436bp片段。在肝中檢測到表達(dá)。
實(shí)施例6TACI-Ig和BCKA-Ig融合載體的制備Igγ1 Fc4片段的構(gòu)建為了制備TACI-Ig融合蛋白，修改人類IgG1的Fc區(qū)(鉸鏈區(qū)及CH2和CH3區(qū))，以便除去Fc的受體(FcgRI)和補(bǔ)體(Clq)結(jié)合功能。人類IgG1Fc的該修飾版本稱作Fc4。
通過PCR采用寡聚體引物ZC10，134(SEQ ID NO43)和ZC10，135(SEQID NO44)，從人類胎兒肝文庫(Clontech)分離該Fc區(qū)。采用PCR在該Fc區(qū)中引入突變以降低FcgRI的結(jié)合。根據(jù)Baum等(EMBO J.133992-4001，1994)，將該FcgRI結(jié)合位點(diǎn)(Leu-Leu-Gly-Gly)突變?yōu)锳la-Glu-Gly-Ala(SEQ ID NO45的第38-41位氨基酸殘基)，以降低FcR1的結(jié)合(Duncan等，自然332563-4，1988)。采用寡核苷酸引物ZC15，345(SEQ ID NO46)和ZC15，347(SEQ ID NO47)引入該突變。在50μl終體積中，加有570ng IgFc模板、5μl 10×Pfu反應(yīng)緩沖液(Stratagene)、8μl 1.25mM dNTPs、31μl dH2O、2μl 20mM ZC15，345(SEQID NO46)和ZC15，347(SEQ ID NO47)。加入等體積的礦物油，并將該反應(yīng)物加熱至94℃1分鐘。加入Pfu聚合酶(2.5個單位，Stratagene)，之后進(jìn)行25個循環(huán)，每個循環(huán)為94℃ 30秒、55℃ 30秒、72℃ 1分鐘，之后72℃延伸7分鐘。電泳該反應(yīng)產(chǎn)物，并檢測相應(yīng)于約676bp預(yù)期大小的條帶。從凝膠上切下該條帶，用QIAGEN QIAquickTM凝膠提取試劑盒(Qiagen)根據(jù)廠家說明書進(jìn)行回收。
還用PCR引入Ala至Ser(SEQ ID NO45的第134位氨基酸殘基)和Pro至Ser(SEQ ID NO45的第135位氨基酸殘基)的突變，以降低補(bǔ)體Clq的結(jié)合和/或補(bǔ)體的固定(Duncan和Winter，自然332788，1988)，以及引入終止密碼子TAA。采用FcγRI結(jié)合位點(diǎn)突變的IgFc序列作為模板進(jìn)行兩個第一輪反應(yīng)。50μl終體積加有1μl FcγRI結(jié)合位點(diǎn)突變的IgFc模板、5μl 10×Rfu反應(yīng)緩沖液(Stratagene)、8μl 1.25mMdNTPs、31μl dH2O、2μl 20mM ZC15，517(SEQ ID NO48)(一個起始于SEQID NO45第26位核苷酸的5’引物)和2μl 20mM ZC15，530(SEQ ID NO49)(一個起始于SEQ ID NO45第405位核苷酸互補(bǔ)鏈的3’引物)。第二個反應(yīng)含有20mM的寡核苷酸引物ZC15，518(SEQ ID NO50)(起始于SEQ IDNO45第388位核苷酸的5’引物)和ZC15，347(SEQ ID NO47)(3’引物)的原液各2μl，以引入Ala至Ser的突變、Xba I限制性位點(diǎn)和終止密碼子。加入等體積的礦物油，并將反應(yīng)物加熱至94℃ 1分鐘。加入Pfu聚合酶(2.5個單位，Stratagene)，之后進(jìn)行25個循環(huán)，每個循環(huán)為94℃ 30秒、55℃ 30秒、72℃2分鐘，之后72℃延伸7分鐘。電泳該反應(yīng)產(chǎn)物，并檢測分別相應(yīng)于~370bp和~395預(yù)期大小的條帶。從凝膠上切下這些條帶，用QIAGEN QIAquickTM凝膠提取試劑盒(Qiagen)根據(jù)廠家說明書進(jìn)行回收。進(jìn)行第二輪反應(yīng)以將上述片段連接起來，并加上5’BamHI限制性位點(diǎn)。50ul終體積中加有30μl dH2O、8μl 1.25mM dNTPs、5μl 10×Pfu聚合酶反應(yīng)緩沖液(Stratagene)和兩個第一次的兩個PCR產(chǎn)物各1μl。加入等體積的礦物油，并將反應(yīng)物加熱至94℃ 1分鐘。加入Pfu聚合酶(2.5個單位，Stratagene)，之后進(jìn)行5個循環(huán)，每個循環(huán)為94℃ 30秒、55℃ 30秒和72℃ 2分鐘。將溫度再次提升到94℃，加入20mM的ZC15，516(SEQ ID NO51)(起始于SEQ ID NO45第1位核苷酸的5’引物)和ZC15，347(SEQ ID NO47)原液各2μl，之后進(jìn)行25個循環(huán)，每個循環(huán)為94℃ 30秒、55℃ 30秒、72℃ 2分鐘，最終72℃延伸7分鐘。采用凝膠電泳觀察部分反應(yīng)產(chǎn)物。檢測到相應(yīng)于預(yù)期大小的一個789bp條帶。TACI-Fc4和BCMA-Fc4表達(dá)載體的構(gòu)建通過在酵母中同源重組構(gòu)建含有TACI-Fc4和BCMA-Fc4融合蛋白的表達(dá)質(zhì)粒。采用PCR分離包括SEQ ID NO5第15位核苷酸至第475位核苷酸的多核苷酸序列的TACI cDNA片段。用于產(chǎn)生該TACI片段的兩個引物是(1)含有40bp的5’載體側(cè)翼序列和相應(yīng)于該TACI片段氨基端的17bp的引物(SEQ ID NO52)；(2)相應(yīng)于側(cè)翼Fc4序列的40bp 3’末端和相應(yīng)于該TACI片段羧基端的17bp(SEQ ID NO53)。100μl終體積中加有10ngTACI模板、10μl 10×Taq聚合酶反應(yīng)緩沖液(Perkin Elmer)、8μl 2.5nMdNTPs、78μl dH2O、20mM寡核苷酸引物SEQ ID NO52和SEQ ID NO53貯液各2μl、和Taq聚合酶(2.5個單位，Life Technology)。加入等體積的礦物油，并將該反應(yīng)物加熱至94℃2分鐘，之后進(jìn)行25個循環(huán)，每個循環(huán)為94℃ 30秒、65℃ 30秒、65℃ 30秒、72℃ 1分鐘，之后72℃延伸5分鐘。
采用PCR分離包括SEQ ID NO7第219位核苷酸至第362位核苷酸的多核苷酸序列的BCMA cDNA片段。用于該BCMA片段制備的兩個引物是含有40bp的5’載體側(cè)翼序列和相應(yīng)于該BCMA片段氨基端的17bp的寡核苷酸引物(SEQ ID NO54)；以及含有相應(yīng)于側(cè)翼Fc4序列的40bp 3’末端和相應(yīng)于該BCMA片段羧基端的17bp的寡核苷酸引物(SEQ ID NO55)。100μl終體積中加有10ng BCMA模板、10μl 10×Taq聚合酶反應(yīng)緩沖液(Perkin Elmer)、8μl 2.5mM dNTPs、78μl dH2O、20mM寡核苷酸引物SEQID NO54和SEQ ID NO55貯液各2μl。加入等體積的礦物油，并將該反應(yīng)物加熱至94℃ 2分鐘，之后進(jìn)行25個循環(huán)，每個循環(huán)為94℃ 30秒、65℃ 30秒、72℃ 1分鐘，之后72℃延伸5分鐘。
以相似方式構(gòu)建各用于TACI和BCMA融合結(jié)構(gòu)的含有編碼Fc4片段的cDNA的片段。對于TACI，用于Fc4片段產(chǎn)生的兩個引物是(上游和下游)含有40bp 5’TACI側(cè)翼序列和相應(yīng)于該Fc4片段氨基端17bp的寡核苷酸引物(SEQ ID NO56)；以及含有相應(yīng)于側(cè)翼載體序列的40bp 3’末端和相應(yīng)于該Fc4片段羧基端17bp的寡核苷酸引物(SEQ ID NO57)。對于BCMA，用于Fc4片段產(chǎn)生的上游引物是含有40bp 5’BCMA側(cè)翼序列和相應(yīng)于該Fc4片段氨基端17bp的寡核苷酸引物(SEQ ID NO58)。用于BCMA結(jié)構(gòu)的Fc4的下游引物與所描述的用于TACI-Fc4的相同(SEQ IDNO57)。
100μl終體積中加有10ng上述Fc4模板、10μl 10×Taq聚合酶反應(yīng)緩沖液(Perkin Elmer)、8μl 2.5nM dNTPs、78μl dH2O、對于TACI 20mM寡核苷酸SEQ ID NO56和SEQ ID NO57貯液各2μl、而對于BCMA 20mM寡核苷酸SEQ ID NO58和SEQ ID NO57貯液各2μl、及Taq聚合酶(2.5個單位，Life Technology)。加入等體積的礦物油，并將該反應(yīng)物加熱至94℃ 2分鐘，之后進(jìn)行25個循環(huán)，每個循環(huán)為94℃ 30秒、65℃ 30秒、72℃ 1分鐘，之后72℃延伸5分鐘。
為了分析，上述每個100μl PCR反應(yīng)物各取10μl在0.8％LMP瓊脂糖凝膠(Seaplaque GTG)上1×TBE緩沖液中電泳。每個PCR反應(yīng)物剩余的90μl通過加入5μl 1M NaCl和250μl無水乙醇進(jìn)行沉淀。用SmaI切割質(zhì)粒pZMP6，以使其在多接頭處線性化。質(zhì)粒pZMP6來源于質(zhì)粒pCZR199(美國典型培養(yǎng)物保藏中心，Manassas，VA，ATCC#98668)，是含有如下表達(dá)盒的一種哺乳動物表達(dá)載體，該表達(dá)盒帶有CMV立即早期啟動子、一個來自小鼠免疫球蛋白重鏈座位可變區(qū)的共有序列內(nèi)含子、用于插入編碼序列的多個限制性位點(diǎn)、一個終止密碼子和一個人類生長激素終止子。該質(zhì)粒還具有一個大腸桿菌的復(fù)制原點(diǎn)、一個帶有SV40啟動子、增強(qiáng)子和復(fù)制原點(diǎn)、一個DHFR基因和SV40的終止子的哺乳動物選擇標(biāo)記表達(dá)單元。通過用CMV立即早期啟動子和該開放閱讀框5’末端的Kozac序列替換掉金屬硫蛋白啟動子，從pCZR199構(gòu)建載體pZMP6。
100μl感受態(tài)酵母細(xì)胞(釀酒酵母)與10μl含有TACI或BCMA胞外域和適用于和它們進(jìn)行重組的Fc4 PCR片段各大約1μg、以及100ng SmaI消化的pZMP6載體的溶液混合，然后轉(zhuǎn)移至0.2cm電穿孔杯中。以0.75kV(5kY/cm)、∞ohms、25μF，電脈沖該酵母/DNA混合物。向每個杯加入600μl1.2M山梨糖醇，并將兩個300μl等分試樣中的酵母鋪在URA-D平板上，30℃進(jìn)行孵育。
大約48小時后，將來自單個平板的Ura+酵母轉(zhuǎn)化體重懸在1ml H2O中，短暫離心以沉淀該酵母細(xì)胞。將該細(xì)胞沉淀重懸在1ml裂解緩沖液(2％Triton X-100、1％SDS、100mM NaCl、10mM Tris pH8.0、1mM EDTA)中。將500μl該裂解混合物加入含有300μl酸洗滌過的玻璃珠和200μl酚-氯仿的Eppendorf管中，渦旋1分鐘，中間間隔兩或三次，之后在Eppendorf離心機(jī)中以最大速度離心5分鐘。將300μl水相轉(zhuǎn)移到一個新管子中，用600μl乙醇(EtOH)沉淀DNA，之后4℃離心10分鐘。將該DNA沉淀重懸在100μl H2O中。
用0.5-2ml酵母DNA制備物和40μl DH10B細(xì)胞轉(zhuǎn)化電感受態(tài)大腸桿菌細(xì)胞(DH10B，GibcoBRL)。在2.0kV，25mF和400ohms下電脈沖這些細(xì)胞。電穿孔后，1ml SOC(2％細(xì)菌培養(yǎng)用蛋白胨(Difco，Detroit，MI)，0.5％酵母提取物(Difco)，10mM NaCl，2，5mM KCl，10mM MgCl2，10mM MgSO4，20mM葡萄糖)以250μl的等分試樣鋪在4個LB AMP平板上(LB培養(yǎng)基(Lennox)，1.8％細(xì)菌培養(yǎng)用瓊脂(Difco)，100mg/L氨芐青霉素)。
通過限制性消化驗(yàn)證插入片段的存在并證實(shí)各種DNA序列均彼此正確地連接在一起，以鑒定含有TACI-Fc4或BCMA-Fc4的正確表達(dá)結(jié)構(gòu)的單克隆。對陽性克隆的插入片段進(jìn)行序列分析。采用Qiagen Maxi試劑盒(Qiagen)根據(jù)廠家說明書較大規(guī)模地分離質(zhì)粒DNA。
實(shí)施例7TACI-Fc4和BCMA-Fc4的哺乳動物表達(dá)將BHK570細(xì)胞(ATCC CRL-10314)鋪在10cm的組織培養(yǎng)皿中，并使其在DMEM/FBS培養(yǎng)基(DMEM，Gibco/BRL高葡萄糖(Gibco BRL，Gaithersburg，MD)，5％胎牛血清(Hyclone，Logan，UT)，1mM L-谷氨酰胺(JRH Biosciences，Lenexa，KS)，1mM丙酮酸鈉(Gibco BRL))中，37℃、5％CO2下過夜生長至大約50-70％匯合。然后在無血清(SF)培養(yǎng)基制品(DMEM，10mg/ml轉(zhuǎn)鐵蛋白，5mg/ml胰島素，2mg/ml胎球蛋白，1％L-谷氨酰胺和1％丙酮酸鈉)中，用質(zhì)粒TACI-Fc4/pZMP6或BCMA-Fc4/pZMP6以及LipofectamineTM(Gibco BRL)轉(zhuǎn)染細(xì)胞。在15ml管中用SF培養(yǎng)基稀釋TACI-Fc4/pZMP6或BCMA-Fc4/pZMP6至640μl總終體積。取35μl LipofectamineTM(Gibco BRL)和605μl SF培養(yǎng)基混合。向所述DNA混合物中加入該LipofectamineTM混合物，并使其在室溫孵育大約30分鐘。向該DNALipofectamineTM混合物加入5ml SF培養(yǎng)基。用5ml SF培養(yǎng)基沖洗所述細(xì)胞一次，吸出，然后加入該DNALipofectamineTM混合物。37℃孵育細(xì)胞5個小時，然后向每個平板加入6.4ml的DMEM/10％FBS、1％PSN培養(yǎng)基。將這些平板37℃孵育過夜，然后次日用新鮮的5％FBS/EMEM培養(yǎng)基替換該DNALipofectamineTM混合物。在轉(zhuǎn)染后第5天，將細(xì)胞分開部分放入T-162搖瓶，于選擇培養(yǎng)基(DMEM/5％FBS，1％L-GLU，1％NaPyr)中培養(yǎng)。轉(zhuǎn)染后大約10天，用胰蛋白酶消化來自每個轉(zhuǎn)染的兩個150mm培養(yǎng)皿的氨甲蝶呤抗性集落，集合這些細(xì)胞并接種在一個T-162搖瓶中，然后轉(zhuǎn)移至大規(guī)模培養(yǎng)。
實(shí)施例9ztnf4的轉(zhuǎn)基因表達(dá)采用成年能生育雄性(B6C3f1)、青春期前的能育雌性(B6C3f1)、切除了輸精管的雄性(B6D2f1)和成年能育雌性(B6D2f1)(所有均來自Taconic Farms，Germantown，NY)，制備表達(dá)ztnf4基因的轉(zhuǎn)基因動物。采用妊馬血清促性腺激素(Sigma，St.Louis，MO)和人類的絨毛膜促性腺激素(hCG(Sigma))，使青春期前的能育雌性超數(shù)排卵。隨后用成年能育雄性與該超數(shù)排卵的雌性交配，并通過陰道栓的存在與否驗(yàn)證交配。
在手術(shù)鏡(Leica MZ12 Stereo Microscope，Leica，Wetzlar，德國)下收集受精卵。然后在已經(jīng)于5％CO2、5％O2和90％N2，37℃孵育過的透明質(zhì)酸酶和Whitten氏W640培養(yǎng)基(表8；所有試劑均可從SigmaChemical公司獲得)中洗滌這些卵。在顯微注射前將卵儲存在37℃/5％CO2孵箱中。
表8WHITTEN氏640培養(yǎng)基mgs/200ml mgs/500mlNaCl 12803200KCl 72 180KH2PO432 80MgSO4-7H2O 60 150葡萄糖200 500乳酸鈣106 265青霉素G 15 37.5硫酸鏈霉素10 25NaHCO3380 950丙酮酸鈉 5 12.5H2O 200ml 500ml500mM EDTA100μl 250μl5％酚紅 200μl 500μlBSA 600 1500采用寡核苷酸引物SEQ ID NO36和SEQ ID NO37，通過PCR擴(kuò)增編碼全長人類TACI配體Blys(SEQ ID NO35)的858bp開放閱讀框，以便引入最佳起始密碼子和側(cè)翼5’PmeI和3’AscI位點(diǎn)。將該P(yáng)meI/AscI片段亞克隆至pKF024中，pKF024是一種B和/或T細(xì)胞限制性轉(zhuǎn)基因載體，含有Ig Em增強(qiáng)子(來自pEmSRd的690bp NotI/XbaI；Bodrug等，EMBO J.132124-30，1994)、Ig Vh啟動子(來自pJH1X(-)的536bpHincII/XhoI片段；Hu等，實(shí)驗(yàn)醫(yī)學(xué)雜志(J.Exp.Med.)1771681-90，1993)、SV40的16S內(nèi)含子(來自pEmSR的171bp XhoI/HindIII片段)、一個PmeI/AscI多接頭、和人類生長激素基因的聚腺苷酸化信號(627bpSmaI/EcoRI片段；Seeburg，DNA 1239-49，1982)。通過NotI消化和瓊脂糖凝膠純化從質(zhì)粒骨架中分離出該轉(zhuǎn)基因插入片段，并基本上按前人所述對來自上述B6C3F1Tac小鼠交配的受精卵進(jìn)行顯微注射，并移植至假孕雌性動物中(Malik等，分子細(xì)胞生物學(xué)(Molec.Cell.Biol.)152349-58，1995)。
將受體動物成對地放回籠中，使其懷孕19-21天。出生后，經(jīng)過產(chǎn)后19-21天辨別性別并斷奶，然后用干凈的剪刀將尾剪斷，獲得0.5cm活檢組織(用于基因型分析)采用可從商業(yè)途徑獲得的試劑盒(DNeasy 96 Tissue試劑盒；Qiagen，Valencia，CA)，依據(jù)廠家說明書，從剪下的尾部小塊制備基因組DNA。采用針對該轉(zhuǎn)基因載體的人類生長激素(hGH)3’UTR部分所設(shè)計(jì)的引物，通過PCR分析基因組DNA。引物ZC17251(SEQ ID NO38)和ZC17252(SEQ IDNO39)擴(kuò)增一個368堿基對的hGH片段。采用該人類序列所特有的區(qū)域(從人類和小鼠的生長激素3’UTR DNA序列的比對鑒定的)，以保證該P(yáng)CR反應(yīng)不擴(kuò)增小鼠序列。此外，還可以和該hGH引物一起使用與載體序列雜交并擴(kuò)增該cDNA插入片段的引物ZC17156(SEQ ID NO40)和ZC17157(SEQ ID NO41)。在這些實(shí)驗(yàn)中，來自該轉(zhuǎn)基因陽性動物的DNA產(chǎn)生兩個條帶，一個是相應(yīng)于該hGH 3’UTR片段的368堿基對條帶，而一個是相應(yīng)于該cDNA插入片段的具有可變大小的條帶。
一旦證實(shí)動物是轉(zhuǎn)基因的(TG)，則通過將一只TG雌性和一只野生型雄性、或一只TG雄性和一只或兩只野生型雌性動物放置在一起，使TG動物與近交系回交。幼崽出生并斷奶后，區(qū)分性別，并剪下它們的尾用于基因型分析。
為了檢查活體動物中轉(zhuǎn)基因的表達(dá)，對存活的活檢組織進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。采用RNA溶液雜交實(shí)驗(yàn)或在ABI Prism 7700(PE Applied Biosystems公司，F(xiàn)oster City，CA)上根據(jù)廠家說明書進(jìn)行的實(shí)時PCR，分析每個轉(zhuǎn)基因的mRNA表達(dá)水平。細(xì)胞的制備和流式細(xì)胞計(jì)量術(shù)分析不同年齡的起始小鼠。為了淋巴組織的流式細(xì)胞計(jì)量術(shù)(FACS)分析，通過采用研缽和研棒在磷酸緩沖鹽溶液(PBS)中仔細(xì)破碎股骨和脛骨以分離骨髓(BM)細(xì)胞。將細(xì)胞重懸起來，通過被動沉降除去骨碎片，然后以1000×g沉淀細(xì)胞。通過在兩塊載玻片之間擠壓完整組織，獲得脾細(xì)胞、胸腺細(xì)胞、或淋巴結(jié)細(xì)胞，然后和用于BM的操作一樣，將細(xì)胞重懸起來然后沉淀。在染色前，將細(xì)胞重懸在FACS洗滌緩沖液(FACSWB)(Hank氏平衡鹽溶液，1％BSA，10mM Hepes，pH7.4)中，濃度為20×106個細(xì)胞/ml。為了染色，將1×106個細(xì)胞轉(zhuǎn)移到5ml管中，并用1mlFACS WB洗滌，然后1000×g進(jìn)行沉淀。然后在有飽和量的適當(dāng)FITC、PE和/或TriColor(TC)結(jié)合的mAbs時，在100ml總體積的FACS WB中將細(xì)胞于冰上孵育20分鐘。用1.5ml WB洗滌細(xì)胞，沉淀，然后重懸在400mlWB中，并在FACSCalibur流式細(xì)胞儀上采用CellQuest軟件(BectonDickinson，Mountain View，CA)進(jìn)行分析。用于前面(FSC)和側(cè)面(SSC)光散射的探測器設(shè)定在線性范圍上，而所有的三個熒光通道(FL-1，F(xiàn)L-2和FL-3)均采用對數(shù)探測器。
每個實(shí)驗(yàn)均采用單個顏色染色的細(xì)胞群校正FL通道之間的光譜重疊。將所有未過閾值的(ungated)細(xì)胞收集到盤上，然后采用CellQuest軟件分析數(shù)據(jù)。通過基于FSC對SSC分布圖的電子閾值(electronicallygating)數(shù)據(jù)，排除RBC和死細(xì)胞。
異硫氰酸熒光素(FITC)結(jié)合的抗CD8單克隆抗體(mAb)(克隆53-6.7)和藻紅素(Phycoerthyrin)(PE)結(jié)合的抗CD4(克隆RM4-5)、抗CD5(克隆53-7.3)、抗CD19(克隆1D3)、和抗多配體蛋白聚糖(克隆281-2)mAb購自PharMingen(San Diego，CA)。TriColor(TC)結(jié)合的抗CD45R/B220 mAb(克隆RA3-6B2)購自Caltag。
在淋巴區(qū)室中超量表達(dá)ztnf4的轉(zhuǎn)基因小鼠出現(xiàn)外周B細(xì)胞數(shù)量增加、漿細(xì)胞增加和血清免疫球蛋白水平的提高。這些轉(zhuǎn)基因動物在脾臟、淋巴結(jié)和胸腺中有增加數(shù)量的B200+細(xì)胞。數(shù)量增加的脾B細(xì)胞包括常規(guī)B-2細(xì)胞和正常情況下稀少的B-1細(xì)胞群。一般，B-1細(xì)胞主要限于腹膜腔和其它體腔，產(chǎn)生低親和力的自反應(yīng)性抗體，并通常與自身免疫病例如系統(tǒng)性紅斑狼瘡SLE的發(fā)生相關(guān)。
年齡較大的轉(zhuǎn)基因動物產(chǎn)生自體抗體，出現(xiàn)系統(tǒng)性紅斑性狼瘡的特征蛋白尿和硬化的腎小球。
圖5A顯示了，按下述制備的，用抗B220-TC染色并通過流式細(xì)胞計(jì)量術(shù)分析的脾(上圖)、腸系膜淋巴結(jié)(中圖)和骨髓(下圖)的單細(xì)胞懸浮物。通過B220+細(xì)胞的百分?jǐn)?shù)乘以血細(xì)胞計(jì)數(shù)器所計(jì)數(shù)的肝細(xì)胞(臺盼藍(lán)染色細(xì)胞除外)總數(shù)，計(jì)算每種組織中B220+細(xì)胞的數(shù)量。每個柱代表從單個ztnf4轉(zhuǎn)基因(Tg，陰影柱)或非TG同窩出生仔畜(空白柱)對照小鼠獲得的數(shù)據(jù)。
圖5B顯示了從ztnf4 TG(左側(cè)圖)或非TG同窩出生仔畜(右側(cè)圖)的淋巴結(jié)(上排)、脾(中排)和胸腺(底排)分離的細(xì)胞，該細(xì)胞用針對所示分子(DC5、CD4和CD8)的mAb染色，然后通過流式細(xì)胞計(jì)量術(shù)進(jìn)行分析。對顯示的數(shù)據(jù)進(jìn)行限定以排除死細(xì)胞和RBC。
圖5C顯示了6-23周齡范圍的ztnf4轉(zhuǎn)基因小鼠的血清中總的IgG、IgM和IgE水平。
圖5D顯示了與對照同窩出生仔畜的正常腎小球相比，ztnf4轉(zhuǎn)基因小鼠的H&E染色腎切片中鑒定的腎小球淀粉樣沉積和腎小球系膜增厚。
圖5E顯示了ztnf4轉(zhuǎn)基因小鼠中效應(yīng)T細(xì)胞的增加，類似于Mackay等的報道(實(shí)驗(yàn)醫(yī)學(xué)雜志(J.Exp.Med.)1901697-1710，1999)。
將可溶性TACI(BR43×2)或BCMA-Ig融合物注射入超量表達(dá)ztnf4的轉(zhuǎn)基因小鼠中。通過流式細(xì)胞計(jì)量術(shù)(FACS)分析淋巴組織，鑒定脾、淋巴結(jié)和胸腺中B220+B細(xì)胞數(shù)量的任何改變。
實(shí)施例10
直接結(jié)合ELISA開發(fā)了一種直接結(jié)合ELISA，以對體外可溶性TACI-Ig或可溶性BCMA-Ig結(jié)合ztnf4和抑制ztnf4的生物學(xué)活性的能力進(jìn)行特性分析。
用ELISA A緩沖液(0.1M Na2HCO3pH9.6，0.02％NaN3)中的1μg/ml羊抗人Ig(Jackson Labs，Bar Harbor，MA)包被96孔板，并于4℃孵育過夜。TACI、BCMA和作為對照的不相關(guān)的TNF受體如ztnfr10(SEQ IDNO42)從10μg/ml作5倍稀釋，滴定至320ng/ml加一個零，然后和2.5、0.5或0.1μg/ml生物素化的ztnf4或作為陰性對照的卵白蛋白共孵育，并在室溫孵育1小時。
然后將該共孵育的受體-生物素化配體混合物加至羊抗人Ig包被的96孔板中。然后用ELISA C(500μl Tween 20(Sigma Chemical公司，St.Louis，MO.)，200mg NaN3，PBS，終體積1升)洗滌這些板，并用Superblock(Pierce，Rockford，IL)封閉。然后將板在37℃孵育2個小時。
用ELISA C再一次洗滌這些板，之后加入100μl/孔存在于ELISA B(5或10μg BSA(Sigma)分別構(gòu)成1％或2％BSA，250μl Tween 20(Sigma)，100mg NaN3，磷酸緩沖鹽溶液pH7.2(PBS，Sigma)，終體積為500ml；或者，該緩沖液可以由ELISA C緩沖液中的1％或2％BSA構(gòu)成。)中的1∶10,000 neutr-抗生物素蛋白-HRP。然后用OPD室溫10分鐘顯色這些板，并于492處進(jìn)行讀數(shù)。
實(shí)施例11生物學(xué)活性分析試驗(yàn)開發(fā)一種生物學(xué)活性分析試驗(yàn)，以測量可溶性TACI-FC對可溶性ztnf4引起的人B細(xì)胞刺激的抑制。采用CD19磁珠和VarioMacs磁性分離系統(tǒng)(Miltenyi Biotec Auburn，CA)根據(jù)廠家說明書，從外周血單核細(xì)胞(PBMNC)中分離B細(xì)胞。純化的B細(xì)胞與可溶性ztnf4(25ng/ml)及重組人IL-4(10ng/ml Pharmingen)混合，并(一式三份)以每孔1×105個細(xì)胞接種在圓形底96孔板中。
將可溶性TACI-FC從5μg/ml稀釋至6ng/ml，并與所述B細(xì)胞一起孵育5天，在第4天每孔用1μCi3H胸苷(Amersham)處理過夜。作為對照，將可溶性TACI-FC在沒有ztnf4時與B細(xì)胞和IL-4一起孵育。
采用Packard平板采集器收獲平板中的細(xì)胞，然后采用Packard讀數(shù)器計(jì)數(shù)。在體外，TACI-Ig可溶性受體以劑量依賴方式抑制可溶性ztnf4刺激B細(xì)胞增殖的能力。10倍摩爾過量的TACI-Ig完全抑制在存在IL-4時人B細(xì)胞響應(yīng)可溶性ztnf4的增殖。
實(shí)施例12ORIGIN分析試驗(yàn)采用電化學(xué)發(fā)光試驗(yàn)，確定相對于正常個體患有疾病病癥(例如SLE、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎等)的患者中ztnf4的水平。從在ORIGIN緩沖液(Igen，Gaithersburg，MD)中制備的10ng/ml、1ng/ml、0.1ng/ml、0.01ng/ml和0ng/ml可溶性人ztnf4制備標(biāo)準(zhǔn)曲線。在ORIGIN緩沖液中稀釋血清樣品。標(biāo)準(zhǔn)品和樣品與在Origin分析緩沖液(IGEN)中稀釋至1μg/ml的生物素化兔抗人ztnf4-NF BV抗體、和在Origin分析緩沖液(IGEN)中稀釋至1μg/ml的ruthenylated兔抗人ztnf4-NF BV多克隆抗體，于室溫一起孵育2個小時。孵育后，渦旋混合樣品，并向每一個標(biāo)準(zhǔn)品和樣品中加入50μl/管0.4mg/ml鏈霉親和素Dynabeads(Dynal，Oslo，Norway)，然后室溫孵育30分鐘。然后渦旋混合樣品，并在Origin分析器(Igen)上根據(jù)廠家說明書對樣品讀數(shù)。該Origin分析試驗(yàn)以電化學(xué)發(fā)光為基礎(chǔ)，在ECL中產(chǎn)生一個結(jié)果輸出信息-這是什么，它如何作用以及這告訴了你什么。
在來自已發(fā)展到腎小球腎炎和自身免疫病晚期的NZBWE1/J和MRL/Mpj-Faslpr小鼠的血清樣品中檢測到升高水平的ztnf4。
實(shí)施例13自發(fā)性SLE模型中的可溶性TACI-IgNZBW小鼠在大約7-9月齡時出現(xiàn)自發(fā)性SLE的癥狀。當(dāng)平均而言B細(xì)胞自體抗體的產(chǎn)生在NZBW小鼠中被認(rèn)為處于高水平時，在5周時間內(nèi)給NZBW小鼠施用TACI-Fc，并監(jiān)測其對B細(xì)胞的抑制作用。
將100只8周齡的雌性(NZB×NZW)F1小鼠(Jackson實(shí)驗(yàn)室)分成6組，每組15只小鼠。處理前，每月一次監(jiān)測小鼠尿中的蛋白質(zhì)，并且抽血用于構(gòu)建CBC和血清庫。篩選存在自體抗體的血清。由于蛋白尿是腎小球腎炎的標(biāo)志信號，因此在研究過程中每隔一定時間間隔以量桿監(jiān)測尿中的蛋白質(zhì)水平。處理前稱重動物。當(dāng)小鼠大約5月齡時開始給藥。5周每周3次給小鼠腹膜內(nèi)注射單純的載體(PBS)或人IgG-FC(對照蛋白質(zhì))或TACI-FC4(測試蛋白質(zhì))。
在給藥期間兩次收集血液，并在給藥后進(jìn)行至少兩次收集。在給藥開始后每兩周測量蛋白尿的尿量桿值和體重。在安樂死時，收集血液、尿量桿值和體重值。稱取脾、胸腺、肝及膽囊、左腎、和腦的重量。脾和胸腺均分成兩份用于FACS分析和組織學(xué)分析。下頜下唾液腺、腸系膜淋巴結(jié)鏈、肝葉及膽囊、盲腸及大腸、胃、小腸、胰腺、右腎、腎上腺、舌及氣管和食道、心臟、與肺也被收集用于組織學(xué)分析。
圖6顯示了NZBWF1和MRL/lpr/lpr小鼠的血清中與SLE的發(fā)生相關(guān)的ztnf4水平升高。圖6A的上圖顯示，68只10-40周齡范圍內(nèi)的NZBWF1小鼠和10周及30周齡的NZB/B小鼠中，ztnf4血清水平與年齡相關(guān)。中圖顯示，與對照NZB/B小鼠相比，NZBWF1小鼠中與三個范圍，即痕量-20mg/dl(T-30)、100-300ng/dl和200mg/dl，的蛋白尿的相關(guān)性。下圖顯示，與對照NZB/B小鼠相比，NZBWF1小鼠中ztnf4水平與各種效價的抗ds DNA抗體的關(guān)系。
圖6B顯示了在23只18-24周齡范圍內(nèi)的MRL/lpr/lpr小鼠和10只11周齡的對照MRL/MpJ小鼠上獲得相似關(guān)系。
圖7顯示了尿分析結(jié)果。如果量桿讀數(shù)≥100mg/dl，則認(rèn)為小鼠患有蛋白尿。(A)PBS，(B)人IgG FC，100mg，(C)人IgG FC，20mg，(D)人TACI-IgG，100mg，和(E)人TACI-IgG，20mg。用可溶性TACI-IgG融合物處理的小鼠表現(xiàn)出蛋白尿的減少。
對處理動物的外周血分析揭示，在處理開始后兩周，與FC(20和100mg)和PBS處理的小鼠比較，TACI-Fc處理小鼠(20和100mg)的白血細(xì)胞和淋巴細(xì)胞計(jì)數(shù)降低。對處理開始后6周(施用最后一次處理后兩周)抽取的外周血進(jìn)行的FAC分析(淋巴細(xì)胞作為閾值)顯示，樣品中存在的B細(xì)胞百分?jǐn)?shù)劇烈降低。在施用最后一次處理后5周B細(xì)胞水平仍在下降，但不劇烈。表9提供了每一個處理組中小鼠的平均值(和標(biāo)準(zhǔn)差)(表9)。在進(jìn)入處理的兩周也觀察到外周血中B細(xì)胞百分?jǐn)?shù)的下降。
表9
實(shí)施例14正常小鼠中的可溶性TACI-Ig給Blab/C小鼠施用TACI-FC，以監(jiān)測其對正常小鼠的影響。將60只8周齡雌性Balb/C小鼠(HSD)分成12組，每組5只小鼠。處理前，稱重小鼠并取血用于CBC和血清庫的構(gòu)建。第1-9組接受12天每天腹膜內(nèi)注射(IP)單純的載體(PBS)或人IgG-FC(對照蛋白質(zhì))或TACI-FC4(測試蛋白質(zhì))，并在第14天處死。第10-11組接受兩周每周3次IP注射，并第14天處死。
在第7天和第12天收集血液。在安樂死時，收集血液并稱體重。稱取脾、胸腺、和腦的重量。脾和胸腺均分成兩份用于FACS分析和組織學(xué)分析。皮膚、脾、腸系膜LN鏈、下頜下唾液腺、卵巢、子宮、子宮頸、膀胱、腸系膜淋巴結(jié)鏈、肝葉及膽囊、盲腸及大腸、胃、小腸、胰腺、右腎、腎上腺、舌及氣管和食道、心臟、胸腺、大腿肌肉、左和右股、腦也將被收集用于組織學(xué)分析。
按實(shí)施例13所描述的，與FC4或PBS單純處理的并經(jīng)CBC或FACS分析的那些樣品相比，在第7天(通過CBC)和12天(采用FACS)，觀察到取自所有TACI-FC4處理樣品的外周血細(xì)胞中B細(xì)胞百分?jǐn)?shù)顯著降低。此外，第14天與取自FC4處理小鼠的相比，取自TACI-FC4處理動物的脾中B細(xì)胞減少將近50％。
實(shí)施例15抗dsDNA ELISA通過高水平的抗雙鏈DNA抗體表征自身免疫。為了測量超量表達(dá)ztnf4的轉(zhuǎn)基因小鼠和NZBW小鼠中的抗dsDNA抗體水平，開發(fā)了一種ELISA分析。用聚L-賴氨酸(Sigma)(20μl/ml，在0.1M Tris緩沖液pH7.3中)以75μl/孔包被96孔微滴定板(Nunc)，并室溫孵育過夜。之后在dH2O中洗滌該板，并用聚dAdT(Sigma)(20μl/ml，0.1M Tris緩沖液pH7.3中)以75μl/孔進(jìn)行包被，然后室溫孵育60分鐘。然后用dH2O洗滌該板，并用Tris緩沖液中的2％BSA(Sigma)室溫封閉30分鐘，之后在dH2O中作最后的洗滌。
從實(shí)施例10所述ztnf4轉(zhuǎn)基因小鼠和實(shí)施例11所述NZBW小鼠采取血清樣品。將該血清樣品1∶50稀釋在Tris緩沖液內(nèi)的1％BSA/2％BGG(Calbiochem)中。然后以1∶50、1∶100、1∶200、1∶400、1∶800、1∶1600、1∶3200和1∶6400(50μl/孔)將這些稀釋樣品滴定在該包被板中，并室溫孵育90分鐘。
然后在dH2O中洗滌板，并以50μl/孔加入1％BSA/2％BGG中1∶1000稀釋的羊抗鼠IgG-Fc-HRP(Cappel)。室溫孵育該板60分鐘。在dH2O中洗滌板5次，并用OPD(1片/10ml Novo D，以100μl/孔鋪板)顯色。用100μl/孔1N H2S04終止顯色，并在492nm處讀取OD值。
圖8顯示了，與NZBWF1(32周齡)和MRL/lpr/lpr(19周齡)小鼠的血清中檢測到的抗dsDNA水平相比，兩只ztnf4轉(zhuǎn)基因小鼠(23周齡)、兩只非轉(zhuǎn)基因同窩出生仔畜中的抗dsDNA水平。
實(shí)施例16自發(fā)性ELE模型中的可溶性TACI-Ig給25只雌性PLxSJL F1小鼠(12周齡，Jackson實(shí)驗(yàn)室)每只皮下注射配制在弗氏完全佐劑中的125μg抗原(髓鞘蛋白脂質(zhì)蛋白，PLP，139-151位殘基)。將這些小鼠分成5組，每組5只小鼠。在第0天和第2天腹膜內(nèi)注射百日咳毒素(400ng)。給一些組施用1倍、10倍或100倍劑量的TACI、BCMA或BR43×2，一組接受單純的載體，而一組不接受處理。預(yù)防治療將在第0天開始，干涉治療將在第7天開始或在臨床癥狀出現(xiàn)時開始。疾病的癥狀、體重的減輕、和癱瘓出現(xiàn)在大約第10-14天，并持續(xù)大約1周。通過稱量體重和指定一個符合癥狀程度的臨床評分，每天對動物進(jìn)行評價。EAE的臨床癥狀出現(xiàn)在接種的第10-14天內(nèi)，并持續(xù)大約1周。在該研究結(jié)束時，通過給予過量氣體，以安樂死方式處死所有動物，并進(jìn)行尸體剖檢。收集腦和脊柱用于組織學(xué)分析，或冷凍用于mRNA分析。就個體和組對體重和臨床評分?jǐn)?shù)據(jù)進(jìn)行作圖。臨床評分0正常0.5弱，尾緊張度可能降低但并非沒有1尾軟(當(dāng)在尾基部撿起小鼠時，不能提起尾部)2尾軟，腿無力(不能提起尾，能夠用后腿直立但腿顫抖)3局部麻痹(不能用腿蹲，用后腿以劃動方式行走)4麻痹(不能移動后腿，當(dāng)試圖行走時拖曳著腿)5四肢麻痹(前腿麻痹或以轉(zhuǎn)圈的方式行走，可能有頭部傾斜)6垂死(完全麻痹，不能獲取食物或水，處死動物)實(shí)施例17TACI-FC和類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的CIA模型將8周齡雄性DBA/1J小鼠(Jackson實(shí)驗(yàn)室)分組，每組5只小鼠，相隔3周給這些小鼠兩次皮下注射50-100μl 1mg/ml膠原蛋白(雞或牛來源的)。一個對照將不接受膠原蛋白注射。第一次注射物配制在弗氏完全佐劑中，而第二次注射物配制在弗氏不完全佐劑中。在第二次注射時或之前，或在動物出現(xiàn)持續(xù)至少24個小時的2或更高臨床評分后，預(yù)防性施用TACI-FC。在第二次膠原蛋白注射后，通常在2-3周內(nèi)，動物開始表現(xiàn)出關(guān)節(jié)炎的癥狀。通過采用測徑器測量爪的厚度并對每個爪給定一個臨床評分(0-3)，從每個爪評價疾病的程度。臨床評分0正常，1一個或多個趾紅腫，2輕微的爪發(fā)炎，3中度的爪發(fā)炎，4嚴(yán)重的爪發(fā)炎。在疾病確立一段時間后安樂處死動物。收集爪用于組織學(xué)分析或mRNA分析，并收集血清用于免疫球蛋白和細(xì)胞因子分析。
實(shí)施例18TACI抗體的中和用肽huztnf4-1SAGIAKLEEGPELQLAIPRE(SEQ ID NO59)或huztnf4-2SFKRGSALEEKENKELVKET(SEQ ID NO60)，免疫2只雌性新西蘭白兔，制備多克隆抗肽抗體。這些肽是采用Applied Biosystems型431A肽合成儀(Applied Biosystems公司，F(xiàn)oster City，CA)，根據(jù)廠家說明書合成的。然后用順丁烯二酰亞胺激活，使這些肽與載體蛋白匙孔血藍(lán)蛋白(KLH)結(jié)合。給所述兔每只最初腹膜內(nèi)(ip)注射200μg配制在弗氏完全佐劑中的肽，之后每三周加強(qiáng)腹膜內(nèi)注射100μg配制在弗氏不完全佐劑中的肽。施用第二次加強(qiáng)注射(總共3次注射)后7-10天，抽取動物血液，并收集血清。然后加強(qiáng)免疫動物，并每三周抽取動物血液。
采用1μg/ml用于制備抗體(SEQ ID NOs59和60)的肽作為抗體靶標(biāo)，通過ELISA滴定檢測定性分析ztnf4肽特異性兔血清。針對huztnf4-1肽(SEQ ID NO59)的2只兔血清具有以1∶1E5(1∶100000)稀釋度與它們的特異肽結(jié)合的滴度。針對huztnf4-2肽(SEQ ID N060)的2只兔血清具有以1∶5E6稀釋度與它們的特異肽結(jié)合，以及以1∶5E6稀釋度與重組的全長蛋白質(zhì)(桿狀病毒中制備的N端FLAG標(biāo)記ztnf4(huztnf4s-NF-Bv)和BHK細(xì)胞中制備的C端FLAG標(biāo)記ztnf4)結(jié)合的滴度。
利用以每克CNBR-SEPHAROSE 10mg特異肽(SEQ ID NO59或60)制備的CNBR-SEPHAROSE 48蛋白柱(Pharmacia LKB)，從兔血清親和純化該ztnf4肽特異性多克隆抗體，之后在PBS中20倍透析過夜。采用1μg/ml適當(dāng)肽抗原或重組全長蛋白質(zhì)(huztnf4-NF-Bv)作為抗體的靶標(biāo)，通過ELISA滴定檢測定性分析ztnf4特異性抗體。該兔抗huztnf4-1親和純化抗體對于其特異性抗原(huztnf4-1肽，SEQ ID NO59)的檢測下限(LLD)為5ng/ml的稀釋液。該兔抗huztnf4-2親和純化抗體對于其特異性抗原(huztnf4-2肽，SEQ ID NO60)的檢測下限(LLD)為0.5ng/ml的稀釋液。該兔抗huztnf4-2親和純化抗體對于重組蛋白huztnf4s-NF-Bv的檢測下限(LLD)為5ng/ml的稀釋液。
還制備小鼠單克隆抗體，并就對生物素標(biāo)記可溶性ztnf4的抑制作用的抑制對其進(jìn)行了選擇。該TACI單克隆抗體(248.14，248.23或246.3)沒有一個阻斷ztnf4與BCMA的結(jié)合。當(dāng)條件培養(yǎng)基被稀釋至1∶243時，單克隆248.23降低10ng/ml ztnf4-生物素的結(jié)合至大約50％，而在未稀釋的培養(yǎng)基中降低結(jié)合至大約2倍。在1∶243-1∶181的條件培養(yǎng)基稀釋液中單克隆246.3降低10ng/ml ztnf4-生物素的結(jié)合至大約50％，而在未稀釋的培養(yǎng)基中降低結(jié)合5倍。
從前文所述，應(yīng)理解，盡管為了舉例說明的目的本文對本發(fā)明的具體實(shí)施方案進(jìn)行了描述，但可以進(jìn)行多種修改而不偏離本發(fā)明的精神和范圍。因此，本發(fā)明除了受所附權(quán)利要求的限制外，不受其它限制。
權(quán)利要求
1.在哺乳動物中抑制ztnf4活性的方法，包括給所述哺乳動物施用一定量的選自下組的化合物a)含有BR43×2的胞外域的多肽；b)含有TACI的胞外域的多肽；c)含有BCMA的胞外域的多肽；d)含有SEQ ID NO10的序列的多肽；e)與SEQ ID NO2的多肽特異結(jié)合的抗體或抗體片段；f)與SEQ ID NO4的多肽特異結(jié)合的抗體或抗體片段；g)與SEQ ID NO6的多肽特異結(jié)合的抗體或抗體片段；h)與SEQ ID NO8的多肽特異結(jié)合的抗體或抗體片段；i)與SEQ ID NO10的多肽特異結(jié)合的抗體或抗體片段；k)SEQ ID NO4的多肽；l)SEQ ID NO6的第1-166位氨基酸殘基；和m)SEQ ID NO8的第1-150位氨基酸殘基。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中所述化合物是由通過肽鍵連接在一起的第一部分和第二部分組成的融合蛋白，所述第一部分含有選自下組的多肽a)含有SEQ ID NO8的序列的多肽；b)含有SEQ ID NO2第25-58位氨基酸殘基的多肽；c)含有SEQ ID NO6第34-66位氨基酸殘基的多肽；d)含有SEQ ID NO6第71-104位氨基酸殘基的多肽；e)含有SEQ ID NO6第25-104位氨基酸殘基的多肽；f)含有SEQ ID NO8第8-37位氨基酸殘基的多肽；g)含有SEQ ID NO8第41-88位氨基酸殘基的多肽；h)含有SEQ ID NO8第8-88位氨基酸殘基的多肽；且所述第二部分含有另一多肽。
3.根據(jù)權(quán)利要求2的方法，其中所述第一部分還含有選自下組的多肽a)SEQ ID NO2第59-120位氨基酸殘基；b)SEQ ID NO6第105-166位氨基酸殘基；和c)SEQ ID NO8第89-150位氨基酸殘基。
4.根據(jù)權(quán)利要求2的方法，其中所述第一部分選自a)含有BR43×2胞外域的多肽；b)含有TACI胞外域的多肽；和c)含有BCMA胞外域的多肽。
5.根據(jù)權(quán)利要求2的方法，其中所述第一部分選自a)SEQ ID NO4的多肽；b)SEQ ID NO6的第1-154位氨基酸殘基；和c)SEQ ID NO8的第1-48位氨基酸殘基。
6.根據(jù)權(quán)利要求2的方法，其中所述第二部分是免疫球蛋白的重鏈恒定區(qū)。
7.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中所述抗體或抗體片段選自a)多克隆抗體；b)鼠單克隆抗體；c)來源于b)的人源化抗體；和d)人單克隆抗體。
8.根據(jù)權(quán)利要求7的方法，其中所述抗體片段選自F(ab’)、F(ab)、Fab’、Fab、Fv、scFv和最小識別單元。
9.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中所述哺乳動物是靈長類動物。
10.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中所述ztnf4活性與B淋巴細(xì)胞相關(guān)。
11.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中所述ztnf4活性與活化的B淋巴細(xì)胞相關(guān)。
12.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中所述ztnf4活性與靜息的B淋巴細(xì)胞相關(guān)。
13.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中所述ztnf4活性與抗體的產(chǎn)生相關(guān)。
14.根據(jù)權(quán)利要求13的方法，其中所述抗體的產(chǎn)生與自身免疫病相關(guān)。
15.根據(jù)權(quán)利要求14的方法，其中所述自身免疫病是系統(tǒng)性紅斑性狼瘡、重癥肌無力、多發(fā)性硬化癥或類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎。
16.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中所述ztnf4活性與哮喘、支氣管炎或肺氣腫有關(guān)。
17.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中所述ztnf4活性與末期腎衰竭相關(guān)。
18.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中所述ztnf4活性與腎疾病相關(guān)。
19.根據(jù)權(quán)利要求18的方法，其中所述腎疾病是腎小球腎炎、脈管炎、腎炎或腎盂腎炎。
20.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中所述與腎瘤、多發(fā)性骨髓瘤、淋巴瘤、輕鏈神經(jīng)病或淀粉樣變性病相關(guān)。
21.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中所述ztnf4活性與效應(yīng)T細(xì)胞相關(guān)。
22.根據(jù)權(quán)利要求21的方法，其中所述ztnf4活性與調(diào)節(jié)免疫應(yīng)答相關(guān)。
23.根據(jù)權(quán)利要求21的方法，其中所述活性與免疫抑制相關(guān)。
24.根據(jù)權(quán)利要求21的方法，其中所述免疫抑制與移植排斥、移植物抗宿主疾病或炎癥相關(guān)。
25.根據(jù)權(quán)利要求24的方法，其中所述活性與自身免疫病相關(guān)。
26.根據(jù)權(quán)利要求25的方法，其中所述自身免疫病是胰島素依賴性糖尿病或Crohn氏病。
27.根據(jù)權(quán)利要求26的方法，其中所述ztnf4活性與炎癥相關(guān)。
28.根據(jù)權(quán)利要求27的方法，其中所述炎癥與關(guān)節(jié)疼痛、腫脹、貧血或敗血癥性休克相關(guān)。
29.用于抑制BR34×2、TACI或BCMA受體-配體嚙合的方法，包括施用一定量的選自下組的化合物a)含有BR43×2胞外域的多肽；b)含有TACI胞外域的多肽；c)含有BCMA胞外域的多肽；d)含有SEQ ID NO10的序列的多肽；e)與SEQ ID NO2的多肽特異結(jié)合的抗體或抗體片段；f)與SEQ ID NO4的多肽特異結(jié)合的抗體或抗體片段；g)與SEQ ID NO6的多肽特異結(jié)合的抗體或抗體片段；h)與SEQ ID NO8的多肽特異結(jié)合的抗體或抗體片段；i)與SEQ ID NO10的多肽特異結(jié)合的抗體或抗體片段；j)與SEQ ID NO18的多肽特異結(jié)合的抗體或抗體片段；k)與SEQ ID NO20的多肽特異結(jié)合的抗體或抗體片段；k)SEQ ID NO4的多肽；l)SEQ ID NO6的第1-166位氨基酸殘基；和m)SEQ ID NO8的第1-150位氨基酸殘基。
30.根據(jù)權(quán)利要求29的方法，其中所述化合物是由通過肽鍵連接在一起的第一部分和第二部分組成的融合蛋白，所述第一部分含有選自下組的多肽a)含有SEQ ID NO8的序列的多肽；b)含有SEQ ID NO2第25-58位氨基酸殘基的多肽；c)含有SEQ ID NO6第34-66位氨基酸殘基的多肽；d)含有SEQ ID NO6第71-104位氨基酸殘基的多肽；e)含有SEQ ID NO6第25-104位氨基酸殘基的多肽；f)含有SEQ ID NO8第8-37位氨基酸殘基的多肽；g)含有SEQ ID NO8第41-88位氨基酸殘基的多肽；h)含有SEQ ID NO8第8-88位氨基酸殘基的多肽；且所述第二部分含有另一種多肽。
31.根據(jù)權(quán)利要求30的方法，其中所述第一部分還含有選自下組的多肽a)SEQ ID NO2的第59-120位氨基酸殘基；b)SEQ ID NO6的第105-166位氨基酸殘基；和c)SEQ ID NO8的第89-150位氨基酸殘基。
32.根據(jù)權(quán)利要求30的方法，其中所述第一部分選自a)含有BR43×2胞外域的多肽；b)含有TACI胞外域的多肽；和c)含有BCMA胞外域的多肽。
33.根據(jù)權(quán)利要求30的方法，其中所述第一部分選自a)SEQ ID NO4的多肽；b)SEQ ID NO6的第1-154位氨基酸殘基；和c)SEQ ID NO8的第1-48位氨基酸殘基。
34.根據(jù)權(quán)利要求30的方法，其中所述第二部分是免疫球蛋白的重鏈恒定區(qū)。
35.根據(jù)權(quán)利要求29的方法，其中所述抗體或抗體片段選自a)多克隆抗體；b)鼠單克隆抗體；c)來源于b)的人源化抗體；和d)人單克隆抗體。
36.根據(jù)權(quán)利要求35的方法，其中所述抗體片段選自F(ab’)、F(ab)、Fab’、Fab、Fv、scFv和最小識別單元。
37.根據(jù)權(quán)利要求29的方法，其中所述BR43×2、TACI或BCMA受體-配體嚙合與B淋巴細(xì)胞相關(guān)。
38.根據(jù)權(quán)利要求29的方法，其中所述BR43×2、TACI或BCMA受體-配體嚙合與活化的B淋巴細(xì)胞相關(guān)。
39.根據(jù)權(quán)利要求29的方法，其中所述BR43×2、TACI或BCMA受體-配體嚙合與靜息的B淋巴細(xì)胞相關(guān)。
40.根據(jù)權(quán)利要求29的方法，其中所述BR43×2、TACI或BCMA受體-配體嚙合與抗體的產(chǎn)生相關(guān)。
41.根據(jù)權(quán)利要求29的方法，其中所述抗體的產(chǎn)生與自身免疫病相關(guān)。
42.根據(jù)權(quán)利要求41的方法，其中所述自身免疫病是系統(tǒng)性紅斑性狼瘡、重癥肌無力、多發(fā)性硬化癥或類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎。
43.根據(jù)權(quán)利要求29的方法，其中所述BR43×2、TACI或BCMA受體-配體嚙合與哮喘、支氣管炎或肺氣腫有關(guān)。
44.根據(jù)權(quán)利要求29的方法，其中所述BR43×2、TACI或BCMA受體-配體嚙合與末期腎衰竭相關(guān)。
45.根據(jù)權(quán)利要求29的方法，其中所述BR43×2、TACI或BCMA受體-配體嚙合與腎疾病相關(guān)。
46.根據(jù)權(quán)利要求45的方法，其中所述腎疾病是腎小球腎炎、脈管炎、腎炎或腎盂腎炎。
47.根據(jù)權(quán)利要求29的方法，其中所述受體-配體嚙合與腎瘤、多發(fā)性骨髓瘤、淋巴瘤、輕鏈神經(jīng)病或淀粉樣變性病相關(guān)。
48.根據(jù)權(quán)利要求29的方法，其中所述BR43×2、TACI或BCMA受體-配體嚙合與效應(yīng)T細(xì)胞相關(guān)。
49.根據(jù)權(quán)利要求48的方法，其中所述BR43×2、TACI或BCMA受體-配體嚙合與免疫應(yīng)答的調(diào)節(jié)相關(guān)。
50.根據(jù)權(quán)利要求49的方法，其中所述受體-配體嚙合與與免疫抑制相關(guān)。
51.根據(jù)權(quán)利要求50的方法，其中所述免疫抑制與移植排斥、移植物抗宿主疾病或炎癥相關(guān)。
52.根據(jù)權(quán)利要求50的方法，其中所述受體-配體嚙合與自身免疫病相關(guān)。
53.根據(jù)權(quán)利要求52的方法，其中所述自身免疫病是胰島素依賴性糖尿病或Crohn氏病。
54.根據(jù)權(quán)利要求50的方法，其中所述BR43×2、TACI或BCMA受體-配體嚙合與炎癥相關(guān)。
55.根據(jù)權(quán)利要求54的方法，其中所述炎癥與關(guān)節(jié)疼痛、腫脹、貧血或敗血癥性休克相關(guān)。
56.編碼SEQ ID NO2的多肽的分離多核苷酸分子。
57.SEQ ID NO1的分離的多核苷酸分子。
58.含有以下可操作地連接的元件的表達(dá)載體轉(zhuǎn)錄啟動子；根據(jù)權(quán)利要求56的多核苷酸分子；和轉(zhuǎn)錄終止子。
59.根據(jù)權(quán)利要求58的表達(dá)載體，其還含有可操作地與所述多核苷酸分子連接的分泌性受體-配體嚙合序列。
60.已導(dǎo)入了根據(jù)權(quán)利要求58的表達(dá)載體的培養(yǎng)細(xì)胞，其中所述培養(yǎng)細(xì)胞表達(dá)所述多核苷酸片段所編碼的所述多肽。
61.制備多肽的方法，包括培養(yǎng)其中已導(dǎo)入了根據(jù)權(quán)利要求58的表達(dá)載體的細(xì)胞；籍此所述細(xì)胞表達(dá)所述多核苷酸分子所編碼的所述多肽；和回收所述表達(dá)多肽。
62.具有SEQ ID NO2的序列的分離多肽。
63.與可藥用載體組合在一起的權(quán)利要求62的多肽。
全文摘要
本發(fā)明公開了可溶性分泌腫瘤壞死因子受體多肽、編碼該多肽的多核苷酸和相關(guān)的組合物和方法。該多肽含有一個與其它腫瘤壞死因子受體例如跨膜激活物和CAML－相互作用物(TACI)同源的富含半胱氨酸的重復(fù)單位。該多肽可以用于檢測配體、拮抗劑和激動劑。該多肽還可以應(yīng)用于調(diào)節(jié)B細(xì)胞活化的方法中。
文檔編號A61P37/06GK1342202SQ00804425
公開日2002年3月27日 申請日期2000年1月7日 優(yōu)先權(quán)日1999年1月7日
發(fā)明者J·A·格羅斯, W·許, K·瑪頓, D·P·耶 申請人:津莫吉尼蒂克斯公司