專利名稱：腫瘤壞死因子受體6α和6β的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及編碼作為TNF受體家族成員的多肽的新的人基因。更為具體的是，本發(fā)明提供了編碼此后有時稱做“TNFR-6α，和TNFR-6β”或統(tǒng)稱為“TNFR-多肽”的名為腫瘤壞死因子受體6α和6β的人多肽的分離的核酸分子。本發(fā)明也提供了TNFR多肽，用于生產(chǎn)該多肽的載體、宿主細胞和重組方法。本發(fā)明進一步涉及篩選用于鑒定TNFR多肽活性的激動劑和拮抗劑的方法。本發(fā)明也提供了應(yīng)用這些組合物的診斷和治療方法。
背景技術(shù)：
許多生物學(xué)功能例如對某些刺激和自然生物學(xué)過程的應(yīng)答都受因子如細胞因子的控制。許多細胞因子都是通過與受體相互作用并且產(chǎn)生細胞內(nèi)應(yīng)答而起作用的。
例如，腫瘤壞死因子α和β就是通過TNF受體起作用從而調(diào)控各種生物學(xué)過程包括抗感染和誘導(dǎo)休克和炎性疾病的細胞因子。TNF分子屬于“TNF配體”超家族，并且與它們的受體或反配體“TNF受體超家族”一起起作用。目前為止，TNF配體超家族的9個成員和TNF受體超家族的10個成員已經(jīng)被鑒定出。
配體包括TNF-α、淋巴毒素-α(LT-α，也稱做TNF-β)、LT-β(在LT-α2-β異源三聚體復(fù)合物中發(fā)現(xiàn))、FasL、CD40L、CD27L、CD30L、4-1BBL、OX40L和神經(jīng)生長因子(NGF)。TNF受體超家族包括p55TNF受體、p75TNF受體、TNF受體相關(guān)蛋白、FAS抗原或APO-1、CD40、CD27、CD30、4-1BB、OX40、低親和性的p75和NGF受體(Meager，A.，生物學(xué)，22291-295(1994))。
TNF配體超家族的許多成員都是由激活的T細胞表達的，這暗示它們是T細胞與作為細胞個體發(fā)育和功能基礎(chǔ)的其它類型的細胞之間的相互作用所必需的(Meager，A.，Supra)。
在鑒定和產(chǎn)生喪失了這些蛋白質(zhì)表達能力的突變體的過程中，獲得了對TNF受體家族中某些成員的基本功能的深刻理解。例如，F(xiàn)AS抗原及其配體的天然突變導(dǎo)致淋巴增殖性疾病(Watanaba-Fukunaga，R.等，自然356314(1992))。這可能反映了細胞程序性死亡的失敗。CD40配體的突變導(dǎo)致以血漿中高水平的免疫球蛋白M和低水平的免疫球蛋白G為特征的X相關(guān)的免疫缺陷狀態(tài)，表明缺陷的T細胞依賴的B細胞的激活(Allen，R.C.等，科學(xué)259990(1993))。對低親和性的神經(jīng)生長因子進行的靶向突變導(dǎo)致以外周結(jié)構(gòu)的缺陷的感覺更新為特征的紊亂(Lee，K.F.等，細胞69737(1992))。
TNF和LT-α能夠與兩種TNF受體(55kd和75kd的TNF受體)結(jié)合。許多由TNF和LT-α通過它們的受體起作用而引發(fā)的生物學(xué)效應(yīng)包括移植腫瘤的出血性壞死、細胞毒性、內(nèi)毒素休克中的作用、炎癥、免疫調(diào)節(jié)、增殖和抗病毒應(yīng)答、以及抗電離輻射的有害效應(yīng)等。TNF和LT-α與多種疾病的致病過程相關(guān)，包括內(nèi)毒素休克、腦瘧疾、腫瘤、自身免疫性疾病、AIDS和移植宿主排斥(Beutler，B.和Von Huffel，C.，科學(xué)264667-668(1994))。p55受體的突變導(dǎo)致對微生物感染的易感性增加。
而且，據(jù)報道TNFRl(p55)和Fas的近C末端大約80個氨基酸的區(qū)段為“死亡區(qū)”，這段區(qū)域負責(zé)傳導(dǎo)細胞程序性死亡的信號(Tartaglia等，細胞74845(1993))。凋亡或細胞程序性死亡是多細胞器官的正常發(fā)育和穩(wěn)態(tài)所必需的生理過程(H.Steller，科學(xué)2671445-1449(1995))。凋亡受到擾亂對某些人類疾病包括癌癥、神經(jīng)變性紊亂以及獲得性免疫缺陷綜合癥的致病具有促進作用(C.B.Thompson，科學(xué)2671456-1462(1995))。最近，人們的注意力更多地集中于兩種細胞表面死亡受體Fas/APO-1和TNFR-1的信號傳導(dǎo)和生物學(xué)功能上(J.L.Cleveland，J.N.Ihle，細胞81，479-482(1995)；A.Fraser，G.Evan，細胞85，781-784(1996)；S.Nagata，P.Golstein，科學(xué)267，1449-56(1995))。它們都是TNF受體家族的成員，此家族還包括TNFR-2，低親和性的NGFR、CD40和CD30以及其它分子(C.A.Smith等，科學(xué)248，1019-23(1990)；M.Tewari，V.M.Dixit，在M.Purton，Heldin，Carl編著的分子和細胞生物學(xué)一書的模塊文本中(Chapman和Hall，倫敦，1995))。家族成員在其細胞外結(jié)構(gòu)域中存在半胱氨酸豐富的重復(fù)序列，F(xiàn)as/APO-1和TNFR-1還共享一個細胞外同源區(qū)，命名為“死亡區(qū)”，此區(qū)與果蠅屬自殺基因reaper遠緣相關(guān)(P.Golstein，D.Marguet，V.Depraetere，細胞81，185-6(1995)；K.White等，科學(xué)264677-83(1994))。這個共享的死亡區(qū)表明這兩種受體分子都與一系列相關(guān)的至今仍未闡明的信號傳導(dǎo)分子相互作用。Fas/APO-1的激活募集了含有死亡區(qū)的銜接分子FADD/MORT1(A.M.Chinnaiyan，K.O’Rourke，M.Tewari，V.M.Dixit細胞81，505-12(1995)；M.P.Boldin等，生命的化學(xué)期刊270，7759-8(1995)；F.C.Kischkel等，EMBO 14，5579-5588(1995))，這個分子結(jié)合并且預(yù)先激活前凋亡蛋白酶ICE/CED-3家族的一個成員FLICE/MACH1(M.Muzio等，細胞85，817-827(1996)；M.P.Boldin，T.M.Goncharov，Y.V.Goltsev，D.Wallach，細胞85，803-815(1996))。Fas/APO-1的中心作用是引發(fā)細胞死亡，而TNFR-1能夠向一系列不同的生物學(xué)活性傳導(dǎo)信號，其中許多都源自其激活NF-KB的能力(L.A.Tartaglia，D.V.Goeddel，今日免疫學(xué)13，151-3(1992)。因此，TNFR-1募集多價的銜接分子TRADD，此分子與FADD一樣也含有一個死亡區(qū)(H.Hsu，J.Xiong，D.V.Goeddel，細胞81，495-504(1995)；H.Hsu，H.-B.Shu，M.-P.Pan，D.V.Goeddel，細胞84，299-308(1996))。通過它與許多信號傳導(dǎo)分子包括FADD，TRAF2和RIP相關(guān)，TRADD能夠為凋亡和NF-KB激活傳導(dǎo)信號(H.Hsu，H.-B.Shu，M.-P.Pan，D.V.Goeddel，細胞84，299-308(1996)；H.Hsu，J.Huang，H.-B.Shu，V.Baichwal，D.V.Goeddel，免疫4，381-396(1996))。
TNF家族配體和TNF家族受體的效應(yīng)是不同的，并且影響到哺乳動物系統(tǒng)生物學(xué)過程中的許多正常的以及異常的功能。因此，現(xiàn)在很有必要對這些影響正常狀態(tài)以及疾病狀態(tài)下生物學(xué)活性的受體和配體進行鑒別和鑒定。分離和鑒定TNF受體家族的新成員尤其必要。
發(fā)明概述本發(fā)明提供了分離的包含或由編碼具有分別在SEQ ID NOS2和4中所示的完整氨基酸序列或由ATCC保藏號為97810和97809的保藏為質(zhì)粒DNA形式的cDNA克隆所編碼的完整氨基酸序列的TNFR(即，TNFR-6α或TNFR-6β多肽)的至少一部分的多核苷酸所組成的核酸分子。對保藏的TNFR-6α或TNFR-6β克隆進行測序所測定的核苷酸序列，如

圖1和圖2所示(SEQ ID NOS分別為1和3)，分別含有編碼300個和170個氨基酸殘基的全長多肽的開放讀碼框，其中包括分別位于SEQ ID NOS1和3中25-27位和73-75位核苷酸的編碼N末端氨基酸的起始密碼子。
本發(fā)明的TNFR蛋白與其它TNF受體具有序列同源性。TNFR-6α和TNFR-6β的剪接變體與人TNFR-I和TNFR-II(圖3)(SEQ IDNOS分別為5和6)mRNAs的翻譯產(chǎn)物具有最高程度的序列同源性，后者也含有多個保守的富含半胱氨酸的區(qū)域。
TNFR-6α和TNFR-6β多肽都具有推測的30個氨基酸的前導(dǎo)序列，在圖1和圖2中31-300位氨基酸殘基(SEQ ID NO2)和31-170位氨基酸殘基(SEQ ID NO4)分別表示了推測的成熟TNFR-6α和TNFR-6β多肽的氨基酸序列。
因此，本發(fā)明一方面提供了一種分離的核酸分子，此核酸分子包含或由具有選自以下各組核苷酸序列的多核苷酸所組成(a)編碼具有SEQ ID NOS2和4完整氨基酸序列，或如同在ATCC保藏號為97810和97809中所包含的cDNA克隆所編碼的完整氨基酸序列的TNFR多肽的核苷酸片段；(b)編碼具有SEQ ID NO2中31-300位氨基酸序列或SEQ ID NO4中31-170位氨基酸序列的成熟TNFR多肽，或如同在ATCC保藏號為97810和97809中所包含的cDNA克隆所編碼的多肽的核苷酸片段；(c)編碼具有SEQ IDNO2中31-283位氨基酸序列或SEQ ID NO4中31-166位氨基酸序列的TNFR多肽的可溶性胞外區(qū)的核苷酸序列，或如同在ATCC保藏號為97810和97809中所包含的cDNA克隆所編碼的多肽胞外區(qū)的核苷酸片段；(d)編碼具有SEQ ID NO2中31-283位氨基酸序列或SEQ ID NO4中31-166位氨基酸序列的TNFR多肽片段的核苷酸序列，或如同在ATCC保藏號為97810和97809中所包含的cDNA克隆所編碼的多肽片段，其中所述的多肽片段具有TNFR-6α和/或TNFR-6β功能活性；和(e)與上述(a)(b)(c)(d)或(e)中任何一種核苷酸序列互補的核苷酸序列。
本發(fā)明另外的實施方案包括含有或由與上述(a)(b)(c)(d)和(e)中任何一種核苷酸序列具有至少90％相同性，更優(yōu)選至少80％，85％，90％，92％或95％，96％，97，98％或99％相同性的多核苷酸，或在嚴格雜交條件下與上述(a)(b)(c)(d)或(e)中多核苷酸雜交的多核苷酸所組成的分離的核酸分子。能夠雜交的多核苷酸在嚴格雜交條件下不與具有僅由A殘基或僅由T殘基構(gòu)成的核苷酸序列的多核苷酸雜交。本發(fā)明的另外一個核酸實施方案涉及包含或由編碼具有上述(a)(b)(c)或(d)氨基酸序列的TNFR多肽表位攜帶部分氨基酸序列的多核苷酸所組成的分離的核酸分子。
本發(fā)明也涉及包括本發(fā)明分離的核酸分子在內(nèi)的重組載體、含有重組載體的宿主細胞以及生產(chǎn)這些載體和宿主細胞的方法和通過重組技術(shù)利用它們生產(chǎn)TNFR多肽或肽的方法。
本發(fā)明另外提供了包含選自下列各組的氨基酸序列的分離的TNFR多肽(a)具有SEQ ID NOS2或4中所示的完整氨基酸序列的或如同ATCC保藏號97810或97809中所含cDNA克隆所編碼的全長TNFR多肽的氨基酸序列；(b)具有SEQ ID NO2中31-300位氨基酸序列或SEQ ID NO4中31-170位氨基酸序列，或如同ATCC保藏號為97810和97809中所包含的cDNA克隆所編碼的成熟TNFR多肽的氨基酸序列；(c)具有SEQ ID NO2中31-283位氨基酸序列或SEQ ID NO4中31-166位氨基酸序列，或如同ATCC保藏號為97810和97809中所包含的cDNA克隆所編碼的TNFR多肽的可溶性胞外區(qū)的氨基酸序列；或(d)具有SEQ ID NO2中31-283位氨基酸序列或SEQ ID NO4中31-166位氨基酸序列，或如同ATCC保藏號為97810和97809中所包含的cDNA克隆所編碼的TNFR多肽片段的氨基酸序列，其中上述片段具有TNFR-6α和/或TNFR-6β功能活性。
本發(fā)明的多肽也包括與上述(a)(b)(c)或(d)中所述的多肽具有至少80％氨基酸序列相同性，更優(yōu)選至少85％相同性，90％，92％，95％，96％，97，98％或99％相同性的多肽，以及與上述(a)(b)(c)或(d)中所述的多肽具有至少90％氨基酸序列相似性，更優(yōu)選至少80％，85％，90％，92％或95％相似性的多肽。
本發(fā)明這一方面另外的一個實施方案涉及包含具有上述(a)(b)(c)或(d)中所述的氨基酸序列的TNFR.多肽攜帶表位部分氨基酸序列的肽或多肽。具有本發(fā)明TNFR多肽攜帶表位部分氨基酸序列的肽或多肽包括至少6或7，優(yōu)選至少9，更優(yōu)選至少30-50個氨基酸的這些多肽的一部分，當(dāng)然本發(fā)明也包括任何長度的攜帶表位的上述多肽，包括本發(fā)明多肽的完整氨基酸序列。
在另外一個實施方案中，本發(fā)明提供了一種能夠與具有上述a)(b)(c)或(d)中所述的氨基酸序列的TNFR多肽特異性結(jié)合的分離的抗體。本發(fā)明另外提供了分離能夠與具有文中所述的氨基酸序列的TNFR多肽特異性結(jié)合的抗體的方法。如下所述，這些抗體在診斷和治療中非常有用。
已知腫瘤壞死因子(TNF)家族配體屬于能夠引發(fā)許多種細胞應(yīng)答的最多效的細胞因子，其中包括細胞毒性、抗病毒活性以及一些基因的轉(zhuǎn)錄后調(diào)控。本發(fā)明也提供了含有TNFR多肽，優(yōu)選人TNFR多肽的藥物組合物，這些藥物組合物可施用于，例如治療傳染性疾病包括HIV感染、內(nèi)毒素休克、癌癥、自身免疫性疾病、移植宿主排斥、急性移植排斥、慢性移植排斥、神經(jīng)變性紊亂、脊髓發(fā)育不良癥狀、局部缺血性損傷(例如心臟局部缺血性損傷)、毒素誘導(dǎo)的肝臟疾病、膿毒性休克、惡病質(zhì)和厭食。本發(fā)明也提供了對需要TNFR多肽的個體進行治療的方法。
本發(fā)明另外提供了用于體外、離體或體內(nèi)向細胞或多細胞器官施與包含TNFR多核苷酸或TNFR多肽的組合物。在本發(fā)明此方面的幾個特別優(yōu)選的實施方案中，組合物包含TNFR多核苷酸以在宿主器官中表達TNFR多肽治療疾病。從這一點上來說，特別優(yōu)選的是在病人中表達以治療與TNFR多肽異常的內(nèi)源活性相關(guān)的機能異常。
另一方面，本發(fā)明提供了激動劑以及拮抗劑的篩選方法，此方法用于測定候選組合物對TNFR多肽與TNF家族配體結(jié)合的效應(yīng)。特別是，此方法涉及使TNF家族配體與TNFR多肽和侯選組合物結(jié)合，并且測定TNFR多肽與TNF家族配體的結(jié)合是否由于侯選化合物的存在而被增強或減弱。在此分析方法中，相對于標準結(jié)合而言，TNFR多肽結(jié)合的增強意味著侯選化合物是TNFR多肽結(jié)合活性的激動劑；與標準結(jié)合相比，TNFR多肽結(jié)合的減弱意味著此化合物是TNFR多肽結(jié)合活性的拮抗劑。
內(nèi)皮細胞、角質(zhì)細胞、正常前列腺以及前列腺腫瘤組織均表達TNFR-6α和TNFR-6β。對于大多數(shù)這些組織或細胞的異常來說，特別是免疫系統(tǒng)紊亂來說，與“標準的”TNFR基因表達水平，即不具有免疫系統(tǒng)紊亂的個體的健康組織的TNFR表達水平相比，從具有這樣的異常的個體中采集的某些組織(例如癌組織)或體液(例如精液、血漿、尿液、滑液或脊髓液)中可以檢測到TNFR基因表達水平的顯著升高或降低。因此，本發(fā)明提供了一種在診斷這種紊亂中有用的診斷方法，此方法涉及(a)分析個體細胞或體液中的TNFR基因表達水平；(b)將TNFR基因表達水平與標準的TNFR基因表達水平進行比較，因此與標準的表達水平相比，所分析的TNFR基因表達水平的升高或降低預(yù)示著免疫系統(tǒng)的紊亂。
本發(fā)明的另外一個方面涉及對需要增加體內(nèi)TNFR多肽活性水平的個體進行治療的方法，此方法包含向此個體施與一種含有治療學(xué)有效量的本發(fā)明的TNFR多肽或其激動劑的組合物。
本發(fā)明的另外一個方面涉及對需要降低體內(nèi)TNFR多肽活性水平的個體進行治療的方法，此方法包含向此個體施與一種含有治療學(xué)有效量的TNFR拮抗劑的組合物。本發(fā)明優(yōu)選使用的拮抗劑是TNFR特異性抗體。
附圖的簡要描述圖1顯示了TNFR-6α的核苷酸序列(SEQ ID NO1)和推測的氨基酸序列(SEQ ID NO2)。起始的30個氨基酸(下劃線)是推測的前導(dǎo)序列。
圖2顯示了TNFR-6β的核苷酸序列(SEQ ID NO3)和推測的氨基酸序列(SEQ ID NO4)。起始的30個氨基酸(下劃線)是推測的前導(dǎo)序列。
圖3顯示應(yīng)用DNAstar中的Megaline程序，利用Clustal方法將TNFR-6α(TNFR-6 alpha(SEQ ID NO2))和TNFR-6β(TNFR-6 beta(SEQ ID NO4))的氨基酸序列與其它TNF受體如TNFR1(SEQ IDNO5)、TNFR2(SEQ ID NO6)、NGFR(SEQ ID NO7)、LTbR(SEQ ID NO8)、FAS(SEQ ID NO9)、CD27(SEQ ID NO10)、CD30(SEQ ID NO11)、CD40(SEQ ID NO12)、4-1BB(SEQ IDNO13)、OX40(SEQ ID NO14)、VC22(SEQ ID NO15)和CRMB(SEQ ID NO16)的氨基酸序列進行序列比較的結(jié)果。
圖4和圖5分別顯示了對TNFR-6α和TNFR-6β的氨基酸序列單獨分析的結(jié)果。使用所述的計算機程序在缺省參數(shù)的情況下分別對SEQ ID NO2和SEQ ID NO4中氨基酸序列進行預(yù)測，顯示了α、β、轉(zhuǎn)角和卷曲區(qū)；疏水性；兩親性區(qū)；柔性區(qū)；抗原性指數(shù)和表面概率。在抗原性指數(shù)-Jameson-Wolf”圖中顯示了TNFR-6α和TNFR-6β的高抗原性區(qū)的位置，即獲得本發(fā)明攜帶表位的肽的區(qū)域。TNFR-6α的抗原性區(qū)包括從大約31位的丙氨酸到大約46位的蘇氨酸，從大約57位的苯丙氨酸到大約117位的蘇氨酸，從大約132位的半胱氨酸到大約175位的蘇氨酸，從大約185位的甘氨酸到大約194位的蘇氨酸，從大約205位的纈氨酸到大約217位的天冬氨酸，從大約239位的脯氨酸到大約264位的亮氨酸，從大約283位的丙氨酸到大約298位的脯氨酸(SEQ ID NO2)；TNFR-6β的抗原性區(qū)包括從大約31位的丙氨酸到大約46位的蘇氨酸，從大約57位的苯丙氨酸到大約80位的谷氨酰胺，從大約86位的谷氨酸到大約106位的組氨酸，從大約108位的蘇氨酸到大約119位的苯丙氨酸，從大約129位的組氨酸到大約138位的纈氨酸，從大約142位的甘氨酸到大約166位的脯氨酸(SEQID NO4)。通過Jameson-Wolf抗原性指數(shù)分析已經(jīng)測定出這些多肽片段含有TNFR-6α和TNFR-6β多肽的抗原性表位。
圖4和圖5中的數(shù)據(jù)也分別出現(xiàn)在表I和表II的表中。表中各欄分別標為“氨基酸殘基”，“位置”以及羅馬數(shù)字I-XIV。各欄標題是指出現(xiàn)在圖4(表I)和圖5(表II)中的氨基酸序列的下列特征“殘基”SEQ ID NO2(圖1)或SEQ ID NO4(圖2)中的氨基酸殘基；“位置”SEQ ID NO2(圖1)或SEQ ID NO4(圖2)中對應(yīng)的氨基酸殘基的位置；Iα，Garnier-Roboson區(qū)；IIα，Chou-Fasman區(qū)；IIIβ，Garnier-Roboson區(qū)；VIβ，Chou-Fasman區(qū)；V轉(zhuǎn)角，Garnier-Roboson區(qū)；VI轉(zhuǎn)角，Chou-Fasman區(qū)；VII螺旋，Garnier-Roboson區(qū)；VIII疏水性，Kyte-Doolittle區(qū)；IX疏水性，Hopp-Woods區(qū)；Xα，Eisenberg兩親性區(qū)；XIβ，Eisenberg兩親性區(qū)；XIIKarplus-Schulz柔性區(qū)；XIIIJameson-Wolf抗原性指數(shù)和XIVEimini區(qū)的表面概率。
圖6顯示了與SEQ ID NOS1和3相關(guān)的HELDIO6R(SEQ IDNO17)和HCEOW38R(SEQ ID NO18)的核苷酸序列。
圖7A-B顯示了TNFR-6α阻斷Fas配體介導(dǎo)的細胞死亡。用Fas配體和TNFR-6αFc受體組合處理Jurkat-T細胞16小時。為了測量處理后的存活細胞水平，將細胞與10％的ALOMAR藍染料孵育5小時后用分光光度計測量570-630納米波長下的光密度值。所有的樣品都設(shè)3個復(fù)孔。與Fas配體一樣，TNFR-6αFc似乎以一種劑量依賴的方式有效地阻斷Fas配體介導(dǎo)的Jurkat細胞的凋亡。
詳細描述本發(fā)明提供了分離的核酸分子，此核酸分子包含或由通過對克隆的cDNA進行測序而測定的，編碼具有分別在SEQ ID NOS2和4中所示的氨基酸序列的TNFR-6α或TNFR-6β多肽、統(tǒng)稱為“TNFR多肽”的多核苷酸所組成。圖1和圖2(SEQ ID NOS1和3)中所示的核苷酸序列是通過分別對HPHAE52和HTPCH84克隆測序而獲得的，HPHAE52和HTPCH84于1996年11月22日被保藏在位于美國弗吉尼亞州20110-2209，Manassas市Boulevard大學(xué)大道的美國典型培養(yǎng)物保藏中心，其保藏號分別為ATCC 97810和97809。所保藏的克隆被包含在pBluescripts SK(-)質(zhì)粒中(Stratagene，La Jolla，加州)。
本發(fā)明的TNFR-6α和TNFR-6β蛋白為在各自蛋白N末端142個氨基酸殘基上具有相同核苷酸序列和氨基酸序列的剪接變體。這些蛋白的氨基酸序列與人TNFR-2mRNA的翻譯產(chǎn)物(圖3)(SEQ IDNO6)具有大約23％的相似性并且共同享有多個半胱氨酸豐富的保守區(qū)。更為重要的是，這些蛋白在包括4個重復(fù)的半胱氨酸豐富基序并且具有顯著的亞單位間同源性的多肽序列上具有顯著的序列相同性。據(jù)認為TNFR-2專有性地通過TNF介導(dǎo)人T細胞的增殖(PCTWO/94/09137)。
核酸分子除非另做說明，所有通過對本文中DNA分子測序而測定的核苷酸序列都是應(yīng)用全自動DNA測序儀(如位于加州Foser市的應(yīng)用生物系統(tǒng)公司的373型)測定的，并且所有由本文中所測定的DNA分子編碼的多肽的氨基酸序列都是通過將上述測定的DNA序列進行翻譯而推測的。因此，對于任何通過自動測序方法測定的DNA序列來說，正如在本領(lǐng)域眾所周知的，文中所測定的核苷酸序列可能含有一些錯誤。通過自動測序技術(shù)所測定的核苷酸序列與所測DNA分子的實際核苷酸序列具有至少90％的相同性，更典型的具有至少大約95％到至少99.9％的相同性。實際序列可以更精確地應(yīng)用本領(lǐng)域眾所周知的其它技術(shù)包括人工測序的方法而測定。也如同本領(lǐng)域所熟知的，與實際的序列相比，在測定的核苷酸序列中的一個單點插入或缺失將會導(dǎo)致核苷酸序列翻譯中的讀碼框移動，以致于從這個插入點或缺失點開始由測定的核苷酸序列所編碼的推測的氨基酸序列與由所測DNA分子的實際序列編碼的氨基酸序列完全不同。
核酸分子或多核苷酸的“核苷酸序列”用于DNA分子或多核苷酸是指脫氧核糖核苷酸的序列；如用于RNA分子或多核苷酸，是指相應(yīng)的核糖核苷酸(A，G，C和U)的序列，其中在特定脫氧核糖核苷酸序列中的每一個胸腺嘧啶脫氧核糖核苷酸(T)都被核糖核苷酸尿嘧啶(U)替換。
利用本文中所提供的信息，例如在圖1和圖2(SEQ ID NOS1和3)中所示的核苷酸序列，可以通過使用標準的克隆和篩選程序例如那些使用mRNA作為起始材料克隆cDNA的程序獲得本發(fā)明編碼TNFR多肽的核酸分子。舉例說明本發(fā)明，在下列組織的cDNA文庫中鑒別出了TNFR-6α和TNFR-6β克隆(分別見圖1和圖2)內(nèi)皮細胞、角質(zhì)細胞、正常前列腺組織和前列腺腫瘤組織。
圖1和圖2(SEQ ID NOS1和3)的TNFRcDNAs的測定的核苷酸序列含有分別編碼300個和170個氨基酸殘基的蛋白質(zhì)的開放讀碼框，其起始密碼子分別在圖1和圖2(SEQ ID NOS1和3)中核苷酸序列的25-27位和73-75位核苷酸位置。
TNFR-6α和TNFR-6β基因的開放讀碼框與人TNFR-2mRNA的翻譯產(chǎn)物共享序列同源性，包括分別見SEQ ID NO.2的大約31-283位氨基酸殘基和SEQ ID NO.4的大約31-166位氨基酸殘基的可溶性胞外區(qū)。
本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)理解的是，由于存在上面所討論的測序錯誤的可能性，由保藏的cDNAs所編碼的包含大約300和大約170氨基酸的實際全長TNFR多肽可能會稍長或稍短一些。更普遍的是，實際的開放讀碼框可能位于圖1和圖2(SEQ ID NOS1和3)N末端第一個推測的甲硫氨酸的±20個氨基酸范圍內(nèi)的任何位置，更可能位于±10個氨基酸范圍內(nèi)的任何位置，此甲硫氨酸位于框內(nèi)，每個圖中分別顯示了翻譯后的序列。需要進一步了解的是，根據(jù)用于鑒定不同功能區(qū)的分析標準，TNFR多肽的細胞外和跨膜區(qū)的精確“位置”可能和上面推測的位置會稍有不同。例如，根據(jù)用于限定功能域和抗原性區(qū)的標準，在SEQ ID NO2和SEQ ID NO4中細胞外功能區(qū)或抗原性區(qū)的精確位置可能會略有變化(例如，此位置可能會移動1-20個氨基酸殘基，更可能是1-5個氨基酸殘基)。在任何情況下，正如下面將要進一步討論的，本發(fā)明另外提供了自全長多肽的N末端具有各種不同殘基缺失的多肽，包括本文所描述的自細胞外功能區(qū)N末端缺少一個或多個氨基酸的多肽，這些多肽組成了TNFR-6α和TNFR-6β蛋白細胞外功能區(qū)的可溶性形式。
正如在SEQ ID NOS2和4中所示，全長TNFR蛋白的氨基酸序列包括一段前導(dǎo)序列和一成熟蛋白。更為具體的是，本發(fā)明提供了編碼TNFR蛋白成熟形式的核酸分子。因此，根據(jù)信號假說，一旦生長中的蛋白鏈自粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)向外轉(zhuǎn)運，由哺乳動物分泌的蛋白就具有一段從全長多肽中切割下來以產(chǎn)生“成熟”形式分泌蛋白的信號或分泌性前導(dǎo)序列。大多數(shù)的哺乳動物細胞甚至昆蟲細胞同樣特異地切割分泌蛋白。但是，在一些情況下，對分泌蛋白的切割并不是完全統(tǒng)一的，可能會導(dǎo)致兩種或更多種成熟蛋白的產(chǎn)生。而且，人們早就知道分泌蛋白的切割特異性最終由此完整蛋白的一級結(jié)構(gòu)決定，即，這是多肽氨基酸序列的內(nèi)在特性。因此，本發(fā)明提供了一種編碼具有由ATCC保藏號為97810或97809中鑒定的cDNA克隆所編碼的氨基酸序列的成熟TNFR多肽的核苷酸序列?！熬哂腥鏏TCC保藏號為97810或97809中保藏的質(zhì)粒中所含有的cDNA克隆所編碼的氨基酸序列的成熟TNFR多肽”意指保藏載體中所含的克隆的人DNA序列的開放讀碼框在哺乳動物細胞中(例如下面所述的COS細胞)表達產(chǎn)生的蛋白成熟形式。
此外，已經(jīng)有方法用于推測是否一種蛋白具有分泌性前導(dǎo)序列，以及是否此蛋白的前導(dǎo)序列具有切割位點。例如.，McGeoch的方法(病毒研究，3271-286(1985))利用從N末端一段短的帶電荷的區(qū)域以及隨后的全長(未切割)蛋白的不帶電荷的區(qū)域中得到的信息。Von Heinje的方法(核酸研究，144683-4690(1986))利用從環(huán)繞在切割位點周圍的氨基酸殘基中得到的信息，典型的是從-13到+2殘基，其中+1表示成熟蛋白的氨基酸殘基。這些方法預(yù)測已知的哺乳動物分泌蛋白切割位點的準確性范圍在75-80％之間(vonHeinje，supra)。但是，對于一種給定的蛋白來說，這兩種方法并不總是產(chǎn)生相同的推測的切割位點。
在本發(fā)明中，使用“PSORT”計算機程序分析推導(dǎo)出全長TNFR多肽的氨基酸序列，此程序得自Kyoto大學(xué)化學(xué)研究所的Kenta Nakai博士，是一種根據(jù)氨基酸序列預(yù)測蛋白質(zhì)在細胞內(nèi)位置的專家系統(tǒng)。McGeoch和Von Heinje的方法被引入其中作為這種計算機定位預(yù)測的一部分。使用此程序?qū)NFR氨基酸序列的分析提供了以下結(jié)果TNFR-6α和TNFR-6β分別編碼具有SEQ ID NOS2和4中31-300位和31-170位殘基氨基酸序列的成熟多肽。
在某些優(yōu)選的實施方案中，TNFR-6α和TNFR-6β分別編碼具有SEQ ID NOS2和4中31-299位和31-169位殘基氨基酸序列的成熟多肽。
如上所示，本發(fā)明的核酸分子可以是RNA的形式，如mRNA，或是DNA的形式，包括例如通過克隆或合成技術(shù)產(chǎn)生的cDNA和基因組DNA。DNA可以是雙鏈或單鏈的。單鏈DNA或RNA可以是編碼鏈，也稱為意義鏈，或也可以是非編碼鏈，也稱為反義鏈。
“分離的”核酸分子是指從其原始環(huán)境中分離出的DNA或RNA核酸分子。例如，就本發(fā)明而言，包含在載體中的重組DNA分子即被認為是“分離的”核酸分子。另外的分離的DNA分子包括在異源宿主細胞中維持的重組DNA分子或溶液中純化的(部分或完全)的DNA分子。分離的RNA分子包括本發(fā)明的DNA分子的體內(nèi)或體外RNA轉(zhuǎn)錄本。但是，包含在克隆中的作為一混合克隆文庫成員(例如基因組或cDNA文庫)并且未從本文庫其它克隆中分離出的(例如，以含有此克隆但不包括文庫中其它成員的同源溶液形式)或從一種細胞或細胞裂解中分離出的染色體不是“分離的”核酸分子。正如本文中進一步討論的，根據(jù)本發(fā)明分離的核酸分子可以自然、重組或合成方式產(chǎn)生。
本發(fā)明分離的核酸分子包括含有在SEQ ID NOS1和3所示的核苷酸序列中分別在25-27位和73-75位具有起始密碼子的開放讀碼框的DNA分子。
本發(fā)明分離的核酸分子同時也包括含有分別在SEQ ID NOS2和4的31-300位和31-170位所示的推測的成熟TNFR多肽序列的DNA分子。
本發(fā)明分離的核酸分子同時也包括含有分別在SEQ ID NOS2和4的31-299位和31-169位所示的推測的成熟TNFR多肽序列的DNA分子。
此外，本發(fā)明分離的核酸分子包括含有序列與上述那些序列顯著不同，但由于遺傳密碼的簡并性仍然編碼TNFR蛋白的DNA分子。當(dāng)然，遺傳密碼和物種特異性密碼子偏性是本領(lǐng)域眾所周知的。因此，對于本領(lǐng)域熟練技術(shù)人員來說產(chǎn)生上述的簡并性變體很普遍，例如，為了在特定宿主中優(yōu)化密碼子的表達(例如，將人mRNA中的密碼子變?yōu)榧毦拗魅绱竽c桿菌偏愛的密碼子)。
另一方面，本發(fā)明提供了編碼具有保藏號為ATCC97810或97809保藏的質(zhì)粒中所含的cDNA克隆所編碼的氨基酸序列的TNFR多肽的分離的核酸分子。優(yōu)選的，此核酸分子將編碼由上述保藏的cDNA克隆所編碼的成熟的多肽。
本發(fā)明另外提供了具有圖1或圖2(SEQ ID NOS1和3)中所示核苷酸序列，或在上述保藏的克隆中所含的TNFR cDNA的核苷酸序列的核酸分子，或具有與上述序列之一互補的序列的核酸分子。這些分離的核酸分子，特別是DNA分子，是很有用的，例如，通過與基因組原位雜交用做基因圖譜的探針，以及在人體組織中檢測TNFR基因的表達，例如，通過核酸印跡分析。
本發(fā)明另外指向編碼文中描述的部分核苷酸序列的核酸分子以及指向文中所述的分離的核酸分子的片段。特別是，本發(fā)明提供了具有代表SEQ ID NOS1和3部分的核苷酸序列的多核苷酸，它們分別由SEQ ID NOS1和3的25-924位和73-582位組成。本發(fā)明也指向編碼缺少氨基端甲硫氨酸的TNFR多肽的多核苷酸，這樣的多核苷酸具有代表SEQ ID NOS1和3部分的核苷酸序列，它們分別由28-924位和76-582位組成。本發(fā)明也提供了這樣的多核苷酸編碼的多肽，這些多肽分別含有SEQ ID NOS2和4的2-300位和2-170位的氨基酸序列。
此外，本發(fā)明提供了如下具有與SEQ ID NOS1和3延伸部分的核苷酸序列相關(guān)的核苷酸序列的核酸分子HELDIO6R(SEQ IDNO17)和HCEOW38R(SEQ ID NO18)與SEQ ID NOS1和3都相關(guān)。優(yōu)選的是SEQ ID NOS1和3的而不是SEQ ID NO17或18的或SEQ ID NO17或18亞片段的多核苷酸片段。圖6中顯示了HELDIO6R和HCEOW38R的序列。
更普遍的是，具有保藏的cDNA的核苷酸序列或具有圖1或圖2(SEQ ID NOS1和3)中所示核苷酸序列的分離的核酸分子的一個片段是長度至少為15nt，優(yōu)選至少為20nt，更加優(yōu)選至少為30nt，甚至更優(yōu)選至少為40nt的片段。這些片段具有很多用途，包括但不局限于用做文中所討論的診斷探針和引物。當(dāng)然，本發(fā)明中更大一些的長度為50-300nt的與大多數(shù)但不是全部保藏的cDNAs的核苷酸序列或如圖1或圖2(SEQ ID NOS1和3)中所示核苷酸序列對應(yīng)的片段也是有用的。特別優(yōu)選的是由與SEQ ID NO1中所示的連續(xù)的500個核苷酸具有至少80％，85％，90％，92％或95％相同性的至少500個核苷酸所組成的片段。長度為至少20nt的片段，例如，是意指包括20個或更多來自保藏的cDNA核苷酸序列或來自圖1或圖2(SEQ ID NOS1和3)中所示核苷酸序列的連續(xù)的堿基的片段。在此上下文中“大約”包括特定引用的大小以及在一端或兩端稍大或稍小幾(5，4，3，2或1)個核苷酸的大小。本發(fā)明優(yōu)選的核酸片段包括編碼如在圖4和圖5中鑒定的并在下文中詳細描述的TNFR多肽的攜帶表位部分的核酸分子。
本發(fā)明TNFR-6α核酸片段的代表性例子包括例如包含或由SEQID NO1的從大約第一位核苷酸到大約第25位核苷酸，從大約第26位核苷酸到大約第75位核苷酸，從大約第76位核苷酸到大約第114位核苷酸，從大約第115位核苷酸到大約第162位核苷酸，從大約第163位核苷酸到大約第216位核苷酸，從大約第217位核苷酸到大約第267位核苷酸，從大約第268位核苷酸到大約第318位核苷酸，從大約第319位核苷酸到大約第369位核苷酸，從大約第370位核苷酸到大約第420位核苷酸，從大約第421位核苷酸到大約第471位核苷酸，從大約第472位核苷酸到大約第522位核苷酸，從大約第523位核苷酸到大約第573位核苷酸，從大約第574位核苷酸到大約第625位核苷酸，從大約第626位核苷酸到大約第675位核苷酸，從大約第676位核苷酸到大約第714位核苷酸，從大約第715位核苷酸到大約第765位核苷酸，從大約第766位核苷酸到大約第816位核苷酸，從大約第817位核苷酸到大約第867位核苷酸，從大約第868位核苷酸到大約第924位核苷酸，從大約第925位核苷酸到大約第975位核苷酸序列組成的片段或其互補鏈，或保藏號為ATCC 97810所保藏的質(zhì)粒中含有的cDNA組成。在此上下文中“大約”包括特定引用的范圍以及在一端或兩端稍大或稍小幾(5，4，3，2或1)個核苷酸的那些范圍。
在一些特別的實施方案中，本發(fā)明的核酸片段包含或由編碼SEQID NO2的第100至150位氨基酸殘基，第150至200位氨基酸殘基，第200至300位氨基酸殘基，第220至300位氨基酸殘基，第240至300位氨基酸殘基，第250至300位氨基酸殘基，第260至300位氨基酸殘基和/或第280至300位氨基酸殘基的多核苷酸序列，其互補鏈組成。能夠與這些核苷酸序列雜交的核苷酸序列也包含在本發(fā)明的范圍之內(nèi)。
本發(fā)明TNFR-6β核酸片段的代表性例子包括例如包含或由SEQID NO3的從大約第1位核苷酸到大約第36位核苷酸，從大約第37位核苷酸到大約第72位核苷酸，從大約第73位核苷酸到大約第123位核苷酸，從大約第124位核苷酸到大約第175位核苷酸，從大約第176位核苷酸到大約第216位核苷酸，從大約第217位核苷酸到大約第267位核苷酸，從大約第268位核苷酸到大約第318位核苷酸，從大約第319位核苷酸到大約第369位核苷酸，從大約第370位核苷酸到大約第420位核苷酸，從大約第421*位核苷酸到大約第471位核苷酸，從大約第472位核苷酸到大約第522位核苷酸，從大約第523位核苷酸到大約第582位核苷酸，從大約第583位核苷酸到大約第622位核苷酸，從大約第623位核苷酸到大約第682位核苷酸，從大約第683位核苷酸到大約第750位核苷酸，從大約第751位核苷酸到大約第800位核苷酸，從大約第801位核苷酸到大約第850位核苷酸，從大約第851位核苷酸到大約第900位核苷酸，從大約第901位核苷酸到大約第950位核苷酸，從大約第951位核苷酸到大約第1000位核苷酸，從大約第1001位核苷酸到大約第1050位核苷酸，從大約第1051位核苷酸到大約第1100位核苷酸，從大約第1101位核苷酸到大約第1150位核苷酸，從大約第1151位核苷酸到大約第1200位核苷酸，從大約第1201位核苷酸到大約第1250位核苷酸，從大約第1251位核苷酸到大約第1300位核苷酸，從大約第1301位核苷酸到大約第1350位核苷酸，從大約第1351位核苷酸到大約第1400位核苷酸，從大約第1401位核苷酸到大約第1450位核苷酸，從大約第1451位核苷酸到大約第1500位核苷酸，從大約第1501位核苷酸到大約第1550位核苷酸，從大約第1551位核苷酸到大約第1600位核苷酸，從大約第1601位核苷酸到大約第1667位核苷酸序列組成的片段或其互補鏈，或保藏號為ATCC 97809所保藏的質(zhì)粒中含有的cDNA組成。在此上下文中“大約”包括特定引用的范圍以及在一端或兩端稍大或稍小幾(5，4，3，2或1)個核苷酸的那些范圍。
在一些特別的實施方案中，本發(fā)明的核酸片段包含或由編碼SEQID NO4的第50至100位氨基酸殘基，第100至170位氨基酸殘基，第110至170位氨基酸殘基，第130至170位氨基酸殘基，第140至170位氨基酸殘基，第150至170位氨基酸殘基和/或第160至170位氨基酸殘基的多核苷酸序列，或其互補鏈組成。能夠與這些核苷酸序列雜交的核苷酸序列也包含在本發(fā)明的范圍之內(nèi)。
優(yōu)選的，本發(fā)明的多核苷酸片段編碼一種顯示TNFR-6α和/或TNFR-6β功能活性的多肽。顯示“功能活性”的多肽意指一種多肽能夠顯示一種或多種已知的與完整的(全長)或成熟的TNFR-6α和/或TNFR-6β多肽有關(guān)的功能活性。這些功能活性包括但不局限于生物學(xué)活性(例如抑制或降低由FasL介導(dǎo)的凋亡，抑制或降低由AIM-II介導(dǎo)的凋亡)、抗原性(與抗TNFR-6α抗體和/或抗TNFR-6β抗體結(jié)合(或與TNFR-6α和/或TNFR-6β多肽競爭結(jié)合)的能力)、與本發(fā)明的TNFR-6α和/或TNFR-6β形成聚合物的能力、與TNFR-6α和/或TNFR-6β的受體或配體結(jié)合的能力(例如，F(xiàn)as配體和/或AIM-II(出版于1997年9月25日的國際申請公開號WO97/34911)。
可以通過各種不同的方法分析TNFR-6α和/或TNFR-6β多肽和片段、衍生變體和其類似物的功能活性。
例如，在一個分析與抗TNFR-6α抗體和/或抗TNFR-6β抗體結(jié)合或與完整的(全長)或成熟的TNFR-6α和/或TNFR-6β多肽競爭結(jié)合的能力的實施方案中，可以使用各種不同的本領(lǐng)域眾所周知的免疫分析方法，包括但不局限于使用放射免疫分析技術(shù)、ELISA(酶聯(lián)免疫吸附分析技術(shù))、“夾心法”免疫分析、免疫放射性測量分析、凝膠擴散沉淀反應(yīng)、免疫擴散分析、原位免疫分析(使用膠體金、酶或放射性同位素標記)、蛋白印跡、沉淀反應(yīng)、凝集分析(例如凝膠凝集分析、血凝分析)、補體結(jié)合分析、免疫熒光分析、蛋白質(zhì)A分析和免疫電泳分析等技術(shù)的競爭性以及非競爭性分析方法。在一個實施方案中，抗體結(jié)合是通過檢測一抗上的標記而檢測的。在另外一個實施方案中，一抗是通過檢測與一抗結(jié)合的二抗或試劑而測定的。本領(lǐng)域中有許多已知的方法用于檢測免疫分析中的結(jié)合，并且它們都在本發(fā)明的范圍之內(nèi)。
在另外一個實施方案中，其中對TNF配體進行了鑒定(例如Fas配體和/或AIM-II(出版于1997年9月25日的國際申請公開號WO97/34911))，或者評價了本發(fā)明的多肽片段、變體或衍生物形成聚合物的能力，也可分析結(jié)合，例如利用本領(lǐng)域眾所周知的方法，例如濃縮以及非濃縮凝膠層析技術(shù)。見Phizicky，E等，微生物學(xué)評論5994-123(1995)。在另外一個實施方案中，可以分析TNFR-6α和/或TNFR-6β與其底物結(jié)合的生物學(xué)相關(guān)性(信號傳導(dǎo))。
此外，文中所描述的方法(例如見實施例7-9)和其它本領(lǐng)域眾所周知的方法可被常規(guī)用于或修改后用于檢測TNFR-6α和/或TNFR-6β多肽和片段、衍生變體及其類似物引發(fā)TNFR-6α和/或TNFR-6β相關(guān)的生物學(xué)活性(例如體外或體內(nèi)抑制或降低FasL介導(dǎo)的凋亡，體外或體內(nèi)抑制或降低AIM-II介導(dǎo)的凋亡)的能力。
例如，可以使用表達Fas的T細胞系如Jurkat來分析本發(fā)明TNFR多肽降低或阻斷FasL介導(dǎo)的凋亡的能力。在此分析中，用可溶性FasL處理的Jurkat細胞經(jīng)歷凋亡。與在不加TNFR多肽和/或TNFR激動劑的情況下相同濃度的FasL與相同濃度的Fas表達細胞相互作用觀測到的結(jié)果相比，在加入FasL之前用TNFR多肽和/或TNFR激動劑預(yù)處理細胞可以保護細胞免受凋亡并且導(dǎo)致凋亡水平降低。另外將FasL蛋白與TNFR多肽和/或TNFR激動劑混合也會阻斷FasL與Jurkat細胞結(jié)合的能力以及介導(dǎo)凋亡的能力(例如，見實施例9)。
相反地，本發(fā)明的TNFR拮抗劑阻斷TNFR介導(dǎo)的對FasL介導(dǎo)的凋亡的抑制。因此，本發(fā)明的TNFR拮抗劑可以通過例如組合成熟的TNFR(已知可FasL)、待測的TNFR拮抗劑以及可溶性FasL，然后將此組合物與Fas表達細胞系相互作用而分析。TNFR拮抗劑降低或阻斷TNFR介導(dǎo)的對FasL介導(dǎo)的凋亡的抑制。因此，當(dāng)與在無TNFR拮抗劑存在的情況下將相同濃度的Fas表達細胞與相同濃度的成熟TNFR和FasL相互作用相比，F(xiàn)as表達細胞與成熟的TNFR、TNFR拮抗劑和可溶性FasL相互作用表現(xiàn)出凋亡水平的升高。
凋亡可以通過使用例如可選擇性結(jié)合凋亡細胞的Annexin染色的增加而測定。在另一個實施例中，可以使用檢測活細胞數(shù)的ALOMAR藍染色測定由于凋亡而減少的細胞數(shù)目。
其它技術(shù)是本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的，并且在本發(fā)明的范圍之內(nèi)。
在另外一個實施方案中，本發(fā)明的多核苷酸編碼TNFR-6α和/或TNFR-6β的功能性特性。就這一點來說本發(fā)明的優(yōu)選的實施方案包括含有TNFR-6α和/或TNFR-6β多肽的α螺旋和α螺旋形成區(qū)(α區(qū)”)、β片層和β片層形成區(qū)(“β區(qū)”)、轉(zhuǎn)角和轉(zhuǎn)角形成區(qū)(“轉(zhuǎn)角區(qū)”)、卷曲和卷曲形成區(qū)(“卷曲區(qū)”)、親水區(qū)、疏水區(qū)、α兩親性區(qū)、β兩親性區(qū)、柔性區(qū)、表面形成區(qū)和高抗原性指數(shù)區(qū)的片段。
就這一點而言，圖4(表I)和圖5(表II)中列出了某些優(yōu)選區(qū)。分別在圖4和圖5中以及表I和表II中顯示的數(shù)據(jù)幾乎是相同結(jié)果的不同格式，這些結(jié)果是用DNA*STAR計算機程序在缺省參數(shù)的情況下對SEQ ID NO2和SEQ ID NO4的氨基酸序列進行分析而獲得的。
上面所提到的在圖4(表I)和圖5(表II)中列出的優(yōu)選區(qū)包括但不局限于前述的通過分析圖1和圖2中的氨基酸序列而鑒定出的各種類型的功能區(qū)。正如在圖4(表I)和圖5(表II)中列出的，這些優(yōu)選區(qū)包括Garnier-Roboson α區(qū)、β區(qū)、轉(zhuǎn)角區(qū)和卷曲區(qū)；Chou-Fasmanα區(qū)、β區(qū)和卷曲區(qū)；Kyte-Doolittle親水區(qū)；Eisenbergα和β兩親性區(qū)；Karplus-Sculz柔性區(qū)；Emini表面形成區(qū)和Jameson-Wolf高抗原性指數(shù)區(qū)。就這一點而言，高度優(yōu)選的多核苷酸是那些編碼含有TNFR-6α和/或TNFR-6β的組成幾種結(jié)構(gòu)性特征如上面列出的幾種(1，2，3或4)特征的功能區(qū)的多肽的多核苷酸。
此外，在表I和表II中VIII，IX，XIII和XIV欄中顯示的數(shù)據(jù)可被常規(guī)用于確定高可能的抗原性區(qū)域。高抗原性區(qū)是利用VIII，IX，XIII和/或XIV欄中的數(shù)據(jù)通過選擇代表多肽功能區(qū)的在抗原識別會導(dǎo)致起始免疫應(yīng)答過程的環(huán)境下易于暴露至多肽表面的值而確定的。
表I殘基 位置 I II III IV V VI VII VIII IX X XI XII XIII XIV甲硫氨酸 1. . B . . .0.06 0.09 * -0.10 0.60精氨酸2. . B . . . .0.10 -0.34 * 0.50 0.82丙氨酸3. . B . . . .0.28 -0.34 * 0.50 0.63亮氨酸4A . . . . . .0.32 -0.34 * 0.50 0.99谷氨酸5A . . . . . .-0.10 -0.53 * F 0.95 0.50甘氨酸6. . . . . T C0.20 0.16 * F 0.45 0.41脯氨酸7. . . . T T .-0.72 0.04 * F 0.65 0.66甘氨酸8. . . . T T .-0.94 0.04 F 0.65 0.32亮氨酸9A . . . . T .-0.80 0.73 -0.20 0.26絲氨酸10 A A -1.61 0.87 -0.60 0.09亮氨酸11 A B -2.12 1.13 -0.60 0.08亮氨酸12 A B -2.72 1.34 -0.60 0.07半胱氨酸 13 A B -2.97 1.34 -0.60 0.04亮氨酸14 A B -2.97 1.46 -0.60 0.05纈氨酸15 A B -2.88 1.46 -0.60 0.05亮氨酸16 A B -2.66 1.20 -0.60 0.15丙氨酸17 A B -2.66 1.13 -0.60 0.18亮氨酸18 A B -2.80 1.13 -0.60 0.20脯氨酸19 A A -2.20 1.17 -0.60 0.20丙氨酸20 A B -2.20 0.91 -0.60 0.31亮氨酸21 A B -1.60 1.06* -0.60 0.28亮氨酸22 A B -1.60 0.80 -0.60 0.28脯氨酸23 A B -1.64 0.87* -0.60 0.28纈氨酸24 B -1.32 1.01* -0.40 0.25脯氨酸25 B -1.08 0.33* -0.10 0.60丙氨酸26 B B-1.12 0.07 -0.30 0.38纈氨酸27 B B-0.90 0.29* * -0.30 0.38精氨酸28 B B-0.69 0.14* * -0.30 0.25甘氨酸29 B B-0.14 -0.29 * * 0.30 0.43纈氨酸30 B B-0.14 -0.30 * * 0.30 0.83丙氨酸31 B B0.13 -0.51 * * 0.60 0.66谷氨酸32 B 0.74 -0.03 * * F 0.65 0.96蘇氨酸33 B T 0.42 0.30* * F 0.40 2.02脯氨酸34 T T 0.48 0.09* * F 0.80 3.10蘇氨酸35 T T 1.44 0.50* F 0.50 1.88酪氨酸36 T C2.03 0.50* 0.15 2.55脯氨酸37 T 1.44 0.01* 0.45 2.76色氨酸38 A C1.76 0.09* 0.05 1.93精氨酸39 A B1.66 -0.40 * F 0.60 2.13天冬氨酸 40 A A 1.62 -0.67 * F 0.90 1.99丙氨酸41 A C1.87 -0.67 * F 1.10 1.87谷氨酸42 A A 2.19 -1.59 * * F 0.90 1.66蘇氨酸43 A A 1.67 -1.59 * F 0.90 1.94甘氨酸44 A T0.70 -0.90 * F 1.30 1.59谷氨酸45 A A 0.03 -0.76 * * F 0.75 0.86精氨酸46 A A 0.03 -0.19 * F 0.45 0.25亮氨酸47 A A 0.03 -0.17 * 0.30 0.26纈氨酸48 A B -0.32 -0.20 0.30 0.26半胱氨酸 49 A B -0.19 0.37 -0.30 0.07丙氨酸50 A B -0.40 0.80 -0.60 0.13谷氨酰胺 51 A B -0.86 0.54 -0.60 0.28半胱氨酸 52 A B -0.36 0.33 -0.30 0.51脯氨酸53TC -0.20 0.24 F 0.45 0.73脯氨酸54 T T-0.39 0.53 F 0.35 0.36甘氨酸55 T T0.20 0.77 F 0.35 0.50蘇氨酸56 T 0.31 0.60 F-0.05 0.56苯丙氨酸 57B B 0.77 0.17 * F-0.15 0.71纈氨酸58B B 0.31 0.17 *0.19 1.12谷氨酰胺 59B B 0.63 0.31 * F0.53 0.41精氨酸60B T 1.09 -0.17 * F1.87 0.94脯氨酸61B T T 1.40 -0.96 * F2.66 2.47半胱氨酸 62 T T 1.80 -1.60 * F3.40 2.38精氨酸63 T T 2.44 -1.61 * F3.06 1.63精氨酸64 T 2.13 -1.19 * F2.77 1.63天冬氨酸 65 T 1.71 -1.13 * F2.68 4.39絲氨酸66 T T 1.26 -1.21 F2.79 3.24脯氨酸67 T T 1.58 -0.64 F2.55 0.89蘇氨酸68 T T 1.26 -0.21 F2.50 0.52蘇氨酸69 T T 0.48 0.21 F1.65 0.61半胱氨酸 70 T 0.27 0.40 F1.14 0.21甘氨酸71 T T 0.36 0.40 * * F1.33 0.22脯氨酸72 T T 0.68 0.34 * F1.62 0.24半胱氨酸 73 T C0.96 -0.14 * F2.01 0.88脯氨酸74 T C1.02 -0.21 * F2.40 1.21脯氨酸75 T T 1.38 0.11 * * F1.76 1.23精氨酸76 T T 1.72 0.17 * * F1.52 3.30組氨酸77B T 1.23 0.00 * * F0.88 3.70酪氨酸78B T 1.61 0.36 * *0.49 2.07蘇氨酸79B 1.82 0.84 *-0.25 1.11谷氨酰胺 80B 1.79 1.24 * *-0.25 1.31苯丙氨酸 81 T 0.87 1.50 * *0.15 1.31色氨酸82 T 0.90 1.43 *0.00 0.75天冬酰胺 83A T 1.26 0.54 *-0.20 0.75酪氨酸84A T 0.90 0.54 * *-0.05 1.70亮氨酸85A T 1.01 0.33 * *0.37 0.87谷氨酸86A T 1.47 -0.59 * *1.71 1.05精氨酸87A T 1.09 -0.23 *1.69 1.05半胱氨酸 88 T T 1.09 -0.41 *2.22 0.69精氨酸89 T T 0.48 -0.70 *2.80 0.64酪氨酸90 T T 0.48 -0.06 *2.22 0.24半胱氨酸 91 T -0.19 0.63 *1.04 0.37天冬酰胺 92B B -0.64 0.63 *-0.04 0.10纈氨酸93B B 0.02 1.06 *-0.32 0.06亮氨酸94B B 0.02 0.30-0.30 0.21半胱氨酸 95B T 0.27 -0.27 0.70 0.25甘氨酸96 T C 0.93 -0.67 F1.35 0.59谷氨酸97A T 0.93 -1.31 F1.30 1.24精氨酸98A T 1.20 -2.00 * F1.30 4.00谷氨酸99A A 2.12 -2.07 * F0.90 4.08谷氨酸100 A A 2.20 -2.50 * F0.90 4.61谷氨酸101 A A 1.88 -2.00 * F0.90 2.38丙氨酸102 A A 1.84 -1.43 F0.75 0.74精氨酸103 A A 1.14 -0.93 0.60 0.58丙氨酸104 A A 0.83 -0.43 *0.30 0.34半胱氨酸 105 A A 0.80 0.06 *-0.30 0.48組氨酸106 A A 0.80 0.06 * *-0.30 0.34丙氨酸107 A A 1.50 0.46 * *-0.60 0.53蘇氨酸108 A A 0.80 -0.04 * *0.45 1.95組氨酸109 A T 0.72 -0.11 *1.13 1.45天冬酰胺 110 A T 1.50 -0.04 *1.26 0.77精氨酸111 A T 0.87 -0.54 *1.99 1.04丙氨酸112 A T 1.57 -0.46 *1.82 0.41半胱氨酸 113 T T 1.57 -0.96 * 2.80 0.50精氨酸114B T 1.26 -0.87 ** 2.12 0.37半胱氨酸 115 T T 0.56 -0.44 ** 1.94 0.36精氨酸116 T T -0.26 -0.16 * 1.66 0.58蘇氨酸117A B T-0.26 0.06* F0.53 0.26甘氨酸118A B T0.38 0.56* -0.20 0.49苯丙氨酸 119A B B -0.32 0.49* -0.60 0.34苯丙氨酸 120A B B 0.00 0.99* -0.60 0.24丙氨酸121 A A B -0.81 0.93* -0.60 0.24組氨酸122 A A -1.17 1.29-0.60 0.24丙氨酸123 A A -1.63 1.07* -0.60 0.15甘氨酸124 A A -0.93 0.97* -0.60 0.12苯丙氨酸 125 A A -0.27 0.47-0.60 0.15半胱氨酸 126 A A -0.27 0.47* -0.60 0.20亮氨酸127 A A -0.53 0.47-0.60 0.21谷氨酸128 A A T -0.61 0.43-0.60 0.32組氨酸129 T T -0.48 0.210.50 0.32丙氨酸130 T T 0.01 0.070.63 0.61絲氨酸131 T T 0.33 -0.19 1.36 0.54半胱氨酸 132T C 0.56 0.240.69 0.39脯氨酸133T C 0.21 0.24 F0.97 0.39脯氨酸134 T T -0.61 0.17 F1.30 0.29甘氨酸135 T T -0.91 0.43 F0.87 0.40丙氨酸136BT-1.20 0.540.19 0.18甘氨酸137B B -0.74 0.61-0.34 0.12纈氨酸138B B -0.88 0.61-0.47 0.19異亮氨酸 139B B -0.98 0.61-0.60 0.18丙氨酸140B B -0.84 0.60-0.60 0.27脯氨酸141B -0.56 0.60 F-0.25 0.55甘氨酸142 T-0.21 0.34 F0.88 1.06蘇氨酸143T C 0.64 0.06 F1.16 1.82脯氨酸144T C 1.22 -0.04 F2.04 1.89絲氨酸145 T T 1.81 0.01 F1.92 2.76谷氨酰胺 146 T T 1.36 -0.01 F2.80 3.31天冬酰胺 147 T T 1.70 0.07 F1.92 1.15蘇氨酸148 T T 1.80 0.04 F1.64 1.48谷氨酰胺 149 T T 1.34 0.09 F1.36 1.32半胱氨酸 150 BT 1.43 0.26 F0.53 0.44谷氨酰胺 151 B 1.22 0.29 F0.05 0.47脯氨酸152 B 0.88 0.23* F0.05 0.42半胱氨酸 153 B 0.88 0.26* F0.05 0.78脯氨酸154 BT 0.18 0.17* F0.25 0.65脯氨酸155 T T 0.54 0.56* F0.35 0.36甘氨酸156 T T -0.04 0.51* F0.35 0.91蘇氨酸157 BT -0.13 0.44 F-0.05 0.59苯丙氨酸 158 B 0.23 0.40 F-0.25 0.51絲氨酸159 B 0.14 0.36 F0.39 0.70丙氨酸160 B 0.06 0.31 F0.73 0.65絲氨酸161T C 0.10 0.21 F1.72 1.00絲氨酸162T C 0.41 -0.19 F2.56 1.00絲氨酸163 T T 1.11 -0.57 F3.40 1.72絲氨酸164 T T 0.74 -0.67 F3.06 2.22絲氨酸165 T1.33 -0.49 F2.07 0.89谷氨酸166 T1.42 -0.47 F1.88 1.15谷氨酰胺 167 T1.69 -0.43 F1.82 1.32半胱氨酸 168 T2.10 -0.31 F1.76 1.34谷氨酰胺 169 B 2.40 -0.70 F1.94 1.52脯氨酸170T2.03 -0.30F2.32 1.41組氨酸171T T 1.72 -0.13F2.80 1.41精氨酸172T T 1.13 -0.21F2.52 1.18天冬酰胺 173T T 0.99 -0.11 * 1.94 0.77半胱氨酸 174 B T 0.64 0.14 0.66 0.47蘇氨酸175 A B 0.04 0.07 -0.02 0.24丙氨酸176 A B -0.51 0.76 * -0.60 0.12亮氨酸177 A B -1.43 0.86 * -0.60 0.23甘氨酸178 A B -1.43 0.97 * -0.60 0.13亮氨酸179 A B -1.62 0.89 * -0.60 0.21丙氨酸180 A B -1.52 1.03 * -0.60 0.19亮氨酸181 A B -1.28 0.77 * -0.60 0.29天冬酰胺 182 A B -0.77 0.77 * -0.60 0.35纈氨酸183 B T -0.72 0.47 * F-0.05 0.46脯氨酸184 T C -0.21 0.36 * F0.73 0.75甘氨酸185T T 0.34 0.06 * F1.21 0.63絲氨酸186T T 1.16 0.16 * F1.64 1.15絲氨酸187 T C 0.84 -0.49F2.32 1.24絲氨酸188T T 0.89 -0.43F2.80 1.81組氨酸189 B T 0.43 -0.17F2.12 1.11天冬氨酸 190T T 0.47 0.01 F1.49 0.45蘇氨酸191 B 0.47 0.11 F0.61 0.48亮氨酸192 B 0.10 0.11 0.18 0.47半胱氨酸 193 B T 0.09 0.19 0.10 0.15蘇氨酸194 B T -0.22 0.67 -0.20 0.15絲氨酸195 B T -0.92 0.61 * F-0.05 0.18半胱氨酸 196 B T -0.82 0.71 F-0.05 0.29蘇氨酸197T-0.82 0.57 F0.15 0.31甘氨酸198T-0.46 0.77 0.00 0.19苯丙氨酸 199 B -0.46 0.77 * -0.40 0.48脯氨酸200 B -0.04 0.69 * * -0.40 0.48亮氨酸201 B -0.23 0.20 * * -0.10 0.96絲氨酸202 B -0.13 0.41 * * F0.02 0.82蘇氨酸203 B -0.13 0.06 * F0.59 0.82精氨酸204 C -0.02 0.06 * F1.06 0.99纈氨酸205T C 0.19 -0.13 * F2.13 0.74脯氨酸206T C 1.00 -0.51 * F2.70 0.89甘氨酸207T C 0.63 -1.00 * F2.43 0.79丙氨酸208 AT0.94 -0.43 * F1.66 0.57谷氨酸209 A A 0.94 -1.07 * F1.29 0.64谷氨酸210 A A 1.21 -1.50 * F1.17 1.26半胱氨酸 211 A A 0.57 -1.43 * F0.90 1.26谷氨酸212 A A 0.02 -1.29 * * F0.75 0.54精氨酸213 A A 0.61 -0.60 * * 0.60 0.22丙氨酸214 A A -0.09 -0.60 * * 0.60 0.68纈氨酸215 A A -0.94 -0.39 * * 0.30 0.34異亮氨酸 216 A A -0.87 0.26 * * -0.30 0.13天冬氨酸 217 A A -1.57 0.76 * * -0.60 0.13苯氨酸218 A A -1.68 1.04 * * -0.60 0.15纈氨酸219 A A -1.09 0.80 -0.60 0.37丙氨酸220 A A -1.12 0.11 -0.30 0.37苯丙氨酸 221 A A -0.53 0.80 * -0.60 0.30谷氨酰胺 222 A A -1.42 0.40 * -0.60 0.54天冬氨酸 223 A A -0.68 0.44 F-0.45 0.38異亮氨酸 224 A A 0.29 -0.06F0.45 0.87絲氨酸225 A A 0.07 -0.84F0.75 0.99異亮氨酸 226 A A 0.77 -0.56 * F0.75 0.49賴氨酸227 A A0.88 -0.16 ** F0.60 1.20精氨酸228 A A0.07 -0.84 ** F0.90 1.76亮氨酸229 A A0.14 -0.54 *F0.90 2.07谷氨酰胺 230 A A0.44 -0.54 *F0.75 0.85精氨酸231 A B 0.74 -0.14 * 0.30 0.76亮氨酸232 A A-0.11 0.36 * -0.30 0.93亮氨酸233 A B -0.22 0.36 **-0.30 0.44谷氨酰胺 234 A B 0.00 -0.04 * 0.30 0.39丙氨酸235 A B -0.21 0.46 * -0.60 0.48亮氨酸236 A B -0.32 0.20 **-0.30 0.89谷氨酸237 A B 0.14 -0.490.30 0.89丙氨酸238B T 0.67 -0.46 F0.85 0.88脯氨酸239 T T 0.32 -0.04 F1.40 1.12谷氨酸240 T T 0.70 -0.30 F1.25 0.64甘氨酸241 T T 1.20 0.13F0.65 0.98色氨酸242 T 0.99 0.11 *F0.45 0.91甘氨酸243 C1.69 0.11 ** F0.59 0.81脯氨酸244 C1.31 0.11 ** F1.08 1.61蘇氨酸245 T C0.97 0.19 *F1.62 1.55脯氨酸246 T C1.42 -0.30 *F2.56 1.55精氨酸247 T T 1.12 -0.73 *F3.40 1.96丙氨酸248 T C0.88 -0.66 *F2.87 1.37甘氨酸249 A A0.28 -0.64 ** F1.77 0.90精氨酸250 A A0.59 -0.39 **0.98 0.38丙氨酸251 A A-0.01 0.01 **0.04 0.65丙氨酸252 A A-0.08 0.20 **-0.30 0.54亮氨酸253 A A-0.30 -0.23 **0.30 0.55谷氨酰胺 254 A A0.16 0.46 * -0.60 0.45亮氨酸255 A A0.16 -0.04 *0.30 0.87賴氨酸256 A A0.86 -0.54 *0.75 2.07亮氨酸257 A A0.63 -1.23 * F0.90 2.34精氨酸258 A A1.13 -0.94 ** F0.90 2.34精氨酸259 A B 1.13 -1.14 ** F0.90 1.69精氨酸260 A B 1.13 -1.14 ** F0.90 3.55亮氨酸261 A B 0.28 -1.14 ** F0.90 1.49蘇氨酸262 A B 0.74 -0.46 ** F0.45 0.63谷氨酸263 A B 0.04 -0.03 **0.30 0.32亮氨酸264 A B -0.07 0.47 * -0.60 0.39亮氨酸265 A B -0.18 0.19*-0.30 0.47甘氨酸266 A A0.29 -0.300.30 0.45丙氨酸267 AT 0.01 0.13F0.25 0.54谷氨酰胺 268 AT -0.80 -0.06 F0.85 0.66天冬氨酸 269 AT -0.80 -0.06 F0.85 0.55甘氨酸270 AT -0.84 0.20 **0.10 0.45丙氨酸271 A A-0.39 0.34 **-0.30 0.19亮氨酸272 A B -0.61 -0.06 **0.30 0.23亮氨酸273 A B -1.42 0.63 **-0.60 0.19纈氨酸274 A A-1.42 0.89 **-0.60 0.15精氨酸275 A A-1.67 0.79 **-0.60 0.32亮氨酸276 A A-1.89 0.60 **-0.60 0.40亮氨酸277 A A-0.97 0.60 **-0.60 0.44谷氨酰胺 278 A A-1.01 -0.04 **0.30 0.44丙氨酸279 A A-0.74 0.60 **-0.60 0.40亮氨酸280 A A-0.74 0.41 **-0.60 0.49精氨酸281 A B -0.53 -0.27 * 0.30 0.55纈氨酸282 A B 0.07 -0.06 * 0.30 0.54丙氨酸283 A B -0.28 -0.13 * 0.72 1.01精氨酸284 A B-0.50 -0.39 * 0.84 0.51甲硫氨酸 285 B T 0.31 0.30*0.91 0.57脯氨酸286 T C 0.31 -0.34 * F2.13 0.97甘氨酸287 T C 0.87 -0.84 ** F2.70 0.97亮氨酸288 AT 0.60 -0.46 ** F2.08 1.32谷氨酸289 A 0.60 -0.43 ** F1.46 0.63精氨酸290 A 1.20 -0.86 ** F1.64 1.25絲氨酸291 A 1.52 -1.29 ** F1.37 2.62纈氨酸292 A 1.17 -1.97 ** F1.10 2.97精氨酸293 A 1.17 -1.19 ** F1.10 1.31谷氨酸294 A 0.96 -0.50 ** F0.65 0.81精氨酸295 A -0.01 -0.46 ** F0.80 1.68苯丙氨酸 296B 0.26 -0.46 *0.50 0.64亮氨酸297B 0.72 0.04*-0.10 0.50脯氨酸298 A 0.22 0.47*-0.40 0.33纈氨酸299 A -0.17 0.90 * -0.40 0.48組氨酸300 A -0.67 0.54 -0.40 0.75
表II殘基位置 I II III IV V VI VII VIII IX X XI XII XIII XIV甲硫氨 1B 0.06 0.09 * -0.10 0.60酸精氨酸 2B 0.10 -0.34 * 0.50 0.82丙氨酸 3B 0.28 -0.34 * 0.50 0.63亮氨酸 4B 0.32 -0.34 0.50 0.99谷氨酸 5B -0.10 -0.53 F0.95 0.50甘氨酸 6TC 0.20 0.16 * F0.45 0.41脯氨酸 7 T T -0.72 0.04 * F0.65 0.66甘氨酸 8 T T -0.94 0.04 F0.65 0.32亮氨酸 9B T -0.80 0.73 -0.20 0.26絲氨酸 10 A B -1.61 0.87 -0.60 0.09亮氨酸 11 A B -2.12 1.13 -0.60 0.08亮氨酸 12 A B -2.72 1.34 -0.60 0.07半胱氨 13 A B -2.97 1.34 -0.60 0.04亮氨酸 14 A B -2.97 1.46 -0.60 0.05纈氨酸 15 A B -2.88 1.46 -0.60 0.05亮氨酸 16 A B -2.66 1.20 -0.60 0.15丙氨酸 17 A B -2.66 1.13 -0.60 0.18亮氨酸 18 A B -2.80 1.13 -0.60 0.20脯氨酸 19 A B -2.20 1.17 -0.60 0.20丙氨酸 20 A B -2.20 0.91 -0.60 0.31亮氨酸 21 A B -1.60 1.06 *-0.60 0.28亮氨酸 22 A B -1.60 0.80 -0.60 0.28脯氨酸 23 A B -1.64 0.87 *-0.60 0.28纈氨酸 24 B -1.32 1.01 *-0.40 0.25脯氨酸 25 B -1.08 0.33 -0.10 0.60丙氨酸 26 B B-1.12 0.07 -0.30 0.38纈氨酸 27 B B-0.90 0.29 * *-0.30 0.38精氨酸 28 B B-0.69 0.14 * *-0.30 0.25甘氨酸 29 B B-0.14 -0.29 * *0.30 0.43纈氨酸 30 B B-0.14 -0.30 * *0.30 0.83丙氨酸 31 B B0.13 -0.51 * *0.60 0.66谷氨酸 32 B 0.74 -0.03 * * F0.65 0.96蘇氨酸 33 B T 0.42 0.30 * * F0.40 2.02脯氨酸 34T T 0.48 0.09 * * F0.80 3.10蘇氨酸 35T T 1.44 0.50 * F0.50 1.88酪氨酸 36 TC 2.03 0.50 * 0.15 2.55脯氨酸 37T 1.44 0.01 * 0.45 2.76色氨酸 38 AC 1.76 0.09 * 0.05 1.93精氨酸 39 A B 1.66 -0.40 * F0.60 2.13天冬氨 40 AC 1.62 -0.67 * F1.10 1.99丙氨酸 41 AC 1.87 -0.67 * * F1.10 1.87谷氨酸 42 AC 2.19 -1.59 * * F1.10 1.66蘇氨酸 43 AT 1.67 -1.59 * F1.30 1.94甘氨酸 44 AT 0.70 -0.90 * F1.30 1.59谷氨酸 45 AT 0.03 -0.76 * * F1.15 0.68精氨酸 46 AT 0.03 -0.19 * F0.85 0.25亮氨酸 47 A B 0.03 -0.17 * 0.30 0.26纈氨酸 48 A B -0.31 -0.20 0.30 0.26半胱氨 49 A B -0.17 0.37 -0.30 0.07酸內(nèi)氨酸 50 A B -0.40 0.80 -0.60 0.13谷氨酰 51A B -0.86 0.54 -0.60 0.28胺半胱氨 52A B -0.36 0.33 -0.30 0.51酸脯氨酸 53T C -0.20 0.24 F 0.45 0.73脯氨酸 54 T T -0.39 0.53 F 0.35 0.36甘氨酸 55 T T 0.20 0.77 *F 0.35 0.50蘇氨酸 56 BT 0.31 0.60 F -0.05 0.56苯丙氨 57 B B0.77 0.17 *F -0.15 0.71酸纈氨酸 58 B B0.31 0.17 * 0.19 1.12谷氨酰 59 B B0.63 0.31 *F 0.53 0.41胺精氨酸 60 BT 1.09 -0.17 *F 1.87 0.94脯氨酸 61 BT 1.40 -0.96 *F 2.66 2.47半胱氨 62 T T 1.80 -1.60 *F 3.40 2.38酸精氨酸 63 T T 2.44 -1.61 *F 3.06 1.63精氨酸 64 T 2.13 -1.19 *F 2.77 1.63天冬氨 65 T 1.71 -1.13 *F 2.68 4.39酸絲氨酸 66 T T 1.26 -1.21 F 2.79 3.24脯氨酸 67 T T 1.58 -0.64 F 2.55 0.89蘇氨酸 68 T T 1.26 -0.21 F 2.50 0.52蘇氨酸 69 T T 0.48 0.21 F 1.65 0.61半胱氨 70 T 0.27 0.40 F 1.14 0.21酸甘氨酸 71 T T 0.36 0.40 F 1.33 0.22脯氨酸 72 T T 0.68 0.34 F 1.62 0.24半胱氨 73T C 0.96 -0.14 * F 2.01 0.88酸脯氨酸 74T C 1.02 -0.21 * F 2.40 1.21脯氨酸 75 T T 1.38 0.11 * F 1.76 1.23精氨酸 76 T T 1.72 0.17 * F 1.52 3.30組氨酸 77 BT 1.23 0.00 * F 0.88 3.70酪氨酸 78 BT 1.61 0.36 * 0.49 2.07蘇氨酸 79 B 1.82 0.84 * -0.25 1.11谷氨酰 80 B 1.79 1.24 * -0.25 1.31胺苯丙氨 81 T 0.87 1.50 * 0.15 1.31酸色氨酸 82 T 0.90 1.43 * 0.00 0.75天冬酰 83AT 1.26 0.94 * -0.20 0.75胺酪氨酸 84AT 0.90 0.54 * -0.05 1.70亮氨酸 85AT 1.01 0.33 * 0.38 0.87谷氨酸 86AT 1.47 -0.59 * 1.71 1.05精氨酸 87AT 1.09 -0.23 1.69 1.05半胱氨88 T T 1.09 -0.41 2.22 0.69酸精氨酸 89 T T 0.48 -0.70 2.80 0.64酪氨酸 90 T T 0.48 -0.06 2.22 0.24半胱氨 91 T T -0.19 0.63 1.04 0.37酸天冬酰 92 B B-0.64 0.63 -0.04 0.10胺纈氨酸 93 B B0.02 1.06 -0.02 0.06亮氨酸 94 B B0.02 0.30 0.30 0.21半胱氨 95 B T 0.27 -0.27 1.60 0.25酸甘氨酸 96 T C 0.93 -0.67 F 2.55 0.59谷氨酸 97 T C 0.93 -1.31 F 3.00 1.24精氨酸 98A T 1.20 -2.00 F 2.50 4.00谷氨酸 99A A 2.12 -2.07 F 1.80 4.08谷氨酸 100 A A 2.20 -2.50 F 1.50 4.61谷氨酸 101 A A 1.88 -2.00 F 1.20 2.38丙氨酸 102 A A 1.84 -1.43 F 0.75 0.74精氨酸 103 A A 1.14 -0.93 0.60 0.58丙氨酸 104 A A 0.83 -0.43 0.30 0.34半胱氨 105 A A 0.80 0.06 -0.30 0.48酸組氨酸 106 A A 0.80 0.06 *-0.30 0.34丙氨酸 107 AT 1.50 0.46 *-0.20 0.53蘇氨酸 108 AT 0.80 -0.04 *0.85 1.95組氨酸 109 AT 0.72 -0.11 *1.13 1.45天冬酰 110 AT 1.50 -0.04 *1.26 0.77胺精氨酸 111 AT 0.87 -0.54 1.99 1.04丙氨酸 112 AT 1.57 -0.46 1.82 0.41半胱氨 113 T T 1.57 -0.96 *2.80 0.50酸精氨酸 114BT 1.26 -0.87 * 2.2 0.37半胱氨 115 T T 0.56 -0.44 * 1.94 0.36酸精氨酸 116 T T -0.26 -0.16 * 1.66 0.58蘇氨酸 117 A B T -0.26 0.06 * F 0.53 0.26甘氨酸 118 A B T 0.38 0.56 * -0.20 0.49苯丙氨 119 A B B -0.32 0.49 * -0.60 0.34酸苯丙氨 120A B B 0.00 0.99 * -0.60 0.24酸丙氨酸 121A B B -0.81 0.93 * -0.60 0.24組氨酸 122AC -1.17 1.29 * -0.40 0.24丙氨酸 123AC -1.63 1.07 * -0.40 0.15甘氨酸 124A T -0.93 0.97 * -0.20 0.12苯丙氨 125A T -0.27 0.47 -0.20 0.15酸半胱氨 126A T -0.27 0.47 * -0.20 0.20酸亮氨酸 127A B -0.53 0.47 -0.60 0.21谷氨酸 128A B T -0.61 0.43 -0.20 0.32組氨酸 129 T T -0.48 0.21 0.50 0.32丙氨酸 130 T T 0.01 0.07 0.63 0.61絲氨酸 131 T T 0.33 -0.19 1.36 0.54半胱氨 132 T C0.56 0.24 0.69 0.39酸脯氨酸 133 T C0.21 0.24 F0.97 0.39脯氨酸 134 T T -0.61 0.17 F1.30 0.29甘氨酸 135 T T -0.91 0.43 F0.87 0.40丙氨酸 136 B T -1.20 0.54 0.19 0.18甘氨酸 137 B B -0.74 0.61 -0.34 0.12纈氨酸 138 B B -0.88 0.61 -0.47 0.19異亮氨 139 B B -0.67 0.61 -0.60 0.18酸丙氨酸 140 B T -0.62 0.11 0.10 0.32脯氨酸 141 B T -0.32 0.07 F 0.25 0.58甘氨酸142 T C-0.57 0.34**F0.45 0.86谷氨酸143 T C0.40 0.16**F0.45 0.86絲氨酸144B0.94 -0.34 **F0.80 1.10氨酸 145 T 1.19 -0.34 **F1.20 1.10丙氨酸146BT 0.81 -0.34 **F0.85 0.63精氨酸147 T T 0.94 0.16**F0.65 0.47甘氨酸148 T T 1.06 0.20 *F0.65 0.69甘氨酸149 T C1.06 -0.71 F1.84 0.35丙氨酸150C1.00 -0.83 F1.83 0.92脯氨酸151C1.24 -0.40*F1.87 0.92精氨酸152 T T 1.24 -0.40 F2.61 0.92絲氨酸153 T T 1.70 -0.83 * F3.40 1.78甘氨酸154 T T 1.38 -1.33 **F3.06 2.26甘氨酸155 T T 1.62 -1.19 **F2.57 0.62精氨酸156 T 1.94 -0.76 **F2.26 0.46精氨酸157 T 1.49 -1.14 **F2.15 0.90半胱氨158B1.79 -1.14 **F1.64 0.90酸甘氨酸159 T T 1.28 -1.17 **F2.47 0.80精氨酸160BT 1.03 -0.53 **F2.30 0.30甘氨酸161BT 0.58 -0.03 **F1.77 0.57谷氨酰162BT 0.26 -0.17 **F1.54 0.57胺纈氨酸163B0.62 -0.17*F1.11 0.45丙氨酸164B0.16 0.21 *F0.28 0.61甘氨酸165BT -0.54 0.47 *F-0.05 0.29脯氨酸166BT -0.41 0.57 F-0.05 0.40絲氨酸167 T C-0.80 0.36 F0.45 0.61亮氨酸168BT -0.33 0.29 0.10 0.78丙氨酸169B-0.13 0.29 -0.10 0.65脯氨酸170B-0.18 0.29 -0.10 0.62
本發(fā)明另外的優(yōu)選的核酸片段包括或由編碼TNFR-6α和/或TNFR-6β一個或多個表位攜帶部分的核酸分子組成。特別是，本發(fā)明的這些核酸片段包括編碼下列多肽的核酸分子一段多肽包括或由SEQ ID NO2中從大約第57位苯丙氨酸到大約第117位蘇氨酸殘基，從大約第132位半胱氨酸到大約第175位蘇氨酸殘基，從大約第185位甘氨酸到大約第194位蘇氨酸殘基，從大約第205位纈氨酸到大約第217位天冬氨酸殘基，從大約第239位脯氨酸到大約第264位亮氨酸殘基和/或從大約第283位丙氨酸到大約第298位脯氨酸殘基。在另外的實施方案中，本發(fā)明的核酸片段包括或由編碼TNFR-6β一個或多個表位攜帶部分的在SEQ ID NO4中從大約第31位丙氨酸到大約第46位蘇氨酸殘基，從大約第57位苯丙氨酸到大約第80位谷氨酰胺殘基，從大約第86位谷氨酸到大約第106位組氨酸殘基，從大約第108位蘇氨酸到大約第119苯丙氨酸位殘基，從大約第129位組氨酸到大約第138位纈氨酸殘基和/或從大約第142位甘氨酸到大約第166位脯氨酸殘基的核酸分子組成。在此上下文中“大約”包括特定引用的范圍以及在一端或兩端稍大或稍小幾(5，4，3，2或1)個氨基酸的范圍。如上面圖4和圖5中所示，通過Jameson-Wolf抗原性指數(shù)分析已經(jīng)確定這些多肽片段分別攜帶有TNFR-6α和TNFR-6β多肽的抗原性表位。而且，使用上述的如在圖4和圖5中所示的Jameson-Wolf抗原性指數(shù)分析方法本領(lǐng)域熟練技術(shù)人員可以很容易地確定帶有TNFR-6α和/或TNFR-6β多肽的抗原性表位的多肽片段。下面詳細描述了用于確定TNFR-6α和/或TNFR-6β其它類似的表位攜帶部分的方法。
在特定的實施方案中，本發(fā)明的核酸在長度上小于100000kb，50000kb，10000kb，1000kb，500kb，400kb，300kb，250kb，200kb，175kb，150kb，125kb，100kb，75kb，50kb，40kb，30kb，25kb，20kb，15kb，10kb，7.5kb或5kb。
在另外的實施方案中，本發(fā)明的核酸包括TNFR編碼序列的至少15，至少30，至少50，至少100，至少250，至少500或至少1000個連續(xù)的核苷酸，但是由少于或等于1000kb，500kb，250kb，200kb，150kb，100kb，75kb，50kb，30kb，25kb，20kb，15kb，10kb或5kb的圖1(SEQ ID NO1)或圖2(SEQ ID NO3)中的編碼核苷酸序列的5’或3’側(cè)翼基因組DNA組成。在另外的實施方案中，本發(fā)明的核酸包括TNFR編碼序列的至少15，至少30，至少50，至少100，至少250，至少500或至少1000個連續(xù)的核苷酸，但不包含所有或部分的任何TNFR內(nèi)含子。在另外的實施方案中，本發(fā)明包含TNFR編碼序列的的核酸并不包含基因組側(cè)翼基因的編碼序列(即，5’或3’端至基因組中的TNFR基因)。在另外一個實施方案中，本發(fā)明的核酸不包括多于1000，500，250，100，50，25，20，15，10，5，4，3，2或1個基因組側(cè)翼基因的編碼序列。
另一方面，本發(fā)明提供了一種包含或由在嚴格雜交條件下能夠與上述的本發(fā)明核酸分子中的一部分核苷酸雜交的核苷酸分子組成，例如，ATCC保藏號97810或97809中保藏的質(zhì)粒所包含的cDNA，或在圖1和/或圖2中所示的多核苷酸序列的片段?！皣栏竦碾s交條件”意指在下述組成的溶液中42℃過夜孵育50％福爾馬林，5×SSC(750mM NaCl，75mM Tris-Cl)，500mM磷酸鈉(pH7.6)，5×Denhardt’s溶液，10硫酸葡聚糖和20ug/ml變性的剪切的鮭魚精DNA，然后在大約65℃用0.1×SSC洗滌濾液。
與多核苷酸的一“部分”雜交的多核苷酸意指與至少大約15nt，優(yōu)選大約至少20nt，甚至更優(yōu)選至少大約30-70(例如50)nt的參考多核苷酸雜交的多核苷酸。它們具有包括但不局限于如上所述并將要在下面詳細討論的用做診斷探針和引物的用途。
“至少大約20nt長度的”多核苷酸的部分意指來自參考核苷酸序列例如保藏的eDNA或圖1或圖2(SEQ ID NOS1或3)中所示的核苷酸序列的20個或更多連續(xù)的核苷酸。在此上下文中“大約”包括特定引用的大小以及在一端或兩端稍大或稍小幾(5，4，3，2或1)個核苷酸的大小。當(dāng)然，只與多聚A序列(例如TNFR cDNA的3”端poly(A)尾巴)雜交，或只與T(或U)殘基的互補鏈雜交的多核苷酸不包括在本發(fā)明的用于與本發(fā)明核酸分子的一部分雜交的多核苷酸中，因為這樣的多核苷酸可以與任何含有poly(A)鏈或其互補鏈的核酸分子雜交(例如，操作中任何使用寡聚dT作為引物而產(chǎn)生的雙鏈cDNA克隆)。
如文中所述，本發(fā)明的編碼TNFR多肽的核酸分子包括但不局限于那些自身編碼成熟多肽的氨基酸序列的核酸分子；和成熟多肽的編碼序列和附加序列，如那些編碼大約26-35氨基酸的前導(dǎo)序列或分泌性序列的核酸分子，例如前，原，或前原蛋白序列；帶有或不帶有前述的附加編碼序列的成熟多肽的編碼序列。
本發(fā)明的核酸也編碼那些帶有附加的非編碼序列的蛋白質(zhì)序列，例如包括但不局限于內(nèi)含子和非編碼的5’和3’序列，如在轉(zhuǎn)錄、處理mRNA包括剪接和多聚腺苷酸化信號例如在核酶結(jié)合和穩(wěn)定mRNA中起作用的轉(zhuǎn)錄的非翻譯的序列；編碼其它氨基酸例如提供額外功能的氨基酸的附加編碼序列。
因此，多肽編碼序列可與標記序列融合，例如一段編碼一種促進融合多肽純化的肽序列。在本發(fā)明的這一方面的某些優(yōu)選的實施方案中，標記氨基酸序列是6個組氨酸肽，例如在pQE載體中所提供的標記(QIAGEN公司，加州Chatsworth市，Eton大街9259號，91311)，還有許多其它商業(yè)上有售的標記。正如在Gentz等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86821-824(1989)中所描述的，為了方便純化融合蛋白使用了6個組氨酸?！癏A”標記是另外一種用于純化的肽，它對應(yīng)于流感血凝素蛋白來源的表位，Wilson等，細胞37767(1984)中描述了此肽。正如下面將要討論的，其它類似的融合蛋白包括在N端或C端與Fc融合的TNFR-6α和/或TNFR-6β多肽。
本發(fā)明另外涉及本發(fā)明核酸分子的變體，它們編碼TNFR多肽的一部分、類似物或衍生物。突變體可以自然發(fā)生，如天然的等位基因突變體。“等位基因突變體”是指一種基因幾種形式中的一種占據(jù)了有機體染色體上的給定位點?；騃I，Lewin B編，John Wiley父子出版社，紐約(1985)。非天然發(fā)生的突變體可能利用本領(lǐng)域所熟知的誘變技術(shù)產(chǎn)生，此技術(shù)包括但不局限于寡核苷酸介導(dǎo)的誘變，alanine掃描，PCR誘變，定點誘變(見例如Carter等，核酸研究134331(1986)；和Zoller等，核酸研究106487(1982))，盒式誘變(見例如Wells等，基因34315(1985))，限制性選擇誘變(見例如Wells等，Philos.Trans.R.Soc.London SerA 317415(1986))。
因此，本發(fā)明也包括具有一個或多個氨基酸缺失、添加或替換以產(chǎn)生更適于在選擇的宿主中高水平表達的TNFR多肽的TNFR突變體(例如衍生物或類似物)。例如為了消除二硫橋，半胱氨酸殘基可缺失或用另外一種氨基酸殘基替換；N端糖基化位點可被改變或消除以獲得例如更易于在已知N端位點超糖基化的酵母宿主中復(fù)性和純化的同源產(chǎn)物的表達。為此目的，在本發(fā)明TNFR多肽的任何一個或多個糖基化識別序列的一個氨基酸位置或第一個或第三個氨基酸位置的多種替換，和/或任何一個或多個類似糖基化識別序列的第二個氨基酸位置的缺失都將阻止TNFR在修飾的三肽序列的糖基化(見例如Miyajimo等，EMBOJ 5(6)1193-97)。此外，本發(fā)明多肽的一個或多個氨基酸殘基(例如精氨酸和賴氨酸殘基)可被缺失或被另外一種殘基替換以消除我們所不希望的蛋白酶例如furins或kexins的處理。例如，本發(fā)明含有羧基端TNFR多肽序列的多肽可以將對應(yīng)于SEQ ID NO2中第290位和/或295位的精氨酸殘基缺失或用另外一種氨基酸殘基替換。
本發(fā)明的變體包括那些通過核苷酸替換、缺失或添加而產(chǎn)生的突變體。這些替換、缺失或添加可能涉及一個或多個核苷酸。這些突變體可能在編碼區(qū)或非編碼區(qū)被改變或二者都被改變。在編碼區(qū)的改變可能產(chǎn)生保守的或非保守的氨基酸替換、缺失或添加。在這些改變中特別優(yōu)選的是沉默替換、添加或缺失，它們并不改變TNFR多肽或其部分的特性和活性。就這一點而言，保守性替換也是特別優(yōu)選的。
編碼具有在SEQ ID NOS2和4中所示的氨基酸序列的蛋白的核酸分子或具有ATCC保藏號97810或97809中保藏的質(zhì)粒所包含的克隆所編碼的成熟TNFR多肽序列的核酸分子是特別優(yōu)選的。
另外的實施方案包括一種分離的核酸分子，此核酸分子包含或由具有與選自以下各組核苷酸序列中任何一種核苷酸序列具有至少90％相同性，更優(yōu)選至少80％，85％，90％，92％或95％，96％，97％，98％或99％相同性的多核苷酸所組成(a)編碼具有SEQ IDNOS2和4完整氨基酸序列，或如在ATCC保藏號為97810和97809中所包含的cDNA克隆所編碼的完整氨基酸序列的TNFR多肽的核苷酸片段；(b)編碼具有SEQ ID NO2中31-300位氨基酸序列或SEQ ID NO4中31-170位氨基酸序列的成熟TNFR多肽，或如同在ATCC保藏號為97810和97809中所包含的cDNA克隆所編碼的多肽的核苷酸片段；(c)編碼具有SEQ ID NO2中31-283位氨基酸序列或SEQ ID NO4中31-166位氨基酸序列的TNFR多肽的可溶性胞外區(qū)的核苷酸序列的核苷酸片段；(d)編碼具有SEQ IDNOS2和4完整氨基酸序列的TNFR多肽片段的核苷酸序列，或如在ATCC保藏號為97810和97809中所包含的cDNA克隆所編碼的多肽片段，其中所述的多肽片段具有TNFR-6α和/或TNFR-6β功能活性；和(e)與上述(a)(b)(c)或(d)中任何一種核苷酸序列互補的核苷酸序列。由這些多核苷酸所編碼的多肽也被包含在本發(fā)明之內(nèi)。
本發(fā)明另外的實施方案包括含有或由與上述(a)(b)(c)(d)和(e)中任何一種核苷酸序列具有至少90％相同性，更優(yōu)選至少80％，85％，90％，92％或95％，96％，97％，98％或99％相同性的多核苷酸，或在嚴格雜交條件下與上述(a)(b)(c)(d)或(e)中多核苷酸雜交的多核苷酸所組成的分離的核酸分子。能夠雜交的多核苷酸在嚴格雜交條件下不與具有僅由A殘基或僅由T殘基構(gòu)成的核苷酸序列的多核苷酸雜交。本發(fā)明的另外一個核酸實施方案涉及包含或由編碼具有上述(a)(b)(c)(d)或(e)氨基酸序列的TNFR多肽表位攜帶部分氨基酸序列的多核苷酸所組成的分離的核酸分子。
一段多核苷酸的核苷酸序列與編碼TNFR多肽的參考核苷酸序列具有例如至少“95％”相同性意指除了多核苷酸序列中的編碼TNFR多肽的參考核苷酸序列的每100個核苷酸可以包括最多5個點突變之外，多核苷酸的核苷酸序列與參考序列是相同的。換句話說，要獲得與參考核苷酸序列具有至少80％，85％，90％，92％或95％相同性的核苷酸序列，參考核苷酸序列中最多5％的核苷酸序列可被缺失或被其它核苷酸序列所替換，或者最多相當(dāng)于總參考序列5％的核苷酸可被插入到參考序列中。參考序列的這些突變可以發(fā)生在參考核苷酸序列的5’端或3’端，或兩端之間的任何位置，單個散布在參考序列的核苷酸中或在參考序列的一個或多個連續(xù)的組中。這些參考序列可以是如圖1(SEQ ID NOS1和2)或圖2(SEQ ID NOS3和4)中所示的TNFR-6α和/或TNFR-6β的整個編碼序列或其片段、變體、衍生物或類似物，如文中所述。
在實際操作中，任何特定的核酸分子是否與例如在圖1或圖2中所示的核苷酸序列，或在一個或兩個保藏的cDNA克隆中所含有的核苷酸序列具有至少90％，95％，96％，97％，98％或99％的相同性可以很方便地用已知的計算機程序例如Bestfit程序(位于威斯康星州麥迪遜科學(xué)大道575號的大學(xué)研究園遺傳計算機研究組的用于UNIX系統(tǒng)的威斯康星序列分析包第8版)來確定。Bestfit程序利用Smith和Waterman應(yīng)用數(shù)學(xué)進展2482-489(1981)中的局部同源性原理以尋找兩種序列之間最佳的同源片段。當(dāng)利用Bestfit程序或其它序列比較程序去確定是否一段特定序列與本發(fā)明的參考序列具有例如95％的相同性時，參數(shù)是這樣設(shè)置的，相同性百分比是在全長參考核苷酸序列的基礎(chǔ)上計算出的并且總核苷酸數(shù)目最多5％的不相同性是允許的。參考序列可以是如圖1(SEQ ID NO1)或圖2(SEQ ID NO3)中所示的完整的TNFR編碼核苷酸序列或TNFR-6α和/或TNFR-6β的任何多核苷酸片段(例如編碼文中所述的N端或C端缺失的氨基酸序列的多核苷酸)、變體、衍生物或類似物，如文中所述。
在一個特定的實施方案中，參考序列(本發(fā)明的序列)和待比較序列之間的相同性，也稱做全局序列比較，是應(yīng)用在Brutlag等(計算機應(yīng)用生物科學(xué)6237-245(1990))演算程序基礎(chǔ)上的FASTDB計算機程序確定的。在FASTDB序列比較中用于計算相同性百分比的優(yōu)選參數(shù)如下Matrix＝Unitary，k-tuple＝4，Mismatch Penalty＝1，Joining Penalty＝30，Randomization Group Length＝0，Cutoff Score＝1，Gap Penalty＝5，Gap Size Penalty＝0.05，Window Size＝500或待比較的核苷酸序列的長度稍短些。根據(jù)這個實施方案，如果待比較的核苷酸序列由于5’或3’缺失而不是內(nèi)部缺失而短于參考序列，在計算結(jié)果時考慮到FASTDB程序在計算相同性百分比時并沒有把待比較的核苷酸序列5’或3’缺失的情況包括在內(nèi)，因此對結(jié)果做了一個人工校正。對于相對于參考序列5’或3’缺失的待比較的核苷酸序列來說，相同性百分比是通過計算參考序列中是待比較的核苷酸序列5’或3’端的并且不相同的堿基數(shù)目作為參考序列總堿基數(shù)的百分比而校正的。確定一個核苷酸是否相配是通過FASTDB序列比較的結(jié)果而決定的。然后這個百分比減去使用上述特定參數(shù)的FASTDB程序計算出的相同性百分比，最后得到了一個最終的百分比數(shù)值。就本發(fā)明而言，此校正的數(shù)值正是所使用的數(shù)值。正如FASTDB序列比較所顯示的，只有在待比較的核苷酸序列5’或3’端堿基之外的并且與參考序列不相配的堿基才被計算以調(diào)整相同性百分比數(shù)值。例如，一段90個堿基的待比較的核苷酸序列與一段100堿基的參考序列進行序列比較以確定相同性百分比。待比較的核苷酸序列的5’端發(fā)生缺失，因此，F(xiàn)ASTDB序列比較并不顯示5’端的頭10個堿基的比較。這10個未配對的堿基代表參考序列的10％(5’或3’端不配對堿基/參考序列總堿基數(shù)目)，所以應(yīng)從由FASTDB程序計算出的相同性百分比中減去10％。如果剩下的90個堿基都配對的話那么最終的相同性百分比應(yīng)該是90％。在另外一個實施例中，一段90個堿基的待比較的核苷酸序列與一段100堿基的參考序列進行序列比較。這次是內(nèi)部缺失所以在待比較的核苷酸序列的5’或3’端沒有不與參考序列不配對的堿基。在這種情況下，由FASTDB程序計算出的相同性百分比未進行人工校正。再說一遍，只有待比較的核苷酸序列的5’或3’端的與參考序列不配對的堿基才被人工校正。就本實施方案而言未做其它人工校正。
本發(fā)明涉及與圖1或2(SEQ ID NOS1或3)中的核酸序列，或與保藏的cDNA中的核酸序列和/或與文中所述的其它核酸序列(例如編碼具有文中所述N端C端氨基酸缺失的多肽的核酸序列，例如編碼SEQ ID NO2中第30位纈氨酸殘基到第300位組氨酸殘基的核酸)具有至少90％，95％，96％，97％，98％或99％的相同性的核酸分子，而不管它們所編碼的多肽是否具有TNFR功能活性。這是因為即使一段特定的核酸分子不能編碼具有TNFR功能活性的多肽，本領(lǐng)域熟練技術(shù)人員仍然知道如何利用此核酸分子例如用做雜交探針或聚合酶鏈式反應(yīng)引物。對本發(fā)明不能編碼具有TNFR功能活性的多肽的核酸分子的應(yīng)用包括，(1)從cDNA文庫中分離TNFR基因或其等位基因變體；(2)與中期染色體涂片進行原位雜交(例如“FISH”)以提供TNFR基因的精確位置，如在Verma等，人類染色體基本技術(shù)手冊，Pergamon出版社，紐約(1988)中所描述的；和在特定組織中檢測TNFRmRNA表達的核酸印跡。
但是，優(yōu)選與圖1或2(SEQ ID NOS1或3)中的核酸序列，或與ATCC保藏號97810或97809中保藏的cDNA克隆中所含有的核酸序列和/或與文中所述的其它核酸序列(例如編碼具有文中所述N端C端氨基酸缺失的多肽的核酸序列)具有至少90％，95％，96％，97％，98％或99％的相同性的核酸分子，而它們確實編碼具有TNFR(即TNFR-6α和/或TNFR-6β)功能活性的多肽?！熬哂蠺NFR功能活性的多肽”意指例如在一種特定的免疫分析或生物學(xué)分析中顯示相似的但不必要等同于本發(fā)明TNFR-6α和/或TNFR-6β(例如所測定的完整的(全長)、成熟和細胞外區(qū))的一種活性的多肽。例如，TNFR-6α和/或TNFR-6β活性可以通過測量TNFR-6α和/或TNFR-6β多肽與TNFR-6α和/或TNFR-6β配體(例如Fas配體和/或AIM-II(出版于1997年9月25日的國際申請公開號WO 97/34911))結(jié)合的能力而確定。在另外一個實施例中，TNFR-6α和/或TNFR-6β功能活性是通過測量一種多肽例如游離的或暴露在細胞表面上的同源配體誘導(dǎo)凋亡的能力而確定的。
TNF家族配體通過與TNF家族受體結(jié)合而誘發(fā)各種不同的細胞應(yīng)答，包括本發(fā)明的TNFR-6α和TNFR-6β。據(jù)認為表達TNFR蛋白的細胞可針對TNFR-1受體配體產(chǎn)生強大的細胞應(yīng)答，這些細胞包括B淋巴細胞(CD19+)，CD4和CD8+的T淋巴細胞，單核細胞以及內(nèi)皮細胞。“針對TNF家族配體的細胞應(yīng)答”意指由TNF家族配體在細胞、細胞系、組織、組織培養(yǎng)或病人中引發(fā)的任何一種基因型、表型、和/或多形性改變。如文中所述，這樣的細胞應(yīng)答不僅包括對TNF家族配體的正常的生理應(yīng)答，而且與增加的細胞增殖或?qū)υ黾拥募毎鲋车囊种评缤ㄟ^抑制凋亡也包括在內(nèi)。
對前述物質(zhì)的篩查分析也是本領(lǐng)域眾所周知的。這樣的篩查分析涉及在一個測量由受體激活導(dǎo)致的細胞外酸堿度變化的系統(tǒng)中使用受體表達細胞(例如，轉(zhuǎn)染的COS細胞)，見例如科學(xué)246181-296(1998年10月)中所描述的。例如，可以通過將一種TNF家族配體與表達本發(fā)明受體多肽成熟形式的細胞相互作用，然后測量第二信使應(yīng)答例如信號傳導(dǎo)或酸堿度改變以確定是否TNFR多肽是有活性的。
當(dāng)然，由于遺傳密碼子的簡并性，本領(lǐng)域熟練技術(shù)人員將會立即認識到與ATCC保藏號97810或97809中保藏的cDNA克隆中所含有的核酸序列，與圖1或2(SEQ ID NOS1或3)中的核酸序列或其片段具有至少90％，95％，96％，97，98％或99％的相同性的許多核酸分子將編碼“具有TNFR功能活性的多肽”。實際上，由于這些核酸序列的簡并性變體都編碼相同的多肽，即使不進行上面所述的比較分析本領(lǐng)域熟練技術(shù)人員也會清楚地認識到這一點。本領(lǐng)域還要認識到的是，對于那些不是簡并性變體的核酸分子來說，相當(dāng)數(shù)量的核酸分子也會編碼具有TNFR蛋白功能活性的多肽。這是因為本領(lǐng)域熟練技術(shù)人員很清楚地認識到氨基酸的替換幾乎不影響蛋白功能或影響非常小(例如，使用第二種脂肪族氨基酸替換一種脂肪族氨基酸)，如下所述。載體和宿主細胞本發(fā)明也涉及包括本發(fā)明分離的核酸分子在內(nèi)的載體、用重組載體基因工程化得到的宿主細胞，或通過重組技術(shù)生產(chǎn)本發(fā)明多肽、TNFR多肽或其片段的方法。
在一個實施方案中，本發(fā)明的多核苷酸連接到一個載體(例如一個克隆或表達載體)上去。此載體可以是例如一種噬菌體、質(zhì)粒、病毒或逆轉(zhuǎn)錄病毒載體。逆轉(zhuǎn)錄病毒載體既可以是能夠復(fù)制的又可以是復(fù)制缺陷的。在后一種情況下，通常病毒的繁殖只能發(fā)生在互補的宿主細胞中。通常情況下，一種質(zhì)粒載體被引入到沉淀中例如磷酸鈣沉淀中，或與一帶電荷的脂類形成復(fù)合物。如果此載體是病毒，它可以在體外使用合適的包裝細胞系被包裝然后轉(zhuǎn)導(dǎo)進入宿主細胞。
通常情況下，重組的表達載體將包括允許轉(zhuǎn)化宿主細胞的復(fù)制起點和選擇標記，例如大腸桿菌的青霉素抗性基因和S.cerevisiae的TRP1基因，以及來自一高表達基因以指引下游結(jié)構(gòu)基因轉(zhuǎn)錄的啟動子。這些啟動子可以來自編碼糖原降解酶的操縱子如3-磷酸甘油酸激酶(PGK)，α-因子，酸性磷酸酶，熱休克蛋白等。表達構(gòu)建物另外包含轉(zhuǎn)錄起始位點、終止位點和在轉(zhuǎn)錄區(qū)包含翻譯的核糖體結(jié)合位點。構(gòu)建物表達的轉(zhuǎn)錄本的編碼部分優(yōu)選包括開始的一個翻譯起始密碼子以及在被翻譯的多肽的大約尾部位置的一個終止密碼子(UAA，UGA或UAG)。異源結(jié)構(gòu)序列在合適時期被裝配帶有翻譯起始和終止序列，和優(yōu)選的一個能夠引導(dǎo)翻譯的蛋白運送到胞漿區(qū)或細胞外培養(yǎng)基中的前導(dǎo)序列。任選的，異源序列可以編碼一種包括顯示我們所希望的特征例如使表達的重組產(chǎn)物穩(wěn)定或便于純化，的N端鑒定肽的融合蛋白。
在一個實施方案中，本發(fā)明的DNA與一異源調(diào)控成分(例如，啟動子或增強子)可操作連接，例如λ噬菌體PL啟動子，大腸桿菌lac，trp，phoA和tac啟動子，SV40早期和晚期啟動子以及逆轉(zhuǎn)錄病毒LTRs啟動子等。其它合適的啟動子是本領(lǐng)域熟練技術(shù)人員所熟知的。
如文中所述，表達載體優(yōu)選包括至少一種選擇標記。這樣的選擇標記包括用于真核細胞培養(yǎng)物的二氫葉酸還原酶、G418或新霉素抗性基因和用于培養(yǎng)大腸桿菌或其它細菌的四環(huán)素、卡那霉素或氨芐青霉素抗性基因。合適的宿主的代表性例子包括但不限于細菌細胞例如大腸桿菌、鏈霉菌和鼠傷寒沙門菌細胞；真菌細胞例如酵母細胞；昆蟲細胞例如果蠅S2細胞和草地夜蛾Sf9細胞；動物細胞例如CHO、COS、293和Bowes黑素瘤細胞；以及植物細胞。合適的培養(yǎng)基以及培養(yǎng)上述細胞的條件是本領(lǐng)域熟練技術(shù)人員眾所周知的。
宿主細胞可以是一種高等真核細胞例如哺乳動物細胞(例人源的細胞)，或低等的真核細胞例如酵母細胞，或者宿主細胞可以是原核細胞例如細菌細胞。宿主細胞株可能因為其調(diào)控插入的基因序列的表達或以我們所希望的方式修飾或處理基因產(chǎn)物而被選擇出來。某些啟動子的表達在存在某些誘導(dǎo)子的情況下會升高；因此可以控制基因工程多肽的表達。而且，不同的宿主細胞對蛋白的翻譯后和翻譯前處理和修飾(例如磷酸化，切割)的特征和機制是不同的?？梢赃x擇合適的細胞系以確保對所表達的外源蛋白進行我們所希望的修飾和處理。選擇用于表達的合適的載體和啟動子是眾所周知的方法，并且表達載體的構(gòu)建、載體引入宿主細胞以及在宿主細胞中的表達是本領(lǐng)域中的常規(guī)技術(shù)。
通過插入一段與功能性啟動子可操作連接的帶有合適的翻譯起始和終止信號的編碼目的蛋白的結(jié)構(gòu)DNA序列而構(gòu)建了有用的用于細菌的表達載體。此載體包含一個或多個表型選擇標記以及一個復(fù)制起始子以確保載體的維持并且，如果需要的話，在宿主內(nèi)提供擴增。轉(zhuǎn)化的合適宿主包括大腸桿菌，枯草桿菌，鼠傷寒沙門菌和葡萄球菌，盡管其它細菌也可作為一種選擇。作為一種典型的但是非限制性的例子，細菌中有用的表達載體包含一種選擇標記和來自商業(yè)上有售的包含眾所周知的克隆載體pBR322(ATCC 37017)遺傳成分的質(zhì)粒的細菌復(fù)制起始點。這些商用載體包括例如pKK223-3(Pharmacia Fine Chemicals，Uppsala，Sweden)和GEM1(PromegaBiotec，Madison，WI，USA)。這些pBR322的骨架部分與一種合適的啟動子以及待表達的結(jié)構(gòu)基因連接在一起。優(yōu)選的用于細菌的載體包括QIAGEN公司的pHE4-5(ATCC編號209311；及其變體)，pQE70，pQE60和pQE9；Stratagene公司的pBS載體，Phagescript載體，Bluescript載體，pNH8A，pNH16A，pNH18A，pNH46A；Pharmacia公司的ptrc99a，pKK223-3，pKK233-3，pDR540，pRIT5。優(yōu)選的真核載體有Stratagene公司的pWLNEO，pSV2CAT，pOG44，pXT1；和Pharmacia公司的pSVK3，pBPV，pMSG和pSVL。其它合適的載體是本領(lǐng)域熟練技術(shù)人員所明了的。
在轉(zhuǎn)化合適的宿主細胞株并且宿主細胞株生長至一合適的密度以后，使用合適的方法誘導(dǎo)所選擇的啟動子(例如溫度轉(zhuǎn)換或化學(xué)誘導(dǎo))表達，細胞再培養(yǎng)一段時間。通過離心的方法收集細胞，利用物理學(xué)或化學(xué)方法破碎細胞，得到產(chǎn)物粗提物用于進一步純化。
用于表達蛋白的微生物細胞可以通過任何便利的方法破碎，包括反復(fù)凍融、超聲、機械破碎或使用細胞裂解試劑，這些方法是本領(lǐng)域熟練技術(shù)人員所熟知的。
通過向載體中插入一段增強序列可以增加高等真核細胞對編碼本發(fā)明多肽的DNA的轉(zhuǎn)錄。增強子是DNA的順式作用的成分，通常距離10到300bp作用于啟動子以增加其轉(zhuǎn)錄。例子包括SV40復(fù)制起始點遠端100至270bp的增強子，巨細胞病毒早期啟動子增強子，復(fù)制起點晚期一側(cè)的多瘤增強子和腺病毒增強子。
各種不同的哺乳動物培養(yǎng)系統(tǒng)也可被用于表達重組蛋白。哺乳動物表達系統(tǒng)的例子有猴腎成纖維細胞COS-7細胞系，Gluzman等(細胞23175(1981))描述了此細胞，以及其它能夠表達相容載體的細胞系例如C127，3T3，CHO，HeLa和BHK細胞系。哺乳動物表達載體包含一個復(fù)制起始點，一個合適的啟動子和增強子，還有任何必須的核酶結(jié)合位點，多聚腺苷酸化位點，剪接供體和受體位點，轉(zhuǎn)錄終止序列以及5’端側(cè)翼非轉(zhuǎn)錄序列。來源自SV40的DNA剪接序列以及多聚腺苷酸化位點可能被用于提供所需要的非轉(zhuǎn)錄遺傳成分。
將載體構(gòu)建物引入宿主細胞可以通過本領(lǐng)域眾所周知的技術(shù)實現(xiàn)，包括但不局限于磷酸鈣轉(zhuǎn)染法，DEAE-葡聚糖介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染，陽離子脂質(zhì)體介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染、電穿孔、轉(zhuǎn)導(dǎo)、感染或其它方法。這些方法在許多標準的實驗室手冊如Davis等，分子生物學(xué)基本方法(1986)中都有詳細描述。
除了包含文中所討論的含有載體構(gòu)建物的宿主細胞以外，本發(fā)明也包括脊椎動物來源的特別是哺乳動物來源的原代、次代和永生化的宿主細胞，這些宿主細胞已經(jīng)被工程化以去掉或替換內(nèi)源性的遺傳物質(zhì)(例如TNFR編碼序列)，和/或包括與本發(fā)明TNFR多核苷酸可操作連接的能夠激活、改變和/或擴增內(nèi)源性TNFR多核苷酸的遺傳物質(zhì)。例如，本領(lǐng)域眾所周知的方法可被用于通過同源重組的方法可操作連接異源控制區(qū)(例如啟動子和/或增強子)和內(nèi)源性TNFR多核苷酸序列(見例如編號為5641670的美國專利，授權(quán)于1997年6月；國際申請公開號WO 96/29411，出版于1996年9月26日；國際申請公開號WO 94/12650，出版于1994年8月4日；Koller等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 868932-8935(1989)；和Zijlstra等，自然342435-438(1989)，以上文獻引入本文做參考)。
下文描述的宿主細胞可被以傳統(tǒng)的方式用于生產(chǎn)由重組序列編碼的基因產(chǎn)物。另外，使用來源自本發(fā)明DNA構(gòu)建物的RNAs，無細胞翻譯系統(tǒng)也可被用于生產(chǎn)本發(fā)明的多肽。
本發(fā)明的多肽可以以一種被修飾的形式例如融合蛋白(含有與(不同蛋白)異源蛋白序列通過肽鍵連接的多肽，例如CK-beta8的信號肽(1995年6月23日申請的，PCT申請?zhí)朠CT/US95/09058中批露的CK-8序列的-21至-1位氨基酸殘基)或司登尼亞鈣蛋白的信號肽(見保藏于1994年1月25日的，ATCC保藏號75652))被表達或合成，并且可能不僅包括分泌信號，也包括額外的異源功能區(qū)。這樣的融合蛋白可以利用本領(lǐng)域眾所周知的技術(shù)，通過將本發(fā)明的多核苷酸與編碼我們所希望的氨基酸序列的核酸序列連接成合適的讀碼框而制備，并且利用本領(lǐng)域眾所周知的技術(shù)表達融合蛋白產(chǎn)物。另外，這樣的融合蛋白也可通過合成技術(shù)制備，例如，通過使用多肽合成儀而制備。因此，例如額外的氨基酸區(qū)特別是帶電荷的氨基酸區(qū)可被加入到多肽的N末端以增加其在宿主細胞中的穩(wěn)定性和持續(xù)性以及在純化過程中、隨后處理過程中和貯存中的穩(wěn)定性。肽分子也可以加入到多肽中以促進純化。這樣的區(qū)域可在最終制備多肽之前被去除。向多肽中加入肽分子以造成分泌或排出，以增加穩(wěn)定性并且利于純化，是本領(lǐng)域中所熟知的常規(guī)方法。
優(yōu)選的融合蛋白包含一段來自免疫球蛋白的用于穩(wěn)定和純化蛋白的異源區(qū)。例如，EP-A-O 464 533(加拿大對應(yīng)申請2045869)中批露了一種含有免疫球蛋白分子穩(wěn)定區(qū)各種不同部分以及另外一種人蛋白或其部分的融合蛋白。在許多情況下，融合蛋白中的Fc部分在治療和診斷中非常有用，并且因此導(dǎo)致例如升高的藥物動力學(xué)特征(EP-A 0233 262)。另一方面，當(dāng)融合蛋白以所述的有利方式被表達、檢測和純化后，對于一些用途來說我們希望去除Fc部分。在這種情況下已經(jīng)證明Fc部分的存在是對治療和診斷的一種障礙，例如，當(dāng)融合蛋白被用于免疫接種中的免疫原時。在藥物發(fā)現(xiàn)研究中，例如人蛋白如hIL-5已經(jīng)和Fc部分融合以用于高產(chǎn)量篩選分析中鑒定hIL-5的拮抗劑。見D.Bennett等，分子識別期刊852-58(1995)和K.Johanson等，生物化學(xué)期刊2709459-9471(1995)。在另外一個實施例中，本發(fā)明優(yōu)選的融合蛋白包含免疫球蛋白輕鏈的一部分(即，κ或λ輕鏈的一部分)。在特定的實施方案中本發(fā)明的融合蛋白包含κ或λ輕鏈穩(wěn)定區(qū)的一部分。
本發(fā)明的蛋白包括從天然原料包括無論是分離的還是培養(yǎng)的體液、組織和細胞中純化的產(chǎn)物；化學(xué)合成程序的產(chǎn)物；和從一種原核或真核宿主細胞包括例如細菌、真菌、高等植物、昆蟲和哺乳動物細胞中通過重組技術(shù)生產(chǎn)的產(chǎn)物。根據(jù)在此重組生產(chǎn)程序中所用的宿主細胞，本發(fā)明的多肽可能是糖基化的也可能是非糖基化的。此外，本發(fā)明的多肽可能也包括一種原始修飾的甲硫氨酸殘基，在一些情況下是由于宿主細胞介導(dǎo)的處理的結(jié)果。
本發(fā)明的蛋白可以利用本領(lǐng)域眾所周知的技術(shù)化學(xué)合成(例如，見Creighton，1983，蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)和分子機理，W.H.Freeman&Co.，紐約，和Hunkapiller，M等，自然310105-111(1984))。例如，對應(yīng)于本發(fā)明完整TNFR多肽(即，TNFR-6α和/或TNFR-6β)的一個片段的肽可以通過利用多肽合成儀而合成。而且，如果希望的話，非經(jīng)典的氨基酸或化學(xué)氨基酸類似物可被作為替代物引入或加入到TNFR多肽序列中。非經(jīng)典的氨基酸通常包括但是不局限于普通氨基酸的D異構(gòu)體，2，4-二氨基丁酸，a-氨基異丁酸，4-氨基丁酸，2-氨基丁酸，g-Abu，e-Ahx，6-氨基己酸，Aib，2-氨基異丁酸，3-氨基丙酸，鳥氨酸，正亮氨酸，正纈氨酸，羥脯氨酸，肌氨酸，瓜氨酸，同型瓜氨酸，磺基丙氨酸，t-丁基甘氨酸，t-丁基丙氨酸，苯甘氨酸，環(huán)己丙氨酸，b-丙氨酸，氟氨基酸，設(shè)計者氨基酸如b-甲基氨基酸，甲基氨基酸鈣，甲基氨基酸鈉和氨基酸類似物。而且，氨基酸可以是D(右旋)也可以是L(左旋)。
TNFR-6α和/或TNFR-6β蛋白可以通過天然過程被修飾例如翻譯后處理，也可通過本領(lǐng)域眾所周知的化學(xué)修飾技術(shù)處理。需要注意的是在一個給定的TNFR-6α和/或TNFR-6β蛋白中相同類型的修飾在幾個不同位點上的程度可能相同或不同。還有在一個給定的TNFR-6α和/或TNFR-6β蛋白中可能含有許多類型的修飾。TNFR-6α和/或TNFR-6β蛋白可能是分枝的例如由于無處不在，它們也可以是帶有或不帶有分枝的環(huán)狀。環(huán)狀的、分枝的以及分枝環(huán)狀的TNFR-6α和/或TNFR-6β蛋白可能是天然的翻譯后處理的結(jié)果，也可能是合成方法所造成的。修飾包括乙?；?，酰化，ADP-核糖基化，酰胺化，黃素的共價連接，血紅素分子部分的共價連接，核苷酸或核苷酸衍生物的共價連接，脂類或脂類衍生物的共價連接，磷脂酰肌醇的共價連接，交聯(lián)，環(huán)化，二硫鍵形成，焦谷氨酸形成，甲?；?羧化，糖基化，GPI錨形成，羥化，甲基化，豆蔻酸化，氧化，pegylation，蛋白水解處理，磷酸化，異戊二烯化，硒酰化(selenoylation)，硫化，轉(zhuǎn)運RNA介導(dǎo)的向蛋白質(zhì)中加入氨基酸如精氨?；捅樵诘鞍谆?見例如，蛋白質(zhì)一結(jié)構(gòu)和分子特征，第二版，T.E.Creighton，W.H.Freeman and Company，紐約(1993)；蛋白質(zhì)的翻譯后共價修飾，B.C.Johnson編，學(xué)院出版社，紐約，1-12頁(1983)；Seifter等，Meth Enzymol 182626-646(1990)；Ratten等，Ann NY Acad Sci66348-62(1992))。
本發(fā)明包含翻譯過程中或翻譯后不同修飾的TNFR-6α和/或TNFR-6β蛋白，例如通過糖基化，乙?；姿峄?，酰胺化，通過已知的保護或阻斷基團衍生化，水解裂解，與一種抗體或其它細胞配體分子連接等。任何一種化學(xué)修飾都可以通過眾所周知的技術(shù)實施，包括但不局限于通過溴化氰，胰蛋白酶，糜蛋白酶，木瓜蛋白酶，V8蛋白酶，NaBH4的特異性化學(xué)裂解，酰化，甲酰化，氧化，還原，在衣霉素存在的情況下的代謝合成等等。
其它的包括在本發(fā)明之內(nèi)的翻譯后修飾包括例如，N連接的或O連接的碳水化合物鏈，N末端或C末端的處理，化學(xué)分子部分吸附到氨基酸骨架上，N連接的或O連接的碳水化合物鏈的化學(xué)修飾，原核宿主細胞表達導(dǎo)致的N末端甲硫氨酸的添加或缺失。多肽也可以被一可檢測到的標記所修飾，例如用于檢測和分離蛋白的酶、熒光、同位素或親和素標記。
本發(fā)明也提供了TNFR-6α和/或TNFR-6β的化學(xué)修飾的衍生物，它們有許多額外的優(yōu)點例如可溶性、穩(wěn)定性和循環(huán)時間的增加或免疫原性的降低(見美國專利4179337)。用于衍生化的化學(xué)分子部分可以選自水溶性的聚合物例如聚乙二醇，乙二醇/丙二醇共聚物，羧甲基纖維素，葡聚糖，聚乙烯基醇及其類似物。多肽可在分子內(nèi)部任意位點被修飾，或在分子內(nèi)部預(yù)先確定的位點被修飾，并且可以包含一個、兩個、三個或更多的附著的化學(xué)分子部分。
聚合物可以是任何分子量的，可以分枝也可以不分枝。對于聚乙二醇來說，為了易于處理和生產(chǎn)優(yōu)選的分子量在大約1kDa到大約100kDa之間(術(shù)語“大約”意指在制備聚乙二醇過程中，一些分子將會比標明的分子量稍重一些，有些會稍輕一些)。其它的分子量大小也可以使用，根據(jù)我們所希望的治療的情況而選擇(例如，我們所希望的持久釋放的時間、對生物學(xué)活性的效應(yīng)，如果有的話、易于處理的程度、抗原性程度或無抗原性以及聚乙二醇對治療性蛋白質(zhì)或其類似物的其它已知的效應(yīng))。例如，聚乙二醇可能具有大約200，500，1000，1500，2000，2500，300，3500，4000，4500，5000，5500，6000，6500，7000，7500，8000，8500，9000，9500，10000，10500，11000，11500，12000，12500，13000，13500，14000，14500，15000，15500，16000，16500，17000，17500，18000，18500，19000，19500，20000，25000，30000，35000，40000，50000，55000，60000，65000，70000，75000，80000，85000，90000或100000kDa的平均分子量。
如上所示，聚乙二醇可能具有分枝結(jié)構(gòu)。在美國專利5643575中分枝的聚乙二醇是所希望的；Morpurgo等，應(yīng)用生物化學(xué)及生物工藝學(xué)5659-72(1996)；Vorobjev等，核苷酸182745-1750(1999)；和Caliceti等，Bioconjug Chem.10638-646(1999)，以上文獻引入本文做參考。
聚乙二醇分子(或其它化學(xué)分子部分)在吸附至蛋白質(zhì)上時應(yīng)該考慮到其對此蛋白質(zhì)的功能性或抗原性區(qū)域的影響。對于本領(lǐng)域熟練技術(shù)人員來說，有很多吸附方法可以使用例如EP 0 401 384，在此引入本文做參考(將PEG與G-CSF偶聯(lián))，也見Malik等，Exp.Hematol.201028-1935(1992)(報道使用tresyl chloride對GM-CSF進行pegylation)。例如，聚乙二醇可能通過反應(yīng)性基團如游離的氨基或羧基基團與氨基酸殘基共價連接。反應(yīng)性基團是那些可以與聚乙二醇分子結(jié)合的基團。具有游離氨基基團的氨基酸殘基可能包括賴氨酸殘基和N末端氨基酸殘基；那些具有游離羧基基團的氨基酸殘基可能包括天冬氨酸殘基、谷氨酸殘基和C末端氨基酸殘基。巰基基團也可被用做與聚乙二醇結(jié)合的反應(yīng)性基團。就用于治療而言，優(yōu)選與氨基基團結(jié)合，例如吸附至N末端或賴氨酸殘基上。
如上面所指的，聚乙二醇可以通過與許多氨基酸殘基中的任何一個連接而吸附至蛋白質(zhì)上去。例如，聚乙二醇可以通過與賴氨酸、組氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、或半胱氨酸殘基共價結(jié)合而連接至蛋白質(zhì)上去。一種或多種反應(yīng)化學(xué)物可被用于使聚乙二醇連接至蛋白質(zhì)的特定氨基酸殘基(例如賴氨酸、組氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、或半胱氨酸)上去，或連接至此蛋白質(zhì)的多于一種類型的氨基酸殘基(例如賴氨酸、組氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、或半胱氨酸及其組合)上去。
人們可能希望蛋白質(zhì)在N末端受到化學(xué)修飾。使用聚乙二醇作為現(xiàn)有組合物的指示劑，人們可以從各種不同的聚乙二醇分子中(通過分子量、分枝等等)，在反應(yīng)混合物中聚乙二醇分子與蛋白質(zhì)(多肽)分子的比例，所要實施的pegylation反應(yīng)的類型，以及獲得所選擇的N末端pegylated蛋白的方法中選擇出來。獲得N末端pegylated制備物的方法(即，如果必要的話把此部分從其它pegylated的部分中分離出來的方法)可以是從大量的pegylated的蛋白質(zhì)分子中純化N末端pegylated的物質(zhì)。所選擇的N末端化學(xué)修飾的蛋白質(zhì)可以通過利用在一種特定蛋白質(zhì)衍生化過程中存在的不同類型的基本氨基酸(賴氨酸和N末端)的不同反應(yīng)性的還原性堿基化而獲得。在合適的反應(yīng)條件下，獲得了N端帶有含有聚合物的羧基基團的蛋白質(zhì)的選擇性衍生化。
如上所述，本發(fā)明蛋白質(zhì)的pegylafion可以通過許多方法中的任何一種而完成。例如，聚乙二醇既可以直接連接到蛋白質(zhì)上，也可以通過一連接序列而連接到蛋白質(zhì)上去。聚乙二醇連接至蛋白質(zhì)上的無連接序列系統(tǒng)見Delgado等，Crit.Rve.Thera.Drug.Carrier Sys.9249-304(1992)；Francis等，Intern J.of Hametol 681-18(1998)；美國專利4002531；美國專利5349052；WO 95/06058；WO 98/32466，以上文獻引入本文做參考。
一個不使用連接序列而使聚乙二醇分子直接連接到蛋白質(zhì)上的系統(tǒng)使用了tresylated MPEG，它是使用tresylchloride(CISO2CH2CF3)對單甲氧基聚乙二醇進行修飾而產(chǎn)生的。一旦蛋白質(zhì)與tresylatedMPEG發(fā)生反應(yīng)，聚乙二醇分子就直接連接到蛋白質(zhì)分子的氨基基團上。因此，本發(fā)明包括通過將本發(fā)明的蛋白質(zhì)與帶有2，2，2-triflureothane sulphonyl基團的聚乙二醇反應(yīng)而產(chǎn)生的蛋白質(zhì)-聚乙二醇結(jié)合物。
聚乙二醇可以使用許多不同的連接序列而被連接到蛋白質(zhì)分子上去。例如，美國專利5612460，全文引入本文做參考，批露了將聚乙二醇連接到蛋白質(zhì)上去的尿烷連接序列。蛋白質(zhì)-聚乙二醇結(jié)合物其中被一段連接序列連接到蛋白質(zhì)上的聚乙二醇也可以通過將蛋白質(zhì)與以下化合物如MPEG丁二酸琥珀酰亞胺，1，1’-羰二咪唑激活的MPEG，MPEG-2，4，5-trichloropenylcarbonate，MPEG-對硝基苯酚碳酸酯和各種不同的MPEG-丁二酸酯衍生物反應(yīng)而產(chǎn)生。WO98/32466中詳細描述了許多將聚乙二醇結(jié)合到蛋白質(zhì)上去的另外的聚乙二醇衍生物和化學(xué)反應(yīng)物，全文引入本文做參考。使用文中所列出的反應(yīng)化學(xué)物而生產(chǎn)的pegylated蛋白質(zhì)產(chǎn)物也在本發(fā)明的范圍之內(nèi)。
吸附到本發(fā)明每一種蛋白質(zhì)上的聚乙二醇分子部分的數(shù)目(即，替換的程度)也是不同的。例如，本發(fā)明的pegylated蛋白質(zhì)可以連接平均1，2，3，4，5，6，7，8，9，10，12，15，17，20或更多的聚乙二醇分子。相似的，平均替換程度也在范圍之內(nèi)例如每一個蛋白質(zhì)分子中1-3，2-4，3-5，4-6，5-7，6-8，7-9，8-10，9-11，10-12，11-13，12-14，13-15，14-16，15-17，16-18，17-19，或18-20個聚乙二醇分子部分。在Delgado等，Crit.Rve.Thera.Drug.CarrierSys.9249-304(1992)中討論了確定替換程度的方法。
TNFR蛋白質(zhì)可以通過已知的方法復(fù)性和純化，這些方法包括但不局限于硫酸氨或乙醇沉淀，酸抽提，陰離子或陽離子交換層析，磷酸纖維素層析，疏水作用層析，親和層析，羥磷灰石層析和植物凝集素層析。最優(yōu)選的是，高效液相層析(“HPLC”)被實施用于純化。TNFR蛋白質(zhì)本發(fā)明另外提供了含有由本發(fā)明多核苷酸序列所編碼的多肽序列的蛋白質(zhì)。
本發(fā)明的TNFR蛋白質(zhì)可以是單體或多聚體(即，二聚體，三聚體，四聚體或更大一些的多聚體)。因此，本發(fā)明涉及本發(fā)明TNFR蛋白質(zhì)的單體和多聚體，它們的制備以及含有它們的組合物(優(yōu)選的，藥物組合物)。在一個特定的實施方案中，本發(fā)明的多肽是單體、二聚體、三聚體或四聚體。在另外的實施方案中，本發(fā)明的多聚體至少是二聚體、至少是三聚體或至少是四聚體。
本發(fā)明所包含的多聚體可以是同聚物也可以是異聚物。正如文中所用的，術(shù)語同聚物是指僅含有本發(fā)明TNFR蛋白質(zhì)(包括TNFR片段、突變體和融合蛋白，如文中所述)的多聚體。這些同聚物可能含有具有相同或不同多肽序列的TNFR蛋白質(zhì)。在一個特定的實施方案中，本發(fā)明的同聚物是僅含有具有相同多肽序列的TNFR蛋白質(zhì)的多聚體。在另外的實施方案中，本發(fā)明的同聚物是含有具有不同多肽序列的TNFR蛋白質(zhì)的多聚體。在特定的實施方案中，本發(fā)明的多聚體是同源二聚體(例如，含有具有相同或不同多肽序列的TNFR蛋白質(zhì))或同源三聚體(例如，含有具有相同或不同多肽序列的TNFR蛋白質(zhì))。在另外的實施方案中，本發(fā)明的同源多聚體是至少同源二聚體，至少同源三聚體，或至少同源四聚體。
正如文中所用的，術(shù)語異聚物是指除了本發(fā)明TNFR蛋白質(zhì)之外還含有異源蛋白質(zhì)(即，僅含有與TNFR基因編碼的多肽序列不相同的多肽序列的蛋白質(zhì))的多聚體。在特定的實施方案中，本發(fā)明的多聚體是異源二聚體，異源三聚體，或異源四聚體。在另外的實施方案中，本發(fā)明的異源多聚體是至少異源二聚體，至少異源三聚體，或至少異源四聚體。
本發(fā)明的多聚體可能是例如脂質(zhì)體形成中疏水、親水、離子和/或共價連接的結(jié)果和/或是間接連接的結(jié)果。因此，在一個實施方案中，當(dāng)本發(fā)明的蛋白質(zhì)在溶液中相互接觸時就形成了本發(fā)明的多聚體，例如，同源二聚體或同源三聚體。在另外一個實施方案中，當(dāng)本發(fā)明的蛋白質(zhì)與本發(fā)明的多肽的抗體(包括針對本發(fā)明融合蛋白中異源多肽序列的抗體)在溶液中相互接觸時就形成了本發(fā)明的異源多聚體，例如，異源三聚體或異源四聚體。在另外一個實施方案中，本發(fā)明的多聚體是通過與本發(fā)明的TNFR蛋白或TNFR蛋白之間共價連接而形成的。這樣的共價連接可能涉及蛋白質(zhì)多肽序列中所含有的一個或多個氨基酸殘基(例如，SEQ ID NO2或SEQ IDNO4中的多肽序列，ATCC 97810所含有的cDNA克隆所編碼的多肽序列中所含的，ATCC 97809所含有的cDNA克隆所編碼的多肽序列中所含的)。一方面，此共價連接是與天然多肽(即，自然發(fā)生的)相互作用的蛋白質(zhì)的多肽序列內(nèi)部的半胱氨酸殘基的交聯(lián)。另一方面，此共價連接是化學(xué)操作或重組操作的結(jié)果。另外，這樣的共價連接可能涉及TNFR融合蛋白中異源多肽序列中所含的一個或多個氨基酸殘基。在一個實施例中，共價連接發(fā)生在本發(fā)明的一種融合蛋白所含的異源序列之間(見例如美國專利5478925)。在一個特定的實施例中，共價連接發(fā)生在本發(fā)明的TNFR-Fc融合蛋白所含的異源序列之間(如文中所述)。在另外一個特定的實施例中，本發(fā)明融合蛋白的共價連接是發(fā)生在來自于另外一個能夠形成共價連接多聚體的TNF家族配體/受體成員的異源多肽序列之間，如osteoprotegerin(見，例如國際申請公開號WO 98/49305，內(nèi)容引入本文做參考)。在另外一個實施方案中，本發(fā)明的兩種或更多種TR6-alpha和/或TR6-beta多肽通過肽連接序列連接在一起。美國專利5073627(引入本文做參考)中詳細描述了那些含有肽連接序列的實施例。包含多個通過肽連接序列連接在一起的分開的TR6-alpha和/或TR6-beta的蛋白質(zhì)可以通過傳統(tǒng)的重組DNA技術(shù)而生產(chǎn)。
另外一個制備本發(fā)明TR6-alpha和/或TR6-beta多肽多聚體的方法包括使用融合至亮氨酸拉鏈或異亮氨酸拉鏈多肽序列的TR6-alpha和/或TR6-beta多肽。亮氨酸拉鏈和異亮氨酸拉鏈是促進它們所形成的蛋白多聚體化的多肽。亮氨酸拉鏈首先在幾種DNA結(jié)合蛋白中鑒定出來(Landschulz等，科學(xué)2401759(1988))，并且自此發(fā)現(xiàn)它存在于多種不同的蛋白質(zhì)中。在已知的亮氨酸拉鏈中是其二聚化或三聚化的天然的肽或衍生物。適于制備可溶性TR6-alpha和/或TR6-beta多聚體蛋白的亮氨酸拉鏈的實施例在PCT申請WO94/10308中有詳細描述，引入本文做參考。在合適的宿主細胞中表達包含與二聚化或三聚化肽融合的可溶性TR6-alpha和/或TR6-beta多肽的重組融合蛋白，然后使用本領(lǐng)域眾所周知的技術(shù)從培養(yǎng)上清中提取可溶性的多聚體化的TR6-alpha和/或TR6-beta產(chǎn)物。
據(jù)認為蛋白TNF家族的某些成員以三聚體形式存在(Beutler和Huffel，科學(xué)264667，1994；Banner等，細胞73431，1993)。因此，三聚體化的TR6-alpha和/或TR6-beta可能具有增強的生物學(xué)活性。優(yōu)選的亮氨酸拉鏈分子部分是那些優(yōu)選來自三聚體的亮氨酸拉鏈。一個實施例是來自肺表面活性劑蛋白質(zhì)D的亮氨酸拉鏈，如同Hoppe等(FEBS Letters 344191(1994))和美國專利申請?zhí)?8/446922中所描述的，在此引入本文做參考。其它來自天然三聚體化蛋白質(zhì)的肽可被適用于制備三聚體化的TR6-alpha和/或TR6-beta。
在另外的優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明的TR6-alpha和/或TR6-beta的多核苷酸被融合至編碼一種“FLAG”多肽的多核苷酸上。因此，TR6-alpha-FLAG或TR6-beta-FLAG融合蛋白也包含在本發(fā)明的范圍之內(nèi)。FLAG抗原性多肽可被融合至本發(fā)明的TR6-alpha或TR6-beta多肽的任一端或羧基端和氨基端。在優(yōu)選的實施方案中，TR6-alpha-FLAG或TR6-beta-FLAG融合蛋白是用pFLAG-CMV-5a或pFLAG-CMV-1表達載體表達的(位于美國圣路易斯市的Sigma公司有售)。見，Andersson，S等，生命的化學(xué)期刊2648222-29(1989)；Thomsen，D.R.等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA.8 1659-63(1984)；和Kozak，M等，自然308241(1984)(每一篇文獻都引入本文做參考)。在另外一個優(yōu)選的實施方案中，TR6-alpha-FLAG或TR6-beta-FLAG融合蛋白是通過利用抗FLAG抗體(Sigma公司也有售)而檢測出的。
本發(fā)明的多聚體也可以使用本領(lǐng)域眾所周知的化學(xué)技術(shù)生產(chǎn)出來。例如，我們所希望包含在本發(fā)明多聚體中的蛋白質(zhì)可以使用連接分子以及本領(lǐng)域所熟知的連接分子長度優(yōu)化技術(shù)(見，例如美國專利5478925，在此全文引入本文做參考)而化學(xué)交聯(lián)。此外，本發(fā)明的多聚體也可以使用本領(lǐng)域眾所周知的技術(shù)以在我們所希望包含在多聚體(見，例如美國專利5478925，在此全文引入本文做參考)內(nèi)的蛋白質(zhì)多肽序列內(nèi)部的半胱氨酸殘基之間形成一個或多個分子間交聯(lián)。而且，本發(fā)明的蛋白質(zhì)可以常規(guī)通過向蛋白質(zhì)多肽序列的N末端或C末端加入半胱氨酸或生物素而被修飾，并且本領(lǐng)域眾所周知的技術(shù)可被應(yīng)用以產(chǎn)生含有一個或多個這樣的修飾的蛋白質(zhì)的多聚體(見，例如美國專利5478925，在此全文引入本文做參考)。此外，本領(lǐng)域眾所周知的技術(shù)可被應(yīng)用以產(chǎn)生含有希望被本發(fā)明多聚體包含在內(nèi)的蛋白質(zhì)成分的脂質(zhì)體(也見，例如美國專利5478925，在此全文引入本文做參考)。
另外，本發(fā)明的多聚體也可以使用本領(lǐng)域眾所周知的基因工程技術(shù)生產(chǎn)出來。在一個實施方案中，包含在本發(fā)明多聚體之中的蛋白質(zhì)是利用文中所述的融合蛋白技術(shù)或本領(lǐng)域所熟知的其它技術(shù)(見，例如美國專利5478925，在此全文引入本文做參考)而重組生產(chǎn)的。在一個特定的實施方案中，編碼本發(fā)明同源二聚體的多核苷酸是通過將編碼本發(fā)明多肽序列的多核苷酸與編碼連接多肽的多核苷酸連接，然后與編碼多肽的翻譯產(chǎn)物的合成的多核苷酸反向從C末端到N末端(缺少前導(dǎo)序列)連接(見，例如美國專利5478925，在此全文引入本文做參考)。在另外的實施方案中，文中所述的重組技術(shù)或本領(lǐng)域所熟知的其它技術(shù)被應(yīng)用于生產(chǎn)本發(fā)明的重組多肽，此多肽含有跨膜區(qū)并且能夠通過膜重建技術(shù)被引入到脂質(zhì)體中(見，例如美國專利5478925，在此全文引入本文做參考)。
在一個實施方案中，本發(fā)明提供了分離的TNFR蛋白質(zhì)，此蛋白質(zhì)包含或由ATCC保藏號97810中所含有的cDNA克隆編碼的完整(全長)TNFR多肽的氨基酸序列，由ATCC保藏號97809中所含有的cDNA克隆編碼的完整(全長)TNFR多肽的氨基酸序列，圖1(SEQ ID NO2)中所示的完整TNFR-6α多肽的氨基酸序列，圖2(SEQ ID NO4)中所示的完整TNFR-6β多肽的氨基酸序列，或上述多肽的一部分組成。
在另外一個實施方案中，本發(fā)明提供了分離的TNFR蛋白質(zhì)，此蛋白質(zhì)包含或由ATCC保藏號978l0中所含有的cDNA克隆編碼的成熟TNFR多肽的氨基酸序列，由ATCC保藏號97809中所含有的cDNA克隆編碼的成熟TNFR多肽的氨基酸序列，圖1(SEQ IDNO2)中所示的TNFR-6α序列的第31位到第300位氨基酸殘基，圖2(SEQ ID NO4)中所示的TNFR-6β序列的第31位到第170位氨基酸殘基，或上述多肽的一部分(即，片段)組成。
本發(fā)明的多肽片段包括下列多肽，這些多肽包括或由如下氨基酸序列組成在SEQ ID NO2中所含有的氨基酸序列，在SEQ IDNO4中所含有的氨基酸序列，ATCC保藏號97810中所含有的cDNA克隆編碼的氨基酸序列，ATCC保藏號97809中所含有的cDNA克隆編碼的氨基酸序列，或由能夠與ATCC保藏號97810或97809中所含有的核苷酸序列，或圖1或圖2(分別是SEQ ID NO1和SEQID NO3)中所示的核苷酸序列或其互補序列雜交(例如在嚴格雜交條件下)的核苷酸序列所編碼的氨基酸序列。能夠與這些核苷酸片段雜交的多核苷酸也在本發(fā)明的范圍之內(nèi)。蛋白質(zhì)片段可以是“自由的”，或者被包含在一個更大一些的多肽中，其中此片段組成了這個多肽的一部分或一個區(qū)域，最優(yōu)選的是一段單一的連續(xù)區(qū)。本發(fā)明多肽片段的典型例子包括那些例如包含或由SEQ ID NO2中從第1位到第31位氨基酸殘基，從第32位到第50位氨基酸殘基，從第51位到第100位氨基酸殘基，從第101位到第150位氨基酸殘基，從第151位到第200位氨基酸殘基，從第201位到第250位氨基酸殘基和/或從第251位到第300位氨基酸殘基組成的片段。本發(fā)明多肽片段另外的典型例子包括那些例如包含或由SEQ ID NO4中從第1位到第31位氨基酸殘基，從第32位到第70位氨基酸殘基，從第70位到第100位氨基酸殘基，從第100位到第125位氨基酸殘基，從第126位到第150位氨基酸殘基和/或從第151位到第170位氨基酸殘基組成的片段。而且，多肽片段在長度上可以至少是10，20，30，40，50，60，70，80，90，100，110，120，130，140，150，175或200個氨基酸。編碼這些多肽的多核苷酸也包含在本發(fā)明的范圍之內(nèi)。
在特定的實施方案中，本發(fā)明多肽片段包含或由下列氨基酸殘基組成圖1(SEQ ID NO2)中所示的第100位到第150位，第150位到第200位，第200位到第300位，第210位到第300位，第220位到第300位，第230位到第300位，第240位到第300位，第250位到第300位，第260位到第300位，第270位到第300位，第280位到第300位和/或第290位到第300位氨基酸殘基。編碼這些多肽的多核苷酸也包含在本發(fā)明的范圍之內(nèi)。
TNF含有兩個具有不同的結(jié)構(gòu)和功能特征的區(qū)域。從SEQ IDNO2中第30位氨基酸殘基到第196位氨基酸殘基的氨基端區(qū)是與TNFR家族其它成員同源的，TNFR家族四個半胱氨酸殘基豐富區(qū)域特征的保守性說明了這一點。在這四個區(qū)的每一個中所含有的氨基酸序列分別是SEQ ID NO2的第34位到第70位，第73位到第113位，第115位到第150位，和第153位到第193位氨基酸殘基。從SEQ ID NO2中第197位氨基酸殘基到第300位氨基酸殘基的羧基端區(qū)與任何已知的序列未顯示明顯的同源性。與TNFR家族的許多其它成員不同，TNFR似乎絕對是一種的分泌性蛋白并且不以膜相關(guān)的形式被合成。TNFR的氨基端似乎是TNFR生物學(xué)功能所必須的，而TNFR的羧基端似乎對TNFR的多聚體化很重要。
在一個實施方案中，本發(fā)明的多肽包含或由SEQ ID NO2的第34位到第70位，第73位到第113位，第115位到第150位，第153位到第193位和/或第30到第196位氨基酸殘基所組成。編碼這些多肽的多核苷酸也包含在本發(fā)明的范圍之內(nèi)。
在另外的一個實施方案中，本發(fā)明的多肽包含或由SEQ ID NO2的第197位到第240位，第241位到第270位，第271位到第300位，和/或第197到第300位氨基酸殘基所組成。編碼這些多肽的多核苷酸也包含在本發(fā)明的范圍之內(nèi)。由于這些多肽片段被認為與TNFR的多聚體化相關(guān)，具有一個或多個這樣的多肽序列的蛋白質(zhì)被認為會形成與單體相比具有有利特征例如增加的結(jié)合親和性、更高的穩(wěn)定性和更長的循環(huán)半衰期的二聚體、三聚體或更高一些的多聚體。在一個特定的實施方案中，本發(fā)明提供了融合蛋白，此融合蛋白包含一個或多個由上述的多肽與細胞信號分子如受體及其胞外區(qū)以及受體或其胞外區(qū)的活性片段、衍生物或類似物的異源序列形成的融合。在一個優(yōu)選的實施方案中，異源序列選自TNF樣受體家族。這些序列優(yōu)選包括功能性細胞外配體結(jié)合區(qū)并且沒有跨膜區(qū)和胞內(nèi)區(qū)。這樣的融合蛋白在檢測可與融合的異源多肽發(fā)生反應(yīng)的分子中非常有用，并且因此可鑒定潛在的新受體和配體。融合蛋白也可用于治療多種不同的紊亂，例如與受體結(jié)合有關(guān)的紊亂。在一個實施方案中，本發(fā)明的包含TNF/TNFR和TNF受體/TNFR序列的融合蛋白被用于治療TNF和TNF受體介導(dǎo)的紊亂失調(diào)，例如炎癥、自身免疫性疾病、癌癥和與過度或降低的凋亡有關(guān)的紊亂。
在另外的實施方案中，TNFR多肽片段包含或由本發(fā)明多肽的功能區(qū)組成，例如在圖4(表I)和圖5(表II)中列出的以及文中所述的Garnier-Robosonα區(qū)、β區(qū)、轉(zhuǎn)角區(qū)和卷曲區(qū)；Chou-Fasmanα區(qū)、β區(qū)和卷曲區(qū)；Kyte-Doolittle親水區(qū)；Eisenbergα和β兩親性區(qū)；Karplus-Sculz柔性區(qū)；Emini表面形成區(qū)和Jameson-Wolf高抗原性指數(shù)區(qū)。在一個優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明的多肽片段是具有抗原性的。在表I和表II中的VIII，IX，XIII和XIV欄中顯示的數(shù)據(jù)可被用于常規(guī)測定TNFR高度可能抗原性的區(qū)域。高抗原性區(qū)是利用VIII，IX，XIII或XIV欄中的數(shù)據(jù)通過選擇代表多肽功能區(qū)的在抗原識別會導(dǎo)致起始免疫應(yīng)答過程的環(huán)境下易于暴露至多肽表面的值而確定的。本發(fā)明高度優(yōu)選的片段是那些含有能夠組合幾種結(jié)構(gòu)特征，例如上面列出的幾(例如，1，2，3或4)種特征的TNFR區(qū)的片段。編碼這些的多肽的多核苷酸也在本發(fā)明的范圍之內(nèi)。
本發(fā)明包括多肽，這些多肽包含或由分別具有SEQ ID NO2或SEQ ID NO4氨基酸序列的多肽的表位，ATCC保藏號97810或97809中所含的多核苷酸序列編碼的多肽序列的表位，由能夠分別與SEQ ID NOS1和3中序列，或ATCC保藏號97810或97809中所含的多核苷酸序列的互補序列在嚴格雜交條件下或如在上述中所明確的低嚴格雜交條件下發(fā)生雜交的多核苷酸編碼的表位所組成。本發(fā)明另外包含編碼本發(fā)明多肽序列(例如，在SEQ ID NOS1和/或3中顯示的序列)的表位的多核苷酸序列，編碼本發(fā)明表位的多核苷酸序列的互補鏈的多核苷酸序列，和在嚴格雜交條件下或如在上述中所明確的低嚴格雜交條件下與互補鏈雜交的多核苷酸序列。
術(shù)語“表位”，正如文中所用的，指在動物，優(yōu)選哺乳動物，最優(yōu)選人體內(nèi)具有抗原性和免疫原性的多肽部分。在一個優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明包含含有表位的多肽，以及編碼此多肽的多核苷酸?！懊庖咴员砦弧?，正如文中所用的，是指能在動物體內(nèi)引發(fā)抗體應(yīng)答的蛋白部分，正如通過本領(lǐng)域任何一種眾所周知的方法所測定的，例如通過下文所描述的生產(chǎn)抗體的方法(見，例如Geysen等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 813998-4001(1983))。術(shù)語“抗原性表位”，正如文中所用的，是指抗體能夠免疫特異性地識別其抗原的蛋白部分，正如通過本領(lǐng)域任何一種眾所周知的方法所測定的，例如通過文中所描述的免疫分析方法。免疫特異性結(jié)合排除了非特異性結(jié)合但并不一定排除了與其它抗原的交叉反應(yīng)?？乖砦徊⒉槐仨毷敲庖咴缘?。
能夠被用于生產(chǎn)TNFR特異性抗體的抗原性多肽或肽的非限制性例子包括包含或由在SEQ ID NO2中從大約第31位丙氨酸到大約第46位蘇氨酸殘基，從大約第57位苯丙氨酸到大約第117位蘇氨酸殘基，從大約第132位半胱氨酸到大約第175位蘇氨酸殘基，從大約第185位甘氨酸到大約第194位蘇氨酸殘基，從大約第205位纈氨酸到大約第217位天冬氨酸殘基，從大約第239位脯氨酸到大約第264位亮氨酸殘基，和從大約第283位丙氨酸到大約第298位脯氨酸殘基；和SEQ ID NO4中從大約第31位丙氨酸到大約第46位蘇氨酸殘基，從大約第57位苯丙氨酸到大約第80位谷氨酰胺殘基，從大約第86位谷氨酸到大約第106位組氨酸殘基，從大約第108位蘇氨酸到大約第119位苯丙氨酸殘基，從大約第129位組氨酸到大約第138位纈氨酸殘基，和從大約第142位甘氨酸到大約第166位脯氨酸殘基。通過分析如圖4和5中所示的Jameson-Wolf抗原性指數(shù)，已經(jīng)確定這些多肽片段攜帶有TNFR-6α和TNFR-6β多肽的抗原性表位。
具有表位功能的片段可以用任何傳統(tǒng)的方法生產(chǎn)。(見，例如，Houghten，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 825131-5135(1985)，另外美國專利4631211中也描述了這些方法)。
在本發(fā)明中抗原表位優(yōu)選含有具有至少4個，至少5個，至少6個，至少7個，更優(yōu)選至少8個，至少9個，至少10個，至少15個，至少20個，至少25個，并且最優(yōu)選在大約15個至大約30個氨基酸組成的序列。優(yōu)選的含有免疫原性或抗原性表位的多肽至少具有10，15，20，25，30，35，40，45，50，55，60，65，70，75，80，85，90，95或100個氨基酸殘基長度?？乖砦皇呛苡杏玫?，例如它可以提高與表位特異性結(jié)合的抗體水平包括單克隆抗體?？乖砦灰部杀挥米雒庖叻治鲋械陌蟹肿印?見，例如，Wilson等，細胞37767-778(1984)；Sutcliffe等，科學(xué)219660-666(1983))。
相似的，免疫原性表位可被用于，例如根據(jù)本領(lǐng)域眾所周知的方法誘導(dǎo)抗體產(chǎn)生。(見，例如，Sutcliffe等，supra；Wilson等，supra；Chow等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 82910-914；和Bittle等，普通病毒學(xué)期刊662347-2354(1985))。含有一個或多個免疫原性表位的多肽可被與載體蛋白如白蛋白一起呈遞到動物系統(tǒng)(例如，大鼠或小鼠)以引發(fā)抗體應(yīng)答，或者如果此多肽長度足夠時(大約至少25個氨基酸)，此多肽可以不用載體單獨呈遞。但是，含有少至8-10個氨基酸的免疫原性表位已經(jīng)被證明足以提高能夠與變性的多肽中的線形表位最低程度結(jié)合的抗體水平(例如，在蛋白印跡中)。
本發(fā)明的表位攜帶多肽可根據(jù)本領(lǐng)域眾所周知的方法被用于誘導(dǎo)抗體產(chǎn)生，這些方法包括但不局限于體內(nèi)免疫接種、體外免疫接種以及噬菌體展示方法。見Sutcliffe等，上述；Wilson等，上述；和Bittle等，普通病毒學(xué)期刊662347-2354(1985)。如果使用體內(nèi)免疫接種的方法，則用游離的肽免疫動物；但是，通過將肽與大分子載體如匙孔嘁血藍蛋白(KLH)或破傷風(fēng)毒素偶聯(lián)可以提高抗肽抗體滴度。例如，含有半胱氨酸殘基的肽可以使用如馬來酰亞胺苯甲酰-N-羥基琥珀酰亞胺(MBS)的接頭而偶聯(lián)到載體上，而其它的肽使用普通的連接試劑如戊二醛就可以偶聯(lián)到載體上去。動物例如兔子、大鼠和小鼠被免疫接種游離的或載體偶聯(lián)的肽，例如，將含有大約100微克的肽或載體蛋白以及弗氏佐劑或其它任何已知可以刺激免疫應(yīng)答的佐劑的乳劑通過腹膜內(nèi)和/或皮下注射方式接種?？赡苄枰獛状渭訌娊臃N，例如，間隔大約兩周，以提供有用的可被利用使用吸附到固相表面的游離肽通過ELISA分析方法檢測到的抗肽抗體滴度。免疫動物血清中抗肽抗體的滴度可以通過對抗肽抗體的選擇而升高，例如根據(jù)本領(lǐng)域眾所周知的方法將肽吸附至固相表面，然后洗脫所選擇的抗體。
本領(lǐng)域熟練技術(shù)人員應(yīng)理解的且如下面所討論的，本發(fā)明的含有免疫原性表位或抗原性表位的多肽可被融合至其它多肽序列上去。例如，本發(fā)明的多肽可與免疫球蛋白(IgA，IgE，IgG，IgM)的穩(wěn)定區(qū)，或其部分(CH1，CH2，CH3，或其任何一種組合或其部分)融合導(dǎo)致產(chǎn)生嵌合多肽。這樣的融合蛋白會有利于純化并且可能增加了其在體內(nèi)的半衰期。這已經(jīng)在由人CD4多肽的前兩個區(qū)和哺乳動物免疫球蛋白重鏈或輕鏈恒定區(qū)各個不同功能區(qū)所組成的嵌合蛋白中得到了證明。見，例如EP 394827；Traunecker等，自然，33184-86(1988)。由于IgG部分的二硫鍵而形成二硫橋連接的二聚體結(jié)構(gòu)的IgG融合蛋白也已經(jīng)被發(fā)現(xiàn)比其單體多肽或單獨的片段具有更有效的結(jié)合和中和其它分子的能力。見Fountoulakis等，生物化學(xué)期刊2703958-3964(1995)。編碼上述多肽的核酸分子也可以與用做表位標記(例如，血凝素“HA”標記或flag標記)的目的基因重組以利于所表達的多肽的檢測和純化。例如，在Janknecht等所描述的系統(tǒng)中，表達在人細胞系中的非變性的融合蛋白易于純化(Janknecht等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 888971-897)。在這個系統(tǒng)中，目的基因被亞克隆到痘苗重組質(zhì)粒中以使得此基因的開放讀碼框可翻譯地融合至由6個組氨酸組成的氨基端標記上。標記作為融合蛋白的基質(zhì)結(jié)合功能區(qū)。從重組痘苗病毒感染的細胞中獲得的提取物被裝載到鎳柱上去，然后組氨酸標記的蛋白可用含有咪唑的緩沖液洗脫下來。
基因重排、基序重排、外顯子重排和/或密碼子重排技術(shù)(統(tǒng)稱為“DNA重排”)可被用于調(diào)控TR-6α和/或TR-6β活性，以有效生產(chǎn)TR-6α和/或TR-6β的激動劑或拮抗劑。見美國專利5605793，5811238，5830721，5834252和5837458以及Patten，P.A.等，生物工藝學(xué)現(xiàn)代論點8724-33(1997)；Harayama，S，生物工藝學(xué)趨勢16(2)76-82(1998)；Hansson，L.O.等，分子生物學(xué)期刊287265-76(1999)；和Lorenzo，M.M.和Blasco，R，生物技術(shù)24(2)308-13(1998)(每一項專利及文獻引入本文做參考)。在一個實施方案中，可以通過DNA重排技術(shù)來改變TR-6α和/或TR-6β的核苷酸序列或相應(yīng)的多肽。DNA重排涉及將兩個或更多的DNA片段通過同源重組或位點特異性重組而裝配到目的TR-6α和/或TR-6β分子中去。在另外一個實施方案中，可以通過錯配PCR、隨機核苷酸插入或重組前的其它方法造成隨機誘變而改變TR-6α和/或TR-6β的核苷酸序列或相應(yīng)的多肽。在另外一個實施方案中，TR-6α和/或TR-6β分子的一個或多個成分、基序、節(jié)段、部分、區(qū)、片段等可以與一個或多個異源分子的一個或多個成分、基序、節(jié)段、部分、區(qū)、片段等重組。在優(yōu)選的實施方案中，異源分子是TNF-α、TNF-β、淋巴毒素-α、淋巴毒素-β、FAS配體、APRIL。在另外的優(yōu)選的實施方案中，異源分子是TNF家族的任一成員。
此外，基因重排、基序重排、外顯子重排和/或密碼子重排技術(shù)(統(tǒng)稱為“DNA重排”)可被用于調(diào)控TNFR活性，以有效生產(chǎn)TNFR的激動劑或拮抗劑。見美國專利5605793，5811238，5830721，5834252和5837458以及Patten等，生物工藝學(xué)現(xiàn)代論點8724-33(1997)；Harayama，生物工藝學(xué)趨勢16(2)76-82(1998)；Hansson等，分子生物學(xué)期刊287265-76(1999)；和Lorenzo和Blasco，生物技術(shù)24(2)308-13(1998)(每一項專利及文獻引入本文做參考)。在一個實施方案中，可以通過DNA重排技術(shù)來改變TNFR的核苷酸序列或相應(yīng)的多肽。DNA重排涉及將兩個或更多的DNA片段通過同源重組或位點特異性重組而裝配到目的TNFR分子中去。在另外一個實施方案中，可以通過錯配PCR、隨機核苷酸插入或重組前的其它方法造成隨機誘變而改變TNFR的核苷酸序列或相應(yīng)的多肽。在另外一個實施方案中，TNFR分子的一個或多個成分、基序、節(jié)段、部分、區(qū)、片段等可以與一個或多個異源分子的一個或多個成分、基序、節(jié)段、部分、區(qū)、片段等重組。在優(yōu)選的實施方案中，異源分子包括但不局限于TNF-α、淋巴毒素-α(LT-α，也稱做TNF-β)、LT-β(在LT-α2-β異源三聚體復(fù)合物中發(fā)現(xiàn))、OPGL、FasL、CD27L、CD30L、CD40L、4-1BBL、DcR3、OX40L、TNF-γ(國際公開WO 96/14328)、TRAIL、AIM-II(國際公開WO 97/34911)、APRIL(實驗醫(yī)學(xué)期刊188(6)1185-1190)、內(nèi)因子-α(國際公開WO98/07880)、神經(jīng)因子-α(國際公開WO 98/18921)、TR6-α(國際公開WO 98/30694)、OPG、OC40和神經(jīng)生長因子(NGF)，以及Fas、CD30、CD27、CD40和4-1BB、TR2(國際公開WO 96/34095)、DR3(國際公開WO 97/33904)、DR4(國際公開WO 98/32856)、TR5(國際公開WO 98/30693)、TR7(國際公開WO 98/41629)、TRANK、TR9(國際公開WO 98/56892)、TR10(國際公開WO 98/54202)、312C2(國際公開WO 98/06842)、和TR12的可溶性形式，和CD154、CD70和CD153的可溶性形式。在另外的優(yōu)選的實施方案中，異源分子是TNF家族的任一成員。
為了改善或改變TNFR多肽的特性，可以運用蛋白質(zhì)工程技術(shù)。本領(lǐng)域熟練技術(shù)人員眾所周知的重組DNA技術(shù)可被用于創(chuàng)造包括單個或多個氨基酸替換、缺失、插入或融合蛋白的新型的突變蛋白質(zhì)或“突變蛋白質(zhì)”。這樣的修飾的多肽可以顯示出例如增強的活性或增加的穩(wěn)定性。此外，與相應(yīng)的天然多肽相比它們可至少在某些純化和貯存條件下以更高的產(chǎn)量被純化或顯示出更佳的溶解性。例如，對于許多蛋白質(zhì)來說，包括膜相關(guān)蛋白的胞外區(qū)或分泌蛋白的成熟形式，本領(lǐng)域中眾所周知N末端或C末端的一個或多個氨基酸可在不引起生物學(xué)功能的顯著損失的前提下被去掉。例如，Ron等，生命的化學(xué)期刊，2682984-2988(1993)報道即使3個、8個或27個氨基酸殘基丟失的修飾的KGF蛋白仍然具有肝素鈉結(jié)合活性。
在本發(fā)明中，由于本發(fā)明的蛋白質(zhì)都是TNFR多肽家族的成員，所以去掉其N末端的氨基酸一直到SEQ ID NOS2和4(TNFR-6α和TNFR-6β)的第49位半胱氨酸殘基的蛋白質(zhì)仍然保留一些生物學(xué)活性例如，調(diào)控細胞增殖和凋亡(例如，淋巴細胞)，與Fas配體(FasL)結(jié)合的能力，與AIM-II結(jié)合的能力。在SEQ ID NOS2和4中具有另外的N末端缺失包括第49位半胱氨酸殘基的缺失的多肽就不能再指望其仍然保留活性，這是因為眾所周知TNFR相關(guān)的多肽中的這些殘基是形成提供結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性的二硫橋所必需的，而結(jié)構(gòu)穩(wěn)定是受體/配體結(jié)合和信號傳導(dǎo)所需要的。但是，即使蛋白質(zhì)的N末端去掉一個或多個氨基酸殘基造成了對此蛋白質(zhì)損失了一項或多項生物學(xué)功能的修飾，其它的功能活性仍然保留下來。因此，當(dāng)少于主要部分的氨基酸殘基被從完整TNFR、成熟TNFR或TNFR的胞外區(qū)N末端去除時，此截短的蛋白質(zhì)誘導(dǎo)或結(jié)合識別完整TNFR、成熟TNFR或TNFR的胞外區(qū)的抗體的能力仍然保留下來。利用本文中所描述的常規(guī)方法和其它本領(lǐng)域眾所周知的方法可以很容易地確定某個缺少完整蛋白N末端的多肽是否仍然保留這樣的免疫學(xué)活性。
因此，本發(fā)明另外提供了包含或另外由一個或多個氨基酸殘基從SEQ ID NOS2和4中TNFR氨基端的去除，一直到第49位半胱氨酸殘基被去除的多肽組成的多肽，以及編碼這些多肽的多核苷酸。尤其是，本發(fā)明提供了TNFR多肽，此多肽包含或另外由圖1(SEQ ID NO2)中m-300殘基的氨基酸序列和/或圖2(SEQ ID NO4)中n-170殘基的氨基酸序列組成。其中m和n都是在1-49范圍中的整數(shù)，并且49是完整TNFR-6α和TNFR-6β多肽自N末端起的第一個半胱氨酸殘基位置(如SEQ ID NOS2和4中所示)，據(jù)認為此位置對于TNFR-6α和TNFR-6β蛋白質(zhì)的活性是必需的。
更特別的是，本發(fā)明提供了編碼多肽的多核苷酸，此多肽具有(即，包含)或另外由選自下列組的氨基酸殘基組成的氨基酸序列所組成SEQ ID NO2的1-300，2-300，3-300，4-300，5-300，6-300，7-300，8-300，9-300，10-300，11-300，12-300，13-300，14-300，15-300，16-300，17-300，18-300，19-300，20-300，21-300，22-300，23-300，24-300，25-300，26-300，27-300，28-300，29-300，30-300，31-300，32-300，33-300，34-300，35-300，36-300，37-300，38-300，39-300，40-300，41-300，42-300，43-300，44-300，45-300，46-300，47-300，48-300，和49-300。以及SEQ ID NO4的1-170，2-170，3-170，4-170，5-170，6-170，7-170，8-170，9-170，10-170，11-170，12-170，13-170，14-170，15-170，16-170，17-170，18-170，19-170，20-170，21-170，22-170，23-170，24-170，25-170，26-170，27-170，28-170，29-170，30-170，31-170，32-170，33-170，34-170，35-170，36-170，37-170，38-170，39-170，40-170，41-170，42-170，43-170，44-170，45-170，46-170，47-170，48-170，和49-170。由這些多核苷酸片段編碼的多肽也在本發(fā)明的范圍之內(nèi)。
在一個特定的實施方案中，本發(fā)明提供了編碼包含或另外由選自下列殘基組SEQ ID NO2的第30位纈氨酸到第300位組氨酸的氨基酸序列組成的多肽的多核苷酸。由這些多核苷酸片段編碼的多肽也在本發(fā)明的范圍之內(nèi)。
在其它特定的實施方案中，本發(fā)明提供了編碼包含或另外由選自下列各組SEQ ID NO2的第23位苯丙氨酸到第300位組氨酸，和/或第34位苯丙氨酸到第300位組氨酸的氨基酸序列組成的多肽的多核苷酸。由這些多核苷酸片段編碼的多肽也在本發(fā)明的范圍之內(nèi)。
如上所述，即使蛋白質(zhì)的N末端去掉一個或多個氨基酸殘基造成了對此蛋白質(zhì)損失了一項或多項生物學(xué)功能的修飾，其它的功能活性(例如，生物學(xué)活性)仍然保留下來。因此，當(dāng)少于主要部分的氨基酸殘基被從完整TNFR、成熟TNFR或TNFR的胞外區(qū)N末端去除時，此截短的蛋白質(zhì)誘導(dǎo)或結(jié)合識別完整TNFR、成熟TNFR或TNFR的胞外區(qū)的抗體的能力仍然保留下來。利用本文中所描述的常規(guī)方法和其它本領(lǐng)域眾所周知的方法可以很容易地確定某個缺少完整蛋白N末端的多肽是否仍然保留這樣的免疫學(xué)活性。一帶有許多N末端氨基酸缺失的TNFR突變蛋白質(zhì)仍然保留一些生物學(xué)或免疫學(xué)活性不是不可能的。實際上，由少至6個TNFR氨基酸殘基構(gòu)成的肽即可引起免疫應(yīng)答。
因此，本發(fā)明另外提供了具有如圖1(即，SEQ ID NO2)中所示的一個或多個氨基酸殘基一直到第295位精氨酸殘基被從TNFR-6α氨基末端去除的氨基酸序列的多肽，和編碼這樣的多肽的多核苷酸。尤其是，本發(fā)明提供了包含或另外由圖1(SEQ ID NO2)中n1-300殘基組成的多肽，其中n1是在49-295范圍之間的整數(shù)，對應(yīng)于圖1(SEQ ID NO2)中氨基酸殘基的位置。
更為特別的是，本發(fā)明提供了編碼多肽的多核苷酸，此多肽具有(即，包含)或由選自下列組的氨基酸殘基組成的氨基酸序列所組成圖1(SEQ ID NO2)中所示的TNFR-6α序列的C-49到H-300，A-50到H-300，Q-51到H-300，C-52到H-300，P-53到H-300，P-54到H-300，G-55到H-300，T-56到H-300，F(xiàn)-57到H-300，V-58到H-300，Q-59到H-300，R-60到H-300，P-61到H-300，C-62到H-300，R-63到H-300，R-64到H-300，D-65到H-300，S-66到H-300，P-67到H-300，T-68到H-300，T-69到H-300，C-70到H-300，G-71到H-300，P-72到H-300，C-73到H-300，P-74到H-300，P-75到H-300，R-76到H-300，H-77到H-300，Y-78到H-300，T-79到H-300，Q-80到H-300，F(xiàn)-81到H-300，W-82到H-300，N-83到H-300，Y-84到H-300，L-85到H-300，E-86到H-300，R-87到H-300，C-88到H-300，R-89到H-300，Y-90到H-300，C-91到H-300，N-92到H-300，V-93到H-300，L-94到H-300，C-95到H-300，G-96到H-300，E-97到H-300，R-98到H-300，E-99到H-300，E-100到H-300，E-101到H-300，A-102到H-300，R-103到H-300，A-104到H-300，C-105到H-300，H-106到H-300，A-107到H-300，T-108到H-300，H-109到H-300，N-110到H-300，R-111到H-300，A-112到H-300，C-113到H-300，R-114到H-300，C-115到H-300，R-116到H-300，T-117到H-300，G-118到H-300，F(xiàn)-119到H-300，F(xiàn)-120到H-300，A-121到H-300，H-122到H-300，A-123到H-300，G-124到H-300，F(xiàn)-125到H-300，C-126到H-300，L-127到H-300，E-128到H-300，H-129到H-300，A-130到H-300，S-131到H-300，C-132到H-300，P-133到H-300，P-134到H-300，G-135到H-300，A-136到H-300，G-137到H-300，V-138到H-300，I-139到H-300，A-140到H-300，P-141到H-300，G-142到H-300，T-143到H-300，P-144到H-300，S-145到H-300，Q-146到H-300，N-147到H-300，T-148到H-300，Q-149到H-300，C-150到H-300，Q-151到H-300，P-152到H-300，C-153到H-300，P-154到H-300，P-155到H-300，G-156到H-300，T-157到H-300，F(xiàn)-158到H-300，S-159到H-300，A-160到H-300，S-161到H-300，S-162到H-300，S-163到H-300，S-164到H-300，S-165到H-300，E-166到H-300，Q-167到H-300，C-168到H-300，Q-169到H-300，P-170到H-300，H-171到H-300，R-172到H-300，N-173到H-300，C-174到H-300，T-175到H-300，A-176到H-300，L-177到H-300，G-178到H-300，L-179到H-300，A-180到H-300，L-181到H-300，N-182到H-300，V-183到H-300，P-184到H-300，G-185到H-300，S-186到H-300，S-187到H-300，S-188到H-300，H-189到H-300，D-190到H-300，T-191到H-300，L-192到H-300，C-193到H-300，T-194到H-300，S-195到H-300，C-196到H-300，T-197到H-300，G-198到H-300，F(xiàn)-199到H-300，P-200到H-300，L-201到H-300，S-202到H-300，T-203到H-300，R-204到H-300，V-205到H-300，P-206到H-300，G-207到H-300，A-208到H-300，E-209到H-300，E-210到H-300，C-211到H-300，E-212到H-300，R-213到H-300，A-214到H-300，V-215到H-300，I-216到H-300，D-217到H-300，F(xiàn)-218到H-300，V-219到H-300，A-220到H-300，F(xiàn)-221到H-300，Q-222到H-300，D-223到H-300，I-224到H-300，S-225到H-300，I-226到H-300，K-227到H-300，R-228到H-300，L-229到H-300，Q-230到H-300，R-231到H-300，L-232到H-300，L-233到H-300，Q-234到H-300，A-235到H-300，L-236到H-300，E-237到H-300，A-238到H-300，P-239到H-300，E-240到H-300，G-241到H-300，W-242到H-300，G-243到H-300，P-244到H-300，T-245到H-300，P-246到H-300，R-247到H-300，A-248到H-300，G-249到H-300，R-250到H-300，A-251到H-300，A-252到H-300，L-253到H-300，Q-254到H-300，L-255到H-300，K-256到H-300，L-257到H-300，R-258到H-300，R-259到H-300，R-260到H-300，L-261到H-300，T-262到H-300，E-263到H-300，L-264到H-300，L-265到H-300，G-266到H-300，A-267到H-300，Q-268到H-300，D-269到H-300，G-270到H-300，A-271到H-300，L-272到H-300，L-273到H-300，V-274到H-300，R-275到H-300，L-276到H-300，L-277到H-300，Q-278到H-300，A-279到H-300，L-280到H-300，R-281到H-300，V-282到H-300，A-283到H-300，R-284到H-300，M-285到H-300，P-286到H-300，G-287到H-300，L-288到H-300，E-289到H-300，R-290到H-300，S-291到H-300，V-292到H-300，R-293到H-300，E-294到H-300，和R％-295到H-300。由這些多核苷酸片段編碼的多肽也在本發(fā)明的范圍之內(nèi)。
相似的，已知也有許多生物學(xué)功能性C末端缺失的突變蛋白質(zhì)的例子。例如，去除羧基端8-10個氨基酸殘基，γ干擾素顯示的活性高到10倍(Dobeli等，生物工藝學(xué)期刊7199-216(1988))。在本發(fā)明中，由于本發(fā)明的蛋白質(zhì)是TNFR多肽家族的成員，去除C末端氨基酸殘基直至SEQ ID NOS2和4的分別是第193位和第132位半胱氨酸殘基，可能仍然保留一些功能性活性，例如生物學(xué)活性(例如，調(diào)控細胞增殖和凋亡(例如，淋巴細胞，與Fas配體(FasL)結(jié)合的能力，與AIM-II結(jié)合的能力。))。在SEQ ID NOS2和4中具有另外的N末端缺失包括第193位和第132位半胱氨酸殘基的缺失的多肽就不能再指望其仍然保留活性，這是因為眾所周知TNFR相關(guān)的多肽中的這些殘基是形成提供結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性的二硫橋所必需的，而結(jié)構(gòu)穩(wěn)定是受體結(jié)合所需要的。
但是，即使蛋白質(zhì)的C末端去掉一個或多個氨基酸殘基造成了對此蛋白質(zhì)損失了一項或多項生物學(xué)功能的修飾，其它的功能活性(例如，生物學(xué)活性，形成多聚體的能力，與配體(Fas配體和AIM-II)結(jié)合的能力)仍然保留下來。因此，當(dāng)少于主要部分的氨基酸殘基被從完整、成熟形式蛋白的C末端去除時，此截短的蛋白質(zhì)誘導(dǎo)和/或結(jié)合識別完整、成熟形式蛋白的抗體的能力仍然保留下來。利用本文中所描述的常規(guī)方法和其它本領(lǐng)域眾所周知的方法可以很容易地確定某個缺少完整蛋白C末端的多肽是否仍然保留這樣的免疫學(xué)活性。
因此，本發(fā)明另外提供了具有如SEQ ID NOS2和4中所示的一個或多個氨基酸殘基一直到SEQ ID NOS2和4的分別是第193位和第132位半胱氨酸殘基被從TNFR-6α和TNFR-6β羧基末端去除的氨基酸序列的多肽，和編碼這樣的多肽的多核苷酸。尤其是，本發(fā)明提供了包含或另外分別由SEQ ID NOS2和4中1-y和1-z殘基組成的多肽，其中y是處于193-300范圍之間的整數(shù)，而z是處于132-170范圍之間的整數(shù)。本發(fā)明也提供了編碼這些多肽的多核苷酸。
在某些優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明提供了如下的多肽，其包含或由選自如下一組的成員的氨基酸序列組成，所述的組分別為SEQID NOS2和4中的殘基1-y′和1-z′，其中y′是193-299之間的任何整數(shù)，z是132-169之間的任何整數(shù)。還提供了編碼這些多肽的多核苷酸。
在另外優(yōu)選的特定的實施方案中，本發(fā)明提供了包含或由選自下列各組SEQ ID NO2的第23位脯氨酸到第300位組氨酸，第30位纈氨酸到第300位組氨酸，第34位脯氨酸到第300位組氨酸的氨基酸序列，和SEQ ID NO2的第23位脯氨酸到第170位脯氨酸，第30位纈氨酸到第170位脯氨酸，第34位脯氨酸到第170位組氨酸脯氨酸的氨基酸序列組成的多肽。如文中所述，這些多肽可被融合至異源多肽序列上去。本發(fā)明也提供了編碼這些多肽的多核苷酸和這些融合的多肽。
本發(fā)明也提供了一般描述為具有SEQ ID NO2中m-y殘基和SEQ ID NO4中n-z殘基的氨基端和羧基端都缺失了一個到多個氨基酸殘基的多肽，其中m，n，y和z都是上面所述的整數(shù)。
也如同上面所描述的，即使蛋白質(zhì)的C末端去掉一個或多個氨基酸殘基造成了對此蛋白質(zhì)損失了一項或多項生物學(xué)功能的修飾，其它的功能活性(例如，生物學(xué)活性，形成同源多聚體的能力，與配體(Fas配體和AIM-II)結(jié)合的能力)仍然保留下來。例如，當(dāng)少于主要部分的氨基酸殘基被從完整、成熟形式蛋白的C末端去除時，此截短的TNFR突變蛋白質(zhì)蛋白質(zhì)誘導(dǎo)和/或結(jié)合識別完整、成熟形式蛋白的抗體的能力仍然保留下來。利用本文中所描述的常規(guī)方法和其它本領(lǐng)域眾所周知的方法可以很容易地確定某個缺少完整蛋白C末端的多肽是否仍然保留這樣的免疫學(xué)活性。一段帶有許多C末端氨基酸缺失的TNFR突變蛋白質(zhì)仍然保留一些生物學(xué)或免疫學(xué)活性不是不可能的。實際上，由少到6個TNFR氨基酸殘基構(gòu)成的肽即可激發(fā)免疫應(yīng)答。
因此，本發(fā)明另外提供了具有如圖1(即，SEQ ID NO2)中所示的一個或多個氨基酸殘基一直到第6位甘氨酸殘基被從TNFR多肽羧基末端去除的氨基酸序列的多肽，和編碼這樣的多肽的多核苷酸。尤其是，本發(fā)明提供了包含或另外由圖1(即，SEQ ID NO2)中1-m1殘基組成的多肽，其中m1是在6-299范圍之間的整數(shù)，對應(yīng)于圖1(SEQ ID NO2)中氨基酸殘基的位置。
更為特別的是，本發(fā)明提供了編碼多肽的多核苷酸，此多肽包含或由選自下列組的氨基酸殘基組成的氨基酸序列所組成圖1(SEQID NO2)中所示的TNFR序列的M-1到V-299，M-1到P-298，，M-1到L-297，M-1到F-296，M-1到R-295，M-1到E-294，M-1到R-293，M-1到V-292，M-1到S-291，M-1到R-290，M-1到E-289，M-1到L-288，M-1到G-287，M-1到P-286，M-1到M-285，M-1到R-284，M-1到A-283，M-1到V-282，M-1到R-281，M-1到L-280，M-1到A-279，M-1到Q-278，M-1到L-277，M-1到A-271，M-1到G-270，M-1到D-169，M-1到Q-268，M-1到A-267，M-1到G-266，M-1到L-265，M-1到L-264，M-1到E-263，M-1到T-262，M-1到L-261，M-1到R-260，M-1到R-259，M-1到R-258，M-1到L-257，M-1到K-256，M-1到L-255，M-1到Q-254，M-1到L-253，M-1到A-252，M-1到A-251，M-1到R-250，M-1到G-249，M-1到A-248，M-1到R-247，M-1到P-246，M-1到T-245，M-1到P-244，M-1到G-243，M-1到W-242，M-1到G-241，M-1到E-240，M-1到P-239，M-1到A-238，M-1到E-237，M-1到L-236，M-1到A-235，M-1到Q-234，M-1到L-233，M-1到L-232，M-1到R-231，M-1到Q-230，M-1到L-229，M-1到R-228，M-1到K-227，M-1到I-226，M-1到S-225，M-1到I-224，M-1到D-223，M-1到Q-222，M-1到F-221，M-1到A-220，M-1到V-219，M-1到F-218，M-1到D-217，M-1到I-216，M-1到V-215，M-1到A-214，M-1到R-213，M-1到E-212，M-1到C-211，M-1到E-210，M-1到E-209，M-1到A-208，M-1到G-207，M-1到P-206，M-1到V-205，M-1到R-204，M-1到T-203，M-1到S-202，M-1到L-201，M-1到P-200，M-1到F-199，M-1到G-198，M-1到T-197，M-1到C-196，M-1到S-195，M-1到T-194，M-1到C-193，M-1到L-192，M-1到T-191，M-1到D-190，M-1到H-189，M-1到S-188，M-1到S-187，M-1到S-186，M-1到G-185，M-1到P-184，M-1到V-183，M-1到N-182，M-1到L-181，M-1到A-180，M-1到L-179，M-1到G-178，M-1到L-177，M-1到A-176，M-1到T-175，M-1到C-174，M-1到N-173，M-1到R-172，M-1到H-171，M-1到P-170，M-1到Q-169，M-1到C-168，M-1到Q-167，M-1到E-166，M-1到S-165，M-1到S-164，M-1到S-163，M-1到S-162，M-1到S-161VA-160，M-1到S-159，M-1到F-158，M-1到T-157，M-1到G-156，M-1到P-155，M-1到P-154，M-1到C-153，M-1到P-152，M-1到Q-151，M-1到C-150，M-1到Q-149，M-1到T-148，M-1到N-147，M-1到Q-146，M-1到S-145，M-1到P-144，M-1到T-143，M-1到G-142，M-1到P-141，M-1到A-140，M-1到I-139，M-1到V-138，M-1到G-137，M-1到A-136，M-1到G-135，M-1到P-134，M-1到P-133，M-1到C-132，M-1到S-131，M-1到A-130，M-1到H-129，M-1到E-128，M-1到L-127，M-1到C-126，M-1到F-125，M-1到G-124，M-1到A-123，M-1到H-122，M-1到A-121，M-1到F-120，M-1到F-119，M-1到G-118，M-1到T-117，M-1到R-116，M-1到C-115，M-1到R-114，M-1到C-113，M-1到A-112，M-1到R-111，M-1到N-110，M-1到H-109，M-1到T-108，M-1到A-107，M-1到H-106，M-1到C-105，M-1到A-104，M-1到R-103，M-1到A-102，M-1到E-101，M-1到E-100，M-1到E-99，M-1到R-98，M-1到E-97，M-1到G-96，M-1到C-95，M-1到L-94，M-1到V-93，M-1到N-92，M-1到C-91，M-1到Y(jié)-90，M-1到R-89，M-1到C-88，M-1到R-87，M-1到E-86，M-1到L-85，M-1到Y(jié)-84，M-1到N-83，M-1到W-82，M-1到F-81，M-1到Q-80，M-1到T-79，M-1到Y(jié)-78，M-1到H-77，M-1到R-76，M-1到P-75，M-1到P-74，M-1到C-73，M-1到P-72，M-1到G-71，M-1到C-70，M-1到T-69，M-1到T-68，M-1到P-67，M-1到S-66，M-1到D-65，M-1到R-64，M-1到R-63，M-1到C-62，M-1到P-61，M-1到R-60，M-1到Q-59，M-1到V-58，M-1到F-57，M-1到T-56，M-1到G-55，M-1到P-54，M-1到P-53，M-1到C-52，M-1到Q-51，M-1到A-50，M-1到C-49，M-1到V-48，M-1到L-47，M-1到R-46，M-1到E-45，M-1到G-44，M-1到T-43，M-1到E-42，M-1到A-41，M-1到D-40，M-1到R-39，M-1到W-38，M-1到P-37，M-1到Y(jié)-36，M-1到T-35，M-1到P-34，M-1到T-33，M-1到E-32，M-1到A-31，M-1到V-30，M-1到G-29，M-1到R-28，M-1到V-27，M-1到A-26，M-1到P-25，M-1到V-24，M-1到P-23，M-1到L-22，M-1到L-21，M-1到A-20，M-1到P-19，M-1到L-18，M-1到A-17，M-1到L-16，M-1到V-15，M-1到L-14，M-1到C-13，M-1到L-12，M-1到L-11，M-1到S-10，M-1到L-9，M-1到G-8，M-1到P-7，和M-1到G-6。由這些多核苷酸片段編碼的多肽也在本發(fā)明的范圍之內(nèi)。
在一個特定的實施方案中，本發(fā)明提供了編碼包含或另外由選自下列各組氨基酸殘基SEQ ID NO2的M-1到A-271，M-1到Q-254和/或M-1到F-221的氨基酸序列組成的多肽的多核苷酸。由這些多核苷酸片段編碼的多肽也在本發(fā)明的范圍之內(nèi)。
本發(fā)明也提供了具有一個或多個氨基酸被從TNFR多肽的氨基端和羧基端去除的多肽，也被一般描述為具有如圖1(即，SEQ IDNO2)中n1-m1殘基，其中n1和m1是如上所述的整數(shù)。
在另外的實施方案中，本發(fā)明提供了包含或另外由圖1(即，SEQID NO2)中30-m3殘基組成的氨基酸序列的多肽，其中m3是在36-299范圍之間的整數(shù)，對應(yīng)于圖1(SEQ ID NO2)中氨基酸殘基的位置。例如，本發(fā)明提供了編碼多肽的多核苷酸，此多肽包含或由選自下列組的氨基酸殘基組成的氨基酸序列所組成圖1(SEQ ID NO2)中所示的TNFR序列的V-30到V-299，V-30到P-298，V-30到L-297，V-30到F-296，V-30到R-295，V-30到E-294，V-30到R-293，V-30到V-292，V-30到S-291，V-30到R-290，V-30到E-289，V-30到L-288，V-30到G-287，V-30到P-286，V-30到M-285，V-30到R-284，V-30到A-283，V-30到V-282，V-30到R-281，V-30到L-280，V-30到A-279，V-30到0-278，V-30到L-277，V-30到A-271，V-30到G-270，V-30到D-169，V-30到Q-268，V-30到A-267，V-30到G-266，V-30到L-265，V-30到L-264，V-30到E-263，V-30到T-262，V-30到L-261，V-30到R-260，V-30到R-259，V-30到R-258，V-30到L-257，V-30到K-256，V-30到L-255，V-30到Q-254，V-30到L-253，V-30到A-252，V-30到A-251，V-30到R-250，V-30到G-249，V-30到A-248，V-30到R-247，V-30到P-246，V-30到T-245，V-30到P-244，V-30到G-243，V-30到W-242，V-30到G-241，V-30到E-240，V-30到P-239，V-30到A-238，V-30到E-237，V-30到L-236，V-30到A-235，V-30到Q-234，V-30到L-233，V-30到L-232，V-30到R-231，V-30到Q-230，V-30到L-229，V-30到R-228，V-30到K-227，V-30到I-226，V-30到S-225，V-30到I-224，V-30到D-223，V-30到Q-222，V-30到F-221，V-30到A-220，V-30到V-219，V-30到F-218，V-30到D-217，V-30到I-216，V-30到V-215，V-30到A-214，V-30到R-213，V-30到E-212，V-30到C-211，V-30到E-210，V-30到E-209，V-30到A-208，V-30到G-207，V-30到P-206，V-30到V-205，V-30到R-204，V-30到T-203，V-30到S-202，V-30到L-201，V-30到P-200，V-30到F-199，V-30到G-198，V-30到T-197，V-30到C-196，V-30到S-195，V-30到T-194，V-30到C-193，V-30到L-192，V-30到T-191，V-30到D-190，V-30到H-189，V-30到S-188，V-30到S-187，V-30到S-186，V-30到G-185，V-30到P-184，V-30到V-183，V-30到N-182，V-30到L-181，V-30到A-180，V-30到L-179，V-30到G-178，V-30到L-177，V-30到A-176，V-30到T-175，V-30到C-174，V-30到N-173，V-30到R-172，V-30到H-171，V-30到P-170，V-30到Q-169，V-30到C-168，V-30到Q-167，V-30到E-166，V-30到S-165，V-30到S-164，V-30到S-163，V-30到S-162，V-30到S-161，V-30到A-160，V-30到S-159，V-30到F-158，V-30到T-157，V-30到G-156，V-30到P-155，V-30到P-154，V-30到C-153，V-30到P-152，V-30到Q-151，V-30到C-150，V-30到Q-149，V-30到T-148，V-30到N-147，V-30到Q-146，V-30到S-145，V-30到P-144，V-30到T-143，V-30到G-142，V-30到P-141，V-30到A-140，V-30到I-139，V-30到V-138，V-30到G-137，V-30到A-136，V-30到G-135，V-30到P-134，V-30到P-133，V-30到C-132，V-30到S-131，V-30到A-130，V-30到H-129，V-30到E-128，V-30到L-127，V-30到C-126，V-30到F-125，V-30到G-124，V-30到A-123，V-30到H-122，V-30到A-121，V-30到F-120，V-30到F-119，V-30到G-118，V-30到T-117，V-30到R-116，V-30到C-115，V-30到R-114，V-30到C-113，V-30到A-112，V-30到R-111，V-30到N-110，V-30到H-109，V-30到T-108，V-30到A-107，V-30到H-106，V-30到C-105，V-30到A-104，V-30到R-103，V-30到A-102，V-30到E-101，V-30到E-100，V-30到E-99，V-30到R-98，V-30到E-97，V-30到G-96，V-30到C-95，V-30到L-94，V-30到V-93，V-30到N-92，V-30到C-91，V-30到Y(jié)-90，V-30到R-89，V-30到C-88，V-30到R-87，V-30到E-86，V-30到L-85，V-30到Y(jié)-84，V-30到N-83，V-30到W-82，V-30到F-81，V-30到Q-80，V-30到T-79，V-30到Y(jié)-78，V-30到H-77，V-30到R-76，V-30到P-75，V-30到P-74，V-30到C-73，V-30到P-72，V-30到G-71，V-30到C-70，V-30到T-69，V-30到T-68，V-30到P-67，V-30到S-66，V-30到D-65，V-30到R-64，V-30到R-63，V-30到C-62，V-30到P-61，V-30到R-60，V-30到Q-59，V-30到V-58，V-30到F-57，V-30到T-56，V-30到G-55，V-30到P-54，V-30到P-53，V-30到C-52，V-30到Q-51，V-30到A-50，V-30到C-49，V-30到V-48，V-30到L-47，V-30到R-46，V-30到E-45，V-30到G-44，V-30到T-43，V-30到E-42，V-30到A-41，V-30到D-40，V-30到R-39，V-30到W-38，V-30到P-37，和V-30到Y(jié)-36。由這些多核苷酸片段編碼的多肽也在本發(fā)明的范圍之內(nèi)。在一個特定的實施方案中，本發(fā)明提供了編碼包含或另外由選自下列各組氨基酸殘基SEQ ID NO2的V-30到A-271，V-30到Q-254和/或V-30到F-221的氨基酸序列組成的多肽的多核苷酸。由這些多核苷酸片段編碼的多肽也在本發(fā)明的范圍之內(nèi)。本發(fā)明也指向包含或由與上面所述的多核苷酸或多肽序列分別具有至少80％，85％，90％，92％，95％，96％，97％，98％或99％相同性的多核苷酸或多肽序列組成的多核苷酸或多肽。本發(fā)明也包括分別與異源多核苷酸或多肽序列融合的多核苷酸或多肽序列。
至于TNFR-6β的片段，正如上面所述的，即使蛋白質(zhì)的N末端去掉一個或多個氨基酸殘基造成了對此蛋白質(zhì)損失了一項或多項生物學(xué)功能的修飾，其它的功能活性(例如，生物學(xué)活性，形成多聚體的能力，與配體(Fas配體和AIM-II)結(jié)合的能力)仍然保留下來。例如，當(dāng)少于主要部分的氨基酸殘基被從完整、成熟形式蛋白的N末端去除時，此截短的TNFR突變蛋白質(zhì)蛋白質(zhì)誘導(dǎo)和/或結(jié)合識別完整、成熟形式蛋白的抗體的能力仍然保留下來。利用本文中所描述的常規(guī)方法和其它本領(lǐng)域眾所周知的方法可以很容易地確定某個缺少完整蛋白N末端的多肽是否仍然保留這樣的免疫學(xué)活性。一段帶有許多N末端氨基酸缺失的TNFR突變蛋白質(zhì)仍然保留一些生物學(xué)或免疫學(xué)活性不是不可能的。實際上，由少至6個TNFR氨基酸殘基構(gòu)成的肽即可引起免疫應(yīng)答。
因此，本發(fā)明另外提供了包含或由如圖2(即，SEQ ID NO4)中所示的一個或多個氨基酸殘基一直到第165位甘氨酸殘基被從TNFR-6β多肽氨基末端去除的氨基酸序列的多肽，和編碼這樣的多肽的多核苷酸。尤其是，本發(fā)明提供了包含或另外由圖2(即，SEQ IDNO4)中n2-170殘基組成的多肽，其中n2是在2-165范圍之間的整數(shù)，對應(yīng)于圖2(SEQ ID NO4)中氨基酸殘基的位置。
更為特別的是，本發(fā)明提供了編碼多肽的多核苷酸，此多肽包含或由選自下列組的氨基酸殘基組成的氨基酸序列所組成圖2(SEQID NO4)中所示的TNFR-6β序列的R-2到P-170，A-3到P-170，L-4到P-170，E-5到P-170，G-6到P-170，P-7到P-170，G-8到P-17，L-9到P-170，S-10到P-170，L-11到P-170，L-12到P-170，C-13到P-170，L-14到P-170，V-15到P-170，L-16到P-170，A-17到P-170，L-18到P-170，P-19到P-170，A-20到P-170，L-21到P-170，L-22到P-170，P-23到P-170，V-24到P-170，P-25到P-170，A-26到P-170，V-27到P-170，R-28到P-170，G-29到P-170，V-30到P-170，A-31到P-170，E-32到P-170，T-33到P-170，P-34到P-170，T-35到P-170，Y-36到P-170，P-37到P-170，W-38到P-170，R-39到P-170，D-40到P-170，A-41到P-170，E-42到P-170，T-43到P-170，G-44到P-170，E-45到P-170，R-46到P-170，L-47到P-170，V-48到P-170，C-49到P-170，A-50到P-170，Q-51到P-170，C-52到P-170，P-53到P-170，P-54到P-170，G-55到P-170，T-56到P-170，F(xiàn)-57到P-170，V-58到P-170，Q-59到P-170，R-60到P-170，P-61到P-170，C-62到P-170，R-63到P-170，R-64到P-170，D-65到P-170，S-66到P-170，P-67到P-170，T-68到P-170，T-69到P-170，C-70到P-170，G-71到P-170，P-72到P-170，C-73到P-170，P-74到P-170，P-75到P-170，R-76到P-170，H-77到P-170，Y-78到P-170，T-79到P-170，Q-80到P-170，F(xiàn)-81到P-170，W-82到P-170，N-83到P-170，Y-84到P-170，L-85到P-170，E-86到P-170，R-87到P-170，C-88到P-170，R-89到P-170，Y-90到P-170，C-91到P-170，N-92到P-170，V-93到P-170，L-94到P-170，C-95到P-170，G-96到P-170，E-97到P-170，R-98到P-170，E-99到P-170，E-100到P-170，E-101到P-170，A-102到P-170，R-103到P-170，A-104到P-170，C-105到P-170，H-106到P-170，A-107到P-170，T-108到P-170，H-109到P-170，N-110到P-170，R-111到P-170，A-112到P-170，C-113到P-170，R-114到P-170，C-115到P-170，R-116到P-170，T-117到P-170，G-118到P-170，F(xiàn)-119到P-170，F(xiàn)-120到P-170，A-121到P-170，H-122到P-170，A-123到P-170，G-124到P-170，F(xiàn)-125到P-170，C-126到P-170，L-127到P-170，E-128到P-170，H-129到P-170，A-130到P-170，S-131到P-170，C-132到P-170，P-133到P-170，P-134到P-170，G-135到P-170，A-136到P-170，G-137到P-170，V-138到P-170，I-139到P-170，A-140到P-170，P-141到P-170，G-142到P-170，E-143到P-170，S-144到P-170，W-145到P-170，A-146到P-170，R-147到P-170，G-148到P-170，G-149到P-170，A-150到P-170，P-151到P-170，R-152到P-170，S-153到P-170，G-154到P-170，G-155到P-170，R-156到P-170，R-157到P-170，C-158到P-170，G-159到P-170，R-160到P-170，G-161到P-170，Q-162到P-170，V-163到P-170，A-164到P-170，和G-165到P-170。由這些多核苷酸片段編碼的多肽也在本發(fā)明的范圍之內(nèi)。
也如同上面所描述的，即使蛋白質(zhì)的C末端去掉一個或多個氨基酸殘基造成了對此蛋白質(zhì)損失了一項或多項生物學(xué)功能的修飾，其它的功能活性(例如，生物學(xué)活性，形成多聚體的能力，與配體(Fas配體和AIM-II)結(jié)合的能力)仍然保留下來。例如，當(dāng)少于主要部分的氨基酸殘基被從完整、成熟形式蛋白的C末端去除時，此截短的TNFR-6β突變蛋白質(zhì)誘導(dǎo)和/或結(jié)合識別完整、成熟形式蛋白的抗體的能力仍然保留下來。利用本文中所描述的常規(guī)方法和其它本領(lǐng)域眾所周知的方法可以很容易地確定某個缺少完整蛋白C末端的多肽是否仍然保留這樣的免疫學(xué)活性。一段帶有許多C末端氨基酸缺失的TNFR-6β突變蛋白質(zhì)仍然保留一些生物學(xué)或免疫學(xué)活性不是不可能的。實際上，由少至6個TNFR-6β氨基酸殘基構(gòu)成的肽即可引起免疫應(yīng)答。
因此，本發(fā)明另外提供了具有如圖2(即，SEQ ID NO4)中所示的一個或多個氨基酸殘基一直到第6位甘氨酸殘基被從TNFR-6β多肽羧基末端去除的氨基酸序列的多肽，和編碼這樣的多肽的多核苷酸。尤其是，本發(fā)明提供了包含或另外由圖2(即，SEQ ID NO4)中1-m2殘基組成的多肽，其中m2是在6-169范圍之間的整數(shù)，對應(yīng)于圖2(SEQ ID NO4)中氨基酸殘基的位置。
更為特別的是，本發(fā)明提供了編碼多肽的多核苷酸，此多肽包含或由選自下列各組的氨基酸殘基組成的氨基酸序列所組成圖2(SEQ ID NO4)中所示的TNFR-6β序列的M-1到A-169，M-1到L-168，M-1到S-167，M-1到P-166，M-1到G-165，M-1到A-164，M-1到V-163，M-1到Q-162，M-1到G-161，M-1到R-160，M-1到G-159，M-1到C-158，M-1到R-157，M-1到R-156，M-1到G-155，M-1到G-154，M-1到S-153，M-1到R-152，M-1到P-151，M-1到A-150，M-1到G-149，M-1到G-148，M-1到R-147，M-1到A-146，M-1到W-145，M-1到S-144，M-1到E-143，M-1到G-142，M-1到P-141，M-1到A-140，M-1到I-139，M-1到V-138，M-1到G-137，M-1到A-136，M-1到G-135，M-1到P-134，M-1到P-133，M-1到C-132，M-1到S-131，M-1到A-130，M-1到H-129，M-1到E-128，M-1到L-127，M-1到C-126，M-1到F-125，M-1到G-124，M-1到A-123，M-1到H-122，M-1到A-121，M-1到F-120，M-1到F-119，M-1到G-118，M-1到T-117，M-1到R-116，M-1到C-115，M-1到R-114，M-1到C-113，M-1到A-112，M-1到R-111，M-1到N-110，M-1到H-109，M-1到T-108，M-1到A-107，M-1到H-106，M-1到C-105，M-1到A-104，M-1到R-103，M-1到A-102，M-1到E-101，M-1到E-100，M-1到E-99，M-1到R-98，M-1到E-97，M-1到G-96，M-1到C-95，M-1到L-94，M-1到V-93，M-1到N-92，M-1到C-91，M-1到Y(jié)-90，M-1到R-89，M-1到C-88，M-1到R-87，M-1到E-86，M-1到L-85，M-1到Y(jié)-84，M-1到N-83，M-1到W-82，M-1到F-81，M-1到Q-80，M-1到T-79，M-1到Y(jié)-78，M-1到H-77，M-1到R-76，M-1到P-75，M-1到P-74，M-1到C-73，M-1到P-72，M-1到G-71，M-1到C-70，M-1到T-69，M-1到T-68，M-1到P-67，M-1到S-66，M-1到D-65，M-1到R-64，M-1到R-63，M-1到C-62，M-1到P-61，M-1到R-60，M-1到Q-59，M-1到V-58，M-1到F-57，M-1到T-56，M-1到G-55，M-1到P-54，M-1到P-53，M-1到C-52，M-1到Q-51，M-1到A-50，M-1到C-49，M-1到V-48，M-1到L-47，M-1到R-46，M-1到E-45，M-1到G-44，M-1到T-43，M-1到E-42，M-1到A-41，M-1到D-40，M-1到R-39，M-1到W-38，M-1到P-37，M-1到Y(jié)-36，M-1到T-35，M-1到P-34，M-1到T-33，M-1到E-32，M-1到A-31，M-1到V-30，M-1到G-29，M-1到R-28，M-1到V-27，M-1到A-26，M-1到P-25，M-1到V-24，M-1到P-23，M-1到L-22，M-1到L-21，M-1到A-20，M-1到P-19，M-1到L-18，M-1到A-17，M-1到L-16，M-1到V-15，M-1到L-14，M-1到C-13，M-1到L-12，M-1到L-11，M-1到S-10，M-1到L-9，M-1到G-8，和M-1到P-7。由這些多核苷酸片段編碼的多肽也在本發(fā)明的范圍之內(nèi)。
本發(fā)明也提供了具有一個或多個氨基酸被從TNFR多肽的氨基端和羧基端去除的多肽，也被一般描述為具有如圖2(即，SEQ IDNO4)中n2-m2殘基，其中n2和m2是如上所述的整數(shù)。
本發(fā)明也涉及包含或由與本文所述的編碼TNFR多肽的如文中m-y、n-z、n1-m1、30-m3和/或n2-m2的多核苷酸序列分別具有至少90％，92％，95％，96％，97％，98％或99％相同性的多核苷酸序列組成的核酸分子。在優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明指向包含或由與上面所述的編碼如文中引用的N末端或C末端具有氨基酸缺失的多肽的多核苷酸序列分別具有至少90％，92％，95％，96％，97％，98％或99％相同性的多核苷酸序列組成的核酸分子。本發(fā)明也包含融合至異源多核苷酸序列的上述多核苷酸序列。由這些核酸分子和/或多核苷酸序列所編碼的多肽也在本發(fā)明的范圍之內(nèi)。
本發(fā)明也包括編碼由ATCC保藏號97810或97809中所含有的cDNA克隆編碼的完整TNFR氨基酸序列的一部分組成的多肽的核苷酸序列，其中這部分不包括分別由ATCC保藏號97810和97809中所含有的cDNA克隆編碼的完整TNFR氨基酸序列氨基端第1位至第49位氨基酸殘基，分別由ATCC保藏號97810和97809中所含有的cDNA克隆編碼的完整氨基酸序列羧基端第1位至第107或58位氨基酸殘基，以及分別由ATCC保藏號97810或97809中所含有的cDNA克隆編碼的完整氨基酸序列上述羧基端或氨基端缺失的任一組合。由以上所有多核苷酸序列所編碼的多肽也在本發(fā)明的范圍之內(nèi)。
除了上面所討論的蛋白質(zhì)的末端缺失形式之外，本領(lǐng)域普通技術(shù)人員也會認識到TNFR多肽的一些氨基酸序列可在不顯著影響蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)或功能的情況下做一些改變。如果設(shè)想到序列中的這些不同之處，應(yīng)該記住的是在蛋白質(zhì)中存在決定活性的關(guān)鍵區(qū)。
因此，本發(fā)明另外提供了TNFR多肽的變異，此變異顯示TNFR多肽的主要功能活性(例如，免疫原性活性，生物學(xué)活性)，或TNFR蛋白的一些功能區(qū)例如下面所討論的蛋白質(zhì)部分。根據(jù)本領(lǐng)域眾所周知的普通規(guī)則所選擇的包括缺失、插入、倒置、重復(fù)和類型替換在內(nèi)的這樣的突變體對活性的影響很小。例如，在Bowie，J.U.等，“解讀蛋白質(zhì)序列中的信息對氨基酸替換的耐受”，科學(xué)2471306-1310(1990)中提供了關(guān)于如何制造表型沉默的氨基酸替換的指導(dǎo)，其中作者指出有兩種主要的研究所要改變的氨基酸序列的耐受性的方法。第一種方法依賴于進化過程，其中突變或被自然選擇所接受或被排斥。第二種方法是使用基因工程技術(shù)向克隆的基因的特定位置引入氨基酸改變，然后選擇、篩選和鑒定維持功能的序列。正如作者所說明的，這些研究已經(jīng)揭示出蛋白質(zhì)對氨基酸替換具有另人驚奇地耐受。作者進一步表明在蛋白質(zhì)某些位置中那些氨基酸改變是可能允許的。例如，大多數(shù)深埋在內(nèi)部的氨基酸殘基需要非極性側(cè)鏈，而表面?zhèn)孺湹暮苌賻讉€特性是保守的。在Bowie，J.U.等，supra中描述了其它這樣的表型沉默替換，參考文獻引入本文做參考。典型地被視做是保守性替換的是置換，用一種脂肪族氨基酸如丙氨酸、纈氨酸、亮氨酸和異亮氨酸置換另外一種；內(nèi)部交換絲氨酸和蘇氨酸的羥基，交換天冬氨酸和谷氨酸的酸性殘基，天冬酰胺和谷氨酰胺之間酰胺殘基的替換，賴氨酸和精氨酸之間堿性殘基的交換以及苯丙氨酸和色氨酸之間芳香族殘基的置換。因此，SEQ ID NO2，4或6的或由保藏的cDNA編碼的多肽的衍生物、類似物或片段可以是如下一種(i)其中一個或多個氨基酸殘基被保守的或非保守的氨基酸殘基(優(yōu)選一種保守的氨基酸殘基)替換，并且這個替換的氨基酸殘基可能是也可能不是由遺傳密碼編碼的；或(ii)其中一個或多個氨基酸殘基包括一個可替換基團，或(iii)其中成熟的或可溶性的細胞外多肽與另外一種化合物例如可以增加多肽半衰期的化合物(例如，聚乙二醇)融合，或(iv)其中另外的氨基酸(例如，IgG Fc肽融合體和/或免疫球蛋白輕鏈恒定區(qū)肽)被融合至文中所述的TNFR多肽上。這樣的片段、衍生物和類似物被視做經(jīng)過文中的教導(dǎo)應(yīng)在本領(lǐng)域熟練技術(shù)人員掌握的范圍之內(nèi)。
因此，本發(fā)明的TNFR多肽可能包含一個或多個來自自然突變或人為操作的氨基酸替換、缺失或添加。正如文中所述，改變優(yōu)選是一種次要特性，例如并不顯著影響蛋白質(zhì)折疊或蛋白質(zhì)活性的保守性氨基酸替換(見表III)。表III保守性氨基酸替換
本發(fā)明TNFR蛋白中功能必需的氨基酸可以通過本領(lǐng)域所熟知的方法鑒定出來，例如定點誘變或丙氨酸掃描誘變(Cunningham和Wells，科學(xué)2441081-1085(1989))。后一方法向分子中的每一個殘基上引入丙氨酸突變。然后測定產(chǎn)物突變體分子的功能活性例如配體/受體(例如Fas配體和/或AIM-II)結(jié)合或體外或體內(nèi)增殖活性。
我們所特別感興趣的是用其它帶電荷的或中性的氨基酸替換帶電荷的氨基酸，所產(chǎn)生的蛋白質(zhì)具有我們所希望的高度改進的特性例如減少凝集。凝集不僅降低活性而且在制備藥物制劑中會產(chǎn)生問題，因為凝集可以導(dǎo)致免疫原性(Pinckard等，臨床實驗免疫學(xué)2331-340(1967)；Robbins等，糖尿病36838-845(1987)；Cleland等，治療性藥物載體系統(tǒng)評論10307-377(1993))。
氨基酸替換也會改變配體與細胞表面受體結(jié)合的選擇性。例如，Ostade等，自然361266-268(1993)描述了某些導(dǎo)致TNF-α僅與兩種已知的TNF受體中的一種選擇性結(jié)合的突變。對配體-受體結(jié)合很關(guān)鍵的位點可以通過結(jié)構(gòu)分析例如晶體化、核磁共振或圖象親和標記等技術(shù)確定(Smith等，分子生物學(xué)期刊224899-904(1992)和de Vos等，科學(xué)255306-312(1992))。
由于TNFR-6α和TNFR-6β是TNF受體相關(guān)的蛋白質(zhì)家族的成員，去調(diào)控而不是完全消除TNFR生物學(xué)活性的優(yōu)選的突變是在TNF保守的胞外區(qū)的氨基酸編碼序列，更優(yōu)選在此功能區(qū)內(nèi)TNF受體家族各成員間不保守的殘基上進行的。也作為本發(fā)明一部分的是含有編碼上述TNFR突變體的核酸序列的分離的多核苷酸。
本發(fā)明的多肽優(yōu)選以分離的形式提供，并且優(yōu)選是基本純化的。重組生產(chǎn)的TNFR多肽可以通過在Smith和Johnson，基因6731-40(1988)中所描述的一步法而進行基本純化。本發(fā)明的天然或重組來源的多肽也可以通過蛋白質(zhì)純化領(lǐng)域眾所周知的方法利用本發(fā)明的TNFR-6α和TNFR-6β的抗體進行純化。
本發(fā)明另外提供了包含有選自以下一組的氨基酸序列的分離的TNFR多肽(a)具有SEQ ID NOS2和4中所示的，或如在ATCC保藏號為97810或97809中所包含的cDNA克隆所編碼的完整氨基酸序列的全長TNFR多肽的氨基酸序列；(b)具有SEQ ID NO2中31-300位氨基酸序列或SEQ ID NO4中31-170位氨基酸序列的，或如在ATCC保藏號為97810或97809中所包含的cDNA克隆所編碼的成熟TNFR多肽的氨基酸序列；(c)具有SEQ ID NO2中31-283位氨基酸序列或SEQ ID NO4中31-166位氨基酸序列的，或如在ATCC保藏號為97810或97809中所包含的cDNA克隆所編碼的TNFR多肽的可溶性胞外區(qū)的氨基酸序列。
本發(fā)明另外的多肽包括與上述氨基酸序列具有至少90％相似性，更優(yōu)選至少80％，85％，90％，92％或95％相似性，甚至更優(yōu)選96％，97％，98％或99％相似性的多肽。本發(fā)明的多肽也包括與保藏的cDNA編碼的多肽(ATCC保藏號為97810或97809)，與SEQ IDNOS2和4中的多肽具有至少90％相似性，更優(yōu)選至少80％，85％，90％，92％或95％相似性，甚至更優(yōu)選96％，97％，98％或99％相似性的多肽，以及這樣的多肽的具有至少30個氨基酸更優(yōu)選具有至少50個氨基酸的部分。
兩種多肽的“％相似性”意指使用Bestfit程序(位于威斯康星州麥迪遜科學(xué)大道575號的大學(xué)研究園遺傳計算機研究組的用于UNIX系統(tǒng)的威斯康星序列分析包第8版)對兩種多肽的氨基酸序列進行比較所得出的相似性數(shù)值，并且程序的默認設(shè)置用以測定相似性。Bestfit程序利用Smith和Waterman應(yīng)用數(shù)學(xué)進展2482-489(1981)中的局部同源性原理以尋找兩種序列之間最佳的相似性片段。
與TNFR多肽的參考氨基酸序列具有，例如，至少95％“相同性”的多肽意指除了TNFR多肽參考氨基酸的每100個氨基酸中可以最多包括5個氨基酸改變之外，多肽的氨基酸序列與參考序列是相同的。換句話說，要獲得與參考氨基酸序列具有至少80％，85％，90％，92％或95％相同性的氨基酸序列的多肽，參考氨基酸序列中最多5％的氨基酸殘基可被缺失或被其它氨基酸殘基所替換，或者最多相當(dāng)于總氨基酸殘基5％的氨基酸可被插入到參考序列中。參考序列的這些突變可以發(fā)生在參考氨基酸序列的氨基端或羧基端，或兩端之間的任何位置，單個散布在參考序列的殘基中或在參考序列的一個或多個連續(xù)的組中。
在實際操作中，任何特定的多肽分子是否與例如SEQ ID NOS2和4中所示的氨基酸序列，或由ATCC保藏號為97810或97809的保藏的cDNA克隆中所編碼的氨基酸序列，或其片段(例如，對應(yīng)于TNFR N末端或C末端缺失的任何一種多肽的序列，正如文中所述(例如，具有SEQ ID NO2中第30位至第300位氨基酸序列的多肽))具有至少80％，85％，90％，92％，95％，96％，97％，98％或99％的相同性可以很方便地用已知的計算機程序例如Bestfit程序(位于威斯康星州麥迪遜科學(xué)大道575號的大學(xué)研究園遺傳計算機研究組的用于UNIX系統(tǒng)的威斯康星序列分析包第8版)來確定。當(dāng)利用Bestfit程序或其它序列比較程序去確定是否一段特定序列與本發(fā)明的參考序列具有例如95％的相同性時，參數(shù)是這樣設(shè)置的，相同性百分比是在全長參考氨基酸序列的基礎(chǔ)上計算出的并且總氨基酸殘基數(shù)目不超過5％的不相同性是允許的。
在一個特定的實施方案中，參考序列(本發(fā)明的序列)和待比較序列之間的相同性，也稱做全局序列比較，是應(yīng)用在Brutlag等(計算機應(yīng)用生物科學(xué)6237-245(1990))演算程序基礎(chǔ)上的FASTDB計算機程序確定的。在FASTDB氨基酸序列比較中優(yōu)選的參數(shù)設(shè)置如下Matrix＝PAM 0，k-tuple＝2，Mismatch Penalty＝1，JoiningPenalty＝20，Randomization Group Length＝0，Cutoff Score＝1，WindowSize＝序列長度，Gap Penalty＝5，Gap Size Penalty＝0.05，WindowSize＝500或稍短些的待比較的氨基酸序列的長度。根據(jù)這個實施方案，如果待比較的氨基酸序列由于N端或C端缺失而不是內(nèi)部缺失而短于參考序列時，在計算結(jié)果時應(yīng)該考慮到FASTDB程序在計算相同性百分比時并沒有把待比較的氨基酸序列N端或C端缺失的情況包括在內(nèi)，因此對結(jié)果做了一個人工校正。對于相對于參考序列N端或C端缺失的待比較的氨基酸序列來說，相同性百分比是通過計算參考序列中是待比較的氨基酸序列N端或C端的，它是與相應(yīng)的待測殘基不配對的，并且不相同的殘基數(shù)目作為參考序列總殘基數(shù)的百分比而校正的。確定一個殘基是否相配是通過FASTDB序列比較的結(jié)果而決定的。然后這個百分比減去使用上述特定參數(shù)的FASTDB程序計算出的相同性百分比，最后得到了一個最終的百分比數(shù)值。就本實施方案而言，此校正的數(shù)值正是所使用的數(shù)值。只有在待比較的序列N端或C端堿基之外的并且與參考序列不相配的殘基才被計算以調(diào)整相同性百分比數(shù)值。即，只有待測序列N或C最遠端的殘基之外的參考殘基位置。例如，一段90個氨基酸殘基的待比較的核苷酸序列與一段100殘基的參考序列進行序列比較以確定相同性百分比。待比較的氨基酸序列的N端發(fā)生缺失，因此，F(xiàn)ASTDB序列比較并不顯示N端的頭10個殘基的比較。這10個未配對的殘基代表序列的10％(N或C端不配對殘基/參考序列總殘基數(shù)目)，所以應(yīng)從由FASTDB程序計算出的相同性百分比中減去10％。如果剩下的90個殘基都配對的話那么最終的相同性百分比應(yīng)該是90％。在另外一個實施例中，一段90個殘基的待比較的氨基酸序列與一段100殘基的參考序列進行序列比較。這次是內(nèi)部缺失所以在待比較的氨基酸序列的N或C端沒有不與參考序列不配對的殘基。在這種情況下，由FASTDB程序計算出的相同性百分比未進行人工校正。再說一遍，只有待比較的氨基酸序列的N或C端的與參考序列不配對的殘基才被人工校正。就本實施方案而言未做其它人工校正。
本發(fā)明的多肽具有包括但不局限于在本領(lǐng)域熟練技術(shù)人員眾所周知的方法中如SDS-PAGE凝膠或分子篩凝膠過濾柱中用做分子量標準的用途。正如將要在下文中詳細描述的，本發(fā)明的多肽也可被用于增強單克隆抗體或多克隆抗體滴度，這些抗體在檢測如下所述的TNFR蛋白表達的分析中或用做能夠增強或抑制TNFR蛋白功能的激動劑或拮抗劑中非常有用。而且，這些多肽可用于酵母雙雜交系統(tǒng)以“捕獲”也可作為本發(fā)明侯選激動劑或拮抗劑的TNFR蛋白結(jié)合蛋白。在Fields和Song，自然340245-246(1989)中描述了酵母雙雜交系統(tǒng)。轉(zhuǎn)基因本發(fā)明的蛋白也可在轉(zhuǎn)基因動物中表達。任一物種的動物包括但不局限于小鼠、大鼠、兔子、倉鼠、豚鼠、豬、微型豬、山羊、綿羊、牛和非人靈長類如狒狒、猴子和猩猩可被用于生產(chǎn)轉(zhuǎn)基因動物。在一個特定的實施方案中，本文中所描述的技術(shù)以及本領(lǐng)域所熟知的其它技術(shù)被用于在人體中表達本發(fā)明的多肽，作為一個治療方法的一部分。
本領(lǐng)域中任何一種已知的技術(shù)都可被用于將轉(zhuǎn)基因(即，本發(fā)明的多核苷酸)引入動物以產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因動物的建立者品系。這樣的技術(shù)包括但不局限于前核微注射(Paterson等，應(yīng)用微生物學(xué)和生物工藝學(xué)40691-698(1994)；Carver等，生物工藝學(xué)(紐約)111263-1270(1993)；Wright等，生物工藝學(xué)(紐約)9830-834(1991)；和Hoppe等，美國專利4873191(1989))；逆轉(zhuǎn)錄病毒介導(dǎo)基因轉(zhuǎn)移進入生殖系(Van der Putten等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 826148-6152(1985))，胚細胞或胚胎；基因定向至胚胎干細胞(Thompson等，細胞56313-321(1989))；細胞或胚胎電穿孔(Lo，分子細胞生物學(xué)31803-1814(1983))使用基因槍導(dǎo)入本發(fā)明的多核苷酸(見，例如Ulmer等，科學(xué)2591745(1993))；將核酸構(gòu)建物導(dǎo)入胚胎全能干細胞，然后將干細胞轉(zhuǎn)移回胚細胞；和精液介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)移(Lavitrano等，細胞57717-723(1989))等。關(guān)于這些技術(shù)的綜述見Gordon，“轉(zhuǎn)基因動物”，Intl.Rev.Cytol.115171-229(1989)，全文引入本文做參考。也見美國專利5464764(Capecchi等，陽性-陰性選擇方法和載體)；美國專利5631153(Capecchi等，含有預(yù)先決定的基因組修飾和陽性-陰性選擇方法以及制備類似物的載體的人體)；美國專利4736866(Leder等，非人轉(zhuǎn)基因動物)；和美國專利4873191(Wagner等，zygotes的基因轉(zhuǎn)化)；以上每一篇文獻全文引入本文做參考。而且，在此段中引用的每一篇文獻的內(nèi)容也引入本文做參考。
本領(lǐng)域任何一項已知的技術(shù)都可被用于生產(chǎn)含有本發(fā)明多核苷酸的轉(zhuǎn)基因克隆，例如，核轉(zhuǎn)移入誘導(dǎo)至靜止期的培養(yǎng)的胚胎或成人細胞中的去核的卵母細胞(Campell等，自然38064-66(1996)；Wilmut等，自然385810-813(1997))，以上每一篇文獻全文引入本文做參考。
本發(fā)明提供了在所有細胞中攜帶轉(zhuǎn)基因的轉(zhuǎn)基因動物，以及在部分而不是全部細胞中攜帶轉(zhuǎn)基因的動物，即馬賽克動物或嵌合動物。轉(zhuǎn)基因既可以以單個轉(zhuǎn)基因的形式整合又可以以多拷貝例如鏈狀聚合物的形式整合，例如頭-頭串聯(lián)或頭-尾串聯(lián)。轉(zhuǎn)基因可以被選擇性引入并通過下列方法例如Lasko等的方法(Lasko等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 896232-6236(1992))在特定類型的細胞中被激活。這樣的細胞類型特異的激活所需要的調(diào)控序列將依賴于所感興趣的特定細胞類型，并且本領(lǐng)域熟練技術(shù)人員很明白這些。當(dāng)我們希望多核苷酸轉(zhuǎn)基因整合進入內(nèi)源基因的染色體位點時，優(yōu)選使用基因打靶技術(shù)。簡言之，當(dāng)利用這種技術(shù)時，設(shè)計含有與內(nèi)源基因同源的一些多核苷酸的載體，然后將其通過與染色體序列同源重組而整合進入內(nèi)源性基因的核苷酸序列并破壞其功能。轉(zhuǎn)基因也可被選擇性導(dǎo)入一種特定細胞類型中，然后通過下列，例如Gu等(科學(xué)265103-106(1994))的方法使僅在那種細胞類型中的內(nèi)源性基因失活。這樣的細胞類型特異的失活所需要的調(diào)控序列將依賴于所感興趣的特定細胞類型，并且本領(lǐng)域熟練技術(shù)人員很明白這些。在本段中引用的每一篇文獻的內(nèi)容也全文引入本文做參考。
一旦轉(zhuǎn)基因動物產(chǎn)生，就可以使用標準技術(shù)分析重組基因的表達。首先的篩查可通過Southern印跡分析或PCR技術(shù)分析動物組織以證實轉(zhuǎn)基因已經(jīng)整合進去來完成。轉(zhuǎn)基因在轉(zhuǎn)基因動物組織中的表達的mRNA水平可以利用包括但不局限于對從動物組織中獲得的樣品進行Northern印跡分析、原位雜交分析以及逆轉(zhuǎn)錄PCR(rt-PCR)分析等方法來完成。轉(zhuǎn)基因基因表達組織的樣品也可以使用轉(zhuǎn)基因產(chǎn)物特異性的抗體通過免疫細胞化學(xué)或免疫組織化學(xué)的方法評價。
一旦建立者品系動物產(chǎn)生，它們即可被繁殖、近交、遠交或種間雜交以產(chǎn)生特定動物品系克隆。這些繁殖策略的實施例包括但不局限于將帶有多于一個整合位點的基線動物進行遠交以建立各個不同的系；在各個不同的系之間近交以產(chǎn)生由于每個轉(zhuǎn)基因過度表達而導(dǎo)致的轉(zhuǎn)基因表達水平更高的復(fù)合轉(zhuǎn)基因；為了提高表達并且消除對動物進行DNA分析篩查的必要，將雜合子轉(zhuǎn)基因動物進行種間雜交以產(chǎn)生給定整合位點的純合子動物；將各個不同的純合子品系間雜交以產(chǎn)生復(fù)合雜合子或純合子品系；繁殖將轉(zhuǎn)基因置于適于目的實驗?zāi)Ｐ偷倪h距離背景下。
本發(fā)明的轉(zhuǎn)基因和“基因敲除”動物具有包括但不局限于用于闡釋TNFR多肽生物學(xué)功能的動物模型系統(tǒng)中，研究與TNFR異常表達相關(guān)的條件和/或紊亂，和篩選在減緩這些條件和/或紊亂中有效的化合物中的應(yīng)用。
在本發(fā)明另外的實施方案中，基因重組表達本發(fā)明蛋白質(zhì)的細胞，或基因重組不表達本發(fā)明蛋白質(zhì)(例如基因敲除)的細胞被體內(nèi)施與病人。這樣的細胞可從病人(即，動物包括人)或一個MHC相容的供體中得到，并且包括但不局限于成纖維細胞、骨髓細胞、血細胞(例如，淋巴細胞)、脂肪細胞、肌肉細胞、內(nèi)皮細胞等。在體外使用重組DNA技術(shù)將本發(fā)明多肽的編碼序列基因工程導(dǎo)入細胞，或者破壞與本發(fā)明多肽相關(guān)的編碼序列和/或內(nèi)源性調(diào)控序列，例如通過轉(zhuǎn)導(dǎo)(使用病毒載體，并且優(yōu)選將轉(zhuǎn)基因整合入細胞基因組的載體)或轉(zhuǎn)化程序，包括但不局限于使用質(zhì)粒、粘粒、YACs、裸DNA、電穿孔、脂質(zhì)體等。本發(fā)明多肽的編碼序列可被置于強組成型或誘導(dǎo)型啟動子或啟動子/增強子控制之下以表達和優(yōu)選分泌本發(fā)明的多肽。表達和優(yōu)選分泌本發(fā)明多肽的工程細胞可被全身導(dǎo)入病人體內(nèi)，例如循環(huán)中或腹膜內(nèi)。另外，細胞可并入基質(zhì)中并且移植入體內(nèi)，例如，基因工程成纖維細胞可作為皮膚移植的一部分而移植；基因工程的內(nèi)皮細胞可作為淋巴或血管移植的一部分而移植。(見，例如Anderson等，美國專利5399349；和Mulligan&Wilson，美國專利5460959，以上每一篇文獻全文引入本文做參考。)當(dāng)待施與的細胞是非自身細胞或MHC不相容的細胞時，它們可使用眾所周知的阻止宿主針對所導(dǎo)入細胞的發(fā)生免疫應(yīng)答的技術(shù)而被施與。例如，細胞可以膠囊的形式被施與，此膠囊在允許與接近的細胞外環(huán)境交換成分的同時，并不允許所導(dǎo)入的細胞被宿主免疫系統(tǒng)所識別。抗體本發(fā)明另外涉及可免疫特異性結(jié)合本發(fā)明多肽優(yōu)選表位的抗體和T細胞抗原受體(TCR)(正如通過本領(lǐng)域眾所周知的分析特異性抗原抗體結(jié)合的免疫分析方法所測定的)。本發(fā)明的抗體包括但不局限于多克隆抗體、單克隆抗體、多特異性抗體、人抗體、人源化抗體或嵌合抗體、單鏈抗體、Fab片段、F(ab’)片段、由Fab表達文庫產(chǎn)生的片段、抗獨特型(anti-ID)抗體(包括，例如抗本發(fā)明抗體的抗獨特型抗體)和以上任何一種表位結(jié)合片段。術(shù)語“抗體”，正如文中所用的，是指免疫球蛋白分子和免疫球蛋白分子的免疫學(xué)活性部分，即含有可與抗原免疫特異性結(jié)合的抗原結(jié)合位點的分子。本發(fā)明的免疫球蛋白分子可以是任何一種型的(例如，IgG，IgE，IgM，IgD，IgA和IgY)，類(例如，IgG1，IgG2，IgG3，IgG4，IgAl和IgA2)或免疫球蛋白分子的亞類。
最優(yōu)選的是抗體是本發(fā)明的人抗原結(jié)合抗體片段，并且包括但不局限于Fab，F(xiàn)ab’和F(ab’)2，F(xiàn)d，單鏈Fvs(scFv)，單鏈抗體，二硫鍵連接的Fvs(scFv)和包含VL或VH功能區(qū)的片段。包括單鏈抗體的抗原結(jié)合抗體片段可能僅含有可變區(qū)或與下列全部或部分組合鉸鏈區(qū)，CH1、CH2和CH3功能區(qū)。本發(fā)明也包括含有可變區(qū)與鉸鏈區(qū)、CH1、CH2和CH3功能區(qū)任意組合的抗原結(jié)合片段。本發(fā)明的抗體可能是動物來源的包括鳥類和哺乳動物。優(yōu)選的是，本發(fā)明的抗體是人、鼠、猴子、船兔、山羊、豚鼠、駱駝、馬或雞來源的。正如文中所用的，“人”抗體包括具有人免疫球蛋白分子氨基酸序列的抗體和包括從人免疫球蛋白庫中分離出的抗體和包括從并不表達內(nèi)源性免疫球蛋白的一種或多種人免疫球蛋白的轉(zhuǎn)基因動物的免疫球蛋白庫中分離出的抗體，如下文中所描述的，和Kucherlapati等的美國專利5939598中的實施例。
本發(fā)明的抗體可以是單特異性的、雙特異性的、三特異性的或更高的多重特異性的。多重特異性抗體可以是對本發(fā)明多肽的不同表位特異的或可以是對本發(fā)明多肽以及異源表位例如異源多肽或固相支持物質(zhì)特異性的。見，例如PCT出版物WO 93/17715；WO92/08802；WO 91/00360；WO 92/05793；Tutt等，免疫學(xué)期刊14760-69(1991)；美國專利4474893，4714681，4925648，5573920，5601819；Kostelny等，免疫學(xué)期刊1481547-1553(1992)。
本發(fā)明抗體也可以用它們識別或特異性結(jié)合的本發(fā)明的表位或多肽部分的術(shù)語來特定化或描述。表位或多肽部分可為如文中所述而特定化，例如通過N端和C端位置，通過連續(xù)氨基酸殘基的大小或表中和圖中所列出的數(shù)據(jù)?？膳c本發(fā)明任何表位或多肽特異性結(jié)合的抗體也可被排除在外。因此，本發(fā)明包括特異性結(jié)合本發(fā)明多肽的抗體，和排除相似的抗體。
本發(fā)明抗體也可以用它們的交叉反應(yīng)性的術(shù)語來特定化或描述。不與本發(fā)明多肽的任何其它類似物、ortholog或同系物結(jié)合的抗體被包括在內(nèi)。和與本發(fā)明的多肽具有至少95％，至少90％，至少85％，至少80％，至少75％，至少70％，至少65％，至少60％，至少55％，和至少50％相同性(如同使用本領(lǐng)域已知的方法和文中所述的方法所計算的)的多肽結(jié)合的抗體也在本發(fā)明的范圍之內(nèi)。不和與本發(fā)明的多肽具有至少95％，至少90％，至少85％，至少80％，至少75％，至少70％，至少65％，至少60％，至少55％，和至少50％相同性(如同使用本領(lǐng)域已知的方法和文中所述的方法所計算的)的多肽結(jié)合的抗體也在本發(fā)明的范圍之內(nèi)。能夠在嚴格雜交條件下(如文中所述)與本發(fā)明的多核苷酸雜交的多核苷酸所編碼的多肽結(jié)合的抗體也在本發(fā)明的包括之內(nèi)。本發(fā)明抗體也可以用它們與本發(fā)明多肽的結(jié)合親和性的術(shù)語來特定化或描述。優(yōu)選的結(jié)合親和性的解離常數(shù)或Kd小于5×10-2M，10-2M，5×10-3M，10-3M，5×10-4M，10-4M，5×10-5M，10-5M，5×10-6M，10-6M，5×10-7M，10-7M，5×10-8M，10-8M，5×10-9M，10-9M，5×10-10M，10-10M，5×10-11M，10-11M，5×10-12M，10-12M，5×10-13M，10-13M，5×10-14M，10-14M，5×10-15M，和10-15M 。
本發(fā)明也提供了競爭性抑制抗體與本發(fā)明表位結(jié)合的抗體，正如通過本領(lǐng)域任何一種已知的測定競爭性結(jié)合的方法例如文中所述的免疫分析方法所測定的。在優(yōu)選的實施方案中，抗體競爭性抑制與表位的至少90％，至少80％，至少70％，至少60％，和至少50％的結(jié)合。
本發(fā)明的抗體也可作為本發(fā)明多肽的激動劑或拮抗劑起作用。例如，本發(fā)明包括部分或完全破壞受體/配體與本發(fā)明多肽相互作用的抗體。受體特異性抗體和配體特異性抗體在本發(fā)明中起重要作用。在本發(fā)明中并不阻止配體結(jié)合但是阻止受體活化的受體特異性抗體具有重要作用。受體激活(即，信號傳導(dǎo))可以通過文中所述的技術(shù)或本領(lǐng)域已知的其它技術(shù)測定。例如，受體激活可以通過免疫沉淀后蛋白印跡(例如，如上所述)的方法檢測受體或底物的磷酸化(例如，酪氨酸或絲氨酸/蘇氨酰胺)而測定。在特定的實施方案中，提供了抑制在不存在抗體時的配體或受體至少90％，至少80％，至少70％，至少60％，和至少50％活性的抗體。
本發(fā)明還包括既阻止配體結(jié)合又阻止受體激活的受體特異性抗體以及識別受體-配體復(fù)合物，并且優(yōu)選不特異性識別未結(jié)合的受體或未結(jié)合的配體的抗體。而且，結(jié)合配體并且阻止配體與受體結(jié)合的中和抗體，以及結(jié)合配體并籍此阻止受體激活但并不阻止配體與受體結(jié)合的抗體也在本發(fā)明的包括之內(nèi)。另外被包括在本發(fā)明之內(nèi)的是激活受體的抗體。這些抗體可作為受體激動劑起作用，即活化配體介導(dǎo)的受體激活的生物學(xué)活性的全部或一部分。這些抗體可被特化為包含文中所述的本發(fā)明多肽的生物學(xué)活性在內(nèi)的生物學(xué)活性的激動劑、拮抗劑或反向激動劑?？梢岳帽绢I(lǐng)域所熟知的技術(shù)方法制備上述抗體激動劑。見，例如PCT出版號WO 96/40281；美國專利5811097；Deng等，血液92(6)1981-1988(1998)；Chen等，癌癥研究58(16)3668-3678(1998)；Harrop等，免疫學(xué)期刊161(4)1786-1794(1998)；Zhu等，癌癥研究58(15)3209-3214(1998)；Yoon等，免疫學(xué)期刊160(7)3170-3179(1998)；Prat等，細胞科學(xué)期刊111(Pt2)237-247(1998)；Pitard等，免疫學(xué)方法期刊205(2)177-190(1997)；Liautard等，細胞因子9(4)233-241(1997)；Carlson等，生命的化學(xué)期刊272(17)11295-11301(1997)；Taryman等，神經(jīng)原14(4)755-762(1995)；Muller等，結(jié)構(gòu)6(9)1153-1167(1998)；Bartunek等，細胞因子8(1)14-20(1996)(以上文獻全文引入本文做參考)。
本發(fā)明的抗體可被用于，但不局限于，例如純化、檢測和定向本發(fā)明的多肽，包括體外和體內(nèi)的診斷和治療方法。例如，抗體可用于免疫分析中以定性或定量測定生物學(xué)樣品中本發(fā)明的多肽的水平，例如參見Harlow等，抗體實驗手冊(冷泉港實驗室出版社，2版，1988)(引入本文作參考)。
如下述所詳細討論的，本發(fā)明的抗體可單獨使用或與其它組合物聯(lián)合使用。這些抗體還可進一步重組融合至異源多肽的N末端或C末端，或化學(xué)偶聯(lián)(包括共價和非共價結(jié)合)至多肽或其它組合物。例如，本發(fā)明的抗體可被重組融合至或偶聯(lián)至在檢測系統(tǒng)中用做標記的分子和效應(yīng)分子如異源多肽、藥物或毒素上。見，例如PCT出版號WO92/08495；WO91/14438；WO89/12624；美國專利5314995；和EP396387。
本發(fā)明的抗體包括修飾的衍生物，即通過將任何類型的分子共價結(jié)合至抗體以致于此共價結(jié)合并不阻止抗體產(chǎn)生抗獨特型應(yīng)答。例如，但是并不是通過限制的方式，抗體衍生物包括已經(jīng)被修飾的抗體，例如糖基化，乙酰化，pegylation，磷酸化，酰胺化，通過已知的保護或阻斷基團衍生化，水解裂解，與一種細胞配體或其它蛋白分子連接等。任何一種化學(xué)修飾都可以通過眾所周知的技術(shù)實施，包括但不局限于特異性化學(xué)裂解，酰化，甲酰化，在衣霉素存在的情況下代謝合成等等。此外，此衍生物可能包含一個或多個非典型的氨基酸。
本發(fā)明抗體可以通過本領(lǐng)域已知的任何合適的方法生產(chǎn)。目的抗原的多克隆抗體可通過本領(lǐng)域眾所周知的各種不同的方法生產(chǎn)。例如，本發(fā)明的多肽可被施與至各種不同的動物體內(nèi)，包括但不局限于兔子、小鼠、大鼠等以誘導(dǎo)含有抗原特異性的多克隆抗體的血清產(chǎn)生。根據(jù)宿主種類，各種不同的佐劑可被用于增強免疫學(xué)應(yīng)答，并且這些佐劑包括但不局限于弗氏佐劑(完全和不完全)、礦物質(zhì)凝膠例如氫氧化鋁、表面活性物質(zhì)例如溶血卵磷脂、pluronic多元醇、聚陰離子、肽、油乳劑、匙孔嘁血藍蛋白、二硝基苯酚(dinitriphenol)和可能有用的人佐劑例如BCG(卡介苗結(jié)核桿菌)和小棒狀桿菌。這些佐劑在本領(lǐng)域中也是眾所周知的。
單克隆抗體也可以使用本領(lǐng)域中已知的各種不同的技術(shù)制備，包括雜交瘤、重組、噬菌體展示技術(shù)或其組合。例如，可以使用包括本領(lǐng)域已知的和傳授的那些雜交瘤技術(shù)生產(chǎn)單克隆抗體，例如，在Harlow等，抗體實驗室手冊(冷泉港實驗室出版，第二版，1988)；Hammerling等，在單克隆抗體和T細胞雜交瘤563-681(Elsevier，紐約，1981)(上述文獻全文引入本文做參考)。術(shù)語“單克隆抗體”正如文中所用的，不僅僅局限于通過雜交瘤技術(shù)生產(chǎn)出來的抗體。術(shù)語“單克隆抗體”意指產(chǎn)生自一個單一克隆包括任何真核、原核或噬菌體克隆的抗體，而不是生產(chǎn)此抗體的方法。
用于生產(chǎn)和篩選特異性抗體的雜交瘤技術(shù)是本領(lǐng)域眾所周知的常規(guī)方法并且在實施例11中詳細討論了此方法。簡言之，可用本發(fā)明的多肽或表達這種多肽的細胞免疫小鼠。一旦檢測到免疫應(yīng)答，例如在小鼠血清中檢測到抗原特異性抗體，就采集小鼠的脾臟然后分離脾細胞。然后使用眾所周知的技術(shù)將脾細胞與任何合適的瘤細胞融合，例如來自于可從ATCC得到的細胞系SP20的細胞。通過有限稀釋的方法選擇和克隆雜交瘤。然后通過本領(lǐng)域已知的方法分析雜交瘤克隆的能夠與本發(fā)明的多肽結(jié)合的抗體分泌細胞。通常含有高水平抗體的腹水可以通過用陽性雜交瘤克隆免疫小鼠產(chǎn)生。
因此，本發(fā)明提供了生產(chǎn)單克隆抗體的方法以及由此方法所產(chǎn)生的抗體，此方法包含培養(yǎng)分泌本發(fā)明抗體的雜交瘤細胞，其中雜交瘤優(yōu)選是通過將從用本發(fā)明抗原免疫的小鼠體內(nèi)分離的脾細胞與瘤細胞融合，然后篩選融合的產(chǎn)物雜交瘤以選擇能夠分泌與本發(fā)明的多肽結(jié)合的抗體的雜交瘤克隆而生成的。
可以通過已知的技術(shù)產(chǎn)生識別特異性表位的抗體片段。例如，本發(fā)明的Fab和F(ab’)2片段可以通過水解裂解免疫球蛋白分子而產(chǎn)生，使用酶例如木瓜蛋白酶(產(chǎn)生Fab片段)和胰蛋白酶(產(chǎn)生F(ab’)2片段)。F(ab’)2片段含有可變區(qū)、輕鏈恒定區(qū)和重鏈的CH1功能區(qū)。
例如，本發(fā)明的抗體也可通過本領(lǐng)域已知的各種噬菌體展示技術(shù)而生產(chǎn)。在噬菌體展示方法中，功能性抗體區(qū)顯示在攜帶編碼此區(qū)多核苷酸序列的噬菌體顆粒的表面。在一個特別的實施方案中，這樣的噬菌體可被用于顯示總成分庫或組合的抗體文庫(例如，人或鼠)所表達的抗原結(jié)合區(qū)?？梢岳每乖x擇和鑒定表達能夠結(jié)合目的抗原的抗原結(jié)合區(qū)的噬菌體，例如，使用標記的抗原或結(jié)合或捕獲至固相表面或珠上的抗原。用于這些方法中的噬菌體是典型的絲狀噬菌體包括fd和M13。帶有Fab、Fv或二硫鍵穩(wěn)定的Fv的噬菌體表達的結(jié)合區(qū)重組融合至噬菌體基因III或VIII蛋白上。噬菌體展示方法的實施例可被用于制備本發(fā)明的抗體包括在Brinkman等，免疫學(xué)方法期刊18241-50(1995)；Ames等，免疫學(xué)方法期刊184177-186(1995)；Kettleborough等，歐洲免疫學(xué)期刊24952-958(1994)；Persic等，基因1879-18(1997)；Burton等，免疫學(xué)進展57191-280(1994)；PCT出版號PCT/GB91/01134；PCT出版物WO 90/02809；WO 91/10737；WO 92/01047；WO 92/18619；WO 93/11236；WO 95/15982；WO 95/20401；和美國專利5698426；5223409；5403484；5580717；5427908；5750753；5821047；5571698；5427908；5516637；5780225；5658727；5733743和5969108中所透露的抗體，以上每一篇文獻全文引入本文做參考。
如在上面的參考文獻中所述的，噬菌體選擇后，噬菌體中的抗體編碼區(qū)可被分離出來并且用于生產(chǎn)整個的抗體包括人抗體，或其它任何我們所希望的抗原結(jié)合片段，并且在任何我們所希望的宿主包括哺乳動物細胞、昆蟲細胞、植物細胞、酵母和細菌等宿主中表達，例如，正如下面詳細描述的。例如，用于重組生產(chǎn)Fab、Fab’和F(ab’)2片段的技術(shù)也可以使用本領(lǐng)域所已知的例如在PCT出版號WO 92/22324；Mullinax等，生物技術(shù)12(6)864-869(1992)；和Sawai等，AJRI 3426-34(1995)；和Better等，科學(xué)2401041-1043(1988)中所批露的方法(所述參考文獻引入本文做參考)。
可被用于生產(chǎn)單鏈Fvs和抗體的技術(shù)的例子包括在美國專利4946778和5258498；Huston等，酶學(xué)方法20346-88(1991)；Shu等，PNAS 907995-7999(1993)；和Skerra等，科學(xué)2401038-1040(1988)中所描述的技術(shù)。對于一些應(yīng)用來說，包括在人體內(nèi)應(yīng)用抗體和體外檢測分析中應(yīng)用，優(yōu)選使用嵌合的、人源化的或人抗體。嵌合抗體是一種抗體的不同部分來自不同動物物種的分子，例如具有來源自鼠單克隆抗體可變區(qū)和人免疫球蛋白恒定區(qū)的抗體。用于生產(chǎn)嵌合抗體的方法是本領(lǐng)域中已知的。見，例如，Morrison等，科學(xué)2291202(1985)；Oi等，生物技術(shù)4214(1986)；Gillies等，免疫學(xué)方法期刊125191-202(1989)；美國專利5807715；4816567和4816397，以上文獻全文引入本文做參考。人源化抗體是來源自非人物種的能夠與我們所希望的抗原結(jié)合的抗體分子，它具有一個或多個來源自非人物種的補體決定簇區(qū)(CDRs)和來源自人免疫球蛋白分子的框架結(jié)構(gòu)區(qū)。人框架結(jié)構(gòu)區(qū)中的框架殘基經(jīng)常與CDR供體抗體的對應(yīng)殘基替換以改變，優(yōu)選改進抗原結(jié)合。這些框架結(jié)構(gòu)的替換可以通過本領(lǐng)域眾所周知的方法鑒定，例如，通過模擬CDR和框架結(jié)構(gòu)的相互作用鑒定對抗原結(jié)合很重要的框架結(jié)構(gòu)殘基，和通過序列比較鑒定特定位點的非尋常的框架殘基。(見，例如Queen等，美國專利5585089；Riechmann等，自然332323(1988)，在此全文引入本文做參考)?？贵w可以使用本領(lǐng)域已知的各種不同的技術(shù)進行人源化，包括例如CDR-接枝(EP239400；PCT出版號WO91/09967；美國專利5225539；5530101和5585089)，veneering和resurfacing(EP592106；EP519596；Padlan等，分子免疫學(xué)28(4/5)489-498(1991)；Studnicka等，蛋白質(zhì)工程7(6)805-814(1994)；Roguska等，PNAS 91969-973(1994))，和鏈重排(美國專利5565332)。
完全的人抗體是特別希望被用于患者的治療的。人抗體可以使用本領(lǐng)域已知的各種不同的方法來制備包括上面所述的使用來源自人免疫球蛋白序列的抗體文庫的噬菌體展示方法。也見，例如美國專利4444887和4716111；和PCT出版號WO 98/46645，WO98/50433，WO 98/24893，WO 98/16654，WO 96/34096，WO 96/33735，和WO 91/10741；以上每一篇文獻全文引入本文做參考。
人抗體也可利用不能表達內(nèi)源性免疫球蛋白但是能夠表達人免疫球蛋白基因的轉(zhuǎn)基因小鼠產(chǎn)生。例如，人重鏈和輕鏈免疫球蛋白基因復(fù)合體可被隨機引入或通過同源重組引入小鼠胚胎干細胞。此外，除了人重鏈和輕鏈基因以外，人的可變區(qū)、恒定區(qū)以及多變區(qū)也可被引入小鼠胚胎干細胞中。小鼠重鏈和輕鏈免疫球蛋白基因在通過同源重組引入人免疫球蛋白位點的同時或單獨處理使之變?yōu)闊o功能活性。特別是，JH區(qū)的純合子缺失會阻止內(nèi)源性抗體的產(chǎn)生。修飾的胚胎干細胞被擴增并且被微注射入胚細胞以生成嵌合小鼠。然后繁殖嵌合小鼠產(chǎn)生能夠表達人抗體的純合子后代。轉(zhuǎn)基因小鼠被用正常方式免疫接種所選擇的抗原，例如本發(fā)明多肽的全部或部分。針對于此抗原的單克隆抗體可利用傳統(tǒng)的雜交瘤技術(shù)從免疫的轉(zhuǎn)基因小鼠中獲得。轉(zhuǎn)基因小鼠所攜帶的人免疫球蛋白轉(zhuǎn)基因B細胞分化過程中重排，隨后經(jīng)歷類別轉(zhuǎn)換和體細胞突變。因此，使用這種技術(shù)，生產(chǎn)治療上有用的IgG、IgA、IgM和IgE抗體是可能的。關(guān)于生產(chǎn)人抗體的這種技術(shù)的綜述，見Lonberg和Huszar(1995，Intl.Rev.Immunol.1365-93)。關(guān)于生產(chǎn)人抗體和人單克隆抗體的這種技術(shù)的詳細討論以及用于生產(chǎn)這些抗體的方法程序，見例如PCT出版物WO 98/24893；WO 96/34096；WO 96/33735；美國專利5413923；5625126；5633425；5568825；5661016；5545806；5814318；和5939598，全文引入本文做參考。此外，一些公司例如Abgenix公司(Freemont，加州)和Genpharm(San Jose，加州)主要使用與上面所述的方法相似的技術(shù)致力于提供抗所選擇的抗原的人抗體。
識別所選擇的表位的完全的人抗體可以利用稱為“指導(dǎo)的選擇”的技術(shù)而產(chǎn)生。在這種方法中非人單克隆抗體例如小鼠抗體被用于指導(dǎo)能夠識別同一個表位的完全人抗體的選擇(Jespers等，生物技術(shù)12899-903(1988))。
而且，使用本領(lǐng)域熟練技術(shù)人員眾所周知的技術(shù)，針對本發(fā)明的多肽的抗體可被用于生產(chǎn)能夠“模擬”本發(fā)明多肽的抗獨特型抗體(見，例如Greenspan&Bona，F(xiàn)ASEB J 7(5)437-444(1989)；和Nissinoff，免疫學(xué)期刊147(8)2429-2438(1991))。例如，能夠結(jié)合多肽和競爭性抑制多肽多聚體化和/或本發(fā)明多肽與配體結(jié)合的抗體可被用于生產(chǎn)“模擬”了多肽多聚體化和/或結(jié)合區(qū)并且因此結(jié)合并中和了多肽和/或其配體的抗獨特型抗體。這樣的中和抗獨特型抗體或這樣的抗獨特型抗體的Fab片段可被用于治療方案中以中和多肽配體。例如，這樣的抗獨特型抗體可被用于結(jié)合本發(fā)明的多肽和/或被用于結(jié)合其配體/受體，并籍此阻斷TNFR介導(dǎo)的對凋亡的抑制。
編碼抗體的多核苷酸本發(fā)明另外提供了含有編碼本發(fā)明抗體或其片段的核苷酸序列的多核苷酸。本發(fā)明也包括能夠在嚴格雜交條件下或如在supra中所闡釋的較低的嚴格雜交條件下與編碼抗體，優(yōu)選能夠與本發(fā)明多肽特異性結(jié)合的抗體，優(yōu)選與具有SEQ ID NOS2和4中氨基酸序列的多肽結(jié)合的抗體的多核苷酸雜交的多核苷酸。
可以通過本領(lǐng)域已知的方法獲得此多核苷酸，并且測定多核苷酸的核苷酸序列。例如，如果此抗體的核苷酸序列是已知的，編碼此抗體的多核苷酸可以通過化學(xué)合成寡核苷酸來合成(例如，如在Kutmeier等，生物技術(shù)17242(1994)中所述的)，此方法，簡言之涉及合成重疊的含有抗體編碼序列部分的寡核苷酸，退火和連接這些寡核苷酸然后通過PCR擴增連接的寡核苷酸。
另外，編碼抗體的多核苷酸可從合適原料的核酸分子中產(chǎn)生。如果一個含有編碼特定抗體的核酸分子的克隆不存在，但是已經(jīng)知道此抗體分子的序列，就可以從合適的原料(例如，抗體cDNA文庫，或產(chǎn)生自任何表達此抗體的組織或細胞的cDNA文庫，或分離自任何表達此抗體的組織或細胞的核酸，優(yōu)選poly(A)+RNA，例如所選擇的表達本發(fā)明抗體的雜交瘤細胞)通過使用與序列的3’端和5’端雜交的合成引物PCR擴增得到或通過使用對特定基因序列特異的寡核苷酸探針例如從編碼此抗體的cDNA文庫中鑒定出cDNA克隆而得到編碼免疫球蛋白的核酸分子。然后利用本領(lǐng)域眾所周知的任何方法將通過PCR擴增出的核酸克隆入可復(fù)制的克隆載體中。
一旦測定了抗體的核苷酸序列和相應(yīng)的氨基酸序列，此抗體的核苷酸序列就可利用本領(lǐng)域眾所周知的操作核苷酸序列的方法操作，例如重組DNA技術(shù)，定點突變，PCR等。(見，例如在Sambrook等，1990，分子克隆，實驗室手冊，第二版，冷泉港實驗室，冷泉港，紐約和Ausubel等編，1998，現(xiàn)代分子生物學(xué)實驗指南，約翰威利父子出版社，紐約，全文引入本文做參考)，以產(chǎn)生具有不同氨基酸序列例如制造氨基酸替換、缺失和/或添加的抗體。
在一個特定的實施方案中，可以通過本領(lǐng)域眾所周知的方法檢測重鏈和/或輕鏈可變區(qū)的氨基酸序列以鑒定互補決定簇區(qū)(CDRs)的序列，例如，通過比較其它重鏈和輕鏈可變區(qū)已知的氨基酸序列以確定序列高變區(qū)。使用常規(guī)的重組DNA技術(shù)，一個或多個CDRs可被插入進框架區(qū)，例如插入到人框架區(qū)以對非人抗體人源化，如supra所述?？蚣軈^(qū)可是天然發(fā)生的或連續(xù)的框架區(qū)，優(yōu)選人框架區(qū)(見，例如Chothia等，分子生物學(xué)期刊278457-479(1998)中的一系列人的框架區(qū))。優(yōu)選的是，通過組合框架區(qū)和CDRs區(qū)所產(chǎn)生的多核苷酸編碼一種能夠特異性結(jié)合本發(fā)明多肽的抗體。如上所述，優(yōu)選在框架區(qū)內(nèi)制造一個或多個氨基酸替換，并且優(yōu)選這些氨基酸替換改進了抗體與其抗原的結(jié)合。此外，這些方法可被用于在替換或刪除可變區(qū)內(nèi)參與到鏈內(nèi)二硫鍵形成的一個或多個半胱氨段殘基，以產(chǎn)生缺少一個或多個鏈內(nèi)二硫鍵的抗體分子。對多核苷酸的其它改變也在本發(fā)明的包括之內(nèi)并且也在本領(lǐng)域的技術(shù)范圍之內(nèi)。
此外，通過剪接來自具有合適抗原特異性的小鼠抗體分子的基因和來自具有合適的生物學(xué)活性的人抗體分子的基因發(fā)展而來的用于生產(chǎn)“嵌合抗體”(Morrison等，1984，Proc.Natl.Acad.Sci USA81851-855；Neuberger等，1984，自然312604-608；Takeda等，1985，自然314452-454)的技術(shù)也可以被使用。正如supra所述，嵌合抗體是一種分子不同部分來自不同動物物種的抗體，例如那些具有來自于小鼠單克隆抗體可變區(qū)和人免疫球蛋白恒定區(qū)的嵌合分子，例如人源化抗體。
另外，所述的用于生產(chǎn)單鏈抗體的技術(shù)(美國專利4694778；Bird，1988，科學(xué)242423-42；Huston等，1988，Proc.Natl.Acad.SciUSA 855879-5883；和Ward等，1989，自然334544-54)可被采納用于生產(chǎn)單鏈抗體。單鏈抗體是通過氨基酸橋連接重鏈和輕鏈片段的Fv區(qū)而形成的一條單鏈多肽。在大腸桿菌中組裝合成功能性Fv片段的技術(shù)也可被使用(Skerra等，1988，科學(xué)2421038-1041)。
生產(chǎn)抗體的方法本發(fā)明的抗體可以使用本領(lǐng)域已知的任何合成抗體的方法產(chǎn)生，特別是，通過化學(xué)合成或優(yōu)選通過重組表達技術(shù)。
重組表達本發(fā)明的抗體或片段、衍生物或其類似物例如本發(fā)明抗體的重鏈或輕鏈需要構(gòu)建一種含有編碼抗體的多核苷酸的表達載體。一旦得到編碼本發(fā)明抗體分子或抗體的重鏈或輕鏈，或其部分(優(yōu)選含有重鏈或輕鏈可變區(qū))的多核苷酸序列，通過重組DNA技術(shù)使用本領(lǐng)域眾所周知的技術(shù)就可產(chǎn)生表達抗體的載體。因此，文中描述了通過表達含有抗體編碼核苷酸序列的多核苷酸而制備蛋白質(zhì)的方法。本領(lǐng)域熟練技術(shù)人員眾所周知的方法可被用于構(gòu)建含有抗體編碼序列和合適的轉(zhuǎn)錄和翻譯控制信號的載體。這些方法包括例如體外重組DNA技術(shù)，合成技術(shù)以及體內(nèi)基因重組。因此，本發(fā)明提供了與啟動子可操作連接的含有編碼本發(fā)明抗體分子，或其重鏈或輕鏈，或其重鏈或輕鏈可變區(qū)的核苷酸序列的可復(fù)制的載體。這些載體可以包括抗體分子恒定區(qū)的核苷酸序列(見，例如PCT出版號WO 86/05807；PCT出版號WO 89/01036；美國專利5122464)并且為了表達完整的重鏈或輕鏈，抗體分子的可變區(qū)也可被克隆入這樣的載體中。
表達載體通過傳統(tǒng)技術(shù)被轉(zhuǎn)移到宿主細胞中并且通過傳統(tǒng)的技術(shù)收獲細胞以產(chǎn)生本發(fā)明的抗體。因此，本發(fā)明包括含有與異源啟動子可操作連接的編碼本發(fā)明抗體或其重鏈或輕鏈的多核苷酸的宿主細胞。在優(yōu)選的表達雙鏈抗體的實施方案中，如下所述，編碼重鏈和輕鏈的載體可在宿主細胞內(nèi)共同表達以表達完整的免疫球蛋白分子。
多種不同的宿主表達載體系統(tǒng)可被用于表達本發(fā)明的抗體分子。這些宿主表達系統(tǒng)不僅代表目的編碼序列產(chǎn)生和隨后純化的運送工具，而且代表當(dāng)被合適的核苷酸編碼序列轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染時能夠在原位表達本發(fā)明抗體分子的細胞。這些包括但不局限于微生物如用含有抗體編碼序列的重組細菌噬菌體DNA、質(zhì)粒DNA或粘粒DNA表達載體轉(zhuǎn)化的細菌(例如大腸桿菌，枯草桿菌)；用含有抗體編碼序列的重組酵母表達載體轉(zhuǎn)化的酵母；用含有抗體編碼序列的重組病毒表達載體(例如，桿狀病毒)感染的昆蟲細胞系統(tǒng)；用含有抗體編碼序列的重組病毒表達載體(例如，花椰菜花葉病毒，CaMV；煙草花葉病毒，TMV)感染的或用含有抗體編碼序列的重組質(zhì)粒表達載體(例如，Ti質(zhì)粒)轉(zhuǎn)化的植物細胞系統(tǒng)；攜帶有含有來源自哺乳動物基因組(例如，金屬硫蛋白啟動子)或哺乳動物病毒(例如，腺病毒晚期啟動子，痘苗病毒7.5K啟動子)的啟動子的重組表達構(gòu)建物的哺乳動物細胞系統(tǒng)(例如，COS，CHO，BHK，293，3T3細胞)。在表達重組抗體分子時優(yōu)選細菌細胞例如大腸桿菌，更優(yōu)選真核細胞，特別是用于表達完整的重組抗體分子時。例如，哺乳動物細胞例如中國倉鼠卵巢細胞(CHO)，與一種載體例如來自于人巨細胞病毒主要立即早期啟動子成分組合是一個非常有效的抗體表達系統(tǒng)(Foecking等，1986，基因45101；Cockett等，1990，生物技術(shù)82)。
在細菌系統(tǒng)中，根據(jù)所要表達的抗體分子的用途許多表達載體可被優(yōu)先選擇。例如，當(dāng)要產(chǎn)生大量的這種蛋白質(zhì)用于抗體分子的藥物組合物時，能夠高水平地表達易于純化的融合蛋白產(chǎn)物的載體可能是我們所希望的。這樣的載體包括但不局限于大腸桿菌表達載體pUR278(Ruther等，1983，EMBO J 21791)，其中抗體編碼序列被單獨連接到框內(nèi)lacZ基因編碼區(qū)以產(chǎn)生融合蛋白；pIN載體(Inouye & Inouye，1985，核酸研究133101-3109；Van Heeke &Schuster，1989，生命的化學(xué)期刊245503-5509)；以及類似的載體。pGEX載體也可被用于表達融合至谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶(GST)的外源多肽。通常情況下，這樣的融合蛋白是可溶的并且可以很容易地通過吸附和結(jié)合至谷胱甘肽瓊脂珠隨后在游離的谷胱甘肽存在的情況下洗脫而從裂解細胞中純化出來。pGEX載體被設(shè)計為包括凝血酶和因子Xa蛋白酶裂解位點，從而克隆的目的基因產(chǎn)物可從GST分子部分被釋放下來。
在一個昆蟲系統(tǒng)中，加利福尼亞核形多角體病毒(AcNPV)被用做表達外源基因的載體。此病毒在草地夜蛾昆蟲細胞中生長?？贵w編碼序列可被分別克隆至病毒的非必需區(qū)(例如，多角體基因)并且置于AcNPV啟動子(例如，多角體基因啟動子)的控制之下。
在哺乳動物宿主細胞中，可以利用許多以病毒為基礎(chǔ)的表達系統(tǒng)。在腺病毒被用做表達載體的情況下，目的抗體編碼序列可被連接至腺病毒轉(zhuǎn)錄/翻譯控制復(fù)合體上，例如晚期啟動子和三部分的前導(dǎo)序列。然后這種嵌合基因通過體外或體內(nèi)重組被插入到腺病毒基因組中。插入病毒基因組的非必需區(qū)(例如，E1和E3區(qū))將導(dǎo)致活的并且能夠在感染的宿主中表達抗體分子的重組病毒產(chǎn)生(例如，見Logan&Shenk，1984，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 81355-359)。有效翻譯插入的抗體編碼序列需要特定的起始信號。這些信號包括ATG起始密碼子和鄰近序列。而且，起始密碼子必須同目的編碼序列的讀碼框相協(xié)調(diào)以確保整個插入序列的翻譯。這些外源性翻譯控制信號和起始密碼子可以是各種不同起源的，天然的和合成的。有效表達可被加入合適的轉(zhuǎn)錄增強成分、轉(zhuǎn)錄終止子等所加強(見Bittner等，1987，酶學(xué)方法15351-544)。
此外，調(diào)控所插入的序列表達的，或以我們所希望的方式修飾或處理表達產(chǎn)物的宿主細胞株也可以選擇。對蛋白質(zhì)產(chǎn)物的這些修飾(例如，糖基化)或處理(例如，裂解)可能對蛋白的功能是很重要的。不同的宿主細胞具有其獨特的對蛋白質(zhì)和基因產(chǎn)物的翻譯后處理和修飾的特性以及機制。為確保要表達的外源蛋白的正確修飾和處理可以選擇合適的細胞系或宿主系統(tǒng)。就此目的而言，可以選擇使用擁有細胞機制對基因產(chǎn)物進行轉(zhuǎn)錄、糖基化和磷酸化等適當(dāng)處理的真核宿主細胞。這樣的哺乳動物宿主細胞包括但不局限于CHO、VERY、BHK、Hela、COS、MDCK、293、3T3、WI38和特別是乳癌細胞系例如BT483、Hs578T、HTB2、BT20和T47D以及正常的乳腺細胞系例如CRL7030和Hs578Bst。
對于長期、高產(chǎn)量地表達重組蛋白質(zhì)來說，優(yōu)選穩(wěn)定的表達。例如，穩(wěn)定表達抗體分子的細胞系可被工程化。宿主細胞可被用在合適的表達序列(例如，啟動子、增強子、序列、轉(zhuǎn)錄終止子、多聚腺苷酸化位點等)控制之下的DNA和一個選擇標記所轉(zhuǎn)化，而不是使用含有病毒來源的復(fù)制起點的表達載體。在導(dǎo)入外源DNA以后，先將工程細胞在豐富培養(yǎng)基中培養(yǎng)生長1-2天，然后轉(zhuǎn)換到選擇培養(yǎng)基。重組質(zhì)粒中的選擇標記轉(zhuǎn)移選擇抗性，并且允許細胞將此質(zhì)粒穩(wěn)定整合到其染色體中，形成可被克隆和擴增到細胞系中的基因源。此方法可優(yōu)先用于對表達抗體分子的細胞系進行工程化。這樣的工程細胞系可能在篩選和評價能夠與抗體分子直接或間接相互作用的化合物中特別有用。
許多選擇系統(tǒng)可被使用，包括但不局限于單純皰疹病毒胸苷激酶(Wigler等，1977，細胞11223)，次黃嘌呤鳥嘌呤磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶(Szybalska & Azybalski，1992，Proc.Natl.Acad.Sci.USA48202)，和腺嘌呤磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶(Lowy等，1980，細胞28817)基因可被分別運用至tk-、hgprt或aprt-細胞內(nèi)?？勾x物抗性也可被用做選擇下列基因的基礎(chǔ)dhfr，轉(zhuǎn)移對甲氨喋呤的抗性(Wigler等，1980，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 77357；O’Hare等，1981，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 781527)；gpt，轉(zhuǎn)移對霉酚酸的抗性(Mulligan & Berg，1981，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 782072)；neo，轉(zhuǎn)移對氨基糖苷G-418的抗性(Goldspiel等，臨床藥物12488-505；Wu和Wu，1991，生物治療387-95；Tolstoshev，1993，藥物學(xué)毒理學(xué)年度評論32573-596；Mulligan，1993，科學(xué)260926-932；和Morgan&Anderson，1993，年度生物化學(xué)評論62191-217；May，1993，TIB TECH 11(5)155-215)；和hygro，轉(zhuǎn)移對潮霉素的抗性(Santerre等，1984，基因30147)。在Ausubel等編，1998，現(xiàn)代分子生物學(xué)實驗指南，約翰威利父子出版社，紐約；Kriegler，1990，基因轉(zhuǎn)移和表達，實驗室手冊，斯托克頓出版社，紐約；和第12和13章，Dracopoli等編，1994，人類遺傳學(xué)實驗指南，約翰威利父子出版社，紐約；Colberre-Garapin等，1981，分子生物學(xué)期刊1501中描述了在重組DNA技術(shù)領(lǐng)域普遍所知的可被應(yīng)用的方法，以上文獻引入本文做參考。
抗體分子的表達水平可被載體擴增所增強(綜述見Bebbington和Hentschel，在DNA克隆中應(yīng)用基于基因擴增基礎(chǔ)之上的載體在哺乳動物細胞中表達克隆的基因，第三卷(學(xué)院出版社，紐約，1987))。當(dāng)表達抗體的載體系統(tǒng)中的標記也是可以擴增時，宿主細胞培養(yǎng)中抑制劑水平的升高將增加標記基因的拷貝數(shù)。由于擴增區(qū)與抗體基因相關(guān)，抗體的產(chǎn)量也會增加(Crouse等，1983，分子細胞生物學(xué)3257)。
宿主細胞可以被本發(fā)明的兩種表達載體共轉(zhuǎn)染，第一種載體編碼重鏈來源的多肽并且第二種載體編碼輕鏈來源的多肽。這兩種載體含有使重鏈和輕鏈多肽等量表達的相同的選擇標記。在這種情況下，輕鏈應(yīng)該置于重鏈之前以避免無毒重鏈的過量表達(Proudfoot，1986，自然32252；Kohler，1980，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 772197)。重鏈和輕鏈的編碼序列可能包含cDNA或基因組DNA。
一旦本發(fā)明的抗體分子被重組表達，即可利用本領(lǐng)域純化免疫球蛋白分子的任何已知的方法對其進行純化，例如，通過層析(例如，離子交換、親和，特別是在蛋白質(zhì)A后與特異性抗原的親和、分子大小柱層析)，離心，分級溶解或通過其它任何一種用于蛋白質(zhì)純化的標準技術(shù)。
抗體綴合物為產(chǎn)生融合蛋白，本發(fā)明的所包含的抗體重組融合至或化學(xué)偶聯(lián)(包括共價和非共價綴合)至本發(fā)明多肽(或其部分，優(yōu)選此多肽的至少10、20或50個氨基酸)上。這種融合并不必要是直接的，但可以通過連接序列融合?？贵w也可以是對除本發(fā)明多肽(或其部分，優(yōu)選此多肽的至少10、20或50個氨基酸)以外的抗原特異性的抗體。例如，通過體外或體內(nèi)將本發(fā)明的多肽融合至或偶聯(lián)至特定細胞表面受體特異性的抗體上，抗體可被用于將本發(fā)明多肽定向至特定細胞類型上。融合或偶聯(lián)至本發(fā)明多肽上的抗體也可被用于使用本領(lǐng)域已知方法的體外免疫分析和純化中。見，例如Harbor等，supra，和PCT出版號WO 93/21232；EP439095；Naramura等，免疫學(xué)通信3991-99(1994)；美國專利5474981；Gillies等，PNAS 891428-1432(1992)；Fell等，免疫學(xué)期刊1462446-2452(1991)，全文引入本文做參考。
本發(fā)明另外包括含有融合或結(jié)合至非可變區(qū)抗體功能區(qū)的本發(fā)明多肽的組合物。例如，本發(fā)明多肽可融合或結(jié)合至抗體Fc區(qū)或其部分。融合至本發(fā)明多肽上的抗體部分可能包含恒定區(qū)、鉸鏈區(qū)、CHl功能區(qū)、CH2功能區(qū)、CH3功能區(qū)或完整功能區(qū)及其部分的任何一種組合。本發(fā)明多肽也可被融合至或結(jié)合至上述抗體部分以形成多聚體。例如，融合至本發(fā)明多肽上的Fc部分能夠通過Fc部分之間的二硫鍵形成二聚體。更高的多聚體形式可以通過將多肽融合至IgA或IgM的部分上形成。將本發(fā)明多肽融合至或結(jié)合至抗體部分的方法是本領(lǐng)域所熟知的。見，例如美國專利5336603；5622929；5359046；5349053；5447851；5112946；EP307434；EP367166；PCT出版號WO96/04338；WO 91/06570；Ashkenazi等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 8810535-10539(1991)；Zheng等，免疫學(xué)期刊1545590-5600(1995)；和Vil等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 8911337-11341(1992)(上述文獻全文引入本文做參考)。
如上所討論的，本發(fā)明多肽可被融合至或綴合至上述抗體部分以增加多肽在體內(nèi)的半衰期或用于使用本領(lǐng)域所熟知方法的免疫分析中。而且，本發(fā)明多肽可被融合至或結(jié)合至上述抗體部分以促進純化。一個報道的例子描述了由人CD4多肽的前兩個區(qū)和哺乳動物免疫球蛋白重鏈或輕鏈恒定區(qū)各個不同功能區(qū)所組成的嵌合蛋白(見，例如EP 394827；Traunecker等，自然，33184-86(1988))。具有二硫橋連接的二聚體結(jié)構(gòu)(由于IgG部分)的融合或結(jié)合至抗體的本發(fā)明多肽也已經(jīng)被發(fā)現(xiàn)比其單體分泌的蛋白或單獨的蛋白更有效的結(jié)合和中和其它分子(見Fountoulakis等，生物化學(xué)期刊2703958-3964(1995))。在許多情況下，融合蛋白中的Fc部分在治療及診斷中非常有用，并且因此能夠?qū)е吕绺倪M的藥物動力學(xué)特征(EP A 232262)。另外，在融合蛋白已經(jīng)被表達、檢測和純化以后去除Fc部分是我們所希望的。例如，F(xiàn)c部分的存在是對治療和診斷的一種障礙，如果融合蛋白被用做免疫接種中的免疫原時。在藥物發(fā)現(xiàn)研究中，例如人蛋白如hIL-5已經(jīng)和Fc部分融合以用于高產(chǎn)量篩選分析中鑒定hIL-5的拮抗劑。見D.Bennett等，分子識別期刊852-58(1995)和K.Johanson等，生物化學(xué)期刊2709459-9471(1995)。
而且，本發(fā)明的抗體或其片段可被融合至標記序列上去，例如一種促進融合多肽純化的肽。在某些優(yōu)選的實施方案中，標記氨基酸序列是6個組氨酸肽，例如在pQE載體中所提供的標記(QIAGEN公司，加州Chatsworth市，Eton大街9259號，91311)，還有許多其它商業(yè)上有售的標記。正如在Gentz等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA86821-824(1989)中所描述的，例如，為了方便純化融合蛋白使用了6個組氨酸。其它用于純化的肽標記包括但不局限于對應(yīng)于流感血凝素蛋白來源的表位的“HA”標記(Wilson等，細胞37767(1984))和“flag”標記。
本發(fā)明另外包含與診斷和治療試劑綴合的抗體或其片段?？贵w可被用于診斷性監(jiān)測腫瘤的發(fā)展或進展，作為臨床檢測程序的一部分例如測定某一給定的治療策略的效率。將抗體偶聯(lián)到一種可檢測到的物質(zhì)上去可促進檢測。可檢測到的物質(zhì)的例子包括各種酶、修復(fù)基團、熒光物質(zhì)、發(fā)光物質(zhì)、生物發(fā)光物質(zhì)、放射性物質(zhì)、使用各種陽離子釋放體層攝影的陽離子釋放金屬、和非放射性順磁金屬離子。見，例如美國專利4741900的根據(jù)本發(fā)明可被結(jié)合至抗體用于診斷的金屬離子。合適的酶的例子包括辣根過氧化物酶、堿性磷酸酶、β-半乳糖苷酶或乙酰膽堿酯酶；合適的修復(fù)基團復(fù)合體的例子包括鏈親和素/生物素和親和素/生物素；合適的熒光物質(zhì)的例子包括傘形酮、熒光素、異硫氰酸熒光素、羅丹明、二氯三嗪基胺(dichlorotriazinylamine)熒光素、丹磺酰氯或藻紅蛋白；合適的發(fā)光物質(zhì)的例子包括魯米諾；生物發(fā)光物質(zhì)的例子包括蟲熒光素酶、蟲熒光素和水母發(fā)光蛋白；合適的放射性物質(zhì)的例子包括125I、131I、111In或99Tc。
而且，本發(fā)明的抗體或其片段可與治療性分子部分如細胞毒素結(jié)合，例如一種細胞抑制劑或殺細胞劑，一種治療劑或一種放射性金屬離子。細胞毒素或細胞毒性試劑包括任何對細胞具有致命危害的試劑。例子包括紫杉酚，細胞松弛素B，短桿菌肽D，溴乙啡啶，吐根堿，絲裂霉素，依托泊甙，tenoposide，長春新堿，長春堿，秋水仙素，阿霉素，柔紅霉素，二羥基炭疽菌素二酮(dihydroxy anthracindione)，米托蒽醌，光輝霉素，放線菌素D，1-去氫睪酮，糖皮質(zhì)激素，普魯卡因，丁卡因，利多卡因，心得安和嘌呤霉素及其類似物或同系物。治療性試劑包括但不局限于抗代謝物(例如，甲氨喋呤，6-巰基嘌呤，6-硫鳥嘌呤，阿糖胞苷，5-氟尿嘧啶decarbazine)，堿基化試劑(例如，氮芥，泛磺瘤可寧，美法侖，卡氮芥(BSNU)和羅氮芥(CCNU)，cyclothosphamide，白消安，二溴甘露醇，鏈佐星，絲裂霉素C，和二氯二胺順鉑(II)(DDP)，順鉑)，蒽環(huán)類抗生素(例如，柔紅霉素(以前稱做柔紅霉素)和阿霉素)，抗生素(例如，放線菌素(以前稱做放線菌素)，博來霉素，光輝霉素和安曲霉素(AMC))，和抗有絲分裂試劑(例如，長春新堿和長春堿)。
本發(fā)明的綴合物可被用于修飾一種給定的生物學(xué)應(yīng)答，治療劑或藥物分子部分不應(yīng)被理解為限于經(jīng)典的化學(xué)治療劑。例如，藥物分子部分可以是具有一種我們所希望的生物學(xué)活性的蛋白質(zhì)或多肽。這樣的蛋白質(zhì)可能包括，例如一種毒素如紅豆毒素，蓖麻子蛋白A，假單胞菌外毒素，或白喉毒素；一種蛋白質(zhì)如腫瘤壞死因子、α-干擾素、β-干擾素、神經(jīng)生長因子、血小板來源的生長因子、組織纖維蛋白溶酶原激活劑、一種血栓形成試劑或一種抗血管生成試劑；例如制管張素或endostatin；或生物學(xué)應(yīng)答修飾劑例如淋巴因子、白細胞介素-1(“IL-1”)、白細胞介素-2(“IL-2”)、白細胞介素-6(“IL-6”)、粒細胞巨噬細胞集落刺激因子(“GM-CSF”)，粒細胞集落刺激因子(“G-CSF”)或其它生長因子。
抗體也可被吸附至在免疫分析或純化目的抗原中特別有用的固相支持載體。這樣的固相支持載體包括但不局限于玻璃、纖維素、聚丙烯酰胺、尼龍、聚苯乙烯、聚氯乙烯或聚丙烯。
將這樣的治療性部分綴合至抗體的方法是眾所周知的，見，例如Amon等，“在癌癥治療中用于藥物免疫定向的單克隆抗體”，在單克隆抗體和癌癥治療中，Reisfield等編，243-56頁(Alan R.Liss公司1985)；Hellstrom等，“用于運送藥物的抗體”，在控制的藥物運送中(第二版)，Robinson等編，623-53頁(Marcel Dekker公司1987)；Thrope，“綜述在癌癥治療中細胞毒性試劑的抗體載體”，在單克隆抗體生物學(xué)的和臨床應(yīng)用，Pinchera等編，475-506頁(1985)；“在癌癥治療中放射性標記的抗體的治療應(yīng)用的分析、結(jié)果以及展望”，在癌癥檢測和治療的單克隆抗體中，Baldwin等編，303-16頁(學(xué)院出版社1985)；和Thrope等，“抗體-毒素結(jié)合物的制備和細胞毒性特性”，免疫學(xué)綜述62119-58(1982)。
另外，抗體可被綴合至第二抗體以形成抗體異源綴合物，正如Segal在美國專利4676980中所描述的，引入本文做參考。
一種帶有或不帶有綴合的治療性部分的抗體可單獨施與，或與細胞毒性因子和/或細胞因子組合施與用于治療。
抗體結(jié)合的分析可以通過本領(lǐng)域任何一種已知的方法分析本發(fā)明抗體的免疫特異性結(jié)合?？梢允褂玫拿庖叻治龇椒òǖ痪窒抻谑褂美绲鞍子≯E、放射免疫分析技術(shù)、ELISA(酶聯(lián)免疫吸附分析技術(shù))、“夾心法”免疫分析、免疫沉淀分析、沉淀反應(yīng)、凝膠擴散沉淀反應(yīng)、免疫擴散分析、凝集分析、補體結(jié)合分析、免疫放射性測量分析、免疫熒光分析、蛋白質(zhì)A免疫分析等技術(shù)的競爭性以及非競爭性分析方法。這樣的分析方法是本領(lǐng)域眾所周知的常規(guī)方法(見，例如Ausubel等編，1994，現(xiàn)代分子生物學(xué)實驗指南，第一卷，約翰威利父子公司，紐約，全文引入本文做參考)。下文中簡要描述了有代表性的免疫分析方法(但并未限制)。
免疫沉淀步驟通常包括在裂解緩沖液如補充有蛋白質(zhì)磷酸酶和/或蛋白酶抑制劑(例如，EDTA，PMSF，抑肽酶，釩酸鈉)的RIPA緩沖液(1％的NP-40或曲拉通X-100，1％脫氧膽酸鈉，0.1％SDS，0.15M NaCl，0.01M磷酸鈉pH7.2，1％抑肽酶)中裂解細胞，將目的抗體加入到裂解液中4℃孵育一段時間(例如，1-4小時)，向細胞裂解液中加入蛋白質(zhì)A和/或蛋白質(zhì)G葡聚糖珠，在4℃孵育1個小時或更長時間，用裂解緩沖液洗滌珠然后將珠重懸在SDS/樣品緩沖液中。目的抗體免疫沉淀特定抗原的能力可以通過例如蛋白印跡分析測得。本領(lǐng)域熟練技術(shù)人員應(yīng)該對參數(shù)具有足夠的知識以便修飾參數(shù)增加抗體與抗原的結(jié)合并且降低背景(例如，用葡聚糖珠預(yù)先清洗細胞裂解液)。另外的關(guān)于免疫沉淀方法的討論見l0.16.1.的Ausubel等編，1994，現(xiàn)代分子生物學(xué)實驗指南，第一卷，約翰威利父子公司，紐約。
蛋白印跡分析通常包括制備蛋白質(zhì)樣品，在聚丙烯酰胺凝膠(例如，根據(jù)抗原的分子量選用8％-20％的SDS-PAGE)中對蛋白質(zhì)樣品進行電泳，將聚丙烯酰胺凝膠上的蛋白質(zhì)樣品轉(zhuǎn)移到膜例如尼龍纖維素膜、PVDF或尼龍膜，在封閉液(例如，含有3％BSA的PBS溶液或脫脂奶)中封閉膜，用洗滌液(例如，含有吐溫-20的PBS溶液)洗滌膜，用稀釋在封閉液中的一抗(目的抗體)封閉膜，用洗滌液洗滌膜，用稀釋在封閉液中的與酶底物(例如辣根過氧化物酶或堿性磷酸酶)或放射性標記(例如，32P或125I)結(jié)合的第二抗體(識別一抗的抗體，例如一種抗人抗體)封閉膜，用洗滌液洗滌膜，然后檢測抗原的存在。本領(lǐng)域熟練技術(shù)人員應(yīng)該對參數(shù)具有足夠的知識以便修飾參數(shù)增強所檢測的信號并且降低背景。關(guān)于蛋白印跡的另外的討論，見10.8.1的Ausubel等編，1994，現(xiàn)代分子生物學(xué)實驗指南，第一卷，約翰威利父子公司，紐約。
ELISAs包含制備抗原，使用抗原包被96孔微量滴定板，將與可檢測的化合物如酶底物(例如辣根過氧化物酶或堿性磷酸酶)綴合的目的抗體加入到孔中并且孵育一段時間，然后檢測抗原的存在。在ELISAs中，目的抗體并不一定要和可檢測的化合物綴合；相反，與可檢測的化合物綴合的二抗(識別目的抗體)可被加入到孔中。而且，除了用抗原包被板孔之外，也可用抗體包被板孔。在這種情況下，在向已經(jīng)包被的孔中加入目的抗原以后，再加入與可檢測的化合物綴合的二抗。本領(lǐng)域熟練技術(shù)人員應(yīng)該對參數(shù)具有足夠的知識以便修飾參數(shù)增強所檢測的信號以及本領(lǐng)域已知的ELISAs方法的其它變化。關(guān)于ELISAs的另外的討論，見11.2.1的Ausubel等編，1994，現(xiàn)代分子生物學(xué)實驗指南，第一卷，約翰威利父子公司，紐約。
抗體與抗原的結(jié)合親和性以及抗原抗體相互作用的解離率可通過競爭結(jié)合分析測定。競爭性結(jié)合分析的一個實施例是放射免疫分析，它包括將標記的抗原(例如，3H或125I)在存在數(shù)量不斷增加的未標記抗原的情況下與目的抗體孵育，然后檢測與標記的抗原結(jié)合的抗體。目的抗體與特定抗原的親和性以及結(jié)合的解離率可以從scatchard plot分析得到的數(shù)據(jù)中測定。與二抗的競爭也可用放射免疫分析測定。在這種情況下，抗原在存在數(shù)量不斷增加的未標記抗體的情況下與結(jié)合了標記化合物的目的抗體(例如，3H或125I)孵育。
治療性用途本發(fā)明另外涉及以抗體為基礎(chǔ)的治療，此治療涉及向患病動物優(yōu)選哺乳動物最優(yōu)選人施與本發(fā)明的抗體治療一種或多種上述的紊亂。本發(fā)明的治療性化合物包括但不局限于本發(fā)明的抗體(如文中所述，包括其片段、類似物和衍生物)和編碼本發(fā)明抗體的核酸(如文中所述，包括其片段、類似物和衍生物)。本發(fā)明抗體可被用于治療或預(yù)防與本發(fā)明多肽異常表達和/或異?；钚韵嚓P(guān)的疾病和紊亂，包括但不局限于疾病和/或紊亂例如自身免疫疾病和/或缺陷，如文中所述。對本發(fā)明多肽異常表達和/或異?；钚韵嚓P(guān)的疾病和紊亂的治療包括但不局限于減緩與這些疾病和紊亂相關(guān)的癥狀。如本領(lǐng)域眾所周知的以及正如文中所述，本發(fā)明抗體可在藥物學(xué)認可的組合物中被提供。
本發(fā)明抗體可被治療性應(yīng)用的方式包括在體內(nèi)局部或全身結(jié)合本發(fā)明的多核苷酸或多肽，或引導(dǎo)抗體的細胞毒性，例如如同由補體(CDC)或效應(yīng)細胞(ADCC)所介導(dǎo)的。下文中詳細描述了一些這樣的方法。利用本文中所提供的知識和教導(dǎo)，本領(lǐng)域熟練技術(shù)人員將會懂得如何在不進行多余實驗的情況下將本發(fā)明的抗體用于診斷、監(jiān)測或治療目的。
本發(fā)明的抗體可優(yōu)先與其它單克隆抗體或嵌合抗體組合使用，或與淋巴因子或造血生長因子(例如，IL-2，IL-3和IL-7)組合使用，例如它們有助于增加能夠與抗體相互作用的效應(yīng)細胞的數(shù)目或活性。
本發(fā)明的抗體既可單獨施與，又可與其它治療手段(例如，放療、化療、激素治療、免疫治療和抗腫瘤試劑)組合施與。通常情況下，優(yōu)選所施與的產(chǎn)品的物種來源或物種反應(yīng)性(當(dāng)是抗體的情況下)與患者是同一物種的。因此，在一個優(yōu)選的實施方案中，人抗體、片段、衍生物、類似物或核酸被施與患病的人體內(nèi)用于治療或預(yù)防。
優(yōu)選使用抗本發(fā)明的多核苷酸或多肽或其片段或功能區(qū)的高親和性和/或強體內(nèi)抑制和/或中和抗體，用于免疫分析和治療與本發(fā)明的多核苷酸或多肽包括其片段相關(guān)的紊亂。這些抗體、片段或功能區(qū)將優(yōu)選與多核苷酸或多肽包括其片段具有親和性。優(yōu)選的結(jié)合親和性的解離常數(shù)或Kd小于5×10-6M，10-6M，5×10-7M，10-7M，5×10-8M，10-8M，5×10-9M，10-9M，5×10-10M，10-10M，5×10-11M，10-11M，5×10-12M，10-12M，5×10-13M，10-13M，5×10-14M，10-14M，5×10-15M，和10-15M。
基因治療在特定的實施方案中，包含抗體或其功能性衍生物編碼序列的核酸被通過基因治療的方式施與以治療、抑制或預(yù)防與本發(fā)明多肽的異常表達和/或活性相關(guān)的疾病或紊亂。基因治療指向待治療個體施與表達的或可表達的核酸的治療。在本發(fā)明這方面的實施方案中，核酸產(chǎn)生它們所編碼的介導(dǎo)治療效應(yīng)的蛋白質(zhì)。
根據(jù)本發(fā)明本領(lǐng)域中任何一種可用于基因治療的方法都可被使用。下文中描述了代表性方法。
關(guān)于基因治療方法的一般綜述，見Goldspiel等，1993，臨床藥物12488-505；Wu和Wu，1991，生物治療387-95；Tolstoshev，1993，藥物學(xué)毒理學(xué)年度評論32573-596；Mulligan，1993，科學(xué)260926-932；和Morgan&Anderson，1993，年度生物化學(xué)評論62191-217；May，1993，TIB TECH 11(5)155-215)。在Ausubel等編，1998，現(xiàn)代分子生物學(xué)實驗指南，約翰威利父子出版社，紐約；和Kriegler，1990，基因轉(zhuǎn)移和表達，實驗室手冊，斯托克頓出版社，紐約中描述了在重組DNA技術(shù)領(lǐng)域普遍所知的可被應(yīng)用的方法。
在一個優(yōu)選的方面，化合物包含編碼抗體的核酸，所述核酸序列是在合適的宿主中表達抗體或片段或嵌合蛋白或其重鏈或輕鏈的載體的一部分。尤其是，這樣的核酸序列具有與抗體編碼基因可操作連接的啟動子，所述的啟動子是誘導(dǎo)型或組成型表達的，并且任選是組織特異性的。在另外一個特別的實施方案中，所使用的核酸分子或任何其它目的序列的兩端都有促進在基因組目的位點發(fā)生同源重組的側(cè)翼區(qū)，這樣就提供了抗體核酸分子的染色體內(nèi)表達(Koller和Smithies，1989，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 868932-8935；Zijlstra等，1989，自然342435-438)。在特定的實施方案中，表達的抗體分子是單鏈分子；另外，核酸序列包括抗體的重鏈和輕鏈或其片段的編碼序列。
可將核酸分子直接運送進入病人體內(nèi)，在這種情況下病人直接暴露至核酸分子或核酸攜帶載體，也可以間接進入病人體內(nèi)，在此情況下先用核酸在體外轉(zhuǎn)化細胞然后將轉(zhuǎn)化的細胞移植入病人體內(nèi)。這兩種方法分別是已知的體內(nèi)和離體基因治療。
在一個特定的實施方案中，核酸分子被直接施與體內(nèi)表達產(chǎn)生編碼產(chǎn)物。這可以通過本領(lǐng)域已知的無數(shù)方法中的任何一種來完成，例如將它們構(gòu)建作為一個合適的核酸表達載體然后施與體內(nèi)使之進入細胞內(nèi)，例如通過使用缺陷的或減毒的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體或其它病毒載體(見美國專利4980286)，或通過直接注射裸DNA，或通過微粒轟擊(例如，基因槍；Biolistic，Dupont)，或利用脂類、細胞表面受體或轉(zhuǎn)染試劑包被，形成膠囊化的脂質(zhì)體、微粒或微膠囊，或通過將它們與一段已知能夠進入核中的肽連接然后施與，或通過將它們與一已知能夠易于起始受體介導(dǎo)的內(nèi)吞的配體連接然后施與(見，例如Wu和Wu，1987，生命的化學(xué)期刊2624429-4432)(可被用于定向至特異性表達受體的細胞類型上)等。在另一個實施方案中，可以形成核酸-配體復(fù)合體其中配體包含一種破壞核內(nèi)體的溶基因病毒肽，這使得核酸分子能夠避免核酶降解。在另外一個實施方案中，由于細胞的特異性攝入和表達，核酸能夠通過定向至一個特異性受體在體內(nèi)定向(見，例如PCT出版號WO 92/06180，1992年4月16日公開(Wu等)；WO 92/22635，1992年12月23日公開(Wilson等)；WO 92/20316，1992年11月26日公開(Findeis等)；WO93/14188，1993年7月22日公開(Clarke等)；WO 93/20221，1993年10月14日公開(Young等))。另外，核酸可被導(dǎo)入細胞內(nèi)并且通過同源重組整合至宿主細胞DNA中表達(Koller和Smithies，1989，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 868932-8935；Zijlstra等，1989，自然342435-438)。
在一個特定的實施方案中，使用了含有編碼本發(fā)明抗體的核酸序列病毒載體。例如，可以使用逆轉(zhuǎn)錄病毒載體(見Miller等，1993，酶學(xué)方法217581-599)。這些逆轉(zhuǎn)錄病毒載體已經(jīng)被去除對病毒基因組包裝和整合進入宿主細胞DNA非必要的逆轉(zhuǎn)錄病毒序列。在基因治療中所用的編碼抗體的核酸序列被克隆到一個或多個促進將基因運送進入病人體內(nèi)的載體中。關(guān)于逆轉(zhuǎn)錄病毒載體更詳細的信息可在Boesen等，1994，生物治療6291-302中發(fā)現(xiàn)，其中描述了使用逆轉(zhuǎn)錄病毒載體向造血干細胞運送mdrl基因以使干細胞對化療產(chǎn)生抗性。其它關(guān)于在基因治療中使用逆轉(zhuǎn)錄病毒載體的文獻有Clowes等，1994，臨床投資期刊93644-651；Kiem等，1994，血液831467-1473；Salmons和Gunzberg，1993，人體基因治療4129-141；以及Grossman和Wilson，1993，遺傳學(xué)和發(fā)育現(xiàn)代論點3110-114。
腺病毒是可被用于基因治療的其它病毒載體。對于將基因運送到呼吸道上皮來說，腺病毒是特別具有吸引力的運送工具。腺病毒自然感染呼吸道上皮并且引起輕微疾病。腺病毒運送系統(tǒng)的其它靶有肝臟、中樞神經(jīng)系統(tǒng)、內(nèi)皮細胞和肌肉。腺病毒具有能夠感染非分裂細胞的優(yōu)點。Kozarsky和Wilson，1993，遺傳學(xué)和發(fā)育現(xiàn)代論點3499-503中發(fā)表了一篇基于腺病毒基因治療的綜述。Bout等，1994，人體基因治療53-10顯示了使用腺病毒載體運送基因到恒河猴的呼吸道上皮。其它關(guān)于在基因治療中使用腺病毒的例子見Rosenfeld等，1991，科學(xué)252431-434；Rosenfeld等，1992，細胞68143-155；Mastrangeli等，1995，臨床投資期刊91225-234；PCT出版號WO 94/12649；和Wang等，1995，基因治療2775-783。在一個優(yōu)選的實施方案中，使用了腺病毒載體。
腺病毒伴隨病毒(AAV)也已經(jīng)被提出可在基因治療中應(yīng)用(Awlsh等，1993，Proc.Soc.Exp.Biol.Med.204289-300；美國專利5436146)。
基因治療的另一途徑涉及通過一些方法例如電穿孔、脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染、磷酸鈣介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染或病毒感染等將基因運送到組織培養(yǎng)中的細胞內(nèi)。通常情況下，轉(zhuǎn)移方法包括將一種可選擇標記轉(zhuǎn)移到細胞內(nèi)。然后將選擇細胞以分離那些已經(jīng)攝入并且表達所轉(zhuǎn)移的基因的細胞。然后把這些細胞運送到病人體內(nèi)。
在這個實施方案中，在體內(nèi)施與產(chǎn)物重組細胞之前將核酸導(dǎo)入細胞內(nèi)。這樣的導(dǎo)入可以使用本領(lǐng)域任何一種已知的方法，包括但不局限于轉(zhuǎn)染、電穿孔、顯微注射、用含有核酸序列的病毒載體或細菌噬菌體載體感染、細胞融合、染色體介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)移、微細胞介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)移、原生質(zhì)體融合等。本領(lǐng)域中有許多中已知的技術(shù)可被用于將外源基因?qū)氲郊毎麅?nèi)(見，例如Loeffler和Behr，1993，酶學(xué)方法217599-618；Cohen等，1993，酶學(xué)方法217618-644；Cline，1985，藥物治療2969-92)并且根據(jù)本發(fā)明都可被使用，但是受體細胞的必須的發(fā)育和生理功能不能被破壞。此技術(shù)應(yīng)該向細胞提供穩(wěn)定的核酸轉(zhuǎn)移，以致于核算是可被細胞表達的優(yōu)選是遺傳的并且由后代細胞表達。
得到的重組細胞可以通過本領(lǐng)域已知的各種不同的方法被運送到病人體內(nèi)。重組的血液細胞(造血干細胞或祖細胞)優(yōu)選被靜脈內(nèi)施與。所使用的細胞的數(shù)量依賴于所希望的效果、病人的狀態(tài)等等，并且可被本領(lǐng)域熟練技術(shù)人員確定。
核酸可被導(dǎo)入其中以用于基因治療的細胞包括任何我們所希望的、可用的細胞類型，并且包括但不局限于上皮細胞、內(nèi)皮細胞、角質(zhì)形成細胞、成纖維細胞、肌肉細胞、肝細胞血液細胞例如T淋巴細胞、B 淋巴細胞、單核細胞、巨噬細胞、嗜中性粒細胞、嗜酸性粒細胞、成巨核細胞、粒細胞；各種不同的干細胞或祖先細胞，特別是造血干細胞或祖細胞，例如從骨髓、臍帶血液、外周血、胎肝等中獲得的細胞。
在一個優(yōu)選的實施方案中，用于基因治療的細胞與病人是自體同源的。
在一個重組細胞用于基因治療的實施方案中，編碼抗體的核酸序列被導(dǎo)入細胞以使得它們能夠被細胞或其后代細胞所表達，然后重組細胞被體內(nèi)施與用于治療。在一個特定的實施方案中，使用了干細胞或祖先細胞。根據(jù)本發(fā)明的這個實施方案，任何能夠被分離并且能夠在體外維持的干細胞和/或祖先細胞都可能被使用(見，例如PCT出版號WO 94/08598，1994年4月8日公開；Stemple和Anderson，1992，細胞71973-985；Rheinwald，1980，細胞生物學(xué)方法21A229；以及Pittelkow和Scott，1986，Mayo Clinic Proc.61771)。
在一個特定的實施方案中，將被導(dǎo)入用于基因治療的核酸包含一個與編碼區(qū)可操作連接的可誘導(dǎo)的啟動子，因此核酸的表達是通過控制轉(zhuǎn)錄的合適的誘導(dǎo)子的存在或不存在而受控制的。
治療或預(yù)防活性的證明本發(fā)明的化合物或藥物組合物在用于人體之前優(yōu)選先在體外然后在體內(nèi)測試所希望的治療或預(yù)防活性。例如，顯示化合物或藥物組合物治療或預(yù)防應(yīng)用的體外分析包括化合物對細胞系或病人組織樣品的效果?；衔锘蚪M合物對細胞系和/或組織樣品的效果可通過利用本領(lǐng)域熟練技術(shù)人員已知的方法去測定，這些方法包括但不局限于玫瑰花結(jié)形成分析和細胞裂解分析。根據(jù)本發(fā)明，用于測定是否施與的一種特定的化合物效果顯現(xiàn)出來的體外分析，包括體外細胞培養(yǎng)分析，其中病人的組織樣品在培養(yǎng)中生長，并且暴露至或另外施與一種化合物，然后觀測這種化合物對組織樣品的效果。
治療性/預(yù)防性施與方法和組合物本發(fā)明提供了通過向研究對象施與本發(fā)明有效劑量的化合物或藥物組合物優(yōu)選本發(fā)明抗體的治療、抑制和預(yù)防方法。在一個優(yōu)選的實施方案中，化合物是基本純化的(例如，基本沒有限制其效果或產(chǎn)生所不希望的副反應(yīng)的物質(zhì))。研究對象優(yōu)選是動物，包括但不局限于動物如牛、豬、馬、雞、貓、狗等，并且優(yōu)選是哺乳動物，最優(yōu)選是人。
當(dāng)此化合物包含核酸分子或免疫球蛋白時，已經(jīng)在上文中描述了可被應(yīng)用的施與此化合物的制劑和方法；其它合適的制劑形式和施與途徑可從下文的描述中選擇應(yīng)用。
各種不同的運送系統(tǒng)都是已知的并且都可被用于施與本發(fā)明的化合物，例如膠囊化脂質(zhì)體、微顆粒、微膠囊、能夠表達此化合物的重組細胞、受體介導(dǎo)的內(nèi)吞(見，例如Wu和Wu，1987，生命的化學(xué)期刊2624429-4432)、核酸作為逆轉(zhuǎn)錄病毒或其它載體部分的構(gòu)建物等。導(dǎo)入的方法包括但不局限于皮內(nèi)、肌肉內(nèi)、腹膜內(nèi)、靜脈內(nèi)、皮下、鼻內(nèi)、硬膜外和經(jīng)口途徑。化合物或組合物可以任何便利的途徑被施與，例如通過輸液或團塊注射，通過內(nèi)皮或皮膚粘膜(例如，口腔粘膜、直腸和消化道粘膜等)吸收和可與其它生物學(xué)活性試劑一起施與?？扇硎┡c或局部施與。此外，可以通過任何合適的途徑將本發(fā)明的藥物組合物或化合物導(dǎo)入到中樞神經(jīng)系統(tǒng)中，包括心室內(nèi)和鞘內(nèi)注射；心室內(nèi)注射可被連接到貯器例如奧馬耶貯器的心室內(nèi)導(dǎo)管所促進。也可以應(yīng)用肺部施與，例如通過使用吸入器或噴霧器，和帶有噴霧劑的劑型。
在一個特定的實施方案中，我們希望將本發(fā)明的藥物化合物或組合物局部施與需要治療的區(qū)域；這可以通過例如，但不是限制的方式，手術(shù)時局部輸液，局部應(yīng)用，例如手術(shù)后與傷口紗布結(jié)合應(yīng)用、通過注射、通過導(dǎo)管方法、通過栓劑方法或通過移植物，所述的移植物是多孔的、非多孔的或凝膠材料包括膜例如sialastic膜或纖維。優(yōu)選的，當(dāng)施與本發(fā)明的一種蛋白質(zhì)包括抗體時，必須注意使用不吸收蛋白質(zhì)的材料。
在另一個實施方案中，化合物或組合物可在一種運送工具中被運送，特別是在脂質(zhì)體中(見Langer，1990，科學(xué)2491527-1533；Treat等，治療傳染性疾病和癌癥中的脂質(zhì)體，Lopez-Berestein和Fidler編，利茲出版社，紐約，353-365頁(1989)；Lopez-Berestein，ibid，317-327頁；見ibid)。
在另一個實施方案中，化合物或組合物可在一種控制的釋放系統(tǒng)中被運送。在一個實施方案中，可使用泵(見，Langer，supra；Sefton，1987，CRC Ref.Biomed.Eng.14201；Buchwald等，1980，外科88507；Saudek等，1989，新英格蘭醫(yī)學(xué)期刊321574)。在另一個實施方案中，可以使用聚合物材料(見，可控制的釋放的醫(yī)學(xué)應(yīng)用，Langer和Wise編，CRC出版社，Boca Raton，佛羅里達(1974)；控制的藥物生物存在，藥物產(chǎn)品設(shè)計和表現(xiàn)，Smolen和Ball編，Wiley出版社，紐約(1984)；Ranger和Peppas J，1983，Macromol.Sci.Rev.Macromol.Chem.2361；也見Levy等，1985，科學(xué)228190；During等，1980，年度神經(jīng)學(xué)25351；Howard等，1989，神經(jīng)外科期刊71105)。在另一個實施方案中，可控制的釋放系統(tǒng)可被放置在治療靶的附近，即腦，因此僅僅只需要全身劑量的一部分(見，例如Goodson，可控制的釋放的醫(yī)學(xué)應(yīng)用，supra，第2卷，115-138頁(1984))。
在Langer的綜述(1990，科學(xué)2491527-1533)中詳細討論了其它的可控制的釋放系統(tǒng)。
在一個特定的實施方案中，其中本發(fā)明的化合物是編碼蛋白質(zhì)的核酸，此核酸可被體內(nèi)施與以促進它所編碼的蛋白質(zhì)的表達，通過將它構(gòu)建作為一個合適的核酸表達載體的一部分然后施與體內(nèi)使之進入細胞內(nèi)，例如通過使用逆轉(zhuǎn)錄病毒載體(見美國專利4980286)，或通過直接注射，或通過微粒轟擊(例如，基因槍；Biolistic，Dupont)，或利用脂類、細胞表面受體或轉(zhuǎn)染試劑包被，或通過將它們與一段已知能夠進入核中的同源盒樣的多肽連接然后施與(見，例如Joliot等，1991，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 881864-1868)等。另外，核酸可被導(dǎo)入細胞內(nèi)并且通過同源重組整合至宿主細胞DNA中表達。
本發(fā)明也提供了藥物組合物。這樣的組合物含有治療上有效劑量的化合物和一種治療上認可的載體。在一個特定的實施方案中，術(shù)語“治療上認可的”意指在動物更優(yōu)選在人體內(nèi)使用被聯(lián)邦或州政府的協(xié)調(diào)處所允許的或在美國藥物標準或其它普遍認可的標準中列出的。術(shù)語“載體”意指與治療同時施與的一種稀釋劑、佐劑、賦形劑或運送載體。這樣的藥物載體也可以是無菌的液體，例如水和油，包括那些石油、動物、植物來源的或合成的，例如花生油、大豆油、礦物油、芝麻油和類似物。當(dāng)藥物組合物被靜脈內(nèi)施與時，水是優(yōu)選的載體。鹽溶液和葡萄糖水以及甘油溶液也可被用做液體載體，特別是用于注射溶液中。合適的藥物賦形劑包括淀粉、葡萄糖、乳糖、蔗糖、動物膠、麥芽、大米、面粉、白堊、二氧化硅凝膠、硬脂酸鈉、單硬脂酸甘油、滑石粉、氯化鈉、表面的干奶、甘油、丙烯、乙二醇、水、乙醇和類似物。如果需要的話，組合物中也可以含有少量的加濕劑、乳化劑或pH緩沖試劑。這些組合物可以采用溶液、懸液、乳劑、藥片、藥丸、膠囊、粉末、持久釋放的劑型以及類似劑型。組合物可與傳統(tǒng)的粘合劑和載體例如甘油三酯一起配制成為栓劑?？诜┬涂梢园藴瘦d體例如藥物學(xué)等級的甘露糖、乳糖、淀粉、硬脂酸鎂，糖精鈉、纖維素、碳酸鎂等。E.W.Martin在“Remington’s藥物科學(xué)”中描述了合適的藥物載體的實施例。這樣的組合物含有治療有效劑量的化合物，優(yōu)選以純化的形式，和提供適當(dāng)形式施與病人的合適劑量的載體。劑型必須與施與方式相配。
在優(yōu)選的實施方案中，根據(jù)常規(guī)方法組合物被配制成為用于人體靜脈注射的藥物組合物。典型的是，用于靜脈注射的組合物是在無菌的等滲緩沖水溶液中。當(dāng)需要時，組合物也可含有溶解試劑以及局部麻醉劑例如利多卡因以減緩注射位點的疼痛。通常情況下，成分是以單位劑量的形式單獨提供或混合在一起提供，例如，在一個標明活性成分數(shù)量的密封容器如安瓿瓶或小包中的凍干粉末或無水濃縮物。當(dāng)組合物將要通過輸液施與時，它可被配制到含有無菌的藥物等級的水或鹽溶液的輸液瓶中。當(dāng)組合物通過注射方式被施與時，可提供一安瓿瓶的用于注射的無菌水或鹽溶液以在注射前用于混合藥物成分。
本發(fā)明的化合物也可以中性或鹽形式配制。藥物學(xué)可接受的鹽包括那些與陰離子例如那些來自鹽酸，磷酸，醋酸，草酸，酒石酸等一起形成的鹽以及那些與陽離子例如那些來自鈉，鉀，銨，鈣，氫氧化鐵，異丙基胺，三乙胺，2-巰基乙醇，組胺，普魯卡因等形成的鹽。
在治療、抑制和預(yù)防與本發(fā)明多肽異常表達和/或異?；钚韵嚓P(guān)的疾病或紊亂中有效的本發(fā)明化合物的量可通過標準的臨床技術(shù)測定。此外，體外分析也可被任選應(yīng)用以輔助鑒定最佳的劑量范圍。在劑型配制中的精確劑量也取決于施與途徑以及疾病和紊亂的嚴重程度，并且應(yīng)該根據(jù)實施者的判斷和每個病人的環(huán)境條件做出判斷。有效劑量可從體外或動物模型檢測系統(tǒng)的劑量應(yīng)答曲線中推算出來。
對于抗體來說，給病人施與的典型的抗體劑量是0.1mg/kg病人體重到100mg/kg。優(yōu)選給病人施與的抗體劑量通常是0.1mg/kg到20mg/kg病人體重，更優(yōu)選是1mg/kg到10mg/kg病人體重。通常情況下，由于機體對外源多肽的免疫應(yīng)答，人抗體在人體內(nèi)的半衰期要比其它物種來源的抗體要長一些。因此，較低劑量和較少次數(shù)的施與是可能的。而且，本發(fā)明抗體的劑量和施與頻率可以通過修飾例如脂質(zhì)化增加抗體的攝入和組織穿透性(例如，進入大腦)而減少。
本發(fā)明也提供了包含一個或多個裝有本發(fā)明藥物組合物一種或多種成分的容器的藥物包裝或試劑盒。這些容器任選地包含由協(xié)調(diào)生產(chǎn)、使用和銷售藥物或生物學(xué)制品的政府部門所簽發(fā)的一則通知，此通知反映了對制造、使用和銷售用于人的這些產(chǎn)品的批準。
診斷和影象可與目的多肽特異性結(jié)合的標記的抗體及其衍生物和類似物可被用于診斷用途以檢測、診斷或監(jiān)測與本發(fā)明多肽異常表達和/或異常活性相關(guān)的疾病和/或紊亂。本發(fā)明提供了檢測目的多肽的異常表達，包含(a)使用一種或多種目的多肽特異性的抗體分析目的多肽在個體細胞或體液中的表達和(b)將基因表達水平與標準基因表達水平相比，與標準表達水平相比所分析的多肽基因表達水平的升高或降低預(yù)示著異常表達。
本發(fā)明提供了一種診斷紊亂的診斷性分析，包括(a)使用一種或多種目的多肽特異性的抗體分析目的多肽在個體細胞或體液中的表達和(b)將基因表達水平與標準基因表達水平相比，與標準表達水平相比所分析的多肽基因表達水平的升高或降低預(yù)示著某一特定紊亂。就癌癥而言，來自一個體的組織活檢標本中存在的相對較高數(shù)量的轉(zhuǎn)錄本可能預(yù)示易于發(fā)展疾病的體質(zhì)，或可能提供了在實際臨床癥狀出現(xiàn)之前檢測這種疾病的方法。對這種類型疾病更決定性的診斷可以允許健康職業(yè)者更早地運用預(yù)防性手段或主動治療，籍此預(yù)防癌癥的發(fā)展和進一步進展。
可以使用基于抗體的技術(shù)分析生物學(xué)樣品中的TR-6α和/或TR-6β多肽水平。通過使用本領(lǐng)域熟練技術(shù)人員已知的經(jīng)典的免疫組織學(xué)方法本發(fā)明抗體可被用于分析生物學(xué)樣品中的蛋白質(zhì)水平(例如，見Jalknen，M.等，細胞生物學(xué)期刊101976-985(1985)；Jalknen，M.等，細胞生物學(xué)期刊1053087-3096(1987))。其它用于檢測蛋白質(zhì)基因表達的基于抗體的方法包括免疫分析例如酶聯(lián)免疫吸附分析(ELISA)和放射免疫分析(RIA)。合適的抗體分析標記是本領(lǐng)域所熟知的并且包括酶標記例如葡萄糖氧化酶，和放射性同位素例如碘(131I，25I，123I，121I)，碳(14C)，硫(35S)，氫(3H)，銦(115mIn，113mIn，112In，111In)，和鈦(99Tc，99mTc)，鉈(201Ti)，鎵(68Ga，67Ga)，鈀(103pd)，鉬(99Mo)，氙(133Xe)，氟(18F)，153Sm，177Lu，159Gd，149pm，140La，175Yb，166Ho，90Y，47Sc，186Re，188Re，142pr，105Rh，97Ru；發(fā)光物質(zhì)標記例如魯米諾；和熒光物質(zhì)標記例如熒光素和羅丹明，和生物素。
本領(lǐng)域已知的技術(shù)可被用于標記本發(fā)明的抗體。這樣的技術(shù)包括但不局限于使用雙功能性結(jié)合試劑(見，例如美國專利5756065，5714631，5696239，5652361，5505931，5489425，5435990，5428139，5342604，5274119，4994560和5808003；以上文獻全文引入本文做參考)。
本發(fā)明的一個方面是在一種動物，優(yōu)選哺乳動物和最優(yōu)選人中檢測和診斷與本發(fā)明的多肽異常表達相關(guān)的疾病或紊亂。在一個實施方案中，診斷包含a)向受試個體施與(例如，非胃腸道，皮下或腹膜內(nèi))有效劑量的能夠與目的多肽特異性結(jié)合的標記的分子；b)在施與藥物后等待一段時間間隔以允許標記的分子優(yōu)選在受試個體的多肽表達的位點聚集(未標記的分子被清除至背景水平)；c)測定背景水平；和d)在受試個體中檢測標記的分子，如果所檢測的標記的分子高于背景水平意味著此受試個體患有某特定疾病或患有與本發(fā)明多肽異常表達相關(guān)的紊亂。背景水平可以通過各種不同的方法檢測，包括將所檢測的標記分子的量與在一特定系統(tǒng)中預(yù)先測定的標準值進行比較。
本領(lǐng)域理解的是，所使用的受試個體以及圖象系統(tǒng)的大小將決定需要產(chǎn)生診斷影象的圖象分子部分的數(shù)量。當(dāng)是放射性同位素分子的情況下，對于人來說，所要注射入的放射活性通常在99mTc大約5至20毫居里之間。標記的抗體或抗體片段將優(yōu)選在含有特定抗原的細胞部位積聚。在S.W.Burchiel等“放射標記的抗體及其片段的免疫藥物動力學(xué)”(在腫瘤影象的第13章癌癥的放射化學(xué)檢測，S.W.Burchiel和B.A.Rhodes編，梅森出版公司(1982))描述了體內(nèi)腫瘤影象。
根據(jù)幾種變量，包括所用標記的類型和施與方式，施與藥物后允許標記的分子優(yōu)先在受試個體局部聚集以及用于將未標記的分子清除至本底水平的時間間隔是6至48小時或6至24小時或6至12小時。在另一個實施方案中，施與藥物后的時間間隔是5到20天或5到10天。
在一個實施方案中，對疾病或紊亂的監(jiān)測是通過重復(fù)診斷疾病或紊亂的方法而實施的，例如在初次診斷后一個月，初次診斷后六個月，初次診斷后一年等。
使用本領(lǐng)域所熟知的體內(nèi)掃描的方法，病人體內(nèi)存在的標記的分子可被檢測出來。這些方法取決于標記的類型。熟練技術(shù)人員能夠決定用于檢測某種特定標記的合適的方法。可被用于本發(fā)明診斷方法中的方法和設(shè)施包括但不局限于計算機體層攝影(CT)，全身掃描例如正電子發(fā)射體層攝影(PET)，磁共振成像(MRI)和超聲檢查。
在一個特定的實施方案中，用放射性同位素標記分子并且使用放射性應(yīng)答醫(yī)療儀器(Thurston等，美國專利5441050)在病人體內(nèi)檢測。在另一個實施方案中，用熒光化合物標記分子并且使用熒光應(yīng)答掃描儀器在病人體內(nèi)檢測。也在另一個實施方案中，用順磁標記分子并且使用磁共振成像(MRI)在病人體內(nèi)檢測。
試劑盒本發(fā)明提供了可用于以上方法的試劑盒。在一個實施方案中，一種試劑盒包括在一個或多個容器中的本發(fā)明的抗體優(yōu)選是純化的抗體。在一個特定的實施方案中，本發(fā)明的試劑盒包含一種由能夠與試劑盒中所含有的抗體發(fā)生特異性免疫反應(yīng)的表位組成的基本分離的多肽。優(yōu)選的，本發(fā)明的試劑盒另外包含一種不與目的多肽發(fā)生反應(yīng)的對照抗體。在另一個特定的實施方案中，本發(fā)明的試劑盒含有一種用于檢測抗體與目的多肽結(jié)合的方法(例如，抗體可與一種可檢測的底物結(jié)合例如熒光化合物、酶底物、放射活性化合物或一種發(fā)光物質(zhì)，或一種能夠識別一抗的二抗也可與可檢測的底物結(jié)合)。
在本發(fā)明的另一個特定的實施方案中，試劑盒是一個用于篩查含有針對增殖性和/或癌癥性多核苷酸和多肽的特異性抗體的血清的診斷試劑盒。這樣的試劑盒可能含有不與目的多肽反應(yīng)的對照抗體。這樣的試劑盒可能含有基本分離的包含能夠與至少一種抗多肽抗原的抗體發(fā)生特異性免疫反應(yīng)的表位的多肽抗原。而且，這樣的試劑盒包括用于檢測所述抗體與抗原結(jié)合的方法(例如，抗體可被結(jié)合至能夠被流式細胞術(shù)檢測出的熒光化合物上如熒光素和羅丹明)。在特定的實施方案中，試劑盒可能包含重組生產(chǎn)的或化學(xué)合成的多肽抗原。試劑盒的多肽抗原也可被吸附到固相支持載體上去。
在一個更特定的實施方案中，上述試劑盒的檢測方法包括一種所述多肽抗原可吸附在其上的固相支持載體。這樣的試劑盒可能包括一種非吸附的報告物標記的抗人抗體。在這個實施方案中，抗體與多肽抗原的結(jié)合可以通過上述的報告物標記的抗體的結(jié)合而檢測出來。
在另外的一個實施方案中，本發(fā)明包括一種用于篩查含有本發(fā)明多肽抗原的血清的診斷試劑盒。此診斷試劑盒包括一種基本分離的能夠與多肽或多核苷酸抗原發(fā)生特異性免疫反應(yīng)的抗體，和檢測多核苷酸和多肽抗原與抗體結(jié)合的方法。在一個實施方案中，抗體被吸附到固相支持載體上。在一個特定的實施方案中，抗體可能是單克隆抗體。此試劑盒的檢測方法可能包括一種標記的單克隆二抗。另外，或此外檢測方法可能包括一種標記的競爭性抗原。
在一個診斷過程中，待測血清與通過本發(fā)明方法獲得的表面結(jié)合有抗原的固相試劑反應(yīng)。在抗體與試劑中的特定抗原結(jié)合以后，通過洗滌去除未結(jié)合的血清成分，然后試劑與報告物標記的抗人抗體反應(yīng)以使報告物隨著結(jié)合在固相支持載體上的抗抗原抗體的量而結(jié)合到試劑上去。然后洗滌試劑以去除未結(jié)合的標記的抗體，并且測定與試劑相關(guān)的報告物的數(shù)量。典型的情況下，報告物是一種酶，它是通過在存在合適的熒光測定的，發(fā)光的或光測定的底物的情況下孵育固相基質(zhì)而測定的。
在上述分析中固相表面試劑是通過已知的技術(shù)將蛋白材料吸附到固相支持材料如聚合珠、浸泡棒、96孔板或過濾材料上而制備的。這種吸附方法通常包括蛋白質(zhì)非特異性吸附至支持物上或?qū)⒋说鞍踪|(zhì)共價結(jié)合，典型的是通過自由的氨基基團，到支持物上的化學(xué)反應(yīng)基團上例如活化的羧基、羥基或醛基基團。另外，鏈親和素包被的板子可以和生物素化的抗原組合使用。
因此，本發(fā)明提供了一種實施這種診斷方法的分析系統(tǒng)或試劑盒。試劑盒通常包括一種表面結(jié)合有重組抗原的支持物，以及一種用于檢測表面包被的抗抗原抗體的報告物標記的抗人抗體。免疫系統(tǒng)相關(guān)的紊亂診斷本發(fā)明人已經(jīng)發(fā)現(xiàn)TNFR-6α和TNFR-6β在造血和轉(zhuǎn)化的組織中表達。對于許多免疫系統(tǒng)相關(guān)的紊亂來說，相對于“標準的”TNFR基因表達水平，即不患有這樣的紊亂的個體的免疫系統(tǒng)組織或其它細胞或體液中的TNFR基因表達水平，明顯改變的(升高或降低)TNFR基因表達水平可以從患有這樣的紊亂的個體中采集的免疫系統(tǒng)組織或其它細胞或體液(例如，血清和血漿)中檢測出來。因此，本發(fā)明提供了一種在診斷免疫系統(tǒng)紊亂中有用的診斷方法，此方法包括測量某個體的免疫系統(tǒng)組織或其它細胞或體液中的編碼TNFR蛋白質(zhì)的基因的表達水平，并且將所測量的基因表達水平與標準的TNFR基因表達水平進行比較，籍此與標準的表達水平相比升高的或降低的基因表達水平預(yù)示著免疫系統(tǒng)紊亂。
特別是，當(dāng)與相應(yīng)的“標準”水平相比較時，據(jù)認為患有癌癥(例如，結(jié)腸、乳和肺癌)的哺乳動物的某些組織中具有升高的TNFR基因拷貝數(shù)和/或表達顯著升高水平的TNFR蛋白質(zhì)和編碼TNFR蛋白的mRNA。另外，與采集自未患有癌癥的同種哺乳動物的血清相比，據(jù)認為升高的TNFR蛋白水平可被在患有癌癥的哺乳動物的某些細胞或體液(例如，血清和血漿)中檢測出來。
因此，本發(fā)明提供了一種在診斷免疫系統(tǒng)紊亂包括癌癥中有用的診斷方法，此方法涉及測量某個體的免疫系統(tǒng)組織或其它細胞或體液中的編碼TNFR蛋白質(zhì)的基因的表達水平，并且將所測量的基因表達水平與標準的TNFR基因表達水平進行比較，籍此與標準的表達水平相比升高的或降低的基因表達水平預(yù)示著免疫系統(tǒng)紊亂。
當(dāng)免疫系統(tǒng)紊亂的診斷包括腫瘤的診斷已經(jīng)根據(jù)傳統(tǒng)的方法完成時，本發(fā)明用做預(yù)后指標，籍此相對于基因表達水平接近于標準水平的個體來說，顯示出降低的基因表達的個體將經(jīng)歷更差的臨床結(jié)果。
“分析編碼TNFR蛋白質(zhì)的基因表達水平”意指直接(測量或評價絕對的蛋白質(zhì)水平或mRNA水平)或相對(與第二個生物樣品中的蛋白質(zhì)水平或mRNA水平進行比較)地定性或定量測量或評價第一份生物樣品中的TNFR-6α和/或TNFR-6β蛋白質(zhì)的水平或編碼TNFR-6α和/或TNFR-6β蛋白質(zhì)mRNA的水平。優(yōu)選的是，測量或評價第一份生物樣品中的TNFR蛋白質(zhì)水平或mRNA水平然后將其與標準的TNFR蛋白質(zhì)水平或mRNA水平進行比較，標準得自未患有此紊亂的個體的第二份生物樣品或是通過平均未患有免疫系統(tǒng)紊亂的群體的結(jié)果而得到的。正如本領(lǐng)域所明了的，一旦測得標準的TNFR蛋白質(zhì)水平或mRNA水平，它們可被反復(fù)用于比較的標準。
“生物學(xué)樣品”意思是指任何從一個個體、體液、細胞系、組織培養(yǎng)或其它來源獲得的含有TNFR蛋白質(zhì)或mRNA的生物學(xué)樣品。如文中所述，生物學(xué)樣品包括含有TNFR蛋白游離的細胞外功能區(qū)(或可溶形式)的體液(例如，血清、胞漿、尿液、滑液和脊髓液)，免疫系統(tǒng)組織和其它已被發(fā)現(xiàn)表達完整TNFR、成熟TNFR或TNFR胞外功能區(qū)的組織。從哺乳動物中獲得組織活檢標本或體液的方法是本領(lǐng)域眾所周知的。由于生物學(xué)樣品含有mRNA，組織活檢標本是優(yōu)選的原料。
本發(fā)明也包括本發(fā)明的基因用于診斷TNFR基因的突變的應(yīng)用。例如，如果在本發(fā)明的基因中的一個基因中存在突變，就會導(dǎo)致本發(fā)明多肽受體產(chǎn)生的減少。而且，增強受體多肽活性的突變將會導(dǎo)致與受體多肽過度表達相關(guān)的疾病例如癌癥?；蛑械耐蛔兛梢酝ㄟ^將缺陷基因的序列與正常基因的序列進行比較而檢測出來。因此，我們可以證實突變基因與疾病狀況或易于發(fā)生一種疾病狀況相關(guān)。那就是說，能夠?qū)е卤景l(fā)明受體多肽低表達的突變基因?qū)⑴cTNFR失去抑制Fas配體和/或AIM-II介導(dǎo)的凋亡的能力相關(guān)，并且籍此導(dǎo)致異常的細胞增殖(例如，腫瘤生長)。
其他的可被前述的分析方法所診斷的免疫系統(tǒng)紊亂包括但不局限于超敏、過敏、傳染性疾病、移植宿主疾病、免疫缺陷、自身免疫性疾病以及類似疾病。
攜帶本發(fā)明基因突變的個體可以通過多種不同的技術(shù)在DNA水平被檢測出。用于診斷的核酸可從病人的細胞例如從血液、尿液、唾液和其它組織活檢標本中獲得。基因組DNA可直接用于檢測或在分析前利用PCR技術(shù)進行酶擴增(Saiki等，自然，324163-166(1986))。RNA或cDNA也可用于同樣目的。作為一個實施例，與本發(fā)明核酸互補的PCR引物可被用于鑒定和分析本發(fā)明中人基因的突變。例如，缺式和插入可以通過與正常基因表型相比擴增產(chǎn)物大小的改變而檢測出來。點突變可以通過將擴增的DNA與放射標記的RNA或與放射標記的本發(fā)明的反義DNA序列雜交而檢測出來。通過RNA酶A消化或熔點溫度的不同可以區(qū)分完全配對的序列和不配對的序列。這樣的診斷方法在產(chǎn)前或新生兒檢查中非常有用。
參考序列和“突變體”之間的差別也可以通過直接DNA測序的方法而檢測出來。此外，克隆的DNA片段可用做探針去檢測特異性DNA片段。當(dāng)與PCR組合使用時，此方法的敏感性大大增強。例如，將測序引物與雙鏈PCR產(chǎn)物或一段通過修飾的PCR產(chǎn)物產(chǎn)生的單鏈模板分子一起使用。序列測定是通過使用放射性標記的核苷酸的傳統(tǒng)方法或使用熒光標記的自動測序方法進行的。
在特定位點的序列改變可以通過核酶保護分析例如RNA酶和Sl保護或化學(xué)裂解方法而檢測出來(例如，Cotton等，PNAS 854397-4401(1985))。
可以使用基于抗體的技術(shù)分析生物樣品中的TNFR蛋白水平。例如，可以使用經(jīng)典的免疫組織學(xué)方法研究組織中的TNFR蛋白表達(Jalkanen，M.等，細胞生物學(xué)期刊101976-985(1985)；Jalkanen，M.等，細胞生物學(xué)期刊1053087-3096(1987))。其它用于檢測TNFR基因表達的基于抗體的技術(shù)包括免疫分析例如酶聯(lián)免疫吸附分析(ELISA)和放射免疫分析(RIA)。合適的抗體分析標記是本領(lǐng)域所熟知的并且包括酶標記例如葡萄糖氧化酶，和放射性同位素例如碘(125I，121I)，碳(14C)，硫(35S)，氫(3H)，銦(112In)，和鈦(99mTc)，和熒光物質(zhì)標記例如熒光素和羅丹明，和生物素。
除了分析從個體中獲得的生物樣品中的TNFR蛋白水平以外，也可以通過影像的方法體內(nèi)檢測TNFR蛋白。用于TNFR蛋白體內(nèi)影像的抗體標記或標志包括可被X光照相、NMR或ESR檢測出的標記。對于X光照相術(shù)來說，合適的標記包括放射性同位素例如能夠釋放可檢測出的射線但是對人無害的鈀和銫。合適的用于NMR和ESR的標記包括那些帶有可檢測的特征性spin的標記例如重氫，它們可以通過標記相關(guān)雜交瘤的營養(yǎng)物而被摻入到抗體中去。
一種已經(jīng)被用合適的可檢測出的影像分子例如一種放射性同位素(例如，碘(131I，25I，123I，121I)，碳(14C)，硫(35S)，氫(3H)，銦(115mIn，113mIn，112In，111In)，和鈦(99Tc，99mTc)，鉈(201Ti)，鎵(68Ga，67Ga)，鈀(103pd)，鉬(99Mo)，氙(133Xe)，氟(18F)，153Sm，177Lu，159Gd，149pm，140La，175Yb，166Ho，90Y，47Sc，186Re，188Re，142pr，105Rh，97Ru)、一種放射性模糊的物質(zhì)、或一種可被核磁共振檢測的物質(zhì)標記的TNFR特異的抗體或抗體片段被導(dǎo)入(例如，非胃腸道，皮下或腹膜內(nèi))將要檢測免疫系統(tǒng)紊亂的哺乳動物。在本領(lǐng)域中將要明白的是，所使用的受試個體以及圖象系統(tǒng)的大小將決定需要產(chǎn)生診斷影象的圖象分子部分的數(shù)量。當(dāng)是放射性同位素分子的情況下，對于人來說，所要注射入的放射活性通常在大約5至20毫居里99mTc之間。標記的抗體或抗體片段將優(yōu)選在含有神經(jīng)因子α蛋白的細胞部位積聚。在S.W.Burchiel等“放射標記的抗體及其片段的免疫藥物動力學(xué)”(在腫瘤影象的第13章癌癥的放射化學(xué)檢測，S.W.Burchiel和B.A.Rhodes編，梅森出版公司(1982))描述了體內(nèi)腫瘤成像。治療已知腫瘤壞死因子家族配體屬于能夠引發(fā)許多種細胞應(yīng)答的最多效的細胞因子，其中包括細胞毒性、抗病毒活性、免疫調(diào)控活性以及一些基因的轉(zhuǎn)錄后調(diào)控(Goeddel，D.V.等，“腫瘤壞死因子基因結(jié)構(gòu)和生物學(xué)活性”Symp.Quant.Biol.51597-609(1986)，冷泉港；Beutler，B和Cerami，A，生物化學(xué)年度評論57505-518(1988)；Old，L.J.，科學(xué)美國人25859-75(1988)；Fiers，W，F(xiàn)EBS Lett 285199-224(1991))。TNF家族配體通過與TNF家族受體結(jié)合而引發(fā)如此多種不同的細胞應(yīng)答。
本發(fā)明的TNFR-6α和/或TNFR-6β多核苷酸和多肽可被用于發(fā)展對任何由缺陷的或量不足的TNFR-6α和/或TNFR-6β所介導(dǎo)(直接或間接)的紊亂的治療方法。TNFR-6α和/或TNFR-6β可被施與患有這種紊亂的患者(例如，哺乳動物，優(yōu)選人)體內(nèi)。另外，基因治療方法可被運用以治療此種紊亂。文中顯示的TNFR-6α和/或TNFR-6β核苷酸序列使得檢測缺陷的TNFR-6α和/或TNFR-6β并且用正常的TNFR-6α和/或TNFR-6β編碼基因替換成為可能。缺陷基因可以在體外診斷分析中通過比較文中所述的TNFR-6α和/或TNFR-6β核苷酸序列和從懷疑此基因缺陷的患者中得到的TNFR-6α和/或TNFR-6β的核苷酸序列而被檢測。
在另一個實施方案中，本發(fā)明多肽被用做研究在不同細胞類型中抑制Fas配體/TNFR-6α和/或TNFR-6β和/或AIM-II相互作用所導(dǎo)致的生物學(xué)效應(yīng)的研究工具。TNFR-6α和/或TNFR-6β多肽也可被用于體外分析檢測Fas配體、AIM-II或TNFR-6α和/或TNFR-6β或其相互作用。
在另一個實施方案中，本發(fā)明的純化的TNFR-6α和/或TNFR-6β被用于抑制Fas配體和/或AIM-II與內(nèi)源性細胞表面Fas配體和/或AIM-II受體的結(jié)合。已經(jīng)報道TNF家族(Fas配體和/或AIM-II是其中成員)的某些配體可以結(jié)合多于一種的遠距離的細胞表面受體蛋白。而且據(jù)認為AIM-II可結(jié)合多個細胞表面蛋白。通過與Fas配體和/或AIM-II結(jié)合，本發(fā)明的可溶性TNFR-6α和/或TNFR-6β不僅可被用于抑制Fas配體和/或AIM-II與內(nèi)源性TNFR-6α和/或TNFR-6β的結(jié)合，而且可被用于抑制距離TNFR-6α和/或TNFR-6β較遠的Fas配體和/或AIM-II受體蛋白。因此，在另一個實施方案中，TNFR-6α和/或TNFR-6β被用于體外或體內(nèi)方法抑制Fas配體和/或AIM-II的生物學(xué)活性。通過抑制Fas配體和/或AIM-II與細胞表面受體的結(jié)合，本發(fā)明的TNFR-6α和/或TNFR-6β多肽也被用于抑制由于Fas配體和/或AIM-II與內(nèi)源性受體的結(jié)合而導(dǎo)致的生物學(xué)效應(yīng)?？梢允褂貌煌问降腡NFR-6α和/或TNFR-6β，包括例如上述的TNFR-6α和/或TNFR-6β片段、衍生物和能夠結(jié)合Fas配體和/或AIM-II的突變體。在優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明的可溶性TNFR-6α和/或TNFR-6β多肽被施與抑制Fas配體和/或AIM-II的生物學(xué)活性，例如抑制易于凋亡的細胞的Fas配體介導(dǎo)的和/或AIM-II介導(dǎo)的細胞凋亡。
在另外的實施方案中，本發(fā)明的TNFR-6α和/或TNFR-6β多肽被施與至哺乳動物體內(nèi)治療Fas配體介導(dǎo)的和/或AIM-II介導(dǎo)的紊亂。這些Fas配體介導(dǎo)的和/或AIM-II介導(dǎo)的(例如，人)紊亂包括由Fas配體和/或AIM-II導(dǎo)致的(直接或間接)或惡化的情況。
能夠表達TNFR多肽并且能夠針對TNFR-6α和/或TNFR-6β配體產(chǎn)生強的免疫應(yīng)答的細胞包括淋巴細胞、內(nèi)皮細胞、角質(zhì)形成細胞和前列腺組織?！搬槍NFR家族配體的細胞應(yīng)答”意思是指由TNF家族配體在細胞、細胞系、組織、組織培養(yǎng)或病人中引發(fā)的任何一種基因型、表型、和/或多形性改變。如文中所述，這樣的細胞應(yīng)答不僅包括對TNF家族配體的正常的生理應(yīng)答，而且包括與增加的細胞凋亡或?qū)Φ蛲龅囊种葡嚓P(guān)的疾病。此外，如文中所述，本發(fā)明TNFR多肽與Fas配體和AIM-II結(jié)合并且因此阻斷Fas配體和AIM-II介導(dǎo)的細胞凋亡。凋亡-細胞程序性死亡是一種涉及去除免疫系統(tǒng)B和/或T淋巴細胞的生理學(xué)機制，并且它的失調(diào)能夠造成許多不同的致病過程(J.C.Ameisen，AIDS 81197-1213(1994)；P.H.Kramner等，免疫學(xué)現(xiàn)代論點6279-289(1994))。
與增加的細胞存活或凋亡的抑制相關(guān)的疾病包括癌癥(例如濾泡性淋巴瘤，帶有p53突變的癌癥，和激素依賴的腫瘤包括但不局限于結(jié)腸癌、心臟腫瘤、胰腺癌、黑素瘤、成視網(wǎng)膜細胞瘤、成膠質(zhì)細胞瘤、肺癌、腸癌、睪丸癌、胃癌、神經(jīng)膠質(zhì)細胞瘤、粘液瘤、淋巴瘤、內(nèi)皮瘤、成骨細胞瘤、破骨細胞瘤、骨肉瘤、軟骨肉瘤、腺瘤、乳癌、前列腺癌、卡波濟氏肉瘤和卵巢癌)自身免疫紊亂(例如，多發(fā)性硬化、斯耶格倫綜合癥、突眼性甲狀腺腫疾病、淋巴瘤性甲狀腺腫、自身免疫性糖尿病、膽汁性肝硬變、貝赫切特綜合癥、局限性回腸炎、多發(fā)性肌炎、系統(tǒng)性紅斑狼瘡和免疫相關(guān)的腎小球腎炎(例如，增殖性腎小球腎炎)、自身免疫性胃炎、自身免疫血小板減少性紫癜、和類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎)和病毒感染(例如，單純皰疹病毒、天花病毒和腺病毒)，炎癥，移植宿主疾病(急性和/或慢性)，急性移植排斥和慢性移植排斥。在優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明的TNFR多核苷酸、多肽和/或拮抗劑被用于抑制癌癥特別是上面列出的癌癥的生長、進展和/或轉(zhuǎn)移。
其它與增加的細胞存活相關(guān)的疾病或情形包括但不局限于惡性瘤的進展和/或轉(zhuǎn)移以及相關(guān)的紊亂例如白血病(包括急性白血病(例如，急性淋巴細胞白血病、急性髓細胞白血病(包括成髓細胞，前髓細胞，骨髓單核細胞，單核細胞，和紅白血病)和慢性白血病(例如，慢性髓細胞(粒細胞性)白血病和慢性淋巴細胞白血病))，真性紅細胞增多，淋巴瘤(例如，霍奇森病和非霍奇森病)，多發(fā)性骨髓瘤，Waldenstrom’s巨球蛋白血癥，重鏈病和實體瘤包括但不局限于肉瘤和癌癥例如成纖維肉瘤，粘液肉瘤，脂肉瘤，軟骨肉瘤，成骨肉瘤，脊索瘤，血管肉瘤，內(nèi)皮肉瘤，淋巴管肉瘤，淋巴管內(nèi)皮肉瘤，滑膜瘤，間皮瘤，尤因腫瘤，平滑肌肉瘤，橫紋肌肉瘤，結(jié)腸癌，胰腺癌，乳癌，卵巢癌，前列腺癌，鱗狀細胞癌，基底細胞癌，腺癌，汗腺癌，皮脂腺癌，乳癌，乳腺癌，囊腺癌，髓癌，支氣管源性癌，腎細胞癌，肝癌，膽管癌，絨毛膜癌，精原細胞瘤，胚癌，維爾姆斯瘤，子宮癌，腸癌，肺癌，小細胞肺癌，膀胱癌，上皮癌，神經(jīng)膠質(zhì)瘤，星形細胞瘤，成神經(jīng)管細胞瘤，顱喉管瘤，室管膜瘤，松果體瘤，成血管細胞瘤，聲學(xué)神經(jīng)瘤，少突神經(jīng)膠質(zhì)瘤，menangioma，黑素瘤，神經(jīng)膠質(zhì)細胞瘤、和成視網(wǎng)膜細胞瘤。
與增加的凋亡相關(guān)的疾病包括AIDS；神經(jīng)變性紊亂(例如阿爾茨海默病，帕金森氏病，肌萎縮性側(cè)索硬化，無色素性視網(wǎng)膜炎，小腦變性和腦瘤或前面相關(guān)的疾病)；自身免疫性紊亂(例如，多發(fā)性硬化、斯耶格倫綜合癥、突眼性甲狀腺腫、淋巴瘤性甲狀腺腫、自身免疫性糖尿病、膽汁性肝硬變、貝赫切特綜合癥、局限性回腸炎、多發(fā)性肌炎、系統(tǒng)性紅斑狼瘡和免疫相關(guān)的腎小球腎炎(例如，增殖性腎小球腎炎)、自身免疫性胃炎、血小板減少性紫癜、和類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎)；骨髓發(fā)育不良綜合癥(例如再生障礙性貧血)，移植宿主疾病(急性和/或慢性)，局部缺血性損傷(例如心臟局部缺血性損傷以及由心肌梗塞、中風(fēng)和reperfusion引起的損傷)，肝損傷或疾病(例如，肝炎相關(guān)的肝損傷，肝硬變，局部缺血性/reperfusion損傷，膽固醇沉著和肝癌)；毒素誘生的肝疾病(例如由酒精引起的)，膿毒性休克，潰瘍性結(jié)腸炎，惡病質(zhì)和厭食。在優(yōu)選的實施方案中，TNFR多核苷酸、多肽和/或激動劑被用于治療或預(yù)防上面列出的這些疾病和紊亂。
在一個特定的實施方案中，本發(fā)明的TNFR多核苷酸、多肽或激動劑被用于治療和/或預(yù)防腎小球腎炎。在另外的實施方案中，本發(fā)明的TNFR多核苷酸、多肽或激動劑被用于治療和/或預(yù)防慢性腎小球腎炎和/或細胞/組織損傷(例如，腎細胞死亡)和/或與這種疾病相關(guān)的醫(yī)學(xué)狀況。在另外一個非專用的實施方案中，本發(fā)明的TNFR多核苷酸、多肽或激動劑被用于治療和/或預(yù)防增生性腎小球腎炎和/或細胞/組織損傷(例如，腎細胞死亡)和/或與這種疾病相關(guān)的醫(yī)學(xué)狀況。
在一個特定的實施方案中，本發(fā)明的TNFR多核苷酸、多肽或激動劑被用于治療或預(yù)防膽汁性肝硬變和/或與這種疾病相關(guān)的醫(yī)學(xué)狀況。
在一個特定的實施方案中，本發(fā)明的TNFR多核苷酸、多肽或激動劑被用于治療或預(yù)防疾病，例如酒精肝疾病和/或與這種疾病相關(guān)的醫(yī)學(xué)狀況(例如肝硬變)。
在一個特定的實施方案中，本發(fā)明的TNFR多核苷酸、多肽或激動劑被用于治療和/或預(yù)防移植宿主疾病。在一個特定的實施方案中，本發(fā)明的TNFR多核苷酸、多肽或激動劑被用于治療(例如，減輕)或預(yù)防組織或細胞損傷或破壞(例如，與移植宿主疾病相關(guān)的淋巴細胞耗竭)和/或與這種疾病相關(guān)的醫(yī)學(xué)狀況。在另外一個非專用的實施方案中，本發(fā)明的TNFR多核苷酸、多肽或激動劑被用于治療(例如，減輕)和/或預(yù)防移植宿主疾病中的腹瀉。
在一個特定的實施方案中，本發(fā)明的TNFR多核苷酸、多肽和/或激動劑或拮抗劑被用于治療和/或預(yù)防斯耶格倫綜合癥和/或減輕組織/細胞損傷或破壞(例如，唾液和/或淚組織的損傷或破壞)和/或與這種疾病相關(guān)的醫(yī)學(xué)狀況。
在一個特定的實施方案中，本發(fā)明的TNFR多核苷酸、多肽或激動劑被用于治療和/或預(yù)防多發(fā)性硬化和/或減輕組織損傷或破壞(例如，神經(jīng)學(xué)組織(例如中樞神經(jīng)系統(tǒng)組織)的損傷或破壞)和/或與這種疾病相關(guān)的醫(yī)學(xué)狀況。
在一個特定的實施方案中，本發(fā)明的TNFR多核苷酸、多肽或激動劑，包括抗體或抗體片段被用于治療和/或預(yù)防阿爾茨海默病和/或減輕組織損傷或破壞(例如，神經(jīng)學(xué)組織或細胞的損傷或破壞)和/或與這種疾病相關(guān)的醫(yī)學(xué)狀況。
在一個特定的實施方案中，本發(fā)明的TNFR多核苷酸、多肽或激動劑被用于治療，預(yù)防帕金森氏病和/或減輕組織損傷或破壞(例如，神經(jīng)學(xué)組織或細胞的損傷或破壞，例如神經(jīng)原細胞)和/或與這種疾病相關(guān)的醫(yī)學(xué)狀況。
在一個特定的實施方案中，本發(fā)明的TNFR多核苷酸、多肽或激動劑被用于中風(fēng)前、中風(fēng)過程中、中風(fēng)后立即和/或中風(fēng)后治療、預(yù)防或減輕細胞或組織的損傷(例如，神經(jīng)學(xué)組織)和/或與中風(fēng)相關(guān)的醫(yī)學(xué)狀況。
在一個特定的實施方案中，本發(fā)明的TNFR多核苷酸、多肽或激動劑被用于治療、預(yù)防或減輕局部缺血性損傷(例如，心臟局部缺血性損傷)和/或與局部缺血性損傷相關(guān)的醫(yī)學(xué)狀況。在一個特定的實施方案中，本發(fā)明的TNFR多核苷酸、多肽或激動劑被用于心臟病前、心臟病過程中、心臟病后立即和/或心臟病后治療、預(yù)防或減輕局部心臟缺血性損傷。
在一個特定的實施方案中，本發(fā)明的TNFR多核苷酸、多肽和/或激動劑被用于治療或預(yù)防骨髓發(fā)育不良綜合癥(MDS)和/或與這種疾病相關(guān)的醫(yī)學(xué)狀況。
在一個特定的實施方案中，本發(fā)明的TNFR多核苷酸、多肽或激動劑被用于增加患有血細胞減少，淋巴細胞減少和/或貧血的病人體內(nèi)循環(huán)血細胞的數(shù)目。
在一個特定的實施方案中，本發(fā)明的TNFR多核苷酸、多肽或激動劑被用于治療和/或預(yù)防淋巴瘤性甲狀腺腫和/或減輕組織或細胞的損傷或破壞(例如，甲狀腺)和/或治療或預(yù)防與這種疾病相關(guān)的醫(yī)學(xué)狀況。
在一個特定的實施方案中，本發(fā)明的TNFR多核苷酸、多肽或激動劑被用于治療(例如，減輕)和/或預(yù)防自身免疫性胃炎和/或與這種疾病相關(guān)的醫(yī)學(xué)狀況。
在一個特定的實施方案中，本發(fā)明的TNFR多核苷酸、多肽或激動劑被用于治療和/或預(yù)防潰瘍性結(jié)腸炎和/或細胞/組織損傷(例如，結(jié)腸中的潰瘍)和/或與這種疾病相關(guān)的醫(yī)學(xué)狀況。
在一個特定的實施方案中，本發(fā)明的TNFR多核苷酸、多肽和/或激動劑或拮抗劑被用于治療和/或預(yù)防類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎和/或與這種疾病相關(guān)的醫(yī)學(xué)狀況。
此外，許多癌癥分泌能夠結(jié)合Fas陽性T細胞并且殺死它們的FasL。任何能夠分泌FasL的癌癥因此可以作為本發(fā)明TBFR和TNFR激動劑治療的靶。這樣的癌癥包括但不局限于惡性黑素瘤、白血病和淋巴瘤。
許多與HIV相關(guān)的病理過程也是由凋亡介導(dǎo)的，包括HIV誘導(dǎo)的糖尿病腎病和HIV腦炎。因此，在另外的優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明的TNFR多核苷酸、多肽和/或激動劑被用于治療或預(yù)防與AIDS相關(guān)的病理過程。本發(fā)明的另一個實施方案旨在在HIV感染的病人體內(nèi)應(yīng)用TNFR-6α和/或TNFR-6β以減少Fas配體和AIM-II介導(dǎo)的細胞死亡。
描述AIDS的免疫缺陷狀態(tài)與CD4+T淋巴細胞功能和數(shù)目的減少相比是次要的。最近的報道表明每天損失CD4+T淋巴細胞數(shù)目在3.5X107和2X109之間(Wei X.等，自然373117-122(1995))。在HIV感染過程中CD4+T淋巴細胞耗竭的一個原因據(jù)認為是HIV誘導(dǎo)的凋亡(見，例如Meyaard等，科學(xué)257217-219(1992)；Groux等，實驗醫(yī)學(xué)期刊175331(1992)；和Oyaizu等，在HIV感染中的細胞激活和凋亡，Andrieu和Lu編，Plenum出版社，紐約，1995，第101-114頁)。實際上，已經(jīng)表明HIV誘導(dǎo)的細胞凋亡死亡不僅在體外發(fā)生而且在感染的個體內(nèi)發(fā)生(Ameisen，J.C.，AIDS 81197-1213(1994)；Finkel，T.H.和Banda，N.K.，現(xiàn)代免疫學(xué)論點6605-615(1995)；Muro-Cach0，C.A.等，免疫學(xué)期刊154-5555-5566(1995))。而且，在AIDS的各種不同動物模型中凋亡和CD4+T淋巴細胞耗竭是緊密相關(guān)的(Brunner，T等，自然373441-444(1995)；Gougeon，M.L.等，AIDS研究和人類逆轉(zhuǎn)錄病毒9553-563(1993))和，在病毒復(fù)制不導(dǎo)致AIDS的模型中未觀測到凋亡(Gougeon，M.L.等，AIDS研究和人類逆轉(zhuǎn)錄病毒9553-563(1993))。另外的數(shù)據(jù)表明來自于HIV感染個體的未感染的但是被起始或激活的T淋巴細胞在遭遇Fas配體后經(jīng)歷凋亡。使用在HIV感染后會導(dǎo)致細胞死亡的單核細胞系，已經(jīng)表明用HIV感染U937細胞導(dǎo)致de novo Fas配體的表達和Fas配體介導(dǎo)的HIV誘導(dǎo)的凋亡(Badley，A.D.等，病毒學(xué)期刊70199-206(1996))。而且，TNF家族配體在未感染的巨噬細胞中是可以檢測到的并且它的表達在HIV感染后被上調(diào)，導(dǎo)致殺死未感染的CD4+T淋巴細胞(Badley，A.D.等，病毒學(xué)期刊70199-206(1996))。而且，另外的研究也已經(jīng)暗示HIV感染個體T細胞損失中的Fas介導(dǎo)的凋亡(Katsikis等，實驗醫(yī)學(xué)期刊1812029-2036，1995)。
因此，本發(fā)明提供了一種HIV陽性個體的方法，此方法涉及施與本發(fā)明的TNFR和/或TNFR激動劑以減少對CD4 T淋巴細胞的選擇性殺傷。在下文中詳細討論了施與的方式和劑量。
也有可能T細胞通過多種機制發(fā)生凋亡。另外在HIV患者中觀察到至少一部分T細胞死亡是由AIM-II介導(dǎo)的。在不被理論束縛的情況下，據(jù)認為這種Fas配體和/或AIM-II介導(dǎo)T細胞死亡是通過稱做激活-誘導(dǎo)的細胞死亡(AICD)的機制發(fā)生的。
一旦由CD3/T細胞受體復(fù)合物引發(fā)，激活的人T細胞被誘導(dǎo)經(jīng)歷程序性細胞死亡(凋亡)，這個過程被定義為激活-誘導(dǎo)的細胞死亡(AICD)。已經(jīng)報道了從HIV無癥狀感染者體內(nèi)分離出的CD4 T細胞的AICD(Groux等，supra)。因此，ACID可能在HIV感染者CD4+T淋巴細胞耗竭以及疾病進展為AIDS中具有重要作用。因此，本發(fā)明提供了一種在HIV感染者體內(nèi)通過向患者施與本發(fā)明的TNFR-6α和/或TNFR-6β多肽而抑制Fas配體介導(dǎo)的和/或AIM-II介導(dǎo)的T細胞死亡的方法。在一個實施方案中，當(dāng)用TNFR-6α和/或TNFR-6β多肽開始治療時此患者是無癥狀的。如果需要的話，在治療之前可以提取HIV患者的外周血T細胞，并且通過經(jīng)典的方法測定其對Fas配體介導(dǎo)的和/或AIM-II介導(dǎo)的細胞死亡的易感性。在一個實施方案中，患者的血液或血漿在離體的情況下與TNFR-6α和/或TNFR-6β相互作用。TNFR-6α和/或TNFR-6β可以通過傳統(tǒng)的方法結(jié)合到本領(lǐng)域已知的層析基質(zhì)上。在返回病人體內(nèi)之前，患者的血液或血漿流過基質(zhì)上結(jié)合有本發(fā)明TNFR-6α和/或TNFR-6β多肽的層析柱。靜止的TNFR-6α和/或TNFR-6β結(jié)合Fas配體和/或AIM-II，因此從患者的血液中去除了Fas配體和/或AIM-II蛋白。
在另外的實施方案中，本發(fā)明的TNFR-6α和/或TNFR-6β多肽可以與其它T細胞凋亡的抑制劑組合施與。例如，在HIV感染者中據(jù)認為至少有一部分所觀察到的T細胞死亡是由TRAIL介導(dǎo)的(國際申請公開號WO 97/01663，引入本文做參考)。因此，例如易于經(jīng)受Fas配體介導(dǎo)的和TRAIL介導(dǎo)的細胞死亡的患者可被用阻斷TRAIL/TRAIL受體相互作用的試劑和阻斷Fas配體/Fas相互作用的試劑一起治療。能夠和本發(fā)明的多核苷酸和或/多肽一起施與以阻斷TRAIL與TRAIL受體結(jié)合的合適的試劑包括但不局限于可溶性TRAIL受體多肽(例如，OPG的可溶性形式，DR4(國際申請公開號WO 98/32856)；TR5(國際申請公開號WO 98/30693)；DR5(國際申請公開號WO 98/41629)；TR10(國際申請公開號WO98/54202))；可溶性TRAIL受體多肽的多聚體形式；和與TRAIL受體結(jié)合從而不傳導(dǎo)導(dǎo)致凋亡的生物學(xué)信號的抗TRAIL受體的抗體；阻斷TRAIL與一個或多個TRAIL受體結(jié)合的抗TRAIL抗體，和能結(jié)合TRAIL受體但不傳導(dǎo)導(dǎo)致凋亡的生物學(xué)信號的TRAIL突變蛋白質(zhì)。根據(jù)本發(fā)明實施的抗體優(yōu)選為單克隆抗體。
能夠和本發(fā)明的多核苷酸和多肽一起施與以阻斷Fas配體和Fas結(jié)合的合適的試劑包括但不局限于可溶性Fas多肽；可溶性Fas多肽的多聚體形式(例如，sFas/Fc的二聚體)；與Fas結(jié)合從而不傳導(dǎo)導(dǎo)致凋亡的生物學(xué)信號的抗Fas抗體；阻斷Fas配體與Fas結(jié)合的抗Fas配體的抗體，和能結(jié)合Fas但不傳導(dǎo)導(dǎo)致凋亡的生物學(xué)信號的Fas配體突變蛋白質(zhì)。在國際申請公開號WO 95/10540中描述了阻斷FasL/Fas相互作用包括阻斷抗Fas單克隆抗體的合適的試劑的實施例，引入本文做參考。
能夠和本發(fā)明的多核苷酸和/或多肽一起施與以阻斷AIM-II與AIM-II受體結(jié)合的合適的試劑包括但不局限于可溶性AIM-II受體多肽(例如，TR2的可溶性形式(國際申請公開號WO 96/34095)；LT-β受體；和TR8(國際申請公開號WO 98/54201))；可溶性AIM-II受體多肽的多聚體形式；和與AIM-II受體結(jié)合從而不傳導(dǎo)導(dǎo)致凋亡的生物學(xué)信號的抗AIM-II受體的抗體；阻斷AIM-II與一個或多個AIM-II受體結(jié)合的抗AIM-II抗體，和能結(jié)合AIM-II受體但不傳導(dǎo)導(dǎo)致凋亡的生物學(xué)信號的AIM-II突變蛋白質(zhì)。根據(jù)本發(fā)明實施的抗體優(yōu)選為單克隆抗體。
在同種移植排斥中，受體動物的免疫系統(tǒng)此前未被初始去應(yīng)答，因為免疫系統(tǒng)的大部分僅被環(huán)境抗原所初始免疫。從相同物種動物的其它個體中得到的組織也未被以同樣的方式，例如病毒和細菌被呈遞的方式被呈遞。在同種移植排斥的情況下，設(shè)計免疫抑制方案以阻止免疫系統(tǒng)到達效應(yīng)階段。但是，異體移植排斥的免疫分布比同種移植排斥更象疾病復(fù)發(fā)。在疾病復(fù)發(fā)的情況下，免疫系統(tǒng)已經(jīng)被激活，其證據(jù)是破壞原始島細胞。因此，在疾病復(fù)發(fā)中免疫系統(tǒng)已經(jīng)處于效應(yīng)期了。本發(fā)明的拮抗劑能夠抑制對同種移植和異體移植的免疫應(yīng)答，因為淋巴細胞激活和分化成的效應(yīng)細胞將表達TNFR多肽，并且因此對增強TNFR活性的化合物很敏感。因此，本發(fā)明另外提供了制造免疫特權(quán)組織的方法。本發(fā)明的拮抗劑可被另外用于治療炎性腸道疾病。
本發(fā)明的TNFR多核苷酸、多肽和激動劑可被用于抑制免疫應(yīng)答。在一個實施方案中，本發(fā)明的TNFR多核苷酸、多肽和激動劑被用于將與移植相關(guān)的副反應(yīng)降到最低。在一個特定的實施方案中，本發(fā)明的TNFR多核苷酸、多肽和激動劑被用于抑制Fas介導(dǎo)的免疫應(yīng)答(例如，以一種與免疫抑制相似的方式，例如雷帕霉素或環(huán)胞菌素)。在另一個特定的實施方案中，本發(fā)明的TNFR多核苷酸、多肽和激動劑被用于抑制AIM-II介導(dǎo)的免疫應(yīng)答。
此外，移植排斥和移植宿主疾病部分是由凋亡引發(fā)的。因此，在另一個優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明的TNFR多核苷酸、多肽和/或激動劑被用于治療和預(yù)防和/或降低移植排斥。在另外的優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明的TNFR多核苷酸、多肽和激動劑被用于本發(fā)明的TNFR多核苷酸、多肽和/或激動劑被用于治療和預(yù)防和/或降低移植宿主疾病。
此外，TNFR-6α和/或TNFR-6β多肽、多核苷酸和/或激動劑可被用于治療或預(yù)防移植排斥(例如，異體移植排斥和同種移植排斥(例如急性同種移植排斥))和/或與移植排斥相關(guān)的醫(yī)學(xué)狀況。在一個特定的實施方案中，本發(fā)明的TNFR-6α和/或TNFR-6β多肽、多核苷酸和/或激動劑可被用于治療或預(yù)防急性同種移植排斥和/或與急性同種移植排斥相關(guān)的醫(yī)學(xué)狀況。在另外的一個特定的實施方案中，本發(fā)明的TNFR-6α和/或TNFR-6β多肽、多核苷酸和/或激動劑可被用于治療或預(yù)防腎急性同種移植排斥和/或與腎急性同種移植排斥相關(guān)的醫(yī)學(xué)狀況。
Fas配體是一種通過與Fas結(jié)合而誘導(dǎo)凋亡的II型膜蛋白。Fas配體由激活的T細胞所表達，并且作為細胞毒性淋巴細胞的效應(yīng)器起作用。對Fas和Fas配體的分子遺傳學(xué)分析表明鼠淋巴增生性突變(lpr)和普通的淋巴增生病(gld)是分別由Fas和Fas配體突變引起的。Gld鼠的lpr發(fā)展淋巴結(jié)病，并且患有自身免疫性疾病。根據(jù)這些表型研究和其它研究，據(jù)認為Fas系統(tǒng)涉及T細胞發(fā)育、特異性外周克隆耗竭或成熟T細胞激活誘導(dǎo)的自殺中的凋亡過程。除了激活的淋巴細胞之外，肝臟、心和肺中也表達Fas。已經(jīng)表明向小鼠施與拮抗的抗Fas抗體可在肝臟中誘導(dǎo)凋亡并且很快殺死小鼠，造成肝損傷。這些發(fā)現(xiàn)表明Fas系統(tǒng)不僅在T淋巴細胞發(fā)育的正常生理過程中起重要作用，而且在細胞毒性T淋巴細胞介導(dǎo)的疾病例如暴發(fā)性肝炎和/或由于病毒感染或毒性試劑導(dǎo)致的肝炎中也起重要作用。正如文中所述，TNFR-6α和/或TNFR-6β結(jié)合Fas配體，因此作為Fas配體介導(dǎo)的活性的激動劑起作用。因此，本發(fā)明的TNFR-6α和/或TNFR-6β和/或多核苷酸，和/或其激動劑可被用于治療或預(yù)防淋巴增生性疾病(例如，淋巴結(jié)病和文中所述的其它疾病)，自身免疫性紊亂(例如，自身免疫性糖尿病，系統(tǒng)性紅斑狼瘡，突眼性甲狀腺腫，淋巴瘤性甲狀腺腫，和免疫相關(guān)的腎小球腎炎，自身免疫性胃炎，自身免疫血小板減少性紫癜，多發(fā)性硬化，類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎和文中所述的其它疾病)和/或肝病(例如，急性和/或慢性肝炎，和肝硬變)。
在一個特定的實施方案中，本發(fā)明的TNFR多核苷酸、多肽和/或激動劑或拮抗劑被用于治療或預(yù)防肝炎和/或組織/細胞的損傷或破壞和/或與肝炎相關(guān)的醫(yī)學(xué)狀況。在一個特定的實施方案中，本發(fā)明的TNFR多核苷酸、多肽和/或激動劑或拮抗劑被用于治療或預(yù)防暴發(fā)性肝炎和/或與暴發(fā)性肝炎相關(guān)的醫(yī)學(xué)狀況。
在一個特定的實施方案中，本發(fā)明的TNFR多核苷酸、多肽和/或激動劑或拮抗劑被用于治療或預(yù)防系統(tǒng)性紅斑狼瘡(SLE)和/或組織/細胞的損傷或破壞和/或與SLE相關(guān)的醫(yī)學(xué)狀況。在另外特定的實施方案中，本發(fā)明的TNFR多核苷酸、多肽和/或激動劑或拮抗劑被用于治療或預(yù)防SLE中的皮膚損傷。
在一個特定的實施方案中，本發(fā)明的TNFR多核苷酸、多肽和/或激動劑或拮抗劑被用于治療或預(yù)防胰島素依賴的糖尿病和/或組織/細胞的損傷或破壞和/或與胰島素依賴的糖尿病相關(guān)的醫(yī)學(xué)狀況。在另外特定的實施方案中，本發(fā)明的TNFR多核苷酸、多肽和/或激動劑或拮抗劑被在糖尿病發(fā)作前、過程中、發(fā)作以后立即用于降低或阻止對島細胞的損傷和/或降低對外源胰島素的需要。
在一個特定的實施方案中，本發(fā)明的TNFR多核苷酸、多肽和/或激動劑或拮抗劑被用于治療或預(yù)防毒性表皮壞死松解(TEN)和/或組織/細胞的損傷或破壞和/或與TEN相關(guān)的醫(yī)學(xué)狀況。在另外特定的實施方案中，本發(fā)明的TNFR多核苷酸、多肽和/或激動劑或拮抗劑被用于治療或阻止萊爾病綜合癥。
肝炎病毒(例如，乙型肝炎病毒和丙型肝炎病毒)是慢性肝病的主要病因。在肝炎感染中，根據(jù)肝臟炎癥的嚴重程度肝細胞中Fas的表達被上調(diào)。當(dāng)肝炎病毒特異性的T細胞進入肝細胞并且通過T細胞受體識別病毒抗原，它們會被激活并且表達能夠?qū)⒌蛲鲂盘栟D(zhuǎn)導(dǎo)給攜帶有Fas的肝細胞。因此，F(xiàn)as系統(tǒng)在由病毒性肝炎所導(dǎo)致的肝細胞損傷中起重要作用。因此，在特定的實施方案中，本發(fā)明的TNFR-6α和/或TNFR-6β多肽和/或多核苷酸和/或其激動劑或拮抗劑被用于治療或預(yù)防由病毒感染導(dǎo)致的肝炎(例如，乙型肝炎病毒和丙型肝炎病毒導(dǎo)致的肝炎)。在一個實施方案中，患者的血液或血漿在離體的情況下與本發(fā)明的TNFR-6α和/或TNFR-6β相互作用。TNFR-6α和/或TNFR-6β可以通過傳統(tǒng)的方法結(jié)合到本領(lǐng)域已知的層析基質(zhì)上。在返回病人體內(nèi)之前，患者的血液或血漿流過基質(zhì)上結(jié)合有本發(fā)明TNFR-6α和/或TNFR-6β多肽的層析柱。靜止的TNFR-6α和/或TNFR-6β結(jié)合Fas配體，因此從患者的血液中去除了Fas配體。
在一個特定的實施方案中，本發(fā)明的TNFR-6α和/或TNFR-6β多肽和/或多核苷酸和/或其激動劑或拮抗劑被用于治療或預(yù)防腎衰竭(例如，慢性腎衰竭)和/或組織/細胞的損傷或破壞(例如，管狀上皮細胞耗竭)和/或與腎衰竭相關(guān)的醫(yī)學(xué)狀況。
在一個特定的實施方案中，本發(fā)明的TNFR-6α和/或TNFR-6β多肽、多核苷酸和/或本發(fā)明的激動劑或拮抗劑被用于調(diào)控(即，刺激或抑制)骨生長。在特定的實施方案中，本發(fā)明的TNFR-6α和/或TNFR-6β多肽、多核苷酸和/或本發(fā)明的激動劑或拮抗劑被用于刺激骨生長。特異的可被本發(fā)明組合物治療和預(yù)防的疾病或狀況包括但不局限于骨折和缺陷，以及導(dǎo)致骨虛弱的紊亂例如骨質(zhì)疏松，骨軟化病和年齡相關(guān)的骨質(zhì)損失。
本發(fā)明的TNFR-6α和/或TNFR-6β多肽或編碼TNFR-6α和/或TNFR-6β多肽的多核苷酸和/或其激動劑或拮抗劑被用于治療或預(yù)防心血管紊亂包括外周主動脈病例如四肢局部缺血。
心血管紊亂包括心血管異常，例如，動脈瘺，動靜脈瘺，腦動靜脈畸形，肺閉鎖，和短彎刀形綜合癥。先天性心臟缺陷包括主動脈縮窄，cor triatriatum，冠狀血管異常，十字形心臟，右位心，動脈導(dǎo)管開放，埃伯斯坦異常，艾森門格爾復(fù)合征，左心發(fā)育不良綜合癥，坐位心，沉降灰四聯(lián)癥，大血管錯位，右心室雙出口，三尖瓣閉鎖，持續(xù)性動脈軀干，和心間隔不全，例如主動脈與肺動脈間的間隔不全，心內(nèi)膜sushion不全，魯藤巴赫綜合癥，沉降灰三聯(lián)癥，心室間隔不全。
心血管紊亂也包括心臟疾病例如動脈粥樣硬化，心律失常，類癌心臟病，高心輸出量，低心輸出量，心壓塞，心內(nèi)膜炎(包括細菌性的)，心臟動脈瘤，心動停止，充血性心力衰竭(例如，慢性充血性心力衰竭)，充血性心臟病，陣發(fā)性呼吸困難，心水腫，心臟肥大，充血性心臟病，左心室肥大，右心室肥大，心肌梗死后心臟破裂，心室間隔破裂，心瓣膜疾病，心肌病，心肌局部缺血，心包滲漏，心包炎(包括狹窄性和結(jié)核性)，氣心包，心包切開術(shù)后綜合癥，肺纖維化，肺心病，風(fēng)濕性心臟病，心室功能障礙，充血，妊娠期心血管并發(fā)癥，短彎刀形綜合癥，心血管梅毒和心血管結(jié)核。
在一個特定的實施方案中，本發(fā)明的TNFR-6α和/或TNFR-6β多核苷酸、多肽或本發(fā)明的激動劑被用于治療和/或預(yù)防慢性充血性心力衰竭和/或與慢性充血性心力衰竭相關(guān)的醫(yī)學(xué)狀況。
在另一個特定的實施方案中，本發(fā)明的TNFR-6α和/或TNFR-6β多核苷酸、多肽或本發(fā)明上午激動劑被用于治療和/或預(yù)防肺損傷或疾病(例如，肺纖維化和慢性阻塞性肺病，如肺氣腫和慢性支氣管炎)和/或組織/細胞的損傷或破壞(例如，牙槽壁和或支氣管性牙槽壁)和/或與肺損傷或疾病相關(guān)的醫(yī)學(xué)狀況。
心律失常包括竇性心律失常，心房纖維性顫動，心房撲動，心動過緩，期外收縮，心源性腦缺氧綜合癥，bundle-branch綜合癥，竇房阻塞，long QT綜合癥，平行收縮，朗-甘-萊綜合癥，Mahaim樣興奮過早綜合癥，午非-帕金森-懷特綜合癥，患病心房綜合癥，心動過速，和心室纖維性顫動。心動過速包括陣發(fā)性心動過速，室上心動過速，心室自身節(jié)律加快，房室結(jié)折返心動過速，心房異位心動過速，結(jié)合異位心動過速，竇房結(jié)折返心動過速，Torsades dePointes，和心室性心動過速。
心臟瓣膜疾病包括主動脈瓣膜不全，主動脈瓣膜狹窄，聽覺雜音，主動脈瓣膜脫垂，左房室瓣膜脫垂，三尖瓣瓣膜脫垂，左房室瓣膜不全，左房室瓣膜狹窄，肺閉鎖，肺瓣膜不全，肺瓣膜狹窄，三尖瓣閉鎖，三尖瓣瓣膜不全，和三尖瓣瓣膜狹窄。
心肌病包括酒精性心臟病，充血性心臟病，肥大性心臟病，主動脈亞瓣不全，肺亞瓣狹窄，限制性心臟病，恰加斯心臟病，心內(nèi)膜彈性組織纖維增生，心內(nèi)膜心肌纖維化，克氏綜合癥，心肌再灌注，和心肌炎。
心肌局部缺血包括冠心病，例如心絞痛，冠狀動脈瘤，冠狀動脈硬化，冠狀動脈血栓形成，冠狀動脈血管痙攣，心肌梗塞和心肌功能喪失。
心血管疾病也包括血管疾病例如血管痙攣，血管發(fā)育異常，多發(fā)性血管瘤，桿狀血管瘤，希佩爾-林道疾病，克-特-韋綜合癥，斯特奇-韋伯綜合癥，血管神經(jīng)水腫，主動脈疾病，Takayasu’s Arteritis，主動脈炎，外傷后骨質(zhì)疏松，動脈堵塞疾病，動脈炎，內(nèi)動脈炎，結(jié)節(jié)性多動脈炎，腦血管紊亂，糖尿病血管病，糖尿病視網(wǎng)膜病，栓塞，血栓形成，紅斑性肢痛病，痔，肝靜脈堵塞，高血壓，低血壓，局部缺血，外周血管疾病，靜脈炎，肺靜脈堵塞，雷諾病，CREST綜合癥，視網(wǎng)膜靜脈堵塞，短彎刀綜合癥，superior vena cava綜合癥，毛細血管擴張，atacia telangiectasia，遺傳性出血性毛細血管擴張，精索靜脈曲張，靜脈曲張，靜脈曲張潰瘍，脈管炎和靜脈不全。
血管痙攣包括解剖性血管痙攣，假血管痙攣，感染性血管痙攣，破裂性血管痙攣，主動脈血管痙攣，腦血管痙攣，冠狀動脈血管痙攣，心血管痙攣，和髖血管痙攣。
動脈堵塞疾病包括動脈硬化，間歇性跛行，頸動脈狹窄，肌纖維性發(fā)育不良，腸系膜血管堵塞，莫雅病，腎動脈堵塞，視網(wǎng)膜動脈堵塞，和閉塞性血栓血管炎。
腦血管紊亂包括頸動脈血管病，淀粉樣腦血管病，腦血管痙攣，腦缺氧，大腦動脈硬化，腦動靜脈畸形，腦動脈病，腦栓塞和血栓形成，頸動脈血栓形成，竇性血栓形成，瓦倫貝格綜合癥，腦出血，硬膜外血腫，硬膜下血腫，蛛網(wǎng)膜下血腫，腦梗塞，腦缺血(包括瞬間缺血)，鎖骨下竊血綜合癥，室周白斑軟化，血管性頭痛，集束性頭痛，偏頭痛，和脊椎基底動脈不全。
栓塞包括空氣栓賽，羊水栓塞，膽固醇栓塞，鈍趾綜合癥，脂肪栓塞，肺栓塞，和血栓栓塞。血栓形成包括冠狀動脈血栓形成，肝靜脈血栓形成，視網(wǎng)膜靜脈血栓形成，頸動脈血栓形成，竇性血栓形成，瓦倫貝格綜合癥，和血栓性靜脈炎。
局部缺血包括腦局部缺血，局部缺血性結(jié)腸炎，隔室綜合癥，前隔室綜合癥，心肌局部缺血，再灌注損傷，和外周肢體局部缺血。脈管炎包括主動脈炎，動脈炎，貝赫切特綜合癥，丘-施綜合癥，粘膜皮膚淋巴結(jié)綜合癥，閉鎖性血栓血管炎，超敏性脈管炎，舍恩萊茵-亨諾紫癜，皮膚過敏性脈管炎，和韋格納肉芽腫病。
在一個實施方案中，本發(fā)明的TNFR-6α和/或TNFR-6β多肽、多核苷酸和/或本發(fā)明的激動劑或拮抗劑被用于治療或預(yù)防血栓形成性微血管病。一種這樣的紊亂的例子是血栓形成血小板減少性紫癜(TTP)(Kwaan，H.C.，Semin.Hematol.2471(1987)；Thompson等，血液801890(1992))。美國疾病控制中心已經(jīng)報道與TTP相關(guān)的死亡率一直在增加(Torok等，美國血液學(xué)期刊5084(1995))。采集自患有TTP的病人(包括HIV陽性病人和HIV陰性病人)的血漿誘導(dǎo)皮膚微血管起源的而不是大血管起源的內(nèi)皮細胞凋亡(Laurence等，血液873245(1996))。因此，據(jù)認為TTP病人的血漿含有一種或多種能夠直接或間接誘導(dǎo)凋亡的因子。已經(jīng)表明一種抗Fas阻斷抗體能夠降低TTP血漿介導(dǎo)的微血管內(nèi)皮細胞的凋亡(Laurence等，血液873245(1996)；引入本文做參考)。因此，存在于TTP病人血清中的Fas配體可能在誘導(dǎo)微血管內(nèi)皮細胞的凋亡中起重要作用。另外一種血栓形成性微血管病是溶血性尿毒性綜合癥(HUS)(Moake，J.L.，柳葉刀343393(1994)；Melnyk等，國際醫(yī)學(xué)檔案1552077(1995)；Thompson等，supra)。因此，在一個實施方案中，本發(fā)明旨在使用TNFR-6α和/或TNFR-6β治療或預(yù)防經(jīng)常被稱做“成人HUS”的情形(盡管它也在兒童中發(fā)作)。稱為兒童/腹瀉相關(guān)的HUS的紊亂在病因?qū)W上與成人HUS不同。在另一個實施方案中，以小血管凝結(jié)成塊為特征的疾病狀況可被使用本發(fā)明的TNFR-6α和/或TNFR-6β多肽和/或多核苷酸所治療。這樣的疾病狀況包括但是不局限于在本文中所描述的那些情形。例如，在大約5-10％的兒童AIDS患者中觀察到的心臟問題據(jù)認為與小血管凝塊有關(guān)。已有報道稱在多發(fā)性硬化患者的心臟中存在微血管系統(tǒng)的崩潰。作為一個另外的實施例，我們設(shè)想去治療系統(tǒng)性紅斑狼瘡(SLE)。在一個實施方案中，患者的血液或血漿在離體的情況下與TNFR-6α和/或TNFR-6β多肽相互作用。TNFR-6α和/或TNFR-6β可以通過傳統(tǒng)的方法結(jié)合到本領(lǐng)域已知的合適的層析基質(zhì)上。在返回病人體內(nèi)之前，根據(jù)本實施方案患者的血液或血漿流過基質(zhì)上結(jié)合有本發(fā)明TNFR-6α和/或TNFR-6β多肽的層析柱。靜止的TNFR-6α和/或TNFR-6β結(jié)合Fas配體和/或AIM-II，因此從患者的血液中去除了Fas配體蛋白。另外，TNFR-6α和/或TNFR-6β可被體內(nèi)施與血栓形成性微血管病患者。在一個實施方案中，本發(fā)明的TNFR-6α和/或TNFR-6β多核苷酸或多肽被施與到患者體內(nèi)。因此，本發(fā)明提供了一種治療血栓形成性微血管病的方法，此方法涉及使用有效劑量的本發(fā)明的TNFR-6α和/或TNFR-6β多肽。TNFR-6α和/或TNFR-6β多肽可被用于體內(nèi)或離體方法中以抑制Fas配體介導(dǎo)的和/或AIM-II介導(dǎo)的對微血管內(nèi)皮細胞的損傷(例如，凋亡)。
本發(fā)明的TNFR-6α和/或TNFR-6β多肽和多核苷酸可以與其它在治療特定紊亂中有用的試劑組合應(yīng)用。例如，在一個由Laurence等報道的體外研究中(血液873245(1996))，通過使用抗Fas阻斷抗體、aurintricarboxylic acid或去除冷沉淀物的正常血漿獲得了對TTP血漿介導(dǎo)的對微血管內(nèi)皮細胞凋亡的降低。因此，可組合使用另外的能夠抑制Fas配體介導(dǎo)的內(nèi)皮細胞凋亡的試劑例如上述試劑對患者進行治療。在一個實施方案中，本發(fā)明的TNFR-6α和/或TNFR-6β多肽和一種抗Fas阻斷抗體被施與到患有以血栓形成性微血管病為特征的紊亂例如TTP或HUS的患者體內(nèi)。在國際申請公開號WO95/10540中描述了抗Fas抗原(CD95)的阻斷單克隆抗體的實施例。
在天然發(fā)生的內(nèi)源性刺激因素與血管生成的抑制之間的平衡中抑制性影響占主導(dǎo)地位。Rastinejad等，細胞56345-355(1989)。在正常生理條件下發(fā)生新血管生成的那些稀有情形有例如傷口愈合、器官再生、胚胎發(fā)育以及雌性生殖過程，血管生成是受到嚴格控制的，只有在一定的空間或時間才會去除限制。在以實體瘤生長為特征的生理性血管生成的情形下，這些調(diào)節(jié)控制失去效力。不受調(diào)控的血管生成是病理性的，并且維持許多瘤形成性或非瘤形成性疾病的進展。許多嚴重的疾病受新血管生成所控制例如實體瘤生長和轉(zhuǎn)移、關(guān)節(jié)炎、一些類型的眼睛疾病和牛皮癬。見，例如Moses等的綜述，生物技術(shù)9630-634(1991)；Folkman等，新英格蘭醫(yī)學(xué)期刊3331757-1763(1995)；Auerbach等，微血管研究期刊29401-411(1985)；Folkman，癌癥研究進展，Klein和Weinhouse編，學(xué)院出版社，紐約，175-203頁(1985)；Pat，美國血液學(xué)期刊94.715-743(1982)；和Folkman等，科學(xué)221719-725(1983)。在許多病理情況下，血管生成的過程對疾病的狀態(tài)貢獻很大。例如，已經(jīng)積聚起來的大量的數(shù)據(jù)表明實體瘤的生長依賴于血管生成。Folkman和Klagsbrun，科學(xué)235442-447(1987)。
本發(fā)明提供了通過施與本發(fā)明的TNFR-6α和/或TNFR-6β多核苷酸和/或多肽而治療與新血管生成有關(guān)的疾病和紊亂的方法?？杀槐景l(fā)明的多核苷酸和多肽治療的惡性或轉(zhuǎn)移的疾病情形包括但是不局限于惡性瘤、實體瘤和文中所述的癌癥以及本領(lǐng)域所已知的其它疾病(對于這些疾病的綜述，見Fishman等，醫(yī)學(xué)第二版，J.B.Lippincott公司出版，費城(1985))。
可被本發(fā)明的TNFR-6α和/或TNFR-6β多核苷酸和多肽(包括本發(fā)明的激動劑和/或拮抗劑)治療的與新血管生成相關(guān)的的眼部疾病包括但是不局限于新血管性青光眼，糖尿病視網(wǎng)膜病，成視網(wǎng)膜細胞瘤，晶體狀后纖維組織形成，眼色素層炎，早熟斑點變性視網(wǎng)膜病，角膜移植新血管形成，以及其它眼睛炎癥疾病、眼部腫瘤或與脈絡(luò)膜或虹膜新血管形成相關(guān)的疾病。見，例如，Waltman等的綜述，美國眼科學(xué)期刊85704-710(1978)和Gartner等，眼睛外科22291-312(1978)。
在另一個實施方案中，本發(fā)明的TNFR-6α和/或TNFR-6β多肽、多核苷酸和/或本發(fā)明的激動劑或拮抗劑被用于刺激圖象受體細胞的分化和/或存活和/或治療或預(yù)防與圖象受體細胞的數(shù)目減少、分化和/或存活相關(guān)的疾病、紊亂或情形。
此外，可被本發(fā)明的TNFR-6α和/或TNFR-6β多核苷酸和多肽(包括TNFR激動劑和/或拮抗劑)治療的紊亂包括但是不局限于血管瘤，關(guān)節(jié)炎，牛皮癬，血管纖維瘤，粥樣硬化斑，延遲的傷口愈合，肉芽發(fā)生，嗜血性關(guān)節(jié)，肥大性斑痕，不結(jié)合骨折，奧斯勒-韋伯綜合癥，化膿性肉芽腫，硬皮病，沙眼，和血管粘附。
在另外的實施方案中，本發(fā)明的TNFR-6α和/或TNFR-6β多核苷酸、多肽和/或其它本發(fā)明的組合物(例如，抗TNFR-6α和/或抗TNFR-6β抗體)被用于治療或預(yù)防與過敏和/或炎癥相關(guān)的疾病或情形。
在一個特定的實施方案中，TNFR多核苷酸、多肽和/或其激動劑或拮抗劑可被用于治療或預(yù)防甲狀腺相關(guān)的眼睛疾病和/或組織/細胞損傷或破壞，和/或與甲狀腺相關(guān)的眼睛疾病相關(guān)的疾病情形。
在一個特定的實施方案中，TNFR多核苷酸、多肽或本發(fā)明的激動劑被用于通過抑制或降低對轉(zhuǎn)基因表達細胞的清除而延長基因治療后的蛋白表達。
在另外的實施方案中，本發(fā)明的TNFR-6α和/或TNFR-6β多核苷酸、多肽和/或其激動劑或拮抗劑被用于促進傷口愈合。
本發(fā)明的TNFR-6α和/或TNFR-6β多核苷酸、多肽和/或其激動劑或拮抗劑在診斷和治療或預(yù)防廣泛范圍的疾病和/或情形中是非常有用的。這樣的疾病和情形包括但不局限于癌癥(例如免疫細胞相關(guān)的癌癥、乳癌、前列腺癌、卵巢癌、濾泡淋巴瘤、p53突變或改變相關(guān)的癌癥、腦瘤、膀胱癌、子宮宮頸癌、結(jié)腸癌、結(jié)腸直腸癌、非小細胞肺癌、小細胞肺癌、胃癌等)；淋巴增生性紊亂(例如，淋巴結(jié)病)；微生物(例如，病毒、細菌等)感染(例如，HIV-1感染，HIV-2感染，皰疹病毒感染(包括但不局限于HSV-1，HSV-2，CMV，VZV，HHV-6，HHV-7，EBV)，腺病毒感染，天花病毒感染，人乳頭瘤病毒感染，肝炎病毒感染(例如，HAV，HBV，HCV等)，幽門螺旋菌感染，侵襲性葡萄球菌等)，寄生蟲感染，腎炎，骨疾病(例如，骨質(zhì)疏松)，動脈粥樣硬化，疼痛，心血管紊亂(例如，新血管生成，血管生成減少或循環(huán)降低(例如，局部缺血疾病(例如，心肌梗塞，中風(fēng)等)))，AIDS，過敏，炎癥，神經(jīng)變性疾病(例如，阿爾茨海默疾病，帕金森氏病，肌萎縮性側(cè)索硬化，色素性視網(wǎng)膜炎，小腦退化等)，移植排斥(急性和慢性)，移植宿主疾病，由于骨髓發(fā)育不良導(dǎo)致的疾病(例如，再生障礙性貧血)，風(fēng)濕病中的關(guān)節(jié)組織破壞，肝病(例如，急性和慢性肝炎，肝損傷和肝硬變)，自身免疫性疾病(例如，多發(fā)性硬化，類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎，系統(tǒng)性紅斑狼瘡，免疫復(fù)合物腎小球腎炎，自身免疫性糖尿病，自身免疫血小板減少紫癜，突眼性甲狀腺腫，淋巴瘤性甲狀腺腫等)，心臟病(例如，擴張性心臟病)，糖尿病，糖尿病并發(fā)癥(例如，糖尿病性腎病，糖尿病性神經(jīng)病，糖尿病性視網(wǎng)膜病)，流感，哮喘，牛皮癬，腎炎，膿毒性休克，和潰瘍性結(jié)腸炎。
本發(fā)明的多核苷酸和/或多肽和/或其激動劑和/或拮抗劑在促進血管生成、調(diào)節(jié)血細胞生成和傷口愈合(例如，創(chuàng)傷，燒傷和骨折)中是非常有用的。
本發(fā)明的多核苷酸和/或多肽和/或其激動劑和/或拮抗劑也可用做佐劑以增強針對特異性抗原的免疫應(yīng)答以及抗病毒應(yīng)答。
更為普遍的是，本發(fā)明的多核苷酸和/或多肽和/或其激動劑或拮抗劑在調(diào)節(jié)免疫系統(tǒng)(例如，升高或降低)中非常有用。例如，本發(fā)明的多核苷酸和/或多肽可被用于外科手術(shù)、創(chuàng)傷、放療、化療和移植的準備和恢復(fù)，或可被用于加強免疫應(yīng)答和/或老年人和免疫妥協(xié)的病人恢復(fù)。另外，本發(fā)明的多核苷酸和/或多肽和/或其激動劑或拮抗劑可被用做免疫抑制劑，例如在治療或預(yù)防自身免疫性紊亂中。在特定的實施方案中，本發(fā)明的多核苷酸和/或多肽被用于治療或預(yù)防慢性炎癥、過敏或自身免疫病，例如文中所述的疾病或本領(lǐng)域已知的其它疾病。
在一個方面，本發(fā)明涉及一種促進由TNF家族配體誘導(dǎo)的凋亡的方法，此方法涉及向患者(優(yōu)選人)施與一種TNFR拮抗劑(例如，一種抗TNFR抗體或TNFR多肽片段)。此TNFR拮抗劑優(yōu)選被施與治療顯示出增加的細胞存活的疾病或情形。本發(fā)明的拮抗劑包括TNFR多肽的可溶性形式和抗TNFR多肽的單克隆抗體。
“拮抗劑”是指能夠增強或強化凋亡的天然或人工合成的化合物?！凹觿笔侵改軌蛞种频蛲龅奶烊换蛉斯ず铣傻幕衔铩１景l(fā)明的任何一種“激動劑”或“拮抗劑”是否能夠抑制或增強凋亡可通過本領(lǐng)域已知的TNF家族配體/受體細胞應(yīng)答分析包括將要在下面詳細描述的那些方法所確定。
一種這樣的篩選方法涉及應(yīng)用已經(jīng)被轉(zhuǎn)染表達本發(fā)明受體的黑素細胞。在1992年2月6日出版的國際申請公開號WO 92/01810中描述了這樣的篩選技術(shù)。這樣的方法可被用于例如通過將編碼本發(fā)明受體的黑素細胞與TNF家族配體和候選拮抗劑(或激動劑)相互作用從而篩選能夠抑制(或增強)本發(fā)明受體多肽激活的化合物。抑制或增強由配體所產(chǎn)生的信號預(yù)示著此化合物是配體/受體信號途徑的一種拮抗劑或激動劑。
其它的篩選技術(shù)包括在一個測定由受體激活引起的細胞外pH變化的系統(tǒng)中使用能夠表達受體的細胞(例如，轉(zhuǎn)染的CHO細胞)，例如，如同在自然246181-296(1989年10月)中所描述的。例如，化合物可與表達本發(fā)明受體多肽的細胞相互作用以及測定第二信使應(yīng)答，例如信號傳導(dǎo)或pH改變，以確定此潛在的化合物是否激活或抑制受體。
另一個這樣的篩選技術(shù)涉及將編碼受體的RNA導(dǎo)入非洲爪蟾卵母細胞瞬時表達受體。然后將受體卵母細胞與受體配體以及待篩選的化合物相互作用，在篩選被認為抑制受體激活的化合物的情況下檢測鈣信號的抑制或激活。
另一種篩選技術(shù)涉及在細胞中表達一種構(gòu)建物，其中受體與磷脂酶C或D連接。這樣的細胞包括內(nèi)皮細胞、平滑肌細胞、胚腎細胞等。如同上文所述，篩選可以通過從磷脂酶信號中檢測受體的激活或者抑制受體的激活來完成。
另一種方法涉及通過測定標記的配體與表面帶有受體的細胞的結(jié)合的抑制來篩選能夠抑制本發(fā)明受體多肽激活的化合物拮抗劑。這樣的方法包括使用編碼受體的DNA轉(zhuǎn)染真核細胞以使得細胞在其表面表達受體，然后在存在已知配體標記形式的條件下將此細胞與化合物作用。配體可被例如放射活性所標記。然后測定與受體結(jié)合的標記的配體的數(shù)量，例如通過測定受體的放射活性。如同所測的，如果化合物通過降低可與受體結(jié)合的標記的配體而與受體結(jié)合，那么標記的配體對受體是抑制的。
另外的篩選本發(fā)明激動劑和拮抗劑的方法見Tartaglia，L.A.和Goeddel，D.V.，生命的化學(xué)期刊267(7)4304-4307(1992)。
因此，在另一方面，本發(fā)明提供了一種用于確定候選激動劑或拮抗劑是否能夠增強或抑制針對TNF家族配體的細胞應(yīng)答的篩選方法。此方法包含將表達TNFR多肽的細胞與一種候選化合物以及TNF家族配體作用，分析細胞應(yīng)答，并且將此細胞應(yīng)答與標準的細胞應(yīng)答進行比較，標準應(yīng)答是在不存在候選化合物的情況下與配體作用而測得的，與標準應(yīng)答相比升高的細胞應(yīng)答表明候選化合物是配體/受體信號途徑的激動劑，與標準應(yīng)答相比降低的細胞應(yīng)答表明候選化合物是配體/受體信號途徑的拮抗劑?！胺治黾毎麘?yīng)答”意思是指定性或定量測定針對候選化合物和/或TNF家族配體的細胞應(yīng)答(例如，測定或檢測T細胞增殖或3H標記的胸苷升高或降低)。通過本發(fā)明，表達TNFR多肽的細胞可與內(nèi)源性或外源性施與的TNF家族配體作用。
本發(fā)明的激動劑包括天然的和人工合成的化合物，例如TNF家族配體肽片段、轉(zhuǎn)化生長因子、神經(jīng)遞質(zhì)(如谷氨酰胺，多巴胺，N-甲基-D-天冬氨酸)、腫瘤抑制劑(p53)、溶細胞T細胞和抗代謝物。優(yōu)選的激動劑包括化療藥物例如順鉑、dexorubicin、博來霉素、阿糖胞苷、氮芥類、甲氨喋呤和長春新堿。其他包括乙醇和淀粉肽(科學(xué)2671457-1458(1995))。另外的優(yōu)選的激動劑包括抗TNFR多肽的多克隆和單克隆抗體或其片段。在Tartaglia，LA.等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 889292-9296(1991)；和Tartaglia，L.A.和Goeddel，D.V.，生命的化學(xué)期刊267(7)4304-4307(1992)中描述了這樣的抗TNF家族受體的抗體激動劑，也見國際申請公開號WO94/09137。
本發(fā)明的拮抗劑包括天然的和人工合成的化合物，例如CD40配體、中性氨基酸、鋅、雌激素、雄激素、病毒基因(如腺病毒的ELB基因，桿狀病毒的p35和IAP基因，牛痘病毒的crmA基因，EB病毒的BHRF1、LMP-1基因，非洲豬瘟病毒的LMW5-HL基因以及皰疹病毒的y134.5基因)，calpain抑制劑，半胱氨酸蛋白酶抑制劑以及腫瘤啟動子(如PMA，苯巴比妥，六氯化苯)。其它的拮抗劑包括抗TNFR多肽的多克隆和單克隆拮抗劑抗體或其片段。在Tartaglia，L.A.和Goeddel，D.V.，生命的化學(xué)期刊267(7)4304-4307(1992)；和Tartaglia，L.A.等，細胞73213-216(1993)中描述了這樣的抗TNF家族受體的拮抗劑抗體，也見國際申請公開號WO94/09137。
在特定的實施方案中，本發(fā)明的拮抗劑是對應(yīng)于TNFR所含的序列或其互補鏈，和/或?qū)?yīng)于保藏的克隆(ATCC保藏號97810和97809)中所含的核苷酸序列的核酸。在一個實施方案中，反義鏈是由有機體內(nèi)在產(chǎn)生的，在另一個實施方案中，反義鏈是單獨施與的(見，例如O’Connor，J.，神經(jīng)化學(xué)56560(1991)；和寡聚脫氧核苷酸作為基因治療的反義抑制劑，CRC出版社，Boca Raton，佛羅里達(1988))。反義技術(shù)可被用于通過反義DNA或RNA，或通過三螺旋形成控制基因表達。在Okano，J，神經(jīng)化學(xué)56560(1991)；和寡聚脫氧核苷酸作為基因治療的反義抑制劑，CRC出版社，BocaRaton，佛羅里達(1988)中描述了反義技術(shù)。在例如Lee等，核酸研究63073(1979)；Cooney等，科學(xué)241456(1988)；和Dervan等，科學(xué)2511300(1991)中描述了三螺旋形成。這些方法都是基于多核苷酸與其互補的DNA或RNA結(jié)合的基礎(chǔ)之上的。
例如，編碼本發(fā)明成熟多肽的多核苷酸的5’端編碼部分可被用于設(shè)計一段大約10到40個堿基對長度的反義RNA寡核苷酸。DNA寡核苷酸是根據(jù)與基因轉(zhuǎn)錄區(qū)互補的原理而設(shè)計的，因此阻止了轉(zhuǎn)錄和受體的產(chǎn)生。反義RNA寡核苷酸與mRNA在體內(nèi)雜交并且因此阻斷了mRNA分子翻譯為受體多肽。
在一個實施方案中，本發(fā)明的TNFR反義核酸是通過外源序列的轉(zhuǎn)錄而在細胞內(nèi)產(chǎn)生的。例如，一個載體或其部分被轉(zhuǎn)錄，從而產(chǎn)生了本發(fā)明的反義核酸(RNA)。這樣的載體必須含有編碼TNFR反義核酸的序列。這樣的載體可以是附加體的形式或整合在染色體中，只要它能夠被轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生目的反義RNA。這樣的載體可通過本領(lǐng)域標準的重組DNA技術(shù)被構(gòu)建。載體可以是用于脊椎動物細胞復(fù)制和表達的質(zhì)粒、病毒或并領(lǐng)域已知的其它載體。TNFR編碼序列或其片段可以通過任何本領(lǐng)域已知的可在脊椎動物優(yōu)選人細胞中起作用的啟動子起始表達。這樣的啟動子可以是誘導(dǎo)型或組成型的。這樣的啟動子包括但不局限于SV40早期啟動子區(qū)(Bernoist和Chambon，自然29304-310(1981))，勞氏肉瘤病毒3’端長末端重復(fù)序列中所含的啟動子(Yamamoto等，細胞22787-797(1980))，皰疹胸苷啟動子(Wagner等，Proc Natl Acad Sci USA 781441-1445(1981))，金屬硫蛋白基因的調(diào)控序列(Brinster等，自然29639-42(1982))等。
本發(fā)明的反義核酸包含一段與TNFR基因RNA轉(zhuǎn)錄本的至少一部分互補的序列。但是，不要求絕對互補，盡管優(yōu)選絕對互補。與“RNA的至少一部分互補的”序列在文中意思是指具有足夠的互補性以致于可與RNA雜交形成穩(wěn)定的雙鏈形式的序列；在雙鏈TNFR反義核酸的情況下，必須測定雙鏈DNA的一條單鏈，或可能分析三鏈形成。雜交的能力取決于互補的程度以及反義核酸的程度。通常情況下，核酸序列越長，其所含的與TNFR RNA不配對的堿基越多，但仍然形成穩(wěn)定的雙螺旋形式(或可能形成三鏈形式)。本領(lǐng)域熟練技術(shù)人員可以通過使用標準技術(shù)測定雜交復(fù)合體的熔點來確定對錯配的耐受程度。
與信使5’末端互補的寡核苷酸，例如從5’端向上并且包括AUG起始密碼子的非翻譯序列，必須有效地翻譯。但是，已經(jīng)表明與mRNAs 3’末端非翻譯序列互補的序列在抑制mRNAs的翻譯中同樣有效。見Wagner，R.，自然372333-335(1994)。因此，與圖1和2中所示的TNFR的5’端或3’端不翻譯的非編碼區(qū)互補的寡核苷酸可被用于反義方法中抑制內(nèi)源性TNFR mRNA的翻譯。與mRNA 5’端非翻譯區(qū)互補的寡核苷酸必須包括完整的AUG起始密碼子。與mRNA編碼區(qū)互補的反義寡核苷酸在抑制翻譯中效率較差但根據(jù)本發(fā)明同樣可被使用。無論是否設(shè)計為與TNFR mRNA的5’端或3’端或編碼區(qū)雜交，反義核酸在長度上應(yīng)該至少由6個核苷酸組成，優(yōu)選寡核苷酸的長度范圍在6個到50個核苷酸之間。在特定的方面，寡核苷酸至少由10個核苷酸，至少由17個核苷酸，至少由25個核苷酸，或至少由50個核苷酸組成。
本發(fā)明的多核苷酸可以是DNA或RNA或嵌合混合物或其衍生物或其修飾的分子部分，可以是單鏈或雙鏈的。寡核苷酸可以在堿基分子、糖分子或磷酸骨架上被修飾例如以增加分子的穩(wěn)定性、雜交等。寡核苷酸也可包括其它附屬基團例如肽(例如，用于體內(nèi)定向至宿主細胞受體)，或促進跨細胞膜轉(zhuǎn)運的試劑(見Letsinger等，Proc Natl.Acad.Sci.USA 866553-6556(1989)；Lemaitre等，Proc Natl.Acad.Sci.USA 84648-652(1987)；出版于1988年12月15日的PCT出版號WO 88/09810)或血腦屏障(見，例如出版于1988年4月25日的PCT出版號WO 89/10134)，雜交引發(fā)的裂解試劑(見，例如Krol等，生物技術(shù)6958-976(1988))或插入試劑(見，例如Zon，藥物研究5539-549(1988))。為此目的，寡核苷酸可結(jié)合至另一個分子上例如肽、雜交引發(fā)交聯(lián)試劑、轉(zhuǎn)運試劑、雜交引發(fā)裂解試劑等。
反義寡核苷酸可以包括至少一個修飾的堿基分子，此堿基分子選自下組包括但不局限于5-氟尿嘧啶，5-溴尿嘧啶，5-氯尿嘧啶，5-碘尿嘧啶，次黃嘌呤，黃嘌呤，4-乙酰胞嘧啶，5-羧羥甲基尿嘧啶，5-羧甲基氨基甲基-2-硫尿嘧啶，5-羧甲基氨基甲基尿嘧啶，二氫尿嘧啶，beta-D-galactosylqueosine，肌苷，N6異戊烯腺苷酸，1-甲基鳥苷酸，1-甲基肌苷，2，2-二甲基鳥苷酸，2-甲基腺苷酸，2-甲基鳥苷酸，3-甲基胞嘧啶，5-甲基胞嘧啶，N6-腺苷酸，7-甲基鳥苷酸，5-甲基氨基甲基尿嘧啶，5-甲基氨基甲基-2-硫氧嘧啶，beta-D-mannosylqueosine，5-甲氧基羧甲基尿嘧啶，5-甲氧基尿嘧啶，2-硫甲基-N6-異戊烯腺苷酸，尿嘧啶-5-羥乙酸，wybutoxosine，假尿嘧啶，queosine，2-硫胞嘧啶，5-甲基-2-硫尿嘧啶，2-硫尿嘧啶，4-硫尿嘧啶，5-甲基尿嘧啶，尿嘧啶-5-羥乙酸甲酯，尿嘧啶-5-羥乙酸，5-甲基-2-硫尿嘧啶，3-(3-氨基-3-N-2-羧丙基)尿嘧啶，(acp3)w，和2，6-二氨基嘌呤。
反義寡核苷酸可以包括至少一個修飾的糖基分子，此糖基分子選自以下組，包括但不局限于阿拉伯糖，2-氟阿拉伯糖，木聚糖，和己糖。
在另一個實施方案中，反義寡核苷酸包括至少一個修飾的磷酸骨架，此磷酸骨架選自以下組，包括但不局限于硫代磷酸，二硫代磷酸，二硫代磷酸酰胺化物(phosphoramidothioate)，磷酸酰胺化物(phosphoramidate)，磷酸二酰胺化物(phosphordiamidate)，甲基磷酸鹽，堿性磷酸三酯，和縮醛形式或其類似物。
在另一個實施方案中，反義寡核苷酸是α-異構(gòu)寡核苷酸。α-異構(gòu)寡核苷酸與互補的RNA形成特定雙鏈結(jié)構(gòu)的雜交體，其中與普通的β單位不同，兩條鏈是平行的(見Gautier等，核酸研究156625-6641(1987))。此寡核苷酸是2φ-0-甲基核糖核苷酸(Inoue等，核酸研究156131-6148(1987))，或一種嵌合的RNA-DNA類似物(Inoue等，F(xiàn)EBS lett 215327-330(1987))。
本發(fā)明的多核苷酸也可以是通過本領(lǐng)域已知的方法合成的，例如通過使用自動DNA合成儀(例如Biosearch應(yīng)用生物系統(tǒng)公司的商品)。例如，可以通過Stein等(核酸研究163209(1988))的方法合成硫代磷酸寡核苷酸，通過使用受控制的帶孔玻璃多聚體支持物制備甲基磷酸鹽(Sarin等，Proc.Natl.Acad.Sci USA 857448-7451(1988))等。
盡管可以使用與TNFR編碼區(qū)序列互補的反義核苷酸，但是與轉(zhuǎn)錄的未翻譯區(qū)互補的反義核苷酸是最優(yōu)選的。
本發(fā)明可能的拮抗劑還包括催化RNA，或核酶(見，例如出版于1990年10月4日的國際申請公開號WO 90/11364；Sarver等，科學(xué)2471222-1225(1990))。雖然在位點特異性識別序列切割mRNA的核酶可被用于破壞TNFR的mRNAs，但優(yōu)選使用錘頭狀核酶。錘頭狀核酶在與目的mRNA形成互補堿基配對的側(cè)翼區(qū)位置切割mRNAs。唯一的要求是目的mRNA帶有下列兩個堿基的序列5’-UG-3’。錘頭狀核酶的結(jié)構(gòu)和生產(chǎn)是本領(lǐng)域眾所周知的，在Haseloff和Gerlach，自然334585-591(1988)中具有更詳細的描述。在TNFR-6α(圖1，SEQ ID NO1)和TNFR-6β(圖2，SEQ ID NO3)的核苷酸序列中有許多潛在的錘頭狀核酶裂解位點。優(yōu)選的情況是，對核酶進行改造以使得切割識別位點位于TNFR mRNA的5’末端，即增加效率并且減少非功能性mRNA轉(zhuǎn)錄本在細胞外的積累。
如同在反義方法中，本發(fā)明的核酶可由修飾的寡核苷酸(例如，為增加穩(wěn)定性、靶定向等)組成并且應(yīng)該在體內(nèi)被運送給表達TNFR的細胞。編碼核酶的DNA構(gòu)建物可以使用與上述的用于導(dǎo)入反義編碼DNA的方法相同的方式被導(dǎo)入到細胞中。一種優(yōu)選的運送方法包含在強組成型啟動子例如polIII或polII啟動子的控制之下使用“編碼”核酶的DNA構(gòu)建物，轉(zhuǎn)染細胞將表達足夠數(shù)量的核酶去破壞內(nèi)源性TNFR信使和抑制翻譯。由于核酶不同于反義分子，它是具有催化性的，所以對于效率來說僅需要較低的細胞內(nèi)濃度。
通過使用靶向同源重組的方法“敲除”TNFR基因和/或其啟動子，或使之失活也可以降低內(nèi)源性基因的表達(例如，見Smithies等，自然317230-234(1985)；Thomas & Capecchi，細胞51503-512(1987)Thompson等，細胞5313-321(1989)；以上文獻全文引入本文做參考)。例如，本發(fā)明的一種突變的非功能性的并且基因側(cè)翼DNA序列與內(nèi)源性多核苷酸序列(編碼序列或基因的調(diào)控區(qū))同源的多核苷酸(或完全無關(guān)的DNA序列)在帶有或不帶有選擇標記和/或陰性選擇標記的情況下可被用于體內(nèi)轉(zhuǎn)染表達本發(fā)明多肽的細胞。在另一個實施方案中，本領(lǐng)域已知的技術(shù)可被用于在含有目的基因但是不表達此基因的細胞內(nèi)以制造基因敲除。通過靶向同源重組插入DNA構(gòu)建物導(dǎo)致靶基因的失活。這樣的方法特別適用于研究領(lǐng)域和農(nóng)業(yè)領(lǐng)域，其中對胚胎干細胞的修飾可被用于生產(chǎn)帶有失活的靶基因的動物后代(例如，見Thomas & Capecchi 1987和Thompson 1988，supra)。但是此方法可被常規(guī)采納用于人體中，只要通過使用本領(lǐng)域熟練技術(shù)人員熟悉的合適的病毒載體將重組DNA構(gòu)建物體內(nèi)直接施與或定向至所要求的位點。本段所引用的參考文獻全文引入本文做參考。
本發(fā)明的抗體可以通過使用任何一種標準方法以本發(fā)明TNFR作為免疫原而制備。這樣的TNFR免疫原包括在圖1和圖2(分別是SEQ ID NO2和SEQ ID NO4)中所示的TNFR蛋白(可能包括或不包括前導(dǎo)序列)和包含TNFR配體結(jié)合區(qū)和/或胞外區(qū)的TNFR多肽片段。
本發(fā)明的多克隆和單克隆抗體激動劑或拮抗劑可根據(jù)文中所述的許多不同方法中的任何一種方法和/或本領(lǐng)域已知的方法制備，例如，在Tartaglia，L.A.和Goeddel，D.V.，生命的化學(xué)期刊267(7)4304-4307(1992)；和Tartaglia，L.A.等，細胞73213-216(1993)以及國際申請公開號WO 94/09137中所描述的方法(本段所引用的參考文獻全文引入本文做參考)，并且對本發(fā)明多肽特異的抗體優(yōu)選具有SEQ ID NO2和/或SEQ ID NO4中所示的氨基酸序列。本發(fā)明的抗體可根據(jù)文中所述的許多不同方法中的任何一種方法和/或本領(lǐng)域已知的方法制備。
本發(fā)明另外的拮抗劑包括TNFR的可溶性形式，例如包含從全長受體的胞外區(qū)開始的配體結(jié)合區(qū)的TNFR片段。受體的這些天然或合成的可溶性形式通過與細胞表面TNFR競爭性結(jié)合TNF家族配體而拮抗TNFR介導(dǎo)的信號傳導(dǎo)和/或拮抗TNFR介導(dǎo)的對凋亡的抑制，例如，通過破壞TNFR形成多聚體的能力或結(jié)合的能力并且籍此中和誘發(fā)凋亡的配體如Fas配體和/或AIM-II。因此，包括配體結(jié)合區(qū)的受體的可溶性形式是能夠降低由TNFR介導(dǎo)的抑制TNF家族配體介導(dǎo)的腫瘤壞死的新型細胞因子。其它這樣的細胞因子是本領(lǐng)域已知的并且包括生理性限制由Fas配體介導(dǎo)的凋亡的FasB(鼠Fas受體的一種可溶性形式)(Hughes，D.P.和Crispe，I.N.，實驗醫(yī)學(xué)期刊1821395-1401(1995))。
與胞外區(qū)結(jié)合的蛋白質(zhì)和其它化合物也是本發(fā)明候選的激動劑和拮抗劑。這樣的結(jié)合化合物可以通過使用酵母雙雜交系統(tǒng)來“捕獲”(Fields和Song，自然 340245-246(1989))。Roger Brent及其同事描述了修飾的酵母雙雜交系統(tǒng)(Gyuris，J等，細胞75791-803(1993)；Zervos，A.S.等，細胞72223-232(1993))。
“TNF家族配體”意思是指能夠與TNFR受體家族的成員結(jié)合并且誘發(fā)配體/受體信號傳導(dǎo)途徑的天然的、重組的或合成的配體。TNF配體家族的成員包括但是不局限于TNFR-6α和TNFR-6β配體，TNF-α，淋巴毒素-α(LT-α，也稱為TNF-β)，LT-β，F(xiàn)asL，CD40，CD27，CD30，4-1BB，OX40，TRAIL，AIM-II，神經(jīng)生長因子(NGF)。配方和施與方式考慮到每個患者的臨床狀況(特別是單獨用TNFR-6α或TNFR-6β多肽治療的副反應(yīng))、TNFR多肽組合物的運送位置、施與方式、免疫計劃以及實施者已知的其它因素，TNFR多肽組合物將以與良好的醫(yī)療實踐相同的方式被配制或給藥。用于本文的TNFR多肽的“有效量”意思是在這些考慮的基礎(chǔ)上做出的。
作為一個普通建議，通過腸道外途徑施與的TNFR多肽的每次服藥的總藥物學(xué)有效劑量的范圍將是大約病人體重的1微克/公斤/天至10毫克/公斤/天，盡管如上所述此劑量根據(jù)治療的情況而變化。更優(yōu)選此劑量是至少0.01毫克/公斤/天，對于人來說最優(yōu)選的激素的劑量是大約0.01到1毫克/公斤/天。如果持續(xù)給藥，TNFR多肽典型以大約1微克/公斤/小時到大約50微克/公斤/小時的劑量比率被施與，每天注射1到次或持續(xù)性皮下輸液，例如使用微泵。靜脈內(nèi)液體也可使用。觀察變化需要的治療時間長度和治療后等待應(yīng)答發(fā)生的間隔根據(jù)所希望的效果而變化。
待施與的本發(fā)明的組合物的有效劑量可通過本領(lǐng)域熟練技術(shù)人員眾所周知的方法確定，所要考慮的參數(shù)包括生物學(xué)半衰期，生物利用度和毒性。這樣的測定方法是完全在本領(lǐng)域熟練技術(shù)人員的能力范圍之內(nèi)的，特別是根據(jù)文中所提供的詳細描述。
在治療過程中有機體的TNFR-6α或TNFR-6β生物暴露度在決定治療學(xué)和/或藥物學(xué)有效的劑量策略中起重要作用。劑量的變化例如在相當(dāng)長的一段時間內(nèi)重復(fù)施與相對低劑量的TNFR-6α或TNFR-6β多肽所取得的治療效果在治療學(xué)上和/或藥物學(xué)上都與在相對短的一段時間內(nèi)重復(fù)施與相對高劑量的TNFR-6α或TNFR-6β多肽所取得的治療效果不同。
使用由Freireich，E.J.等(癌癥化療報告50(4)219-44(1996))提供的相等的表面積劑量換算因子，本領(lǐng)域普通技術(shù)人員可以很方便地將從在一個給定的實驗系統(tǒng)中使用TNFR-6α或TNFR-6β多肽獲得的數(shù)據(jù)換算成為將要在另一個實驗系統(tǒng)中施與的每次服藥的TNFR-6α或TNFR-6β多肽藥物學(xué)有效劑量的精確估計。通過向小鼠施與TNFR6-Fc(見，例如實施例21)所獲得的實驗數(shù)據(jù)可通過由Freireich，E.J.等所提供的換算因子換算成為在大鼠、狗、猴子和人中TNFR-6的精確的藥物學(xué)有效劑量。下面的換算表是對Freireich，E.J.等所提供的數(shù)據(jù)的總結(jié)。表IV列出了劑量換算的大致因子，其表述方式是在一個動物物種中毫克/公斤到另一動物物種以毫克/公斤表示的相同表面積劑量。
表IV相同表面積劑量轉(zhuǎn)換因子到小鼠 大鼠猴子 狗 人來自于 (20克)(150克)(3.5公斤) (8公斤) (60公斤)小鼠 1 1/2 1/41/6 1/12大鼠 2 1 1/21/4 1/7猴子 4 2 1 3/5 1/3狗 6 4 5/311/2人 127 3 21因此，例如，使用表IV中提供的換算因子，在小鼠中50毫克/公斤的劑量在猴子中換算成為大約12.5毫克/公斤的劑量，因為(50毫克/公斤)×(1/4)＝12.45毫克/公斤。作為另外的一個例子，在小鼠中0.02，0.08，0.8，2和8毫克/公斤的劑量分別等于在人體內(nèi)1.667微克/公斤，6.67微克/公斤，66.7微克/公斤，166.7微克/公斤，和0.667毫克/公斤。
本發(fā)明的TNFR-6α和/或TNFR-6β多肽可使用本領(lǐng)域已知的任何一種方法被施與，包括但是不局限于在運送位點直接注射、靜脈注射、局部施與、導(dǎo)管輸液、biolistic injectors、粒子加速、可吸收明膠海綿積存、其它商用積存材料、外科手術(shù)或氣溶膠運送時傾析或局部使用。這樣的方法是本領(lǐng)域已知的。本發(fā)明的TNFR-6α和/或TNFR-6β多肽也可作為藥物組合物的一部分被施與，下面詳細描述了這一點。運送本發(fā)明的TNFR-6α和/或TNFR-6β多核苷酸的方法是本領(lǐng)域已知的并且在文中更詳細地，描述了這些方法。
含有本發(fā)明TNFR的藥物組合物可通過口服、直腸內(nèi)、非胃腸道途徑、腦池內(nèi)、陰道內(nèi)、腹膜內(nèi)、局部(作為粉末，油膏，滴液或經(jīng)皮的貼片)，向頰或作為口或鼻噴霧劑途徑施與?！八幬飳W(xué)可接受的”意思是指無毒的固體、半固體或液體填充劑、稀釋劑、膠囊化材料或任何類型的輔助劑型。如果需要的話，組合物也可含有少量的加濕劑、乳化劑或pH緩沖劑。這些組合物可以采用溶液、懸液、乳劑、藥片、藥丸、膠囊、粉末、持久釋放的劑型以及類似劑型。術(shù)語“非胃腸道途徑”，如文中所述，是指一種施與方式包括靜脈、肌內(nèi)、腹膜內(nèi)、胸骨內(nèi)、皮下和關(guān)節(jié)內(nèi)注射和輸液。
TNFR多肽也可通過持久釋放的系統(tǒng)被施與。持久釋放的組合物的合適的例子包括合適的聚合物材料(例如，以有形狀的物品形式存在的半滲透性的聚合物基質(zhì)，如膠片或微膠囊)，合適的疏水材料(例如以在認可的油中的乳劑的形式)或離子交換樹脂，以及少量的可溶性衍生物(例如，少量的可溶性鹽)。
持久釋放的基質(zhì)包括聚交酯(美國專利號3773919；EP 58481)，L-谷氨酸和γ-乙基-L-谷氨酸的共聚物(Sidman，U.等，生物聚合物22547-556(1983))，聚(2-羥乙基甲基丙烯酸酯)(R.Langer等，生物醫(yī)學(xué)材料研究期刊15167-277(1981)，和R.Langer等，化學(xué)技術(shù)1298-105(1982))，乙烯基乙酸酯(R.Langer等，Id.)或聚-D-(-)-3-羥丁酸(EP 133988)。
持久釋放的組合物也包括脂質(zhì)體包裹的本發(fā)明的組合物(見，Langer，科學(xué)2491527-1533(1990)；Treat等，在治療傳染性疾病和癌癥中的脂質(zhì)體，Lopez-Berestein和Fidler編，利茲出版社，紐約，317-327頁和353-365頁(1989))。包含有TNFR多肽的脂質(zhì)體可以通過已知的方法制備，參見DE3218121；Epstein等，Proc.Natl.Acad.Sci.(USA)823688-3692(1 985)；Hwang等，Proc.Natl.Acad.Sci.(USA)774030-4034(1980)；EP52322；EP36676；EP88046；EP143949；EP142641；日本專利申請?zhí)?3-118008；美國專利號4485045和4544545；和EP102324。通常，脂質(zhì)體是小的(大約200-800埃)單層形式，其中脂類內(nèi)容物多于大約30摩爾百分比的膽固醇，用于最佳的TNFR多肽治療的選擇的部分。
在一個另外的實施方案中，本發(fā)明的組合物是通過泵運送的(見Langer，supra；Sefton，CDC生物醫(yī)學(xué)工程參考標準14201(1987)；Buchwald等，外科學(xué)88507(1980)；Saudek等，新英格蘭醫(yī)學(xué)期刊321574(1989))。
在Langer(科學(xué)2491527-1533(1990))的綜述中討論了其它的可控制的釋放系統(tǒng)。
對于腸道外途徑施與藥物來說，在一個實施方案中，TNFR多肽是通過在我們所希望的純度上，以單位劑量可注射的形式(溶液，懸液或乳劑)，將其與藥物學(xué)可接受的載體即在實施劑量和濃度上對受體無毒并且與劑型組成中其它成分相容的載體混合而配置的。例如，配方中優(yōu)選不包括氧化試劑和其它已知對多肽有害的化合物。
通常情況下，劑型是通過將TNFR多肽與液體載體或精細分開的固體載體或二者均一地和緊密地作用而制備的。然后，如果需要的話，產(chǎn)品被賦予一定的形狀成為我們所希望的劑型。優(yōu)選的載體是非胃腸道載體，更優(yōu)選的載體是與受體血液等滲的溶液。這樣的載體運送工具的例子包括水、鹽、林格注射液、和葡萄糖溶液。非水載體例如固體油和乙基油酸鹽以及脂質(zhì)體也是有用的載體。
載體最好含有少量添加劑例如增加等滲性和化學(xué)穩(wěn)定性的物質(zhì)。這樣的物質(zhì)在實施劑量和濃度是對受體無毒的，并且包括緩沖液如磷酸、檸檬酸、琥珀酸、醋酸和其它有機酸以及它們的鹽；抗氧化劑例如抗壞血酸；低分子量(少于大約10個殘基)多肽，例如聚精氨酸或三肽；蛋白質(zhì)，例如血清白蛋白，明膠或免疫球蛋白；親水性聚合物例如聚乙烯吡咯酮；氨基酸，例如甘氨酸、谷氨酸、天冬氨酸、或精氨酸；單糖，雙糖和其它碳水化合物包括纖維素或其衍生物，葡萄糖，甘露糖或糊精；螯合試劑如EDTA；糖醇例如甘露醇或山梨糖醇；反離子例如鈉；和/或非離子性表面活性劑例如聚山梨醇、泊洛沙姆或PEG。
TNFR多肽典型地以大約0.1毫克/毫升到100毫克/毫升，優(yōu)選1-10毫克/毫升的濃度在pH值3到8之間被配制到這樣的運送工具中。需要明白的是，使用前述的賦形劑、載體或穩(wěn)定劑將會導(dǎo)致TNFR多肽鹽的形成。
將要被用于治療性施與的TNFR多肽必須是無菌的。通過無菌濾膜(例如，0.2微米濾膜)過濾很容易達到無菌要求。治療性TNFR多肽組合物通常被置于一個帶有無菌開口的容器中，例如靜脈注射液貯存袋或帶有可被皮下注射針穿透的塞子的藥瓶。
TNFR多肽通常以單位貯存或多劑量容器中貯存例如密封的安瓿瓶或藥瓶，以水溶液的形式或以用于恢復(fù)的凍干劑型貯存的。作為凍干劑型的一個例子，10毫升藥瓶里裝了5毫升無菌過濾的1％(重量/體積比)TNFR多肽水溶液，并且此產(chǎn)物混合物被凍干。待輸入液體是通過用抑菌注射水恢復(fù)凍干的TNFR多肽而制備的。
本發(fā)明也提供了一種包含一個或多個裝有一種或多種本發(fā)明藥物組合物成分的容器中的藥物學(xué)包裝或試劑盒。這樣的容器包含一由政府機構(gòu)簽發(fā)的調(diào)控藥物或生物制品生產(chǎn)、使用或銷售的通知，它反應(yīng)了政府機構(gòu)對施與人體的制品的生產(chǎn)、銷售或使用的許可。此外，本發(fā)明多肽可與其它治療性化合物組合使用。
本發(fā)明的組合物可被單獨施與或與其它治療試劑組合施與，包括但不局限于化療試劑、抗機會感染試劑、抗病毒藥、抗生素、類固醇或非類固醇消炎藥、免疫抑制劑、傳統(tǒng)的免疫治療試劑和細胞因子。組合使用的試劑可同時施與例如作為混合物，單獨但是立即或同時施與，或連續(xù)施與。這包括組合的試劑作為混合物一起施與的呈遞方式和組合的試劑分別施與但是同時給藥的方法，例如，通過不同的靜脈進入同一人體。“組合”施與另外包括單獨施與一種化合物或試劑，然后施與另外一種。
在一個實施方案中，本發(fā)明的組合物與TNF家族的其它成員組合施與到體內(nèi)。可與本發(fā)明的組合物一起施與的TNF、TNF相關(guān)的或TNF樣分子包括但不局限于TNF-α的可溶性形式、淋巴毒素-α(LT-α，也稱為TNF-β)、LT-β(在LT-α2-β異源三聚體復(fù)合物中發(fā)現(xiàn))、OPGL、CD27L、CD30L、CD40L、4-1BBL、DcR3、OX40L、TNF-γ(國際申請公開號WO 96/14328)、AIM-I(國際申請公開號WO 97/33899)、AIM-II(國際申請公開號WO 97/34911)、APRIL(實驗醫(yī)學(xué)，188(6)1185-1190)、因子α(國際申請公開號WO98/07880)、OPG和神經(jīng)因子α(國際申請公開號WO 98/18921)、TWEAK、OX40、和神經(jīng)生長因子(NGF)、和Fas的可溶性形式、CD30、CD27、CD40、和4-1BB、TR2(國際申請公開號WO96/34095)、DR3(國際申請公開號WO 97/33904)、DR4(國際申請公開號WO98/32856)、TR5(國際申請公開號WO 98/30693)、TR7(國際申請公開號WO 98/41629)、TRANK、TR9(國際申請公開號WO98/56892)、TR10(國際申請公開號WO 98/54202)、312C2(國際申請公開號WO 98/06842)和TR12。
可與本發(fā)明的組合物一起施與的傳統(tǒng)的非特異性免疫抑制試劑包括但不局限于類固醇、環(huán)孢菌素類似物、環(huán)磷酰胺甲基強的松、強的松、硫唑嘌呤、FK-506、15-deoxyspergualin和其它通過抑制應(yīng)答T細胞的功能而起抑制作用的免疫抑制劑。
在特定的實施方案中，本發(fā)明的組合物可與免疫抑制劑組合施與。可與本發(fā)明的組合物一起施與的免疫抑制劑制備物包括但不局限于ORTHOCLONETM(OKT3)、SANDIMMUNETM/NEORALTM/SANGDYATM(頭孢菌素)、PROGRAFTM(tacrolimus)、CELLCEPTTM(麥考酚鹽)、硫唑嘌呤、糖類固醇和RAPAMUNETM(sirolimus)。在一個特定的實施方案中，免疫抑制劑被用于預(yù)防器官或骨髓移植排斥。
在某些實施方案中，本發(fā)明的組合物可與抗逆轉(zhuǎn)錄病毒試劑、核苷逆轉(zhuǎn)錄酶抑制劑、非核苷逆轉(zhuǎn)錄酶抑制劑和/或蛋白酶抑制劑組合施與?？膳c本發(fā)明的組合物一起施與的核苷逆轉(zhuǎn)錄酶抑制劑包括但不局限于RETROVIRTM(疊氮胸苷/AZT)、VIDEXTM(didanosine/DDZ)、HIVIDTM(zalcitabine/ddC)、ZERITTM(stavudine/d4T)、EPIVIRTM(lamivudine/3TC)和COMBIVIRTM(疊氮胸苷/lamivudine)?？膳c本發(fā)明的組合物一起施與的非核苷逆轉(zhuǎn)錄酶抑制劑包括但不局限于VIRAMUNETM(nevirapine)、RESCRIPTORTM(delvuirdine)、和SUSTIVATM(efavirenz)?？膳c本發(fā)明的組合物一起施與的蛋白酶抑制劑包括但不局限于CRIXIVANTM(indinavir)、NORVIRTM(vitonavir)、INVIRASETM(saquinavir)和VIRACEPTTM(nelfinavir)。在一個特定的實施方案中，核苷逆轉(zhuǎn)錄酶抑制劑和/或蛋白酶抑制劑可與本發(fā)明組合物任意組合用于治療AIDS和/或預(yù)防或治療HIV感染。
在其它的實施方案中，本發(fā)明的組合物可與抗機會感染試劑組合施與?？膳c本發(fā)明的組合物一起施與的抗機會感染試劑包括但不局限于TRIMETHOPRIM-SULFAMETHIXAZOLETM、DAPSONETM、PENTAMIDINETM、ATOVAQUONETM、ISONIAZIDTM、RIFAMPINTM、PYRAZINAMIDETM、ETHAMBUTOLTM、RIFABUTINTM、CLARITHROMYCINTM、AZITHROMYCINTM、GANCICLOVIRTM、FOSCARNETTM、CIDOFOVIRTM、FLUCONAZOLETM、TMITRACONAZOLETM、KETOCONAZOLETM、ACYCLOVIRTM、FAMCICOLVIRTM、PYRIMETHAMINETM、LEUCOVORINTM、NEUPOGENTM(filgrastim/C-GSF)和LEUKINETM(sargramostim/GM-CSF)。在一個特定的實施方案中，本發(fā)明的組合物可與TRIMETHOPRIM-SULFAMETHIXAZOLETM、DAPSONETM、PENTAMIDINETM和/或ATOVAQUONETM任意組合使用預(yù)防性治療或預(yù)防卡氏肺囊蟲機會感染。在另一個特定的實施方案中，本發(fā)明的組合物可與RIFABUTINTM、CLARITHROMYCINTM和/或AZITHROMYCINTM任意組合使用預(yù)防性治療或預(yù)防結(jié)核桿菌機會感染。在另一個特定的實施方案中，本發(fā)明的組合物可與GANCICLOVIRTM、FOSCARNETTM和/或CIDOFOVIRTM任意組合使用預(yù)防性治療或預(yù)防巨細胞病毒機會感染。在另一個特定的實施方案中，本發(fā)明的組合物可與FLUCONAZOLETM、ITRACONAZOLETM和/或KETOCONAZOLETM任意組合使用預(yù)防性治療或預(yù)防真菌機會感染。在另一個特定的實施方案中，本發(fā)明的組合物可與ACYCLOVIRTM和/或FAMCICOLVIRTM任意組合使用預(yù)防性治療或預(yù)防單純皰疹病毒I型和/或II型機會感染。在另一個特定的實施方案中，本發(fā)明的組合物可與PYRIMETHAMINETM和/或LEUCOVORINTM任意組合使用預(yù)防性治療或預(yù)防鼠弓形體機會感染。在另一個特定的實施方案中，本發(fā)明的組合物可與LEUCOVORINTM和/或NEUPOGENTM任意組合使用預(yù)防性治療或預(yù)防機會性細菌感染。
在另一實施方案中，本發(fā)明的組合物可與抗病毒劑組合施與?？捎诒景l(fā)明的組合物一起施與的抗病毒劑包括但不限于無環(huán)鳥苷(acyelovir)，三唑核苷(ribavirin)，金剛烷胺和remantidine。
在其它的實施方案中，本發(fā)明的組合物可與抗生素試劑組合施與?？膳c本發(fā)明的組合物一起施與的抗生素試劑包括但不局限于羥氨芐青霉素、氨基糖苷、β-內(nèi)酰胺酶(糖肽)、克林霉素、氯霉素、頭孢菌素、環(huán)丙沙星、紅霉素、氟喹啉、大環(huán)內(nèi)酯物、甲硝唑、青霉素、喹啉、利福平、鏈霉素、磺胺、四環(huán)素、甲氧芐啶、甲氧芐啶-磺胺甲惡唑和萬古霉素。
在另外的一個實施方案中，本發(fā)明的組合物可單獨施與或與一種抗炎癥試劑組合施與?？膳c本發(fā)明的組合物一起施與的抗炎癥試劑包括但不局限于糖皮質(zhì)類固醇和非類固醇抗炎癥試劑、氨芳基羧酸衍生物、arylacetic酸衍生物、pyrazoles、吡唑啉、水楊酸衍生物、噻嗪羧胺、e-對乙酰己酸、s-腺苷甲硫氨酸、3-氨基-4-羥丁酸、amixatrine、芐達酸、芐達明、nimesulide、奧古蛋白、oxaceprol、paranyline、perisoxal、pifoxime、普羅喹宗、普羅沙唑和tenidap。
在另外的一個實施方案中，本發(fā)明的組合物與一種化療試劑組合施與?？膳c本發(fā)明的組合物一起施與的化療試劑包括但不局限于抗生素衍生物(例如阿霉素、博來霉素、柔紅霉素、放線菌素)；抗雌性激素(例如他黃昔芬)；抗代謝物(例如氟尿嘧啶、5-FU、氨甲喋呤、氟尿苷、干擾素α-2b、谷氨酸、光輝霉素、樂疾寧和6-硫鳥嘌呤)；細胞毒性試劑(例如卡氮芥、BCNU、羅氮芥、CCNU、阿拉伯糖胞嘧啶、環(huán)磷酰胺、雌氮芥、羥基脲、丙卡巴肼、絲裂霉素、百消安、順鉑和硫酸長春新堿)；激素(例如甲羥孕酮、雌氮芥磷酸鈉、雌二醇、甲地孕酮、甲睪酮、乙烯雌酚、二瞵酸鹽、氯烯雌醚和睪酮)；氮芥衍生物(例如meohalen、chorambucil、氮芥和塞替派)；以及其它(例如dizarbazine、天冬酰胺酶、米托坦、硫酸長春新堿、硫酸長春堿以及依托泊甙)。
在一個特定的實施方案中，本發(fā)明的組合物與CHOP(環(huán)磷酰胺、阿霉素、長春新堿和強的松)或CHOP成分的任何一種組合一起組合施與。在另一個實施方案中，本發(fā)明的組合物與Rituximab一起施與。。在另外的實施方案中，本發(fā)明的組合物與Rituximab和CHOP或Rituximab和CHOP的成分任意組合一起施與體內(nèi)。
在另外的一個實施方案中，本發(fā)明的組合物與細胞因子組合施與。可與本發(fā)明的組合物一起施與的細胞因子包括但不局限于GM-CSF、G-CSF、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-10、IL-12、IL-13、IL-15、抗CCD40、CD40L、IFN-α、IFN-β、IFN-γ、TNF-α和TNF-β。在另一個實施方案中，本發(fā)明的組合物可與任何一種白細胞介素一起施與包括但不局限于IL-1、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-9、IL-10、IL-11、IL-12、IL-13、IL-14、IL-15、IL-16、IL-17、IL-18、IL-19、IL-20和IL-21。在一個優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明的組合物與TNF-α組合施與。在另一個優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明的組合物與IFN-α組合施與。
在另外的實施方案中，本發(fā)明的組合物與血管生成蛋白一起組合施與?？膳c本發(fā)明的組合物一起施與的血管生成蛋白包括但不局限于神經(jīng)膠質(zhì)瘤來源的生長因子(GDGF)，如在歐洲專利號EP-399816中所述；血小板來源的生長因子-A(PDGF-A)，如在歐洲專利號EP-682110中所述；血小板來源的生長因子-B(PDGF-B)，如在歐洲專利號EP-282317中所述；胎盤生長因子(PIGF)，如在國際申請公開號WO 92/06194中所述；胎盤生長因子-2(PIGF-2)，如在Hauser等，生長因子4259-268(1993)中所述；血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)，如在國際申請公開號WO 90/13649中所述；血管內(nèi)皮生長因子A(VEGF-A)，如在歐洲專利號EP-506477中所述；血管內(nèi)皮生長因子2(VEGF-2)，如在國際申請公開號WO96/39515中所述；血管內(nèi)皮生長因子B-186(VEGF-B186)，如在國際申請公開號WO96/26736中所述；血管內(nèi)皮生長因子D(VEGF-D)，如在國際申請公開號WO98/02543中所述；血管內(nèi)皮生長因子D(VEGF-D)，如在國際申請公開號WO98/07832中所述；血管內(nèi)皮生長因子E(VEGF-E)，如德國專利號DEl9639601中所述；上面提到的參考文獻引入本文做參考。
在另外的實施方案中，本發(fā)明的組合物與成纖維生長因子組合施與?？膳c本發(fā)明的組合物一起施與的成纖維生長因子包括但不局限于FGF-1、FGF-2、FGF-3、FGF-4、FGF-5、FGF-6、FGF-7、FGF-8、FGF-9、FGF-10、FGF-11、FGF-12、FGF-13、FGF-14、FGF-15。
在另外的實施方案中，本發(fā)明的組合物與其它治療性或預(yù)防性方法組合施與，例如放療。染色體分析本發(fā)明的核酸分子在染色體鑒定中也是有用的。序列特異性定向至并與個體染色體的特定位置雜交。而且，現(xiàn)在有必要鑒定染色體的特定位置?，F(xiàn)在很少有基于實際序列(重復(fù)多形性)數(shù)據(jù)的染色體標記試劑可用于焦急染色體位置。根據(jù)本發(fā)明給染色體做DNA圖譜是將那些序列與疾病相關(guān)的基因聯(lián)系起來的重要的第一步。
在某些優(yōu)選的實施方案中，就這一點而言，文中所述的cDNAs被用于TNFR蛋白基因的基因組DNA。這可以通過使用各種不同的眾所周知的技術(shù)以及商業(yè)上普遍有售的文庫來完成。然后基因組DNA被用于原位染色體圖譜。
此外，在一些情況下，序列可通過從cDNA中制備PCR引物(優(yōu)選15-25bp)被繪制倒染色體圖譜上去。對基因3’端未翻譯區(qū)的計算機分析被用于快速選擇在基因組DNA中并不跨越多于一個外顯子的引物，因此，使擴增過程復(fù)雜化。然后這些引物被用于PCR篩選含有個體染色體的體細胞雜交體。cDNA克隆與一個中期染色體涂片進行的熒光原位雜交(“FISH”)可被用于在一步之內(nèi)提供精確的染色體位置。此技術(shù)可與來自cDNA的短至50-60bp的探針一起使用。這項技術(shù)的綜述，見Verma等，人類染色體基本技術(shù)手冊，Pergamon出版社，紐約(1988)。
一旦一段序列被定位至精確的染色體位置，此序列在染色體上的物理位置就可與基因圖譜數(shù)據(jù)聯(lián)系起來。這些數(shù)據(jù)可見如V.McKusick，人體中的孟德爾遺傳，可通過約翰霍普金斯大學(xué)Welch醫(yī)學(xué)圖書館從網(wǎng)上查閱。已經(jīng)被定位至相同染色體區(qū)域上的基因與疾病就可通過聯(lián)系分析(物理相鄰基因的共遺傳)而鑒定。
接著，有必要測定受影響的個體和未受影響的個體的cDNA或基因組序列的差異。如果在一些或全部受到影響的個體中觀察到突變而不是在任何一個普通個體中，那么此突變可能是疾病的致病因素。
已經(jīng)概括描述了本發(fā)明，通過參考下列的實施例將會更易于理解本發(fā)明，這些實施例是以舉例說明的方式提供的，其意并不在于限制本發(fā)明。實施例實施例1TNFR-6α和TNFR-6β在大腸桿菌中的表達和純化細菌表達載體pQE60被用于本實施例中的細菌表達(QIAGEN公司，9259 Eton大街，Chatsworth，加州，91311)。pQE60編碼氨芐青霉素抗性(“Ampr”)和含有一個細菌的復(fù)制起始子(“Ori”)，一個IPTG誘導(dǎo)的啟動子，一個核酶結(jié)合位點(“RBS”)，6個編碼組氨酸殘基的密碼子，這6個組氨酸允許使用QIAGEN公司所售的次氮基三乙酸鎳(“Ni-NTA”)親和層析樹脂進行親和純化，和合適的單一的限制性酶切位點。安排這些成分以使得編碼多肽的DNA片段被以這樣的方式插入以致于產(chǎn)生在多肽的羧基末端共價連接有6個組氨酸殘基(即“6×His標記”)的多肽。但是，在此實施例中，插入多肽編碼序列以使得6個組氨酸密碼子的翻譯受到抑制，因此，所產(chǎn)生的多肽是不帶有6×His標記的。
編碼含有成熟形式TNFR-6α和TNFR-6β序列的我們所希望的TNFR-6α和TNFR-6β蛋白部分的DNA序列是使用與TNFR-6α和TNFR-6β蛋白目的部分的氨基末端序列以及與保藏的構(gòu)建物中3’端至cDNA編碼序列之間的序列退火的PCR寡核苷酸引物從保藏的cDNA克隆中擴增出來的。另外的含有限制性位點以促進在pQE60眾克隆的核苷酸被分別加入到序列的5’和3’端。
為克隆成熟形式的TNFR-6α蛋白，5’端引物具有含有下劃線表示的NcoI限制性位點的序列5’-CGCCCATGGCAGAAACACCCACCTAC-3’(SEQ ID NO19)。當(dāng)然本領(lǐng)域普通技術(shù)人員應(yīng)該明白在蛋白質(zhì)編碼序列中5’引物開始的位點可被改變以擴增短于或長于成熟形式的完整蛋白的目的部分。3’端引物具有含有下劃線表示的HindIII限制性位點的5’-CGCAAGCTTCTCTTTCAGTGCAAGTG-3’(SEQ ID NO20)序列。為克隆成熟形式的TNFR-6β蛋白，5’引物具有上面SEQ ID NO19的序列，3’端引物具有含有下劃線表示的HindIII限制性位點的5’-CGCAAGCTTCTCCTCAGCTCCTGCAGTG-3’(SEQ ID NO21)序列。
用NcoI和HindIH消化擴增的TNFR-6α和TNFR-6βDNA片段和pQE60載體，然后將它們連接在一起。TNFR-6α和TNFR-6βDNA插入倒限制性酶切的pQE60載體中，將包括它相關(guān)的終止密碼子的TNFR-6α和TNFR-6β蛋白編碼序列置于IΠTH誘導(dǎo)型啟動子的下游，并且位于讀碼框內(nèi)帶有起始密碼子AUG。相關(guān)的終止密碼子阻止插入位點下游的6個組氨酸密碼子的翻譯。
使用標準的方法，例如在Sambrook等，分子克隆，實驗室手冊，第二版，冷泉港實驗室，冷泉港，紐約(1989)中所描述的方法用連接混合物轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌細胞。含有多個拷貝的表達lac抑制子并且轉(zhuǎn)移卡那霉素抗性(“Kanr”)的pREP4質(zhì)粒的大腸桿菌M15/rep4菌株被用于實施文中所述的實施例。此菌株只是許多適于表達TNFR-6α和/或TNFR-6β蛋白的菌株中的一種，可購自QIAGEN公司。可根據(jù)其具有在含有氨芐青霉素和卡那霉素的LB平板上生長的能力而鑒定轉(zhuǎn)化株。從抗性克隆中分離質(zhì)粒DNA，并且使用限制性分析、PCR和DNA測序?qū)寺〉腄NA進行確認鑒定。
含有目的構(gòu)建物的克隆在含有氨芐青霉素(100微克/毫升)和卡那霉素(25微克/毫升)的LB液體培養(yǎng)基中過夜(“O/N”)，O/N培養(yǎng)物用于以大約1∶25-1∶250的稀釋度接種大的培養(yǎng)物。細胞生長至600納米光密度值(“OD600”)至0.4-0.6時，加入異丙基-β-D硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)至終濃度為1mM，以通過使lacI抑制子失活的方式從lac抑制子敏感的啟動子誘導(dǎo)轉(zhuǎn)錄。隨后細菌被繼續(xù)培養(yǎng)3-4小時，離心收集細菌。
為純化TNFR-6α和/或TNFR-6β多肽，然后將細胞置于pH8的6M鹽酸胍中4℃攪拌3-4小時。離心去除細胞殘渣，然后含有TNFR-6α和/或TNFR-6β的上清在加有200mM NaCl的pH6的50mM醋酸鈉緩沖溶液中透析。另外，在含有蛋白酶抑制劑的500mM NaCl、20％甘油、25mM Tris/HCl pH7.4的透析液眾透析可使蛋白質(zhì)成功折疊。復(fù)性后蛋白質(zhì)可通過離子交換、疏水性相互作用和分子大小排阻層析而純化。另外，一種親和層析步驟例如抗體柱可被用于獲取純的TNFR-6α和/或TNFR-6β蛋白。純化的蛋白在4℃保存或在-80℃凍存。
當(dāng)表達產(chǎn)物以包涵體形式存在時，下列替代方法可被用于純化大腸桿菌表達的TNFR-6α或TNFR-6β。除非另做說明，所有下列步驟都是在4-10℃實施的。
完成大腸桿菌發(fā)酵的生產(chǎn)期后，細菌培養(yǎng)物被冷卻至4-10℃，然后通過1500轉(zhuǎn)連續(xù)離心收獲細菌(Heraeus Sepatech)。根據(jù)我們所希望的每單位重量細胞糊的蛋白產(chǎn)量和所要求的純化的蛋白的數(shù)量，合適數(shù)量的細胞糊重懸于含有100mM Tris，50mM EDTA，pH7.4的緩沖溶液中，使用高剪切混合器細菌被分散成為均一的懸液。
在4000-6000psi時，將細胞通過microfluidizer(Microfluidics公司或APV Gaulin公司)兩次以裂解細胞。均一溶液與NaCl溶液混合至NaCl終濃度為0.5M，然后7000×g離心15分鐘。使用0.5M NaCl，100mM Tris，50mM EDTA，pH7.4溶液洗滌沉淀。
使用1.5M鹽酸胍(GnHCl)溶解洗滌過的產(chǎn)物包涵體2-4小時，7000×g離心15分鐘后，棄去沉淀，將含有TNFR-6α或TNFR-6β多肽的上清置于4℃過夜以允許進一步GnHCl提取。
高速(30000×g)離心去除不溶的顆粒后，通過將GnHCl提取物與20倍體積的含有50mM鈉，pH4.5，150mM NaCl，2mM EDTA的緩沖液快速混合劇烈振蕩，GnHCl溶解的蛋白進行再折疊。再折疊的稀釋的蛋白溶液在進行下一步純化之前4℃靜置12小時。
為澄清再折疊的TNF受體多肽溶液，使用了一種事先制備的用pH6.0的40mM醋酸鈉溶液平衡過的帶有0.16微米合適表面面積濾膜的濾器。過濾后的樣品被裝載到陽離子交換樹脂(例如，PorosHS-50，前景生物系統(tǒng))上，用pH6.0的40mM醋酸鈉溶液洗滌柱子，用含有250mM，500mM，1000mM和1500mM NaCl的同樣溶液逐步洗脫柱子。連續(xù)監(jiān)測洗脫流出液在280納米波長的吸收值。收集各個部分進一步用SDS-PAGE分析。
混合含有TNF受體多肽的各部分并且與4倍體積的水混合。稀釋的樣品然后被裝載到事先制備的強陰離子(Poros HS-50，前景生物系統(tǒng))上，用pH6.0的40mM醋酸鈉溶液平衡柱子。兩柱子都是用pH6.0的40mM醋酸鈉，200mM NaCl溶液洗滌。然后用10倍體積的從pH6.0的0.2M NaCl，50mM醋酸鈉溶液到1.0MNaCl，50mM醋酸鈉溶液線形梯度洗脫CM-20柱。連續(xù)監(jiān)測洗脫流出液在280納米波長的吸收值，收集各個部分?；旌虾蠺NFR-6α或TNFR-6β(例如通過10％SDS-PAGE測定)的部分。
經(jīng)過上述的再折疊和純化步驟后，產(chǎn)物TNFR受體肽的純度在95％以上。當(dāng)上樣5微克純化的蛋白時，考馬斯亮藍染色的16％SDS-PAGE凝膠眾并未觀察倒主要的污染條帶。也檢測純化的蛋白的內(nèi)毒素/LPS污染情況，根據(jù)LAL分析通常LPS含量在0.1納克/毫升以下。實施例2在桿狀病毒表達系統(tǒng)中克隆和表達TNFR-6α和TNFR-6β
在此實施例中，通過使用在Summers等，桿狀病毒載體和昆蟲細胞培養(yǎng)方法技術(shù)手冊，德克薩斯農(nóng)業(yè)實驗站編號1555(1987)中所描述的標準方法，質(zhì)粒穿梭載體pA2被用于將編碼包括其天然相關(guān)的分泌信號(前導(dǎo))的完整蛋白的克隆的DNA插入到桿狀病毒中以表達成熟的TNFR-6α或TNFR-6β蛋白。這種表達載體包含Autographa California核形多角體病毒(AcMNPV)的強的多角體啟動子，隨后是方便的限制性酶切位點如BamHI，XbaI和Asp718。猴病毒40(“SV40”)的多聚腺苷酸化位點被用于有效的多聚腺苷酸化。為易于選擇重組病毒，質(zhì)粒含有一個受同一方向果蠅弱啟動子控制之下的來自大腸桿菌的β-半乳糖苷酶基因，隨后是多角體基因的多聚腺苷酸化信號。插入基因的兩個側(cè)翼區(qū)是病毒序列以與野生型病毒DNA通過細胞介導(dǎo)的同源重組產(chǎn)生表達克隆的核苷酸的活病毒。
許多其它的桿狀病毒載體也可被用于替換上述載體，例如pAc373，pVL941和pAcIMl，正如本領(lǐng)域熟練技術(shù)人員所明白的，只要構(gòu)建物提供了合適的轉(zhuǎn)錄、翻譯、分泌等信號，包括所必需的一段信號肽和框內(nèi)AUG。在Luckow等，病毒學(xué)17031-39(1989)眾描述了這樣的載體。
使用對應(yīng)于基因的5’和3’序列的PCR寡核苷酸引物從保藏的克隆中擴增了包括SEQ ID NO2或4所示的AUG起始密碼子和天然相關(guān)的前導(dǎo)序列在內(nèi)的編碼全長TNFR-6α或TNFR-6β蛋白的cDNA序列。TNFR-6α和TNFR-6β的5’端引物是具有含有下劃線表示的HindIII限制性位點的5’-CGCGGATCCGCCATCATGAGGGCGTGGAGGGGCACG-3’(SEQ ID NO22)序列。正如Kozak，M，分子生物學(xué)196947-950(1987)等所述的，所有前述引物編碼一種在真核細胞中起始翻譯的有效信號。TNFR-6α的3’端引物是具有含有下劃線表示的Asp718限制性位點的5’-CGCGGTACCCTCTTTCAGTGCAAGTG-3’(SEQ ID NO23)序列。TNFR-6β的3’端引物是具有含有下劃線表示的Asp718限制性位點的5’-CGCGGTACCCTCCTCAGCTCCTGCAGTG-3’(SEQ ID NO24)序列。
使用商用試劑盒(“Genedean”BIO 101公司，La Jolla，加州)從1％瓊脂糖凝膠中分離擴增的片段。然后對于所使用的每一條引物如上所述，用合適的限制性酶消化片段，再次用1％瓊脂糖凝膠純化。
用相同的限制性酶消化質(zhì)粒，并且任選利用本領(lǐng)域已知的常規(guī)技術(shù)使用小牛腸磷酸酶去磷酸化。然后使用商用試劑盒(“Genedean”BIO 101公司，La Jolla，加州)從1％瓊脂糖凝膠中回收DNA。
用T4 DNA連接酶將片段和去磷酸化的質(zhì)粒連接在一起。然后用連接混合物轉(zhuǎn)化大腸桿菌HB 101或其它合適的大腸桿菌宿主XL-1藍細胞(Stratagene克隆系統(tǒng)，La Jolla，加州)并且鋪平板。通過使用上面所用的酶鮮花單個克隆的DNA然后通過凝膠電泳分析酶切產(chǎn)物來鑒定含有帶有TNF人受體基因質(zhì)粒的細菌。通過DNA測序證實克隆片段的序列。這個質(zhì)粒在此命名為pA2-TNFR-6α/或pA2-TNFR-6β(統(tǒng)稱為pA2-TNFR)。
使用由Felgner等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 847413-7417(1987)中所述的脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染方法，5微克的pA2-TNFR質(zhì)粒與1.0微克的商用線形化的桿狀病毒DNA(“BaculoGoldTM桿狀病毒DNA”，Pharmingen，圣迭哥，加州)共轉(zhuǎn)染。1微克BaculoGoldTM桿狀病毒DNA和5微克pA2-TNFR質(zhì)粒在含有50微升無血清的Grace’s培養(yǎng)基(生命科技公司，Gaithersburgh，MD)微量滴定板的無菌孔中混合。然后，加入10微升lipofectin和90微升Grace’s培養(yǎng)基，混合并室溫孵育15分鐘。然后轉(zhuǎn)染混合液被逐滴加入倒種植在35毫米組織培養(yǎng)板中1毫升無血清Grace’s培養(yǎng)基中sf9昆蟲細胞(ATCC CRL 1711)中。然后，27℃孵育5小時。去除板中的轉(zhuǎn)染溶液然后加入1毫升含有10％小牛血清的Grace’s昆蟲細胞培養(yǎng)基，27℃連續(xù)培養(yǎng)4天。
4天后收集上清然后進行噬斑分析，如Summers和Smith，supra中所述的方法。帶有“BlueGal”(生命科技公司，Gaithersburgh，MD)的瓊脂糖凝膠被使用，使得易于鑒定和分離產(chǎn)生染色噬斑的gal表達克隆(在生命科技公司的昆蟲細胞培養(yǎng)和桿狀病毒學(xué)應(yīng)用手冊眾可以找到關(guān)于這種類型“噬斑分析”的詳細描述，第9-10頁)。適當(dāng)孵育后用槍尖挑出藍色噬斑。含有重組病毒的瓊脂被重懸于含有200微升Grace’s培養(yǎng)基的微量離心管內(nèi)，然后含有重組桿狀病毒的懸液被用于感染種植在35毫米培養(yǎng)皿上的sr9細胞。4天后收集上清并且4℃保存。
為證實TNF受體基因的表達，sf9細胞培養(yǎng)在含有10％熱滅活的胎牛血清的Grace’s培養(yǎng)基中。細胞被感染復(fù)數(shù)(“MOI”)為2的重組桿狀病毒所感染。如果需要放射性標記的蛋白，6小時以后去除培養(yǎng)基，加入不含甲硫氨酸和半胱氨酸(生命科技公司，Rockville，MD)的sf900 II培養(yǎng)基中。42小時后加入5微居35S標記的甲硫氨酸和5微居35S標記的半胱氨酸(Amersham)。再培養(yǎng)細胞16小時，然后離心收獲細胞。通過SDS-PAGE隨后進行放射自顯影(如果放射性標記)來分析上清中的蛋白質(zhì)以及細胞內(nèi)蛋白質(zhì)。
純化蛋白的氨基末端氨基酸序列的微量測序可被用于測定成熟形式TNF受體蛋白的氨基末端序列。實施例3在哺乳動物細胞中克隆和表達TNFR-6α和TNFR-6β典型的哺乳動物表達載體含有介導(dǎo)起始mRNA轉(zhuǎn)錄的啟動子成分，蛋白質(zhì)編碼序列和轉(zhuǎn)錄終止以及多聚腺苷酸化需要的信號。另外的成分包括增強子、Kozak序列和基因的兩端帶有用于RNA剪接的供受體位點的干預(yù)序列。高效轉(zhuǎn)錄可通過SV40的早期和晚期啟動子、逆轉(zhuǎn)露病毒例如RSV、HTLV1、HIV1的長末端重復(fù)序列(LTRs)和巨細胞病毒(CMV)的早期啟動子完成。但是也可以使用細胞成分(例如人的肌動蛋白啟動子)。合適的可用于實踐本發(fā)明的載體包括例如pSVL和pMSG(Pharmacia，Uppsala，瑞典)，pRSVcat(ATCC 37512)，pSV2dhfr(ATCC 37416)和pBC12M1(ATCC67109)?？杀皇褂玫牟溉閯游锼拗骷毎ㄈ薍ela，293，H9和Jurkat細胞，小鼠的NIH3T3和C127細胞，COS1，COS7和CV1，QC1-3細胞，小鼠L細胞和中國倉鼠卵巢細胞(CHO)。
另外，基因可在含有基因整合入染色體的穩(wěn)定細胞系中表達。與可選擇的標記例如dhfr，gpt，新霉素，潮霉素共轉(zhuǎn)染易于鑒定和分離轉(zhuǎn)染細胞。
轉(zhuǎn)染的基因也可被擴增以大量表達所編碼的蛋白質(zhì)。DHFR(二氫葉酸還原酶)標記在發(fā)展含有幾百甚至幾千個拷貝目的基因的細胞系中很有用。另一個有用的選擇標記是谷氨酰胺合成酶(GS)(Murphy等，生物化學(xué)期刊277“-279(1991)；Bebbington等，生物技術(shù)10169-175(1992))。使用這些標記，哺乳動物細胞在選擇行培養(yǎng)基中生長并且具有最強抗性的細胞被選擇出來。這些細胞含有整合進染色體的擴增的基因。中國倉鼠卵巢細胞(CHO)和NSO細胞也常被用于生產(chǎn)蛋白。
pC1和pC4表達載體含有勞氏肉瘤病毒的強啟動子(LTR)(Gullen等，分子和細胞生物學(xué)438-447(1985年3月))和CMV增強子片段(Boshart等，細胞41521-530(1985))。多克隆位點例如帶有限制性酶切位點BamHI，XbaI和Asp718促進了目的基因的克隆。載體另外含有3’內(nèi)含子、小鼠前胰島素原基因的多聚腺苷酸化信號和終止信號。實施例3(a)在COS細胞中的克隆和表達表達質(zhì)粒pTNFR-α-HA和pTNFR-6β-HA是通過將編碼成熟形式TNF受體蛋白的cDNA的一部分克隆入表達載體pcDNA I/Amp或pcDNA III(可從Invitrogen公司購買)中而構(gòu)建的。
pcDNA I/Amp表達載體含有(1)在大腸桿菌以及其它原核細胞中有效繁殖的大腸桿菌復(fù)制起始點；(2)用于篩選含有質(zhì)粒的原核細胞的氨芐青霉素抗性基因；(3)用于在真核細胞中繁殖的SV40復(fù)制起點；(4)CMV啟動子，多聚接頭和SV40內(nèi)含子；(5)編碼血凝素的片段(即，促進純化的“HA”標記)的幾個密碼子，其后是終止信號和多聚腺苷酸化信號，之所以這樣安排是因為DNA可被很方便地置于CMV啟動子的表達控制之下并且通過多聚接頭中的限制性酶切位點與SV40內(nèi)含子以及多聚腺苷酸化信號可操作連接。HA標記對應(yīng)于來源自流感血凝素蛋白的一個表位，Wilson等，細胞37767(1984)。HA標記與目的蛋白的融合使得應(yīng)用識別HA表位的抗體可以很容易地檢測到重組蛋白并且重組蛋白易于復(fù)性。pDNA III此外還含有新霉素選擇標記。
編碼全長TNF受體多肽的DNA片段被克隆到載體的多聚接頭區(qū)，以使得重組蛋白的表達受到CMV啟動子的控制。此質(zhì)粒構(gòu)建策略如下。使用含有方便的限制性酶切位點的引物擴增保藏克隆中的TNF受體DNA。
用Xba I和ExoR I消化PCR擴增的DNA片段以及pcDNA I/Amp載體，然后將它們連接，連接混合物轉(zhuǎn)化入大腸桿菌SURE菌株(Stratagene克隆系統(tǒng)有售，11099 North Pines Road，La Jolla，加州92037)，然后轉(zhuǎn)化的培養(yǎng)物涂布在含有氨芐青霉素的培養(yǎng)皿上培養(yǎng)以使氨芐青霉素抗性克隆生長。從抗性克隆中分離質(zhì)粒DNA并且通過限制性分析或其它方法檢測編碼TNFR-6α和TNFR-6β多肽的片段的存在。
為表達重組的TNFR-6和TNFR-6β，使用在例如Sambrook等，1990，分子克隆實驗指南，第二版，冷泉港實驗室，冷泉港，紐約(1989)中所述的DEAE-葡聚糖法用上述表達質(zhì)粒轉(zhuǎn)染COS細胞。細胞在利于表達TNFR的條件下培養(yǎng)。
利用例如Harlow等，抗體實驗室指南，第二版，冷泉港實驗室，冷泉港，紐約(1988)中所述的方法通過放射性標記和免疫沉淀檢測pTNFR-6α-HA和pTNFR-6β-HA融合蛋白的表達。為達到此目的，轉(zhuǎn)染后2天，細胞在含有3sS標記的半胱氨酸的培養(yǎng)基中標記8小時。然后收集細胞和培養(yǎng)基，洗滌細胞，然后用含有去垢劑的RIPA緩沖液150mM NaCl，1％NP-40，0.1％SDS，0.5％DOC，50mMTris，pH7.5裂解細胞，如同上文眾引用的Wilson等的描述。使用HA特異性的單克隆抗體將蛋白從細胞裂解液以及培養(yǎng)上清中沉淀下來。然后通過SDS-PAGE和放射自顯影分析沉淀的蛋白?？稍诩毎呀庖罕娪^察到預(yù)期大小的表達產(chǎn)物，陰性對照中則沒有。實施例3(b)在CHO細胞中的克隆和表達pC4載體被用于表達TNFR-6α和TNFR-6β多肽。pC4質(zhì)粒是pSV2-dhfr(ATCC 37146)質(zhì)粒的衍生物。質(zhì)粒含有SV40早期啟動子控制之下的小鼠DHFR基因。用這些質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的中國倉鼠卵巢細胞或其它缺少二氫葉酸活性的細胞可通過在加有化療試劑氨甲喋呤的選擇培養(yǎng)基(α-MEM，生命科技)中生長而被選擇出來。很多記載表明DHFR基因在氨甲喋呤(MTX)抗性的細胞中擴增見，例如Alt，F(xiàn).W.，Kellems，R.M.，Bertino，J.R.和Schimke，R.T.，生命的化學(xué)期刊2531357-1370；Hamlin，J.L.和Ma，C.，1990，生物化學(xué)和生物物理學(xué)報1097107-143；Page，M.J.和Sydenham，M.A.，1991，生物技術(shù)964-68)。在不斷增加的MTX濃度中生長的細胞由于DHFR基因過量擴增所產(chǎn)生的酶DHFR從而發(fā)展了對此藥物的抗性。如果另一種基因與DHFR基因連接，它也通常是被共擴增并且過量表達的。本領(lǐng)域已知此方法可被用于發(fā)展攜帶有1000個以上拷貝擴增基因的細胞系。隨后，當(dāng)去除氨甲喋呤時，獲得了含有擴增基因整合入宿主細胞一個或多個染色體的細胞系。
pC4質(zhì)粒含有例如目的基因，勞氏肉瘤病毒長末端重復(fù)序列(LTR)的強啟動子(Gullen等，分子和細胞生物學(xué)，1985年3月，38-447)和一個分離自人巨細胞病毒(CMV)立即早期基因增強子的片段(Boshart等，細胞41521-530(1985))，啟動子的下游是允許基因整合的下列單一的限制性酶切位點BamHI，XbaI和Asp718。在這些克隆位點之后質(zhì)粒含有3’內(nèi)含子和大鼠前胰島素原基因的多聚腺苷酸化位點。其它高效啟動子也可被用于表達，例如人-β-肌動蛋白啟動子、SV40早期或晚期啟動子或逆轉(zhuǎn)錄病毒如HIV和HTLV1的長末端重復(fù)序列。Clontech的Tet-off和Tet-on基因表達系統(tǒng)以及其它類似的系統(tǒng)可被用于以受調(diào)控的方式在哺乳動物細胞眾表達TNF受體多肽(Gossen，M和Bujard，，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 895547-5551(1992))。對mRNA的多聚腺苷酸化，其它信號例如來自人生長激素或珠蛋白基因的信號也可使用。攜帶整合入染色體中目的基因的穩(wěn)定細胞系也可通過與一種選擇性標記如gpt、G418或潮霉素共轉(zhuǎn)染二選擇出來。優(yōu)選在開始時使用一種以上的選擇標記，例如G418加氨甲喋呤。
使用對于擴增所選擇的TNF受體特異性引物合適的限制性酶消化pC4質(zhì)粒，然后通過本領(lǐng)域已知的技術(shù)用小牛腸磷酸酶對其去磷酸化。然后從1％瓊脂糖凝膠眾分離載體。使用對應(yīng)于基因目的部分5’和3’序列的寡核苷酸引物PCR擴增編碼TNF受體多肽的DNA序列。TNFR-6α和TNFR-6β的5’端引物是具有含有下劃線表示的BamH I限制性位點的5’-CGCGGATCCGCCATCATGAGGGCGTGGAGGGGCCAG-3’(SEQ ID NO22)序列。正如Kozak，M，分子生物學(xué)196947-950(1987)等所述的，所有前述引物編碼一種在真核細胞中起始翻譯的有效信號。TNFR-6α的3’端引物是具有含有下劃線表示的Asp718限制性位點的5’-CGCGGTACCCTCTTTCAGTGCAAGTG-3’(SEQ ID NO23)序列。TNFR-6β的3’端引物是具有含有下劃線表示的Asp718限制性位點的5’-CGCGGTACCCTCCTCAGCTCCTGCAGTG-3’(SEQ ID NO24)序列。使用將在工程限制性位點切開的內(nèi)切核酸酶消化擴增的片段，然后再次在1％瓊脂糖凝膠中純化。然后用T4 DNA連接酶連接分離的片段和去磷酸化的載體。轉(zhuǎn)化大腸桿菌HB 101或XL-1藍細胞，使用例如限制性分析的方法鑒定細菌含有插入到pC4載體中的片段。
缺少活性DHFR基因的中國倉鼠卵巢細胞被用于轉(zhuǎn)染。5微克pC4表達質(zhì)粒與0.5微克pSVneo質(zhì)粒使用lipofectin的方法共轉(zhuǎn)染(Felgner等，supra)。pSV2neo質(zhì)粒含有一個顯性的選擇標記，來自Tn5編碼一種轉(zhuǎn)移抗生素包括G418抗性的酶的neo基因。細胞被種植到含有1毫克/毫升G418的α-MEM培養(yǎng)基中。2天后，用胰酶消化細胞然后種植到雜交瘤克隆板(Greiner，德國)上加有10，25或50納克/毫升氨甲喋呤和1毫克/毫升G418的α-MEM培養(yǎng)基中。大約10-14天后，用胰酶消化單克隆然后種植到6孔板中或10毫升培養(yǎng)瓶中，使用不同的氨甲喋呤濃度(50nM，100nM，200nM，400nM，800nM)。在最高濃度氨甲喋呤中生長的克隆被轉(zhuǎn)移到含有更高氨甲喋呤濃度(1uM，2uM，5uM，10mM，20mM)的新6孔板中。重復(fù)操作直至獲得可在100-200 uM濃度中生長的克隆。然后分析目的基因的表達產(chǎn)物，例如通過SDS-PAGE和蛋白印跡或通過反向HPLC分析。實施例4TNF受體mRNA表達的組織分布使用上面引用的Sambrook等所述的方法進行Northern分析以檢測TNFR-6α或TNFR-6β在人體組織中的表達。含有TNF受體蛋白(SEQ ID NOS1或3)完整核苷酸序列的cDNA探針，通過在制造商的指導(dǎo)之下使用rediprimeTMDNA標記系統(tǒng)(Amersham生命科學(xué))被標記上32P。標記之后，在制造商技術(shù)手冊PT1200-1的指導(dǎo)之下應(yīng)用HROMA SPIN-100TM柱(Clontech公司)對探針進行純化。然后純化的標記探針被用于檢測各種不同的人體組織中TNF受體mRNA的表達，包含各種不同人體組織(H)或人免疫系統(tǒng)組織(IM)的多組織Northern印跡(MTN)購自Clontech公司，然后利用ExprexxHybTM雜交溶液(Clontech公司)根據(jù)制造商技術(shù)手冊PT1190-1使用標記的探針進行檢測。雜交和洗滌后，計算印跡點數(shù)目然后在-70℃過夜暴光至膠片，并且根據(jù)標準程序?qū)δz片進行處理。
所要明白的是，本發(fā)明可通過其它不同于特別是前述方法以及實施例的方法而被實踐。根據(jù)本發(fā)明的教導(dǎo)，對本發(fā)明的各種修改和改變都是可能的，但都在附屬的權(quán)利要求的范圍之內(nèi)。實施例5使用內(nèi)源性TNFR-6基因進行基因治療本發(fā)明基因治療的另一種方法涉及將內(nèi)源性TNFR(即TNFR-6)序列與一個啟動子根據(jù)如下列文獻中所述的方法通過同源重組而可操作連接。見，例如1997年6月24日授權(quán)的美國專利5641670；1996年9月26日出版的國際申請公開號WO 96/29411；1994年8月4日出版的國際申請公開號WO 94/12650；Koller等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 868932-8935(1989)；和Zijlstra等，自然342435-438(1989)。此方法涉及激活一個靶細胞中所含有但不表達或低于預(yù)期水平表達的基因。制備含有啟動子以及與內(nèi)源性TNFR 5′端非編碼區(qū)同源的啟動子側(cè)翼靶序列的多核苷酸構(gòu)建物。靶基因?qū)⑴cTNFR-6基因的5’端足夠近，以使得通過同源重組啟動子與內(nèi)源性序列可操作連接。可通過PCR擴增啟動子和靶序列，擴增的啟動子優(yōu)選在5’和3’末端含有相距較遠的限制性酶切點。優(yōu)選的情況是，第一個靶序列的3’末端含有與擴增的啟動子5’末端相同的限制酶位點；并且第二個靶序列的5’末端含有與擴增的啟動子3’末端相同的限制酶位點。
用合適的限制酶消化擴增的啟動子和擴增的靶序列，然后用小牛腸磷酸酶處理。消化的啟動子和消化的靶序列在T4 DNA連接酶存在的情況下被加在一起，產(chǎn)物混合物在適于兩片段連接的條件下維持。在瓊脂糖凝膠上分離構(gòu)建物，然后用酚抽提和乙醇沉淀進行純化。
在本實施例中，寡聚核苷酸構(gòu)建物通過電穿孔的方法以裸的多核苷酸的形式被施與。但是，多核苷酸構(gòu)建物也可能與促進轉(zhuǎn)染的試劑如脂質(zhì)體、病毒序列、病毒顆粒、沉淀試劑等一起施與。這些運送方法也是本領(lǐng)域已知的。
一旦細胞被轉(zhuǎn)染，將會發(fā)生啟動子與內(nèi)源性TNFR-6序列可操作連接的同源重組。這導(dǎo)致TNFR-6在細胞中表達?？梢酝ㄟ^免疫學(xué)染色或本領(lǐng)域已知的其它方法檢測蛋白表達。
通過皮膚活檢，從受檢者得到了成纖維細胞。產(chǎn)物組織被置于含有10％胎牛血清的DMEM中。對數(shù)生長或早期靜止期的成纖維細胞被用胰酶消化下來并用豐富培養(yǎng)基從塑料表面沖洗下來。一部分細胞懸液被計數(shù)，剩下的細胞懸液離心。吸去上清，沉淀重懸于5毫升電穿孔緩沖液中(20mM HEPES pH7.3，137mM NaCl，5mM KCl，0.7mM Na2HPO4，6mM葡聚糖)。細胞重離心，吸去上清，沉淀重懸于含有1毫克/毫升乙?；Ｑ灏椎鞍椎碾姶┛拙彌_液中。終細胞懸液含有大約3×106細胞/毫升。重懸后應(yīng)立即開始電穿孔。
根據(jù)標準技術(shù)制備DNA質(zhì)粒。例如，為構(gòu)建一種定向至TNFR-6位點的質(zhì)粒，用HindIII消化pUC18質(zhì)粒(MBI Fermentas，Amherst，NY)。用PCR擴增5’末端帶有Xba I位點并且3’末端帶有BamH I位點的CMV啟動子。通過PCR擴增兩段TNFR-6非編碼序列一段TNFR-6非編碼序列(TNFR片段1)5’末端帶有Hind III位點并且3’末端帶有Xba I位點；另一段TNFR-6非編碼序列(TNFR片段2)被擴增帶有5’末端BamH I位點和3’末端Hind III位點。用合適的酶消化CMV啟動子和TNFR-6片段(CMV啟動子-Xba I和BamH I；TNFR-6片段1-Xba I；TNFR-6片段2-BamH I)并且將它們連接在一起。用Hind III消化連接產(chǎn)物，Hind III消化的pUC18質(zhì)粒連接。
質(zhì)粒DNA被加入倒一個帶有0.4厘米電極裂隙的無菌小杯中(Bio-Rad)。DNA濃度通常是至少120微克/毫升。然后向小杯眾加入0.5微升細胞懸液(大約含有1.5×106細胞)，溫和混勻細胞懸液和DNA溶液。使用Gene-Pulser設(shè)備(Bio-Rad)進行電穿孔。電容和電壓分別是960uF和250-300伏。隨著電壓增加，細胞存活增加，但是將導(dǎo)入的DNA穩(wěn)定整合基因組的存活細胞百分比急劇增加。考慮到這些參數(shù)，應(yīng)該觀察到的刺激時間大約是14-20毫秒。
電穿孔的細胞在室溫大約維持15分鐘，然后使用移液器輕柔移走小杯內(nèi)容物。細胞被直接加入到10厘米平皿預(yù)溫的豐富培養(yǎng)基中(含有15％小牛血清DMEM)，并在37℃孵育。次日，吸去培養(yǎng)液然后換上新鮮培養(yǎng)基，再孵育16-24小時。
然后將工程化的成纖維細胞注射到宿主體內(nèi)，單獨注射或與cytodex 3微載體珠生長匯合后注射?，F(xiàn)在成纖維細胞表達產(chǎn)物蛋白。然后如上所述成纖維細胞可被導(dǎo)入到患者體內(nèi)。實施例6TNFR在治療小鼠移植宿主疾病中的效果本發(fā)明也包含一種通過向患者(優(yōu)選人)施與本發(fā)明的TNFR多肽或TNFR激動劑從而治療頑固性/嚴重的急性GVHD的方法。
分析本發(fā)明可溶性TNFR多肽(例如TNFR-6)在治療移植宿主疾病(GVHD)中的應(yīng)用的方法是使用C57BL/6親本注射的(BALB/c×C57BL/6)F1小鼠模型進行的。這種F1小鼠模型是特征清楚的并且是可在骨髓移植患者中可繁殖的GVHD動物模型，這是本領(lǐng)域熟練技術(shù)人員眾所周知的(見，例如Gleichemann等，今日免疫學(xué)5324 1984，全文引入本文做參考)。我們希望可溶性TNFR結(jié)合FasL和抑制由FasL介導(dǎo)的凋亡，其在GVHD這種動物模型中所觀察到的肝、皮下以及淋巴器官的損傷中起重要的病理學(xué)作用(Baker等，實驗醫(yī)學(xué)1832645(1996)；Charles等，免疫學(xué)期刊1575387(1996)；和Hattori等，血液914051(1988)，以上文獻引入本文做參考)。
GVHD病情的起始是通過靜脈注射C57BL/6小鼠的大約1-3×108個脾細胞進入(BALB/c×C57BL/6)F1小鼠(可從Jackson實驗室得到，Barharbor，緬因)。每組6-8只小鼠，在注射脾細胞間隔一天以后腹膜內(nèi)或皮下注射0.1-5.0毫克/公斤的TNFR或同型人IgG對照。每周分析兩次TNFR對血清中作為肝損傷指示劑的肝酶釋放的影響，此分析持續(xù)3周。當(dāng)在人IgG治療的小鼠中檢測到顯著數(shù)量的肝酶時，殺死小鼠生理學(xué)評價肝、脾、皮膚和腸的組織損傷的相對程度，和評價TNFR在這些器官上引發(fā)的治療效果。
TNFR緩解與頑固性/嚴重的急性GVHD相關(guān)的系統(tǒng)是通過與對照相比血清中肝酶釋放的減少、組織損傷和/或降低的惡病質(zhì)、體重減低和/或致死率的降低而表示的。
最后，隔日臨床評價TNFR和人IgG治療的動物的惡病質(zhì)、體重和致死率。
也可在此GVHD小鼠模型中檢測TNFR與TNF-α抑制劑的組合治療。實施例7TNFR-6α(DcR3)抑制AIM-II介導(dǎo)的凋亡背景腫瘤壞死因子(TNF)家族成員涉及調(diào)節(jié)不同的生物學(xué)活性例如調(diào)節(jié)細胞增殖、分化、細胞存活、細胞死亡、細胞因子產(chǎn)生、淋巴細胞共刺激、免疫球蛋白分泌和型別轉(zhuǎn)換(Armitage，R.等，免疫學(xué)現(xiàn)代論點6407-413(1994)；Tewari，M.等，遺傳發(fā)育學(xué)現(xiàn)代論點639-44(1996))。此家族的受體在胞外區(qū)共享一個由大約30到40個氨基酸的多個半胱氨酸重復(fù)組成的結(jié)構(gòu)基序(Gruss，H.J.等，血液853378-3404(1995))。TNFR1、CD95/Fas/APO-I、DR3/TRAMP/APO-3、DR4/TRAIL-R1/APO-2、DR5/TRAIL-R2和DR6受體含有一個大約30到40個氨基酸組成的保守的胞內(nèi)基序稱為死亡區(qū)，與凋亡信號傳導(dǎo)途徑的激活相關(guān)，在胞內(nèi)區(qū)含有低序列相同性的其它成員，刺激轉(zhuǎn)錄因子NF-κB和AP-1(Armitage，R.等，免疫學(xué)現(xiàn)代論點6407-413(1994)；Tewari，M.等，遺傳發(fā)育學(xué)現(xiàn)代論點639-44(1996)；Gruss，H.J.等，血液853378-3404(1995))。
大多數(shù)TNF受體含有功能性胞質(zhì)區(qū)，包括TNFR1(Loetscher，H.等，細胞61351-356(1990)；Schall，T.J.等，)細胞61361-370(1990))；TNFR2(Smith，C.A.等，基因組16214-214(1993))；4-1BB(Kwon，B.S.等，Proc Natl Acad Sci USA 861963-1967(1989))；HVEM/TR2/ATAR(Kwon，B.S.等，生命的化學(xué)27214272-14276(1997)；Montgomery，R.I等，細胞87427-436(1996)；Hsu，H.等，生命的化學(xué)27213471-13474(1997))；NGFR(Johnson，D.等，細胞47545-554(1986))，CD27(Van Lier，R.A.等，免疫學(xué)期刊1391589-1596(1987))，CD30(Durop，H.等，細胞68421-427(1992))，CD4O(Banchereau，J.等，細胞68421-427(1994))，OX40(Mallett，S.等，EMBO J 91063-1068(1990))，F(xiàn)as(Itoh，N等，細胞66233-243(1991))，DR3/TRAMP(Chinnaiyan，A.M.等，科學(xué)274990-992(1996))，DR4/TRAIL-R1(Pan，G等，科學(xué)277815-818(1997))和RANK(Anderson，D.等，自然390175-179(1997))。TNFR超家族的一些成員不具有分泌的，例如骨前整合素(OPG)(Simmonet等，細胞89309-319(1997))，或通過糖磷脂尾巴，例如TRID/DcR1/TRAIL-R3(Delgi-Eposti，M.A等，實驗醫(yī)學(xué)1861165-1170(1997)；Sheridan，J.P.等，科學(xué)277818-821(1997))連接的胞質(zhì)區(qū)。也已經(jīng)鑒定了編碼可溶性TNFRs的病毒開放讀碼框，例如SFV-T2(Smith，C.A.等，科學(xué)2481019-1023(1990))、Va53(Howard，S.T.等，病毒學(xué)180633-647(1991))、G4RG(Hu，E.Q.等，病毒學(xué)204343-356(1994))和crmB(Gruss，H.J.等，血液853378-3404(1995))。
通過搜索表達序列標記(EST)數(shù)據(jù)庫，鑒定出TNFR超家族的一個新成員，命名為TNFR-6α，其特征是其是AIM-II和FasL/CD95L的可溶性同族配體。AIM-II和FasL介導(dǎo)的凋亡是細胞死亡的最常見的生理性形式，可在胚胎發(fā)組織重建、免疫調(diào)節(jié)和腫瘤消退過程中發(fā)生。
在激活T淋巴細胞和巨噬細胞中AIM-II是高度誘導(dǎo)的。AIM-II的特征是其是HVEM/TR2和LTβR的細胞受體(Mauri，D.W.等，免疫821-30(1998))。HVEM/TR2是單純皰疹病毒2型(HSV-2)進入人成淋巴細胞的受體。已經(jīng)表明HVEM/TR2-Fc的可溶性形式和HVEM/TR2的抗體抑制混合的淋巴細胞反應(yīng)，預(yù)示著這種受體或其配體在T淋巴細胞激活中的作用(Kwon，B.S.等，生命的化學(xué)27214272-14276(1997)；Mauri，D.W.等，免疫821-30(1998)；Harrop等，免疫學(xué)期刊161(4)1786-1794(1998))。LTβR在上皮細胞上明顯地表達，但在T及B淋巴細胞中不存在表達。在一些腺瘤中通過LTβR進行信號傳導(dǎo)引發(fā)細胞死亡(Browning，J.L等，實驗醫(yī)學(xué)183867-878(1996))。由激活的淋巴細胞產(chǎn)生的AIM-II可逃避只表達HVEM/TR2的造血細胞的調(diào)控，并且誘發(fā)表達LTβR和HVEM/TR2受體的腫瘤細胞凋亡(Zhai，Y.等，臨床投資期刊1021142-1151(1998)；Harrop，J.A.等，生命的化學(xué)27327548-27556(1998))。
FasL是細胞毒性T淋巴細胞和自然殺傷細胞的一個主要效應(yīng)器。它也涉及到在激活誘導(dǎo)的淋巴細胞死亡中外周耐受的建立。而且，F(xiàn)asL在非淋巴細胞和腫瘤細胞中的表達通過阻止Fas敏感的淋巴細胞浸潤而有助于維持組織的免疫特權(quán)(Nagata，S.，細胞88355-365(1997))。FasL也被處理并從人細胞的表面出芽(Schneider，P.等，實驗醫(yī)學(xué)期刊1871205-1213(1998))。
在此，我們顯示了TNFR超家族的一個新成員TNFR-6α與AIM-II和FasL結(jié)合。因此，TNFR-6α可通過阻斷AIM-II與其受體的相互作用而作為AIM-II誘導(dǎo)的細胞死亡的抑制劑。材料和方法TNFR超家族新成員的鑒定和克隆使用blastn和tblastn計算程序在從多于600種不同的cDNA文庫種獲得的EST cDNA數(shù)據(jù)庫種篩選與TNFR超家族半胱氨酸豐富區(qū)同源的序列。從正常的人前列腺以及胰腺腫瘤cDNA文庫中鑒定出了三個含有氨基酸序列與TNFR-II顯著同源的開放讀碼框完全相同的克隆。從正常人前列腺文庫中獲得了一個編碼完整N端信號肽的全長TNFR-6α cDNA克隆。RT-PCR分析為用于RT-PCR分析，使用Trizol試劑盒(GIBCO)從用PMA/離子霉素或LPS刺激之前或之后的各種不同的人細胞系中分離總RNA。通過逆轉(zhuǎn)錄將RNA轉(zhuǎn)變?yōu)閏DNA并用PCR擴增35個循環(huán)。用于擴增的TNFR-6α片段的引物是根據(jù)TNFR-6α序列而設(shè)計的。β-肌動蛋白被用做RNA完整性的內(nèi)在對照。PCR產(chǎn)物進行2％瓊脂糖凝膠電泳，溴酚藍染色并在紫外燈下觀察結(jié)果。重組蛋白的產(chǎn)生和純化重組TNFR-6α蛋白是利用C末端的6個組氨酸生產(chǎn)的。PCR擴增編碼完整TNFR-6α蛋白的TNFR-6α-(His)。為正確克隆，在上游引物(5’-AGACCCAAGCTTCCTGCTCCAGCAAGGACCATG-3’SEQ ID NO25)的5’端設(shè)計了BamHI位點。用BamHI和HindIII酶切擴增片段然后克隆入哺乳動物表達載體pCEP4(Invitrogen)中。TNFR-6α-(His)/pCEP4穩(wěn)定轉(zhuǎn)染入HEK 293 EBNA細胞中以產(chǎn)生重組的TNFR-6α-(His)。轉(zhuǎn)染有TNFR-6α-(His)/pCEP4質(zhì)粒的細胞的無血清培養(yǎng)基經(jīng)過鎳柱(Novagen)。通過SDS-PAGE將柱流出液分成幾部分，然后使用抗多聚(His)6抗體(Sigma)進行蛋白印跡分析檢測TNFR-6α-(His)。
前面已經(jīng)描述了HVEM/TP2-Fc，LTβR-Fc和Flag標記的可溶性AIM-II融合蛋白的生產(chǎn)(Zhai，Y.等，臨床投資期刊1021142-1151(1998))。過濾含有Fc融合蛋白的上清然后捕獲到蛋白G Sepharose珠上去。使用抗Flag單克隆抗體親和柱對Flag標記的可溶性AIM-II進行純化。免疫沉淀TNFR-6α-(His)與Flag標記的TNFR超家族的各種不同的配體以及Flag瓊脂糖在結(jié)合緩沖液中(150mM NaCl，0.1％NP-40，0.25％明膠，50mM HEPES，pH7.4)4℃過夜孵育，然后進行沉淀分析，通過12.5％的SDS-PAGE解析結(jié)合的蛋白，并HRP標記的抗多聚(His)6抗體或抗人IgG1抗體進行蛋白印跡分析。細胞結(jié)合分析為用于細胞結(jié)合分析，用pCEP4/AIM-II cDNA全序列或只用pCEP4載體穩(wěn)定轉(zhuǎn)染HEK 293 EBNA細胞。用潮霉素B選擇以后，用含有1mM的EDTA的PBS收獲細胞，然后與TNFR-6α-(His)、HVEM/TP2-Fc或LTβR-Fc在冰上孵育20分鐘。為檢測Fc融合蛋白，用FITC標記的羊抗人IgG對細胞進行染色。為了檢測TNFR-6α的結(jié)合，用抗多聚(His)6抗體和FITC標記的羊抗人IgG連續(xù)對細胞進行染色。然后用流式細胞儀(Becton Dickinson)分析細胞。細胞毒性分析使用HT29細胞的細胞毒性分析如前所述(Browning，J.L.等，實驗醫(yī)學(xué)183867-878(1996))。簡言之，5000個HT29細胞被種植在96孔板上含有1％FBS的DMEM中，然后用可溶性AIM-II(10ng/ml)和10單位/ml的人重組γ干擾素(IFNγ)處理。系列稀釋的TNFR-6α-(His)被加入到微量滴定板孔中，做4個復(fù)孔。在加入3H標記的胸苷進行最后6個小時的培養(yǎng)之前，用IFNγ和可溶性AIM-II處理的細胞與各種不同量的TNFR-6α-(His)孵育4天。收獲細胞，使用液體閃爍計數(shù)儀測定摻入的胸苷。結(jié)果和討論TNFR-6α是TNFR超家族的新成員TNFR-6α是通過搜索EΣT數(shù)據(jù)庫鑒定出來的。三個含有完全相同的開放讀碼框的克隆被從正常的人前列腺以及胰腺腫瘤cDNA文庫中鑒定出來。從正常人前列腺文庫中獲得了一個編碼完整N端信號肽的全長TNFR-6αcDNA克隆。TNFR-6α的開放讀碼框編碼300個氨基酸。為測定成熟TNFR-6α的N端氨基酸序列，在哺乳動物表達系統(tǒng)中表達6個組氨酸標記的TNFR-6α并通過多肽測序測定N末端氨基酸序列。處理后的成熟TNFR-6α-(His)的N端氨基酸序列第第30位開始，這表明前29個氨基酸組成了信號序列。因此，成熟的TNFR-6α蛋白由271個氨基酸組成，并不含跨膜區(qū)。在TNFR-6α中無潛在的N端糖基化位點(Asn173)。與OPG(Simmonet等，細胞89309-319(1997))一樣，推測的蛋白是一種可溶性的分泌蛋白，并且在哺乳動物中表達的重組TNFR-6α蛋白的分子量大約位40KD，如同在聚丙烯酰胺凝膠電泳中所測定的那樣。對TNFR-I、TNFR-II、4-1BB、TR2/HVEN、LTβR、TR1/OPG和TNFR-6α進行氨基酸序列比較表明存在潛在的半胱氨酸豐富基序并且其氨基酸序列與TR1/OPG的氨基酸序列驚人地相似。TNFR-6α與OPG和TNFR-II具有大約30％的序列同源性。mRNA表達通過Northern雜交我們分析了TNFR-6αmRNA在各種人體組織中的表達。Northern分析表明TNFR-6αmRNA大約為1.3Kb大小并且在肺組織以及結(jié)腸直腸腺瘤細胞系SW480中優(yōu)勢表達。RT-PCR分析以測定TNFR-6α在各種不同細胞系中的表達特征。在Jurkat白血病細胞中一旦激活TNFR-6α立即表達。有趣的是，TNFR-6α在內(nèi)皮細胞中組成型表達，而HUVEC則高水平表達。鑒定TNFR-6α配體為鑒定TNFR-6α配體，通過免疫沉淀篩選TNF配體家族成員的幾種Flag標記的可溶性蛋白與重組的TNFR-6α-(His)蛋白的結(jié)合。在所測試的Flag標記的可溶性TNF配體家族成員中，TNFR-6α-(His)與AIM-II-Flag和FasL-Flag選擇性結(jié)合。這個結(jié)果表明TNFR-6α至少可與兩種配體結(jié)合，即AIM-II和FasL。AIM-II和FasL的C末端受體結(jié)合區(qū)顯示出明顯的序列同源性(31％)，但是可溶性AIM-II不能與Fas結(jié)合(Mauri，D.N.，免疫821-30(1998)；Zhai，Y.等，臨床投資期刊1021142-1151(1998))。它們可能具有TNFR-6α結(jié)合的相同的表位。
此前，Zhai和Harrop(Zhai，Y.等，臨床投資期刊1021142-1151(1998)；Harrop，J.A.等，生命的化學(xué)27327548-27556(1998))報道了AIM-II的生物學(xué)功能以及它作為HVEM/TR2和/或LTβR配體的可能機制。AIM-II在激活的T細胞中表達。AIM-II與血清饑餓或加入IFNγ一起抑制腫瘤細胞MDA-MB-231和HT29的細胞增殖。
為測定TNFR-6α是否以AIM-II與HVEM/TR2或LTβR相互作用的抑制劑起作用，TNFR-6α-(His)被用做AIM-II-HVEM/TR2相互作用的競爭性抑制劑。當(dāng)AIM-II在存在TNFR-6α-(His)的情況下被HVEM/TR2-Fc免疫沉淀時，HVEM/TR2-Fc與AIM-II的結(jié)合被TNFR-6α-(His)競爭性降低，但是HVEM/TR2-Fc并不影響TNFR-6α-(His)與AIM-II的結(jié)合。而且在免疫沉淀分析中，HVEM/TR2-Fc(6nM)或LTβR(6nM)的結(jié)合受到20nM TNFR-6α-(His)的競爭性抑制。這些結(jié)果支持TNFR-6α通過HVEM/TR2或LTβR作為AIM-II功能的強抑制劑而起作用這一論斷。TNFR-6α-(His)與AIM-II轉(zhuǎn)染的細胞的結(jié)合為了測定TNFR-6α-(His)是否與表達在細胞表面的AIM-II結(jié)合，我們使用了AIM-II轉(zhuǎn)染的HEK 293 EBNA細胞通過流式細胞術(shù)進行了結(jié)合分析。AIM-II轉(zhuǎn)染的HEK 293 EBNA細胞可被TNFR-6α-(His)以及HVEM/TR2-Fc和LTβR-Fc明顯染色。在pCEP4載體轉(zhuǎn)染的HEK 293 EBNA細胞上并未觀察到HVEM/TR2-Fc或LTβR-Fc的結(jié)合。而且，同型對照并不與AIM-II轉(zhuǎn)染的HEK 293EBNA細胞結(jié)合，并且任何一種上述融合蛋白都不與載體轉(zhuǎn)染的細胞結(jié)合，證明了這些結(jié)合的特異性。這些結(jié)合表明TNFR-6α可與可溶性的以及膜結(jié)合形式的AIM-II結(jié)合。在HT29細胞中TNFR-6α抑制AIM-II介導(dǎo)的細胞毒性Browning等(實驗醫(yī)學(xué)183867-878(1996))已經(jīng)表明Fas激活導(dǎo)致細胞快速死亡(12-24小時)，而LTβR誘導(dǎo)結(jié)腸直腸腺瘤細胞系HT29發(fā)生凋亡至少需要2-3天。Zhai等(臨床投資期刊1021142-1151(1998))也報道AIM-II導(dǎo)致同時表達LTβR和HVEM/TR2的細胞死亡，而不是只表達LTβR或HVEM/TR2的細胞死亡。在AIM-II介導(dǎo)的對HT29細胞的殺傷中，LTβR和HVEM/TR2協(xié)同作用(Zhai等，臨床投資期刊1021142-1151(1998))。
為測定TNFR-6α的結(jié)合是否抑制AIM-II介導(dǎo)的細胞毒性，在存在200ng/ml LTβR-Fc或TNFR-6α-(His)的情況下，HT29細胞與10ug/ml的可溶性AIM-II和10u/ml的IFNγ孵育。TNFR-6α-(His)顯著阻斷AIM-II介導(dǎo)的細胞殺傷。細胞也在存在不同濃度的TNFR-6α-(His)的情況下與可溶性AIM-II和/或IFNγ孵育。TNFR-6α-(His)以一種劑量依賴的方式阻斷AIM-II介導(dǎo)的細胞死亡。綜合到一起，TNFR-6α似乎以一種AIM-II介導(dǎo)的腫瘤細胞殺傷的天然抑制劑起作用。這些數(shù)據(jù)也表明TNFR-6α有利于腫瘤的免疫逃避。
AIM-II與HVEM/TR2和/或LTβR的相互作用可能引發(fā)不同的生物學(xué)作用，例如細胞增殖、阻斷HVEM依賴的HSV1感染和抗腫瘤活性(Mauri，D.N.等，免疫821-30(1998)；Zhai等，臨床投資期刊1021142-1151(1998)；Harrop，J.A.等，生命的化學(xué)27327548-27556(1998))。TNFR-6α可能作為AIM-II相互作用的抑制劑起作用并且在不同細胞類型中起不同作用。在由AIM-II和/或FasL介導(dǎo)的凋亡途徑介導(dǎo)的快速和慢速腫瘤細胞死亡中，TNFR-6α也可作為誘餌受體起作用并且有助于免疫逃避。
另一種可能是TNFR-6α可能作為細胞因子起作用引發(fā)膜結(jié)合FasL或AIM-II并且直接通過FasL或AIM-II傳導(dǎo)信號。最近Desbarats和Suzuki研究組報道FasL自身就能傳導(dǎo)信號，導(dǎo)致CD4+T細胞的細胞循環(huán)停止和細胞死亡，但在CD8+T細胞中卻導(dǎo)致細胞增殖(Desbarats，J.等，自然醫(yī)學(xué)41377-1382(1998)；Suzuki等，實驗醫(yī)學(xué)期刊187123-128(1998))。因此，TNFR-6α涉及通過FasL和AIM-II傳導(dǎo)信號。
在RT-PCR分析中，HUVEC細胞組成型表達TNFR-6α。已知AIM-II和/或FasL在活化的T細胞中被表達。因此，據(jù)推測TNFR-6α及其配體在激活的T細胞與內(nèi)皮細胞的相互作用中很重要。TNFR-6α可能與活化的T細胞之間的交流以及內(nèi)皮細胞存活有關(guān)。實施例8活化誘導(dǎo)的凋亡分析活化誘導(dǎo)的凋亡式使用SupT13 T白血病細胞分析并通過細胞周期分析方法測定的。分析過程如下。SupT13 T細胞在含有10％的FCS的RPMI培養(yǎng)基中培養(yǎng)并指數(shù)增長(大約1×106)。SupT13 T種植到24孔板的孔中，細胞濃度為0.5×106/ml，1ml/孔。AIM-II和FasL蛋白(0.01，0.1，1，10，100，1000ng/ml)或緩沖液對照被加入到孔中，在存在或不存在本發(fā)明多肽的情況下37℃孵育24小時。在另一塊24孔板上，通過將溶于無菌過濾的pH9.5的0.05M碳酸氫鹽緩沖液中的濃度為10ug/ml的純化的CD3單抗或緩沖液加入到孔中孵育每孔0.5毫升以制備帶有或不帶有抗CD3抗體的孔。板子4℃包被過夜。處理的SupT13 T細胞被轉(zhuǎn)移到抗體包被孔中，37℃孵育18小時。使用PI和流式細胞儀通過細胞循環(huán)的分析方法測定凋亡。為測定處理細胞的增殖，從處理孔中吸出300ul每種處理的細胞，然后轉(zhuǎn)移到96孔板上的3個復(fù)孔種(100ul/孔)，每孔加入3H標記的胸苷(0.5uCi/20ul，2Ci/mM)并37℃孵育18小時。收獲細胞并對細胞攝入的3H標記的胸苷計數(shù)。這種測量方法可被用于證實對通過其它方法觀察到的凋亡的效應(yīng)。此分析的陽性對照是單獨用抗CD3交聯(lián)抗體，單獨用Fas配體和/或單獨用AIM-II。此外，使用Fas單克隆抗體(500ng/ml，可溶形式的IgM單克隆抗體)已經(jīng)在此細胞系中表現(xiàn)出復(fù)雜的和增殖性的凋亡。此分析方法的陰性對照是只加培養(yǎng)基或只加緩沖液。同樣，已經(jīng)表明與另一種抗CD3單克隆抗體(OKT3)交聯(lián)沒有什么影響。當(dāng)與在TNFR激動劑存在的情況下用AIM-II或FasL處理SupT13 T細胞比較時，本發(fā)明的TNFR激動劑表現(xiàn)出降低的凋亡。本發(fā)明的拮抗劑可以通過將具有FasL和/或AIM-II結(jié)合親和性(例如成熟TNFR)的TNFR多肽與待測的TNFR多肽組合，然后將此組合與AIM-II或FasL和SupT13 T細胞作用而鑒定。此分析的陰性對照只含有成熟TNFR、SupT13 T細胞和AIM-II或FasL的混合物。與陰性對照相比，含有本發(fā)明拮抗劑的樣品顯示出增加的凋亡。
如果通過細胞周期分析觀測到效果，此細胞可被進一步使用本領(lǐng)域熟練技術(shù)人員眾所周知的技術(shù)用Annexin V染色進行流式細胞儀TUNEL分析。實施例9通過TNFR-6α-Fc阻斷配體介導(dǎo)的Jurkat細胞凋亡方法單獨用sFas配體或sFas配體與Fas-Fc或TNFR-6α-Fc(如文中所述，對應(yīng)于與Fc區(qū)融合的全長的NFR-6α蛋白(SEQ ID NO2中1-300氨基酸序列))組合處理表達Fas受體的Jurkat T細胞。所使用的sFas配體蛋白購自Alexis公司并且在N末端含有一個FLAG表位標記。正如此前所表明的，使用單克隆Flag表位交聯(lián)Fas配體顯著增強了Fas配體介導(dǎo)凋亡的能力，F(xiàn)lag抗體被包括在本研究中。特異地，用Fas配體(Alexis)(20ng/ml)和抗Flag單抗(200ng/ml)處理106Jurkat細胞(RPMI+5％血清)，然后37℃孵育16小時。當(dāng)此分析中包括TNFR-6α-Fc時，受體與Fas配體和抗Fas單抗預(yù)孵育15分鐘。
結(jié)果孵育后收獲細胞重懸于PBS中并進行流式細胞術(shù)分析(表V)。在不存在Fas配體(FasL)的情況下，如同通過較高的annexin染色和較低的PI染色所測定的大約1％的細胞經(jīng)歷凋亡。單獨用可溶性FasL處理導(dǎo)致凋亡細胞數(shù)目增加大約7倍，并可被Fas-Fc的存在而阻斷。與Fas-Fc相似，TNFR-6α-Fc也能阻斷Fas介導(dǎo)的凋亡。如同所觀察到的，TNFR-6α-Fc以劑量依賴的方式在三個對數(shù)級(表V)上阻斷凋亡。也可在細胞死亡分析(圖7A-B)中測定TNFR-6α-Fc阻斷Fas介導(dǎo)的Jurkat細胞殺傷的能力。在此分析中，再次用FasL和TNFR-6α-Fc組合處理細胞16小時。為測定處理后的細胞存活水平，將細胞與10％的ALOMAR藍孵育5小時后在570-630納米波長下用分光光度計測量OD值。Fas配體的處理導(dǎo)致細胞存活率減少50％(圖7A-B)。細胞存活率的降低可被Fas-Fc或TNFR-6α-Fc而不是TR5-Fc所克服(圖7A-B)，表明TNFR-6α干預(yù)Fas配體介導(dǎo)的活性的能力。與不加入TNFR-6α-Fc相比，在此分析中TNFR-6α-Fc在100ng/ml和10ng/ml時阻斷Fas配體介導(dǎo)的活性的能力時顯著不同的(p＜0.05)(圖7A-B)。而且，TNFR-6α-Fc在阻斷Fas配體介導(dǎo)的細胞死亡和凋亡中與Fas-Fc一樣有效(表V和圖7A-B)。
表V流式細胞術(shù)分析表明阻斷了Fas配體介導(dǎo)的凋亡用Fas配體(Alexis)(20ng/ml)和抗Flag單抗(200ng/ml)處理106Jurkat細胞(RPMI+5％血清)，然后37℃孵育16小時。當(dāng)此分析中包括Fc受體時，受體與Fas配體和抗Flag單抗預(yù)孵育15分鐘。孵育后收獲細胞重懸于PBS中然后進行流式細胞術(shù)分析。
處理 經(jīng)歷凋亡的細胞％對照(緩沖液) 1.24FasL(20ng) 8.87FasL(20ng)+Fas-Fc(100ng) 1.78FasL(20ng)+TNFR-6α-Fc(100ng) 1.24FasL(20ng)+TNFR-6α-Fc(10ng) 2.79FasL(20ng)+TNFR-6α-Fc(1ng)7.95FasL(20ng)+TNFR-6α-Fc(0.1ng) 8.58結(jié)論TNFR-6α-Fc于Fas配體一樣以一種劑量依賴的方式阻斷Fas配體介導(dǎo)的Jurkat細胞的凋亡。實施例10TNFR-6α和/或TNFR-6β的融合蛋白本發(fā)明的TNFR-6α和/或TNFR-6β多肽可任選融合至其它蛋白，這些融合蛋白可用于各種應(yīng)用中。例如，TNFR-6α和/或TNFR-6β多肽融合至His標記、HA標記、蛋白A、IgG功能區(qū)和麥芽糖結(jié)合蛋白促進純化(見，EP A 394827；Traunecker等，自然33184-86(1988))。同樣，融合至IgG-1、IgG-3和白蛋白增加了在體內(nèi)的半衰期，共價結(jié)合異聚體或同聚體可以增加或降低融合蛋白的活性。融合蛋白也可產(chǎn)生具有多個功能區(qū)的嵌合分子。最后，與非融合蛋白相比，融合蛋白可增加融合的蛋白的溶解性合/或穩(wěn)定性。上述所有類型的融合蛋白都可使用本領(lǐng)域已知的技術(shù)制備，或通過使用常規(guī)修改的下述將多肽融合至IgG分子上的方法來制備。
簡言之，使用跨越下述序列5‘和3’端的引物PCR擴增人IgG分子的Fc部分。這些引物也優(yōu)選含有合適的限制性位點，以利于將其克隆入表達載體優(yōu)選哺乳動物表達載體。
例如，如果使用pC4(209646)表達載體，F(xiàn)c部分可連接到BamHI位點上。注意3’端BamHI位點應(yīng)該被破壞掉。其次，用BamHI酶切含有人Fc部分的載體并使之線性化，用實施例1中的方法PCR擴增分離的TNFR-6α和/或TNFR-6β多核苷酸被連接到BamH I位點上。注意克隆的多核苷酸應(yīng)無終止密碼子，否則不會產(chǎn)生融合。
如果天然信號序列被用于產(chǎn)生分泌蛋白，pC4不需要另外的信號肽。如果未用天然的信號序列，可修飾載體使之含有一段異源信號序列(見，例如國際申請公開號WO 96/34891)。
人IgG分子的Fc區(qū)的序列如下AGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTACAACAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAATGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGCCCTCCCAACCCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGATGAGCTGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCAAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACGCAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGTAAATGAGTGCGACGGCCGCGACTCTAGAGGAT(SEQ ID NO27)實施例11抗體的生產(chǎn)a)雜交瘤技術(shù)本發(fā)明的抗體可通過各種方法制備(見，現(xiàn)有方法，第二章)。作為這些方法的一個例子，表達TNFR-6α和/或TNFR-6β多肽的細胞可被施與到動物體內(nèi)誘導(dǎo)產(chǎn)生含有多克隆抗體的血清。在一個優(yōu)選的實施方案中，制備TNFR-6α和/或TNFR-6β蛋白，然后純化去除天然雜質(zhì)。這樣的制備物被導(dǎo)入動物體內(nèi)以產(chǎn)生具有更高特異性活性的多克隆抗血清。
TNFR-6α和/或TNFR-6β蛋白特異性的單克隆抗體使通過雜交瘤技術(shù)制備的(Kohler等，自然256495(1975)；Kohler等，歐洲免疫學(xué)期刊6511(1976)；Kohler等，歐洲免疫學(xué)期刊6292(1976)；Hammerling等，單克隆抗體和T細胞雜交瘤，Elsevier出版社，紐約，563-681頁(1981))。通常來說，用TR-6α和/或TR-6β多肽優(yōu)選使用分泌TR-6α和/或TR-6β多肽的細胞免疫一種動物(優(yōu)選小鼠)。這樣的多肽表達細胞可在任何合適的組織培養(yǎng)基中培養(yǎng)，優(yōu)選在含有10％胎牛血清(56℃熱滅活)和加有10g/l非必需氨基酸，大約1000u/ml青霉素和100ug/ml鏈霉素)的Earle’s修改的Eagle’s培養(yǎng)基中培養(yǎng)。
分離這些小鼠的脾細胞然后與合適的骨髓瘤細胞融合。根據(jù)本發(fā)明可使用任何合適的骨髓瘤細胞系；但是，優(yōu)選使用親本骨髓瘤細胞系(PS20)，可從ATCC索取。融合后，產(chǎn)物雜交瘤細胞在HAT培養(yǎng)基中被選擇性培養(yǎng)并通過Wands等(胃腸道學(xué)80225-232(1981))中所述的有限稀釋法克隆。然后對通過這樣的選擇獲得的雜交瘤細胞進行分析以鑒定能夠分泌可TR-6α和/或TR-6β多肽結(jié)合的抗體的克隆。
另外，可在使用抗獨特型抗體的兩步法中生產(chǎn)另外的能夠結(jié)合TR-6α和/或TR-6β多肽的抗體。這樣的方法使用抗體本身就使抗原這個事實，因此可能獲得與二抗結(jié)合的抗體。根基此方法，用蛋白質(zhì)特異性抗體免疫動物優(yōu)選小鼠。免疫動物的脾細胞被用于生產(chǎn)雜交瘤細胞，并且篩選這些雜交瘤細胞以鑒定能夠產(chǎn)生具有與TR-6α和/或TR-6β蛋白特異性抗體結(jié)合能力的抗體，并且此結(jié)合可被TR-6α和/或TR-6β阻斷的克隆。這樣的包含針對TR-6α和/或TR-6β蛋白特異性抗體的抗獨特型抗體的抗體可被用于免疫動物以誘導(dǎo)TR-6α和/或TR-6β蛋白特異性抗體的形成。
為在人體內(nèi)應(yīng)用抗體，抗體被“人源化”。這樣的抗體可以通過利用來自上述產(chǎn)生單抗的雜交瘤細胞的基因構(gòu)建物而制備。用于制備嵌合的人源化抗體的方法是本領(lǐng)域已知的，并在文中已經(jīng)詳細討論(見，例如Morrison等，科學(xué)2291202(1985)；Oi等，生物技術(shù)4214(1986)； Cabilly等，美國專利4816567；Taniguchi等，EP 171496；Morrison等，EP 173494；Neuberger等，WO 8601533；Robison等，WO 8702671；Boulianne等，自然312643(1984)；Neuberger等，，自然314268(1985))。
b)從scFvs庫中分離抗TR-6α和/或TR-6β的抗體片段分離自PBLs的天然V基因被構(gòu)建到一個含有供體可能顯示出或未顯示出抗TR-6α和/或TR-6β反應(yīng)活性的抗體片段文庫中(見，例如美國專利5885793，全文引入本文做參考)。
文庫的拯救。如IIXT出版號WO 92/01047中所述的方法，從PBLs的RNA構(gòu)建了scFvs庫。為拯救噬菌體展示抗體片段，大約109含有噬菌體質(zhì)粒的大腸桿菌被用于接種50毫升含有1％葡萄糖和100ug/ml氨芐青霉素的2×TY(2×TY-AMP-GLU)，然后振搖直至生長至OD值為0.8。用5毫升培養(yǎng)物接種至50毫升2×TY-AMP-GLU中，然后加入2×108δ基因III輔助子(M13δ基因III，見PCT出版號WO 92/01047)，37℃靜置培養(yǎng)45分鐘，然后37℃搖動培養(yǎng)45分鐘。培養(yǎng)物4000轉(zhuǎn)離心10分鐘。沉淀重懸至含有100ug/ml氨芐青霉素和50ug/ml卡那霉素的2升2×TY中過夜培養(yǎng)。按照PCT出版號WO 92/01047所述的方法制備噬菌體。
按照如下方法制備M13 δ基因IIIM13 δ基因III輔助噬菌體并不編碼基因III蛋白，因此噬菌體展示抗體片段具有較強的抗原結(jié)合親和性。通過輔助噬菌體在攜帶有在噬菌體形態(tài)形成中提供野生型基因III蛋白的pUC19衍生質(zhì)粒的細胞中生長而制備了傳染性M13δ基因III顆粒。培養(yǎng)物在37℃靜置培養(yǎng)1小時，然后37℃搖動培養(yǎng)1小時。細胞離心(84000rpm×10分鐘)后重懸至含有100ug/ml氨芐青霉素和25ug/ml卡那霉素的300毫升2×TY中37℃過夜搖動培養(yǎng)。通過2次PEG沉淀(Sambrook等，1990)從培養(yǎng)基中純化和濃縮噬菌體顆粒，重懸于2毫升PBS中然后用0.45微米濾器過濾(Minisart NML，Sartorius)，最后得到終濃度大約為1013轉(zhuǎn)導(dǎo)單位/ml(氨芐青霉素抗性克隆)。
文庫的篩選。用含有100ug/ml或10ug/ml本發(fā)明多肽的PBS包被免疫試管(Nunc)。37℃用2％Marvel-PBS封閉試管2小時，然后用PBS洗滌3次。大約1013噬菌體被加入到管中，翻轉(zhuǎn)室溫孵育30分鐘，然后直立孵育1.5小時。使用含有0.1％土溫20的PBS洗滌試管10次，再用PBS洗滌10次。加入1mM三乙胺并且翻轉(zhuǎn)15分鐘洗脫噬菌體，然后立即用pH7.4的0.5毫升1M的Tris-HCl中和流出液。然后通過將流出的噬菌體與細菌37℃孵育30分鐘用噬菌體感染10毫升對數(shù)生長期的大腸桿菌TG1。然后細菌被鋪到含有1％葡萄糖和100ug/ml氨芐青霉素的YEC平板上。然后用上述方法使用δ基因III輔助噬菌體拯救產(chǎn)物細菌文庫為隨后的選擇過程制備噬菌體。重復(fù)此親和純化過程共4次，對于第3和第4回合，試管洗滌液使用20倍體積含有0.1％吐溫20的PBS洗滌，再用20倍體積PBS洗滌。
結(jié)合者的鑒定。從第3和第4回合中流出的噬菌體倍用于感染大腸桿菌HB2151菌株，并且可溶性scFv從用于分析的單克隆中生產(chǎn)出來(Marks等，1991)。然后使用包被有10pg/ml溶于pH9.6的50mM碳酸氫鹽中的本發(fā)明多肽的96孔板進行ELISA分析。ELISA分析中的陽性克隆被用于PCR指紋圖譜法(見，例如PCT出版號WO92/01047)進一步鑒定，然后測序鑒定。實施例12測定TNFR-6α和/或TNFR-6β基因改變的方法從整個家族或單個表現(xiàn)出目的表型(例如，疾病)的個體中分離RNA。使用這樣的RNA樣品通過本領(lǐng)域已知的技術(shù)得到cDNA。然后以此cDNA為模板，以環(huán)繞在SEQ ID NO1中目的區(qū)域周圍的引物進行PCR擴增。建議的PCR條件為35個循環(huán)，95℃30秒；52-58℃60-120秒；70℃60-120秒。使用Sidransky，D等，科學(xué)252706(1991)中所描述的緩沖溶液。
然后使用5’端標記有T4多核苷酸激酶的引物，和SequiTherm的聚合酶對PCR產(chǎn)物進行測序。已經(jīng)測定了選擇的TNFR-6α和/或TNFR-6β外顯子的內(nèi)含子-外顯子界線，并且分析基因組PCR產(chǎn)物證實了此結(jié)果。然后懷疑TNFR-6α和/或TNFR-6β上帶有突變的PCR產(chǎn)物被克隆并測序以證實直接測序的結(jié)果。
如Holton，T.A.和Graham，M.W.，核酸研究191156(1991)所述將TNFR-6α和/或TNFR-6β的PCR產(chǎn)物克隆進T加尾載體中，并用T7聚合酶測序(United States Biochemical)。通過在未受影響的個體中不存在的TNFR-6α和/或TNFR-6β中的突變鑒別受影響的個體。
基因重排也是鑒定TNFR-6α和/或TNFR-6β改變的一個方法。利用本領(lǐng)域已知的技術(shù)分離的基因組克隆被用毛地黃毒苷脫氧尿苷-5-三磷酸(寶靈曼)進行缺口翻譯，并用Johnson等，細胞生物學(xué)方法3573-99(1991)所述的方法進行FISH分析。用標記的探針進行的雜交是使用大量TNFR-6α和/或TNFR-6β基因組位點特異性雜交的人cot-1 DNA進行的。
用4，6-二氨基-2-phenylidole和PI對染色體進行染色，產(chǎn)生了C帶和R帶的組合。精確圖譜的排列圖象組合3條帶過濾設(shè)置(Chroma技術(shù)，Brattleoboro，VT)與冷卻的帶電裝置相機(Photometrics，Tucson，AZ)和可變的激發(fā)波長濾鏡而獲得的(Johnson等，Genet.Anal.Tech.Appl.875(1991))。使用Isee圖象程序系統(tǒng)(Invision公司，Durham，NC)進行圖象收集、分析和染色體部分長度測量。TNFR-6α和/或TNFR-6β基因組位置的染色體改變(通過探針雜交)被鑒定位插入、缺失和轉(zhuǎn)位。這些TNFR-6α和/或TNFR-6β改變被用做相關(guān)疾病的診斷標志。實施例13檢測生物樣品中異常水平TNFR-6α和/或TNFR-6β的方法可檢測一生物學(xué)樣品中的TNFR-6α和/或TNFR-6β多肽，并且如果檢測到TNFR-6α和/或TNFR-6β水平的升高或降低，這一多肽就是某一特定表型的標志。檢測方法多種多樣，因此，本領(lǐng)域熟練技術(shù)人員可根據(jù)他們的需要對下列方法做些改動。
例如，抗體夾心法ELISA被用于檢測樣品中優(yōu)選生物學(xué)樣品中的TNFR-6α和/或TNFR-6β。微量板的孔用終濃度微0.2到10ug/ml的TNFR-6α和/或TNFR-6β特異性抗體所包被?？贵w是利用本領(lǐng)域已知的技術(shù)生產(chǎn)的單抗或多抗。封閉孔以減少TNFR-6α和/或TNFR-6β的非特異性結(jié)合。
然后包被孔與含有TNFR-6α和/或TNFR-6β的樣品在室溫下孵育2小時以上。為使結(jié)果正確，優(yōu)選使用系列稀釋的樣品。然后用去離子水或蒸餾水洗滌板子3次以去除未結(jié)合的TNFR-6α和/或TNFR-6β。
接著，加入50ul終濃度為25-400ng的堿性磷酸酶標記的特異性抗體，室溫孵育2小時。然后用去離子水或蒸餾水洗滌板3次以去除未結(jié)合的綴合物。
然后每孔加入75ul MUP或NPP底物溶液，室溫孵育1小時，以允許底物和熒光的分離。使用微量滴定板讀數(shù)儀測定熒光。使用系列稀釋的對照樣品的實驗數(shù)據(jù)繪制標準曲線，其中X軸代表樣品濃度(對數(shù)軸)，Y軸代表熒光或光吸收值(線性軸)。樣品中TNFR-6α和/或TNFR-6β濃度就可以利用標準曲線在所測得的熒光讀數(shù)的基礎(chǔ)上算出來。實施例14TNFR-6α和/或TNFR-6β降低水平的治療方法本發(fā)明涉及對需要降低體內(nèi)TNFR-6α和/或TNFR-6β生物學(xué)活性的個體進行治療的方法，此方法包括向此個體施與治療學(xué)有效量的TNFR-6α和/或TNFR-6β拮抗劑組成的組合物。優(yōu)選用于本發(fā)明的拮抗劑使TNFR-6α和/或TNFR-6β特異性抗體。
而且，個體中標準或正常TNFR-6α和/或TNFR-6β表達水平的降低可通過向此個體施與優(yōu)選可溶性的和/或分泌形式的TNFR-6α和/或TNFR-6β而治療。因此，本發(fā)明也提供了一種在需要增加TNFR-6α和/或TNFR-6β多肽的個體中進行治療的方法，此方法包括向此個體施與由一定劑量TNFR-6α和/或TNFR-6β組成的藥物組合物以增加此個體的TNFR-6α和/或TNFR-6β生物活性水平。
例如，具有低水平TNFR-6α和/或TNFR-6β多肽的患者每天接受0.1-100ug/kg此多肽，連續(xù)6天。此多肽優(yōu)選可溶性的和/或分泌形式的。實施例15TNFR-6α和/或TNFR-6β升高水平的治療方法本發(fā)明還涉及對需要升高體內(nèi)TNFR-6α和/或TNFR-6β生物學(xué)活性的個體進行治療的方法，此方法包括向此個體施與治療學(xué)有效量的TNFR-6α和/或TNFR-6β激動劑組成的組合物。
反義技術(shù)被用于抑制TNFR-6α和/或TNFR-6β的產(chǎn)生。由于各種不同的病因?qū)W例如癌癥，此技術(shù)是降低TNFR-6α和/或TNFR-6β多肽水平，優(yōu)選可溶性的和/或分泌形式的TNFR-6α和/或TNFR-6β水平的一個例子。
例如，被診斷為具有異常的TNFR-6α和/或TNFR-6β水平的個體被靜脈注射反義寡核苷酸，注射劑量為0.5，1.0，1.5，2.0和3.0mg/kg/天，持續(xù)21天。如果確認為耐受良好的話，休息7天后重復(fù)此項治療。實施例16離體使用基因治療的方法基因治療的一個方法是將能夠表達可溶性和/或成熟的TNFR-6α和/或TNFR-6β多肽的成纖維細胞移植入患者體內(nèi)。通常情況下，成纖維細胞通過皮膚活檢從受檢者獲得。所得到的組織被置于組織培養(yǎng)液中并被分解成許多小塊。小塊的組織被置于潮濕的組織培養(yǎng)瓶表面，每個瓶中大約可放置10塊這樣的組織。將培養(yǎng)瓶平置，蓋緊，置于室溫過夜。24小時后，翻轉(zhuǎn)培養(yǎng)瓶，組織塊仍然固著在培養(yǎng)瓶底部，加入新鮮培養(yǎng)基(例如Ham’s F12培養(yǎng)基，含有10％FCS，青霉素鏈霉素)。然后置于37℃培養(yǎng)大約7天。
此時，加入新鮮培養(yǎng)基并且每間隔幾天換液。另外培養(yǎng)2周后，形成成纖維細胞單層。用胰酶消化此細胞單層并分入大瓶中。
用EcoR I和Hind III消化側(cè)翼區(qū)帶有莫羅尼鼠肉瘤病毒長末端重復(fù)序列的pMV7(kirschmeier，R.T等，DNA 7219-225(1988))，然后用小牛腸磷酸酶處理。線性載體在瓊脂糖凝膠上分離并用玻璃珠法純化。
可使用分別對應(yīng)于編碼序列5’和3’端的引物PCR擴增編碼TNFR-6α和/或TNFR-6β的cDNA。優(yōu)選的5’端引物含有EcoR I位點并且3’端引物含有Hind III位點。等量的莫羅尼鼠肉瘤病毒線性骨架以及擴增的EcoR I和Hind III片段在T4 DNA連接酶存在的情況下被加入到一起。產(chǎn)物混合物在適于兩片段連接的條件下維持，以確保載體含有正確插入的TNFR-6α和/或TNFR-6β。
兩嗜性的pA317活GP+am12包裝細胞在含有10％小牛血清、青霉素鏈霉素的DMEM組織培養(yǎng)中生長至細胞匯片密度。然后加入含有TNFR-6α和/或TNFR-6β的MSV載體和用此載體轉(zhuǎn)導(dǎo)的包裝細胞。包裝細胞此時產(chǎn)生含有TNFR-6α和/或TNFR-6β基因的傳染性病毒顆粒(此時包裝細胞被稱做生產(chǎn)者細胞)。
新鮮培養(yǎng)基被加入到轉(zhuǎn)導(dǎo)的生產(chǎn)者細胞中，隨后，從10厘米生產(chǎn)者細胞完全匯片的培養(yǎng)瓶中收獲培養(yǎng)液。使用掉的含有傳染性病毒顆粒的培養(yǎng)液經(jīng)過微孔濾器過濾除去其中的生產(chǎn)者細胞，然后此培養(yǎng)液濾液被用于感染人成纖維細胞。從成纖維細胞的亞匯片培養(yǎng)瓶中除去培養(yǎng)基然后快速用來自生產(chǎn)者細胞的培養(yǎng)液替換。除去此培養(yǎng)液然后用新鮮培養(yǎng)基替換。如果病毒滴度高，那么幾乎所有的成纖維細胞被感染，就不用再選擇了；如果病毒滴度非常低，那么很有必要使用含有可選擇標記如neo或his的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體。一旦成纖維細胞被有效感染，就分析成纖維細胞以測定TNFR-6α和/或TNFR-6β蛋白是否產(chǎn)生。
然后將工程化的成纖維細胞移植入宿主體內(nèi)，單獨或生長至cytodex 3微載體上以后。實施例17體內(nèi)使用基因治療的方法本發(fā)明的另一方面是使用體內(nèi)基因治療方法治療紊亂、疾病以及類似情況。此基因治療方法涉及向動物體內(nèi)導(dǎo)入TNFR-6α和/或TNFR-6β裸核酸序列(DNA、RNA和反義DNA或RNA)以提高或降低TNFR-6α和/或TNFR-6β多肽的表達。TNFR-6α和/或TNFR-6β多核苷酸可操作地連接至啟動子或靶組織表達TNFR-6α和/或TNFR-6β多肽必需的其它遺傳成分。這樣的基因治療方法和運送技術(shù)是本領(lǐng)域已知的，見，例如國際申請公開號WO 90/11092；國際申請公開號WO 98/11779；美國專利號5693622；5705151；5580589；Tabata，H.等，心血管研究35470-479(1997)；Chao，J.等，藥物研究35517-522(1997)；Wolff，J.A.等，神經(jīng)肌肉紊亂7314-318(1997)；Schwartz，B.等，基因治療3405-411(1996)；Tsurumi，Y.等，循環(huán)943281-3290(1996)(以上文獻引入本文做參考)。
TNFR-6α和/或TNFR-6β多核苷酸構(gòu)建物可通過任何運送可注射物質(zhì)到動物細胞內(nèi)的方法被運送，例如注射至組織(心臟、肌肉、皮膚、肺、肝、腸及其它)間隙。TNFR-6α和/或TNFR-6β多核苷酸構(gòu)建物可再藥物學(xué)可接受的液體或水溶液載體中被運送。
術(shù)語“裸”寡核苷酸，DNA或RNA，意思是指不使用任何起輔助、促進或利于進入細胞的運送工具，包括病毒序列、病毒顆粒、脂質(zhì)體、lipofectin或沉淀試劑和其它。但是，TNFR-6α和/或TNFR-6β多核苷酸也可被包裹在脂質(zhì)體中運送(例如，F(xiàn)elgner等，(1995)，Ann.NY Acad.Sci，772126-139和Abdallah，B.等(1995)，生命的化學(xué)85(1)1-7的方法)，這可通過本領(lǐng)域熟練技術(shù)人員已知的方法制備。
用于基因治療的TNFR-6α和/或TNFR-6β多核苷酸載體構(gòu)建物優(yōu)選不整何入宿主基因組也不含有復(fù)制序列。任何強啟動子可被本領(lǐng)域熟練技術(shù)人員用于驅(qū)動DNA表達。于其它基因治療方法不同，將裸核酸序列導(dǎo)入靶細胞的一個優(yōu)點是細胞中多核苷酸合成的瞬時性。研究表明非復(fù)制性DNA序列可被引入細胞中以在最多至6個月的時間內(nèi)提供目的多肽的產(chǎn)生。
TNFR-6α和/或TNFR-6β多核苷酸構(gòu)建物可被運送至動物的組織包括肌肉、皮膚、腦、肺、肝、脾、骨髓、胸腺、心臟、淋巴、血液、骨、軟骨、胰腺、腎、膽囊、胃、腸、睪丸、卵巢、子宮、直腸、神經(jīng)系統(tǒng)、眼睛、腺體的組織間隙和連接組織中。組織間隙包括細胞間質(zhì)、器官組織網(wǎng)狀纖維中的粘多糖、血管壁或室壁的彈性纖維、纖維性組織的膠原纖維或連續(xù)組織中包裹肌肉組織或骨腔隙中的相同基質(zhì)。同樣還有被循環(huán)中的血漿和淋巴管中的淋巴液所占據(jù)的間隙。優(yōu)選向肌肉組織間隙運送藥物是因為以下原因它們可被方便地注射入包含這些細胞的組織中。它們優(yōu)選被運送至持續(xù)、分化但未分裂的細胞中表達，盡管它們也可被運送至未分化的或未完全分化的細胞例如血液中的干細胞或皮膚成纖維細胞中并表達。體內(nèi)肌細胞特別勝任于攝入并表達多核苷酸。
對于裸的TNFR-6α和/或TNFR-6β多核苷酸注射來說，有效劑量的DNA或RNA范圍將在大約0.05g/kg到大約50g/kg之間，優(yōu)選劑量范圍將在大約0.005mg/kg到大約20g/kg之間，更優(yōu)選劑量范圍將在大約0.05mg/kg到大約5mg/kg之間。當(dāng)然，本領(lǐng)域熟練技術(shù)人員所要明白的是，這個劑量將隨注射部位的變化而改變。核酸序列的有效劑量可很容易地被本領(lǐng)域熟練技術(shù)人員所確定，并且它取決于待治療的情況和施與方式。優(yōu)選的施與方式是通過非胃腸道途徑注射入組織間隙。但是，也可使用其它的非胃腸道途徑例如吸入特別是用于運送至肺或支氣管組織、喉或鼻粘膜的噴霧劑型。此外，裸的TNFR-6α和/或TNFR-6β多核苷酸構(gòu)建物可在血管成形術(shù)中通過導(dǎo)管而被施與到動脈內(nèi)。
可通過下列方法測定注射入的TNFR-6α和/或TNFR-6β多核苷酸的體內(nèi)劑量應(yīng)答效應(yīng)。根據(jù)標準的重組DNA方法學(xué)，合適的TNFR-6α和/或TNFR-6β模板DNA被用于產(chǎn)生編碼TNFR-6α和/或TNFR-6β多肽的mRNA。環(huán)狀或線性的模板DNA或以裸DNA形式被使用，或與脂質(zhì)體形成復(fù)合物。然后用不同劑量的模板DNA注射小鼠四頭肌。
通過腹膜內(nèi)注射0.3ml 2.5％的阿佛丁麻醉5-6周齡的Bala/b雌鼠和雄鼠。在大腿前方切開一段長1.5厘米的傷口就可直接看到股四頭肌。在0.1ml載體中的TNFR-6α和/或TNFR-6β模板DNA就可通過使用帶有27號針頭的1毫升注射器在1分鐘的時間內(nèi)注射到肌肉中，從遠端插入點到膝蓋大約1.5厘米，插入深度為0.2厘米。注射部位染色以利于將來識別，皮膚用不銹鋼夾固定。
孵育一段合適的時間之后(例如，7天)切除小鼠的整個四頭肌制備肌肉提取物。對每個小鼠的四頭肌肌肉組織部分進行組織化學(xué)染色以測定TNFR-6α和/或TNFR-6β蛋白的表達。TNFR-6α和/或TNFR-6β蛋白的表達時間可以以相似的方式測定除了不同小鼠的四頭肌在不同時間收獲之外。注射以后，TNFR-6α和/或TNFR-6β DNA在肌肉中的持續(xù)時間可在制備注射鼠以及對照鼠的總細胞DNA以及HIRT上清以后通過Southern印跡分析來測定。上述小鼠實驗的數(shù)據(jù)可被用于在人以及其它動物中使用TNFR-6α和/或TNFR-6β裸DNA時推測合適的劑量以及其它的治療參數(shù)。實施例18兔子下肢模型中局部缺血的拯救為研究TNFR-6α和/或TNFR-6β模板在體內(nèi)對局部缺血的影響，如前所述手術(shù)去除兔子一只后肢的股動脈而建立了兔子后肢局部缺血模型(Takeshita等，美國病理學(xué)期刊1471649-1660(1995))。股動脈的切除導(dǎo)致了血栓的變性散播并且阻塞了外部的髖動脈，因此，血液流至局部缺血后肢只能依賴于深部髖動脈分支的平行血管(Takeshita等，美國病理學(xué)期刊1471649-1660(1995))。術(shù)后有10天的間隔期以利于兔子的手術(shù)后恢復(fù)以及內(nèi)源性平行血管的生成。術(shù)后第10天(第0天)，在進行基底膜血管造影后，根據(jù)所述的方法通過水凝膠氣囊管動脈基因轉(zhuǎn)移技術(shù)用500mg裸的TNFR-6α和/或TNFR-6β表達質(zhì)粒轉(zhuǎn)染局部缺血后肢的深部髖動脈(Riessen，R等，人體基因治療4749-758(1993)；Leclerc，G等，臨床投資90936-944(1992))。當(dāng)用于治療中時，500mg單一塊狀的蛋白質(zhì)或?qū)φ胀ㄟ^輸液管在大約1分鐘左右的時間內(nèi)被運送至局部缺血肢的深部髖動脈。在第30天，測量這只兔子的各種不同的參數(shù)(a)BP比率-局部缺血肢的收縮壓于正常肢的收縮壓之比；(b)血流以及血流儲備-剩余FL血管未擴張的情況下的血流和最大FL血管充分擴張的情況下的血流(也作為血管容量的一個間接指標)，并且最大FL與剩余FL的比率反映了血流儲備；(c)血管造影值-對平行血管進行血管造影所測定的數(shù)值。此數(shù)值是通過在一覆蓋的柵格中的具有交叉的不透明化動脈除以兔大腿的總數(shù)m的圓圈百分比測定的；(d)毛細血管密度-從后肢切片顯微鏡視野中平行血管的數(shù)目。
本實施例所描述的研究檢測了TNFR-6蛋白的活性。但是，本領(lǐng)域熟練技術(shù)人員應(yīng)該能夠很容易地改動實施例中的方法以檢測TNFR-6α和/或TNFR-6β多核苷酸(例如，基因治療)、激動劑和/或拮抗劑。實施例19糖尿病小鼠以及糖皮質(zhì)類固醇損傷的傷口愈合模型A.db+/db+糖尿病小鼠模型為證明TNFR-6促進傷口愈合過程，我們使用了傷口愈合的糖尿病小鼠模型。在db+/db+小鼠的全皮厚度傷口愈合模型是一種鑒定清楚的、臨床相關(guān)的并且可繁殖的損傷傷口愈合模型。糖尿病性傷口的愈合取決于肉芽組織的形成以及上皮重新形成而不是締結(jié)(Gartner，M.H.等外科研究52389(1992)；Greenhalgh，D.G等，美國病理學(xué)1361235(1990))。
糖尿病動物具有許多在II型糖尿病中觀察到的典型特征。與雜合子鼠(db+/+m)相比，純合子小鼠(db+/db+)脂肪較多一些。糖尿病小鼠突變體(db+/db+)在染色體4(db+)上存在一個隱性的單一常染色體突變(Coleman等，Proc.Nat.Acad.Sci.USA 77283-293(1982))。動物表現(xiàn)為貪食、多飲、多尿。糖尿病小鼠突變體(db+/db+)血糖升高，胰島素水平升高或正常并且細胞介導(dǎo)的免疫受到抑制(Mandel等，免疫學(xué)期刊1201375(1978)；Debray-Sachs，M等，臨床實驗免疫學(xué)51(1)1-7(1983)；Leiter等，美國病理學(xué)11446-55(1985))。外周神經(jīng)病、心肌綜合癥、微血管損傷、基底膜加厚和腎小球滲透性異常也已在這些動物中有所報道(Norido，F(xiàn)等，實驗神經(jīng)學(xué)83(2)221-232(1984)；Roberston等，糖尿病29(1)60-67(1980)；Giacomelli等，實驗室投資40(4)460-473(1979)；Coleman，D.L.等，糖尿病31(增刊)1-6(1982))。這些純合子糖尿病小鼠發(fā)展為與人類II型糖尿病相似的抗胰島素的高血糖癥(Mandel等，免疫學(xué)期刊1201375(1978))。
在這些動物中觀察到的特征表明此模型中傷口的愈合與人糖尿病中傷口愈合相似(Greenhalgh，D.G等，美國病理學(xué)1361235-1246(1990))。
糖尿病雌鼠C57BL/KsJ(db+/db+)以及與其同窩的非糖尿病雜合子(db+/+m)被用于此研究之中。開始實驗時動物6-8周齡大小。每只動物單獨飼養(yǎng)并且給予充足的食物和水。所有的操作都是無菌操作。實驗是在人類基因組科學(xué)有限公司的研究型動物使用規(guī)則和條例以及實驗動物使用規(guī)定之下進行的。
根據(jù)前述的報道造成創(chuàng)傷(Tsuboi，R.和Rifkin，D.B.，實驗醫(yī)學(xué)172245-251(1990))。簡言之，創(chuàng)傷前一天，腹膜內(nèi)注射溶于去離子水中的阿佛丁(0.01mg/ml)、2，2，2-三溴乙醇和methyl-2-butanol以麻醉動物。注射區(qū)域進行剃毛處理，并用酒精以及碘酒棉球消毒。創(chuàng)傷之前，手術(shù)區(qū)域用無菌紗布干燥。使用Keyes組織穿刺造成8毫米的全皮厚度創(chuàng)傷。創(chuàng)傷之后，輕柔局部組織以防止傷口擴展。在整個治療期間傷口都是開放的。在造成創(chuàng)傷的當(dāng)天開始一項連續(xù)5天的局部治療。在治療前用無菌生理鹽水以及無菌棉球清洗局部傷口。
自手術(shù)之日起每隔兩日觀察傷口并且在固定距離照相。傷口愈合是通過在第1至第5天每日測量以及第8天的測量所測定的。使用Jameson測徑器水平以及垂直測量傷口。如果肉芽組織不再可見并且傷口被連續(xù)的上皮所覆蓋，那么就認為傷口愈合了。
每個傷口每天施與不同劑量的TNFR-6α和/或TNFR-6β蛋白，從4mg到500mg不等。載體對照組施與50ul的運送液體。
第8天腹膜內(nèi)注射戊巴比妥鈉實施安樂死(300mg/kg)。采集傷口以及周圍組織用于組織學(xué)以及免疫組化研究。組織標本是置于10％的中性緩沖的福爾馬林中的。
共評價了3組小鼠每組十只(5只糖尿病小鼠+5只非糖尿病對照小鼠)，評價1)運送載體安慰對照，2)TNFR-6α和/或TNFR-6β。
傷口愈合是通過縱向及橫向測量傷口直徑從而獲得傷口面積大小而分析的。傷口的收縮值是通過創(chuàng)傷時的面積(第0天)和治療結(jié)束后(第8天)的面積之間的差值算出來的。第1天時創(chuàng)傷面積時64平方厘米，對應(yīng)于皮膚穿刺的面積大小。通過下列公式計算第8天的開放面積-第1天的開放面積/第1天的開放面積標本用10％中性緩沖的福爾馬林固定，石蠟垂直插入傷口表面(5mm)，用Reichert-Jung組織切片機進行組織切片。在等分的傷口的交聯(lián)部分進行常規(guī)的嗜酸蘇木精染色。傷口的組織學(xué)檢查嗜用于評價是否愈合過程和修復(fù)皮膚的形態(tài)學(xué)再現(xiàn)受到TNFR-6治療的改變。這種評價包括證實細胞聚集、炎性細胞、血管、成纖維細胞、上皮重新形成的存在和皮膚成熟度(Greenhalgh，D.G等，美國病理學(xué)1361235(1990))。
使用ABC Elite檢測系統(tǒng)對組織切片部分進行兔抗人角蛋白多克隆抗體免疫組化染色。人皮膚被用做陽性對照，非免疫IgG被用做陰性對照。角質(zhì)形成細胞的生長是使用帶有測量鏡頭的測微儀評價上皮重新形成的程度而測定的。
使用ABC Elite檢測系統(tǒng)用PCNA抗體(1∶50)檢測出了皮膚標本中的增殖細胞核抗原(PCNA)。人結(jié)腸癌組織作為陽性對照，人腦組織作為陰性對照。每個標本都有一部分忽略了一抗，而用非免疫小鼠IgG替代。根據(jù)增殖的程度以增殖尺度0-8表示對這些組織部分排序，尺度低表明輕微增殖，否則是劇烈增殖。
實驗數(shù)據(jù)是使用不配對t檢驗分析的。P值小于0.05被認為是顯著的。
B.類固醇損傷的大鼠模型在各種體外以及體內(nèi)系統(tǒng)中都有記載表明類固醇很有效地抑制傷口愈合(Wahl，S.M.，糖皮質(zhì)類固醇和傷口愈合，在抗炎性類固醇作用基礎(chǔ)和臨床280-302頁(1989)；Wahl，S.M.，免疫學(xué)期刊115476-481(1975)；Werb，Z.等，實驗醫(yī)學(xué)1471684-1694(1978))。糖皮質(zhì)類固醇通過抑制血管生成，降低血管通透性(Ebert，R.H.等，An.Intern.Med.37701-705(1952))，抑制成纖維細胞增殖和膠原蛋白合成(Beck，L.S.等，生長因子5295-304(1991)；Haynes，B.F.等，臨床投資61703-797(1978))并且產(chǎn)生對循環(huán)單核細胞的瞬時減少(Haynes，B.F.等，臨床研究61703-797(1978)；Wahl，S.M.，糖皮質(zhì)類固醇和傷口愈合，在抗炎性類固醇作用基礎(chǔ)和臨床280-302頁(1989))而阻礙傷口愈合。全身施與類固醇破壞傷口愈合在大鼠中時一個已經(jīng)建立的現(xiàn)象(Beck，L.S.等，生長因子5295-304(1991)；Haynes，B.F.等，臨床投資61703-797(1978)；Wahl，S.M.，糖皮質(zhì)類固醇和傷口愈合，在抗炎性類固醇作用基礎(chǔ)和臨床280-302頁(1989)；Pierce，G.F等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 862229-2233(1989))。
為證明TNFR-6α和/或TNFR-6β能夠加速傷口愈合過程，評價了在創(chuàng)傷愈合已經(jīng)被全身施與甲基強的松龍所破壞的大鼠全皮厚度切開創(chuàng)傷局部多次應(yīng)用TNFR-6的效果。
本實施例所用的大鼠是體重250-300克的雄性SD鼠。開始實驗時動物8-9周齡大小。已經(jīng)表明在造成創(chuàng)傷時全身施與甲基強的松龍(17mg/kg/rat，肌肉注射)破壞創(chuàng)傷的愈合。每只動物單獨飼養(yǎng)并且給予充足的食物和水。所有的操作都是無菌操作。實驗是在人類基因組科學(xué)，研究型動物使用規(guī)則和條例以及實驗動物使用規(guī)定之下進行的。
創(chuàng)傷方法見上述A部分。創(chuàng)傷前一天，肌肉注射鹽酸氯酮胺(50mg/kg)和鹽酸噻拉嗪(5mg/kg)以麻醉動物。注射區(qū)域進行剃毛處理，并用酒精以及碘酒棉球消毒。創(chuàng)傷之前，手術(shù)區(qū)域用無菌紗布干燥。使用Keyes組織穿刺造成8毫米的全皮厚度創(chuàng)傷。創(chuàng)傷之后，輕柔局部組織以防止傷口擴展。在整個治療期間傷口都是開放的。在造成創(chuàng)傷并且注射甲基強的松龍的當(dāng)天開始一項連續(xù)7天的局部應(yīng)用待測物質(zhì)的治療。在治療前用無菌生理鹽水以及無菌棉球清洗局部傷口。
自手術(shù)之日起每隔兩日觀察傷口并且在固定距離照相。傷口愈合是通過在第1至第5天每日測量以及第8天的測量所測定的。使用Jameson測徑器水平以及垂直測量傷口。如果肉芽組織不再可見并且傷口被連續(xù)的上皮所覆蓋，那么就認為傷口愈合了。
每個傷口每天施與不同劑量的TNFR-6α和/或TNFR-6β蛋白，從4mg到500mg不等。載體對照組施與50ul的運送液體。
第8天腹膜內(nèi)注射戊巴比妥鈉實施安樂死(300mg/kg)。采集傷口以及周圍組織用于組織學(xué)以及免疫組化研究。組織標本是置于10％的中性緩沖的福爾馬林中的。
共評價了4組大鼠每組十只(5只甲基強的松龍+5只無糖皮質(zhì)類固醇鼠)，評價1)未治療組，2)運送載體安慰對照，3)TNFR-6α和/或TNFR-6β。
傷口愈合是通過縱向及橫向測量傷口直徑從而獲得傷口面積大小而分析的。傷口的收縮值是通過創(chuàng)傷時的面積(第0天)和治療結(jié)束后(第8天)的面積之間的差值算出來的。第1天時創(chuàng)傷面積時64平方厘米，對應(yīng)于皮膚穿刺的面積大小。通過下列公式計算第8天的開放面積-第1天的開放面積/第1天的開放面積標本用10％中性緩沖的福爾馬林固定，石蠟垂直插入傷口表面(5mm)，用奧林巴斯組織切片機進行組織切片。在等分的傷口的交聯(lián)部分進行常規(guī)的嗜酸蘇木精染色。傷口的組織學(xué)檢查嗜用于評價是否愈合過程和修復(fù)皮膚的形態(tài)學(xué)再現(xiàn)受到TNFR-6α和/或TNFR-6β治療的改變。無經(jīng)驗觀察者可使用帶有測量鏡頭的測微儀以決定傷口的位置。
實驗數(shù)據(jù)是使用不配對t檢驗分析的。P值小于0.05被認為是顯著的。
本實施例所描述的研究檢測了TNFR-6蛋白的活性。但是，本領(lǐng)域熟練技術(shù)人員應(yīng)該能夠很容易地改動實施例中的方法以檢測TNFR-6α和/或TNFR-6β多核苷酸(例如，基因治療)、激動劑和/或拮抗劑。實施例20淋巴水腫動物模型本實驗的目的時建立一個合適的持續(xù)的淋巴水腫模型以用于在大鼠后肢檢測對淋巴血管生成以及淋巴循環(huán)系統(tǒng)重建的治療效果。效果是通過測量受影響肢的腫脹體積、對淋巴血管系統(tǒng)數(shù)目定量、總血漿蛋白以及組織病理而評價的。觀察到的急性水腫通常7-10天?？赡芨匾模[的慢性進展長至3-4周。
在開始手術(shù)以前，進行血樣的蛋白質(zhì)濃度分析。雄鼠體重大約在350克左右，注射戊巴比妥。隨后，右腿從膝到臀剃毛，用70％酒精棉球消毒。采血測定血清中總蛋白。在給爪子注射染料之前測量周長和體積。左右爪的皮下都注射0.05毫升1％的伊文斯藍。折射染料后，再次測量周長和體積。
以膝關(guān)節(jié)為標志，在腿中部腹股溝處環(huán)繞切開以定位股血管。鑷子和止血鉗被用于切開以及分離皮膚。在找到股血管后，那么在股血管旁側(cè)以及其下的淋巴血管就找到了。在此部位的主淋巴血管被電凝結(jié)然后再縫合到一起。
使用顯微鏡切開腿背后的肌肉組織找到PP淋巴結(jié)。兩個近端以及兩個遠端的淋巴血管以及向PP淋巴結(jié)供血的遠端血管被縫合連接。去除PP淋巴結(jié)以及其所連接的脂肪組織。
此過程應(yīng)該十分小心防止出血。淋巴被阻塞以后，使用液體皮膚是傷口皮膚回合。或縫合將肌肉縫合在內(nèi)。
為避免感染，動物單獨飼養(yǎng)。每日通過觀察水腫高度而檢查復(fù)原的動物，通常在第5-7天發(fā)生，水腫部位變平。為評價淋巴水腫的程度，每個爪子的2個指定位置在手術(shù)開始時以及術(shù)后第7天測量周長和體積。檢測淋巴水腫的血漿效應(yīng)蛋白并且研究是否蛋白質(zhì)分析時有用的實驗參數(shù)。在兩處評價對照以及水腫肢的重量。分析采取隨即分析的方式。
周長測量簡單氣體麻醉以防止動物移動，使用布條測量周長。分別在踝骨處和爪背由2個不同的人測量，取讀數(shù)的平均值。測量對照組以及水腫肢的讀數(shù)。
體積測量手術(shù)當(dāng)天，用戊巴比妥麻醉動物并在術(shù)前測量。對于日常的體積測量，使用簡單的氣體麻醉即可。雙腿都去毛并且用防水筆標記。將腿浸入水中，標記位置并用Buxco水腫軟件測量。兩人操作，一人記錄數(shù)據(jù)，另一人將鼠腿浸入水中。
血液-血漿蛋白分析在術(shù)前以及實驗結(jié)束時采集血液、離心得到血清，測量總蛋白以及鈣離子水平并比較。
肢重比較采集血液以后，動物被用于組織收集。在關(guān)節(jié)連接處切除整個后肢然后稱重。第二次稱重時在關(guān)節(jié)處切斷，僅測量足的重量。
組織學(xué)制備膝后區(qū)域的肌肉被切除下來并置于金屬模子重，充滿凍膠，然后浸入冷的methylbutane中，裝入標記樣品袋直至切開。然后在熒光顯微鏡下觀察。目前正在評價其它的免疫/組織學(xué)方法。
本實施例所描述的研究檢測了TNFR-6蛋白的活性。但是，本領(lǐng)域熟練技術(shù)人員應(yīng)該能夠很容易地改動實施例中的方法以檢測TNFR-6α和/或TNFR-6β多核苷酸(例如，基因治療)、激動劑和/或拮抗劑。
很明白本發(fā)明可以通過其它不同于前述方法和實施例的方法實踐。但是，根據(jù)此前的描述，任何對本發(fā)明的修改和變化都在本發(fā)明附屬的權(quán)利要求的范圍之內(nèi)。實施例21TNFR6-Fc在肝損傷的ConA鼠模型中抑制FasL介導(dǎo)的細胞毒性向小鼠靜脈注射刀豆蛋白A激活T淋巴細胞并且誘導(dǎo)肝細胞的凋亡和壞死死亡，模仿了慢性肝炎的病理生理學(xué)特性(Tiegs等，臨床投資90196(1992))。被希望抑制Fas配體活性的Fas的一種嵌合形式Fas-Fc已被報道可在這種模型中通過抑制Fas配體而降低肝損傷表明Fas途徑也涉及到病理學(xué)之中(Ksontini等，免疫學(xué)期刊60(8)4082-4089(1998))。
模型的證明為證明ConA小鼠模型，向Balb/c小鼠靜脈注射刀豆蛋白A，劑量分別為10，15和20mg/kg，對照組每鼠注射97.5mg安慰劑或Fas-Fc。治療組每組10只小鼠。治療后22小時，殺死小鼠采集血清使用臨床生化分析儀ILAB90進行生化分析測定肝中特異性的肝損傷時釋放至血清的轉(zhuǎn)氨酶、丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶以及天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶水平(Tiegs等，臨床投資90196(1992))。在存在10-15mg/kg而不是20mg/kg的ConA時，向小鼠靜脈注射97.5mg Fas-Fc可明顯抑制升高的肝酶水平，因此，證明了本模型。
向Balb/c小鼠靜脈注射刀豆蛋白A，劑量15mg/kg，同時注射或不注射三個對數(shù)劑量的TNFR6-Fc(0.6，6，60ug/鼠)。本實施例中所用的TNFR6-Fc對應(yīng)于融合至Fc的全長TNFR-6α多肽序列(SEQID NO2的1-300氨基酸)。每治療組10只小鼠。治療后22小時，殺死小鼠采集血清使用臨床生化分析儀ILAB90進行生化分析測定丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶以及天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶水平。注射TNFR6-Fc，在最高劑量(60mg/鼠，3mg/kg)時明顯抑制50％的ALT和AST(數(shù)據(jù)未顯示)。因此，TNFR6-Fc以劑量應(yīng)答的方式顯著降低血清中ConA誘導(dǎo)的AST和ALT水平。
TNFR6-Fc對ConA在肝中誘導(dǎo)的凋亡的影響由于血清中肝酶水平的升高反映了肝細胞破壞的凋亡途徑以及非凋亡途徑，因此，對肝損傷程度的一個更關(guān)鍵的測定可以通過對凋亡的測量來完成。凋亡是使用從用TNFR6-Fc和ConA處理的小鼠中分離的全肝細胞懸液而分析的。在同一樣品上檢測了三個獨立的凋亡標志，包括三磷酰絲氨酸表面表達的改變、DNA損傷的測量以及caspase激活。
向Balb/c小鼠靜脈注射刀豆蛋白A(劑量15mg/kg)，同時注射或不注射三個對數(shù)劑量的TNFR6-Fc(0.6，6，60ug/鼠)。利用每組三只小鼠的肝制備細胞懸液，將完整的肝組織置于70um細胞篩中，用5毫升注射器內(nèi)芯破碎肝組織，使用含由10％FCS的RPMI 1640培養(yǎng)基制備肝細胞懸液。為除去紅細胞以及組織殘渣，將過濾的細胞懸液置于淋巴細胞分離液上。收集界面層的細胞，洗滌并計數(shù)。在上流式細胞儀分析之前，用40um濾器再次過濾細胞懸液。
為測量Annexin V(凋亡指示劑)的結(jié)合，細胞先與熒光素標記的單抗CD45 CyChrome和B220或PE標記的抗TCRβ(Pharmingen，San Diego，CA)。用結(jié)合緩沖液洗滌細胞然后與FITC標記的AnnexinV孵育。使用Becton Dickinson流式細胞儀分析染色的細胞。只有CD45陽性的情況被收集。B220和Annexin V染色的細胞被認為是凋亡的B細胞；抗TCRβ和Annexin V染色的細胞被認為是凋亡的T細胞。
通過末端UTP缺刻標記(TUNEL)測定DNA的降解(凋亡的另一個標志)，末端UTP缺刻標記是使用Apo-DIRECT試劑盒利用TdT酶將FITC標記的dUTP加入到缺刻DNA的3’末端而測定這種DNA降解的。簡言之，用1％的多聚甲醛固定細胞，用PBS洗滌然后用冰預(yù)冷的70％乙醇固定。用洗滌液洗滌細胞兩次，然后與含由TdT酶和dUTP-FITC的染色液37℃孵育1小時。用沖洗液洗滌兩次，重懸于PI溶液中然后進行上機分析。對于分析來說，電門設(shè)置為單一，并且dUTP-FITC染色的細胞即被認為是凋亡細胞。
為測定活性形式caspase-3(凋亡的早期指示劑)的存在，細胞于IC FIX孵育，用PBS洗滌兩次，然后滲透過IC PERM。細胞與ICPERM中的5ug PE標記的大鼠抗caspase-3抗體孵育，在IC PERM中洗滌，然后再用PBS洗滌兩次。然后進行上機分析平均的PE熒光度。
對于凋亡的這三種指示劑來說，與只用ConA處理的小鼠相比，TNFR6-Fc抑制小鼠肝中的凋亡(表VI)。使用DNA損傷作為標志再TUNEL分析中觀察到TNFR6-Fc的抑制是以一種劑量依賴的方式發(fā)生的。這些數(shù)據(jù)支持了TNFR6-Fc在抑制ConA誘導(dǎo)的肝炎中的凋亡作用。
表VI從TNFR6-Fc處理的小鼠分離的肝細胞的凋亡1由以下方法測定的凋亡細胞百分比處理 Tunel Caspase-3 Annexin AnnexinV/TcRβ V/B220未處理的對照 -18.7 2.0 6.1ConA(15mg/kg)對照 24.4 35.2 7.0 12.2TNFR6-Fc(0.6μg/小鼠) 15.6 22.7 3.5 6.3TNFR6-Fc(6.0μg/小鼠) 13.6 22.5 2.3 2.9TNFR6-Fc(60μg/小鼠) 9.5 20.3 3.0 4.21肝細胞懸液用三種獨立測量的一種分析凋亡。用TUNEL染色測量DNA降解；通過分析caspase-3的活性形式分析caspase活化；annexin V染色分析表面膜變化。從3只小鼠/組的肝分離細胞懸液并合并。得到的合并的懸液用于進行每項分析。對于Annexin染色，只獲取CD45+肝細胞并且Annexin V與TCRβ或B220進行共染色分析。
結(jié)論TNFR6-Fc既降低ConA誘導(dǎo)的血清中AST和ALT水平又降低由ConA誘導(dǎo)的肝細胞凋亡支持了本發(fā)明的TNFR-6α和TNFR-6β多肽在治療和/或抑制肝炎和其它形式肝損傷中的治療性應(yīng)用。
以上所有的出版物(包括專利、專利出版物、學(xué)術(shù)期刊文獻、實驗指南、書或其它文獻)全文引入本文做參考。
權(quán)利要求
1.一種分離的核酸分子，其包含具有與選自以下一組的序列具有至少80％，85％，90％，或95％相同性的核苷酸序列的多核苷酸(a)編碼具有SEQ ID NOS2和4的完整氨基酸序列，或如ATCC保藏號為97810和97809中所包含的cDNA克隆所編碼的完整氨基酸序列的TNFR多肽的核苷酸序列；(b)編碼具有SEQ ID NO2中31-300位氨基酸序列或SEQ IDNO4中31-170位氨基酸序列的成熟TNFR多肽，或編碼如ATCC保藏號為97810和97809中所包含的cDNA克隆所編碼的成熟多肽的核苷酸序列；(c)編碼具有SEQ ID NO2中31-283位氨基酸序列或SEQ IDNO4中31-166位氨基酸序列的TNFR多肽的可溶性胞外區(qū)的核苷酸序列；(d)與上述(a)(b)或(c)中任何一種核苷酸序列互補的核苷酸序列。
2.如權(quán)利要求1的核酸分子，其中所述的多核苷酸具有選自SEQ ID NO1和SEQ ID NO3的完整核苷酸序列。
3.如權(quán)利要求1的核酸分子，其中所述的多核苷酸的核苷酸序列編碼具有選自SEQ ID NO2和SEQ ID NO4的完整氨基酸序列的TNFR多肽。
4.如權(quán)利要求1的核酸分子，其中所述的多核苷酸的核苷酸序列編碼具有SEQ ID NO2中31-300位氨基酸序列或SEQ ID NO4中31-170位氨基酸序列的成熟TNFR多肽。
5.如權(quán)利要求1的核酸分子，其中所述的多核苷酸的核苷酸序列編碼具有SEQ ID NO2中31-283位氨基酸序列或SEQ ID NO4中31-166位氨基酸序列的TNFR多肽的可溶性胞外區(qū)。
6.一種分離的核酸分子，其包含具有與選自以下一組的序列具有至少80％，85％，90％，或95％相同性的核苷酸序列的多核苷酸(a)編碼具有SEQ ID NO2中m-300位氨基酸殘基序列的多肽的核苷酸序列，其中m是1-49之間的整數(shù)；(b)編碼具有SEQ ID NO4中n-170位氨基酸殘基序列的多肽的核苷酸序列，其中n是1-49之間的整數(shù)；(c)編碼具有SEQ ID NO2中1-y位氨基酸殘基序列的多肽的核苷酸序列，其中y是193-300之間的整數(shù)；(d)編碼具有SEQ ID NO4中1-z位氨基酸殘基序列的多肽的核苷酸序列，其中z是132-170之間的整數(shù)；和(e)編碼具有SEQ ID NO2中m-y位或SEQ ID NO4中n-z位氨基酸殘基序列的多肽的核苷酸序列，其中m，n，y，z分別見上面(a)，(b)，(c)或(d)中的定義。
7.一種分離的核酸分子，其包含具有與選自以下一組的序列具有至少80％，85％，90％，或95％相同性的核苷酸序列的多核苷酸(a)編碼由ATCC保藏號為97810或97809中所含的cDNA克隆所編碼的完整TNFR氨基酸序列的一部分的多肽的核苷酸序列，其中所述部分不包括由ATCC保藏號為97810或97809中所含的cDNA克隆所編碼的所述完整氨基酸序列的氨基末端的第1位到第48位氨基酸；(b)編碼由ATCC保藏號為97810或97809中所含的cDNA克隆所編碼的完整TNFR氨基酸序列的一部分的多肽的核苷酸序列，其中所述部分不包括分別由ATCC保藏號為97810和97809中所含的cDNA克隆所編碼的所述完整氨基酸序列的羧基末端的第1位到第107位氨基酸和第1位到第38位氨基酸；(c)編碼由ATCC保藏號為97810或97809中所含的cDNA克隆所編碼的完整TNFR氨基酸序列的一部分的多肽的核苷酸序列，其中所述部分包括(a)和(b)各個克隆中氨基端和羧基端缺失的的任何一種組合。
8.如權(quán)利要求1的核酸分子，其中所述的多核苷酸具有ATCC保藏號97810和97809中所包含的cDNA克隆的完整核苷酸序列。
9.如權(quán)利要求1的核酸分子，其中所述的多核苷酸的核苷酸序列編碼具有由ATCC保藏號97810和97809中所包含的cDNA克隆所編碼的完整氨基酸序列的TNFR多肽。
10.如權(quán)利要求1的核酸分子，其中所述的多核苷酸的核苷酸序列編碼具有由ATCC保藏號97810和97809中所包含的cDNA克隆所編碼的氨基酸序列的成熟TNFR多肽。
11.一種分離的核酸分子，其包含在嚴格雜交條件下與具有與權(quán)利要求1(a)(b)(c)或(d)中核苷酸序列相同的核苷酸序列的多核苷酸雜交的多核苷酸，所述的多核苷酸在嚴格雜交條件下不與具有僅由A殘基或僅由T殘基構(gòu)成的核苷序列的多核苷酸雜交。
12.一種分離的核酸分子，其包含編碼具有權(quán)利要求1(a)(b)(c)或(d)中氨基酸序列的TNFR多肽的表位攜帶部分的氨基酸序列的多核苷酸。
13.如權(quán)利要求12的核酸分子，其編碼由選自下列氨基酸組成的TNFR多肽的表位攜帶部分SEQ ID NO2中從大約第31位丙氨酸到大約第46位蘇氨酸殘基，從大約第57位苯丙氨酸到大約第117位蘇氨酸殘基，從大約第132位半胱氨酸到大約第175位蘇氨酸殘基，從大約第185位甘氨酸到大約第194位蘇氨酸殘基，從大約第205位纈氨酸到大約第217位天冬氨酸殘基，從大約第239位脯氨酸到大約第264位亮氨酸殘基，和從大約第283位丙氨酸到大約第298位脯氨酸殘基；和SEQ ID NO4中從大約第31位丙氨酸到大約第46位蘇氨酸殘基，從大約第57位苯丙氨酸到大約第80位谷氨酰胺殘基，從大約第86位谷氨酸到大約第106位組氨酸殘基，從大約第108位蘇氨酸到大約第119位苯丙氨酸殘基，從大約第129位組氨酸到大約第138位纈氨酸殘基，和從大約第142位甘氨酸到大約第166位脯氨酸殘基。
14.一種制備重組載體的方法，包括將權(quán)利要求1分離的核酸分子插入到載體中。
15.如權(quán)利要求14的方法制備的重組載體。
16.一種制備重組宿主細胞的方法，包括將權(quán)利要求15的重組載體導(dǎo)入到宿主細胞。
17.如權(quán)利要求16的方法制備的重組宿主細胞。
18.一種生產(chǎn)TNFR多肽的重組方法，包括在合適條件下培養(yǎng)權(quán)利要求17的重組宿主細胞以使得所述多肽表達，并回收所述多肽。
19.分離的TNFR多肽，其包含與選自下列一組的氨基酸序列具有至少80％，85％，90％，或95％相同性的氨基酸序列(a)具有SEQ ID NOS 2或4中所示的完整氨基酸序列的或如ATCC保藏號97810或97809中所含cDNA克隆所編碼的全長TNFR多肽的氨基酸序列；(b)具有SEQ ID NO2中31-300位氨基酸序列或SEQ ID NO4中31-170位氨基酸序列，或如ATCC保藏號為97810和97809中所包含的cDNA克隆所編碼的成熟TNFR多肽的氨基酸序列；(c)具有SEQ ID NO2中31-283位氨基酸序列或SEQ ID NO4中31-166位氨基酸序列，或如ATCC保藏號為97810和97809中所包含的cDNA克隆所編碼的TNFR多肽的可溶性胞外區(qū)的氨基酸序列。
20.包括TNFR蛋白質(zhì)表位攜帶部分的分離的多肽，其中所述的部分是含有選自下列氨基酸殘基的多肽SEQ ID NO2中從大約第31位丙氨酸到大約第46位蘇氨酸殘基，從大約第57位苯丙氨酸到大約第117位蘇氨酸殘基，從大約第132位半胱氨酸到大約第175位蘇氨酸殘基，從大約第185位甘氨酸到大約第194位蘇氨酸殘基，從大約第205位纈氨酸到大約第217位天冬氨酸殘基，從大約第239位脯氨酸到大約第264位亮氨酸殘基，和從大約第283位丙氨酸到大約第298位脯氨酸殘基；和SEQ ID NO4中從大約第31位丙氨酸到大約第46位蘇氨酸殘基，從大約第57位苯丙氨酸到大約第80位谷氨酰胺殘基，從大約第86位谷氨酸到大約第106位組氨酸殘基，從大約第108位蘇氨酸到大約第119位苯丙氨酸殘基，從大約第129位組氨酸到大約第138位纈氨酸殘基，和從大約第142位甘氨酸到大約第166位脯氨酸殘基。
21.與權(quán)利要求19的TNFR多肽特異性結(jié)合的分離的抗體。
22.一種對需要TNFR多肽活性的患者進行治療的方法，包括將權(quán)利要求19的TNFR多肽施與患者。
23.一種對需要TNFR多肽活性的患者進行治療的方法，包括將權(quán)利要求1的核酸施與患者。
全文摘要
本發(fā)明涉及新的腫瘤壞死因子受體蛋白,特別是提供了編碼人腫瘤壞死因子受體6α和6β蛋白的分離的核酸分子。本發(fā)明還提供了TNFR 6α和6β多肽,以及用于生產(chǎn)所述多肽的載體,宿主細胞和重組方法。本發(fā)明進一步涉及用于鑒定TNFR 6α和6β活性的激動劑和拮抗劑的篩選方法。本發(fā)明也提供了用于檢測免疫系統(tǒng)相關(guān)的紊亂的診斷方法和用于治療免疫系統(tǒng)相關(guān)的紊亂的治療方法。
文檔編號A61P3/10GK1345329SQ00804601
公開日2002年4月17日 申請日期2000年3月3日 優(yōu)先權(quán)日1999年3月4日
發(fā)明者賴納·L·根茨, 倪健, 賴因哈德·埃布納, 余國良, 史蒂文·M·魯賓, 馮平 申請人:人體基因組科學(xué)有限公司