專利名稱：抑制免疫球蛋白e與其高親和性受體結(jié)合的抗體的抗獨(dú)特型抗體的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及抗獨(dú)特型抗體。本發(fā)明涉及對(duì)如下相互作用的抑制細(xì)胞結(jié)合的IgE結(jié)合過敏原誘導(dǎo)肥大細(xì)胞和嗜堿性粒細(xì)胞的活化、由此產(chǎn)生組胺與其它介質(zhì)的釋放以及參于調(diào)節(jié)過敏反應(yīng)和炎癥反應(yīng)的細(xì)胞因子的從頭合成。本發(fā)明涉及干擾IgE的Cε3區(qū)與IgE高親和性受體結(jié)合的抗獨(dú)特型抗體或抗體片段。
IgE上與其高親和性受體(FCεRI)相互作用的特異性結(jié)合位點(diǎn)的知識(shí)，為產(chǎn)生通過識(shí)別該結(jié)合表位而阻止這種相互作用的抗體提供了基礎(chǔ)。通過疫苗接種誘生這種抗體，產(chǎn)生了一種新的可普遍適用的過敏反應(yīng)治療方法。本發(fā)明特別描述了重組抗體片段的鑒定和生產(chǎn)，該重組抗體片段可配制成疫苗以產(chǎn)生能夠防止誘導(dǎo)IgE介導(dǎo)的過敏反應(yīng)的抗-IgE抗體。
細(xì)胞釋放到周圍組織和血管結(jié)構(gòu)的血管活性胺類(介質(zhì))，特別是組胺，引起變態(tài)反應(yīng)癥狀。組胺通常儲(chǔ)存在稱為肥大細(xì)胞和嗜堿性粒細(xì)胞的特殊細(xì)胞中。肥大細(xì)胞散布于整個(gè)動(dòng)物組織中，而嗜堿性粒細(xì)胞存在于血管系統(tǒng)中。這些細(xì)胞合成并在細(xì)胞中儲(chǔ)存組胺，除非特定系列事件的發(fā)生導(dǎo)致組胺釋放。
IgE抗體在介導(dǎo)過敏反應(yīng)中的作用是眾所周知的。IgE是一個(gè)復(fù)雜排列的多肽鏈，與其它免疫球蛋白一樣，由兩條重鏈和兩條輕鏈通過二硫鍵連接成“Y”構(gòu)型。每條輕鏈有兩個(gè)結(jié)構(gòu)域，一個(gè)可變區(qū)(VL)與一個(gè)稱作恒定區(qū)(CL)的相對(duì)不變的氨基酸序列相連。相反，重鏈有一個(gè)可變區(qū)(VH)，就IgE而言，還有4個(gè)恒定區(qū)(CH1，CH2，CH3，CH4，也稱為Cε1，Cε2，Cε3，Cε4)。抗體兩“臂”負(fù)責(zé)抗原結(jié)合，具有多肽結(jié)構(gòu)可變的區(qū)域，稱為Fab’片段或F(ab’)2，后者表示被二硫鍵連在一起的兩個(gè)Fab’臂。抗體的尾部或中軸包含固定或恒定的多肽序列，稱為Fc片段。Fc片段含有相互作用位點(diǎn)，使抗體能夠通過結(jié)合Fc受體與其它免疫系統(tǒng)分子或細(xì)胞通訊。Fc受體是特異結(jié)合免疫球蛋白Fc區(qū)活性分子位點(diǎn)的分子。Fc受體以整合膜蛋白存在細(xì)胞外值膜中或以游離的“可溶性”分子自由循環(huán)在血漿或其它體液中。在人系統(tǒng)中，IgE與其FcεRI的高親和性結(jié)合通過復(fù)雜的蛋白-蛋白相互作用完成，涉及IgE第三個(gè)重鏈恒定區(qū)結(jié)構(gòu)域(Cε3)和FcεRIα亞單位的膜近側(cè)免疫球蛋白樣結(jié)構(gòu)域(α2)。雖然Fcε的Cε3結(jié)構(gòu)域和屬于FcεRIαα2結(jié)構(gòu)域的區(qū)域?qū)Y(jié)合有重要作用的殘基已被確定，但結(jié)合過程的詳細(xì)機(jī)制尚待闡明。實(shí)驗(yàn)證據(jù)表明人IgE采用一種彎曲結(jié)構(gòu)，推測(cè)可能與IgE對(duì)FcεRI的高親和性有關(guān)(Kd≌10-10M)。而且，推測(cè)這種彎曲結(jié)構(gòu)可能負(fù)責(zé)IgE和細(xì)胞結(jié)合型或可溶型FcεRIα形成等摩爾復(fù)合物，雖然IgE分子在兩個(gè)Cε3結(jié)構(gòu)域中提供了受體結(jié)合的相同表位。為了避免在沒有過敏原時(shí)的受體活化，這種單價(jià)性是功能上需要的。
根據(jù)它們的功能，相互作用位點(diǎn)可能已暴露，因此能夠結(jié)合到細(xì)胞受體上?；蛘?，它們也可能隱藏，直到抗體結(jié)合到抗原上，由此抗體可以改變結(jié)構(gòu)并隨后暴露能引發(fā)特異免疫活性的其它活性位點(diǎn)。構(gòu)象重排影響Cε3的受體結(jié)合被認(rèn)為是對(duì)細(xì)胞表面Fcε/FcεRI復(fù)合物1∶1化學(xué)計(jì)量的解釋。
僅在以下情況下，機(jī)體內(nèi)從肥大細(xì)胞和嗜堿性粒細(xì)胞過敏性(免疫性)釋放介質(zhì)IgE分子必須通過Fc部分鎖定或結(jié)合到細(xì)胞Fc受體位點(diǎn)上，這樣確保IgE分子結(jié)合到肥大細(xì)胞和嗜堿性粒細(xì)胞上；且細(xì)胞結(jié)合的IgE分子的Fab部分必須與特定的親和性抗原(過敏原)交聯(lián)。只有發(fā)生這種相互作用，肥大細(xì)胞或嗜堿性粒細(xì)胞才能被自動(dòng)觸發(fā)釋放組胺到局部環(huán)境中，產(chǎn)生熟悉的過敏反應(yīng)癥狀(圖1)。隨后在晚期反應(yīng)中發(fā)生其它生化事件，導(dǎo)致細(xì)胞因子和其它介質(zhì)的從頭合成和釋放。
治療變態(tài)反應(yīng)的常規(guī)方法包括用抗組胺藥系統(tǒng)治療或試圖使患者脫敏，這些方法并未涉及基本的IgE-肥大細(xì)胞/嗜堿性粒細(xì)胞相互作用。另一方法涉及產(chǎn)生能夠阻斷IgE抗體結(jié)合到細(xì)胞表面Fc受體上并從已結(jié)合IgE的結(jié)合位點(diǎn)替換IgE的多肽鏈，并研究IgE Fc區(qū)被認(rèn)為提供了引發(fā)肥大細(xì)胞/嗜堿性粒細(xì)胞釋放組胺的免疫信號(hào)的推定效應(yīng)位點(diǎn)的本質(zhì)。
已嘗試用重組IgE片段作為免疫原產(chǎn)生保護(hù)性抗-IgE疫苗并表明是有效的。反對(duì)這種疫苗的主要原因是使用這種大片段IgE免疫，在患者中不僅可能誘發(fā)抑制性抗體，而且可能產(chǎn)生交聯(lián)并因而產(chǎn)生過敏原性抗體。
克服該問題的一個(gè)策略是鑒定可能的最小IgE片段，理想地僅由受體結(jié)合位點(diǎn)組成，而且結(jié)合后埋藏在IgE/IgERI復(fù)合物中，因此不再被疫苗產(chǎn)生的免疫應(yīng)答所交聯(lián)。雖然仍在嘗試，但考慮到參與IgE/IgERI相互作用的不同Cε3區(qū)的空間距離，這種策略不可能成功。
也許可通過使用短的模擬表位(mimotope)肽進(jìn)行主動(dòng)免疫來克服“經(jīng)典”疫苗方法的內(nèi)在問題，模擬表位肽或?yàn)榕悸?lián)到合適載體上的化學(xué)合成肽，或?yàn)榕c如卵白蛋白或IgG的重組融合結(jié)構(gòu)。這種肽是單克隆抗體BSW17所識(shí)別的表位的結(jié)構(gòu)模擬物，BSW17識(shí)別Fcε上一個(gè)部分位于Cε3區(qū)、部分位于Cε4區(qū)的構(gòu)象型表位。根據(jù)保藏微生物的布達(dá)佩斯條約規(guī)定，產(chǎn)生BSW17的雜交瘤細(xì)胞系已于1996年12月19日保藏在ECACC，保藏號(hào)是96121916。這種抗體顯示了有趣的生物學(xué)活性，總結(jié)見圖2。它本身無過敏原性，能夠防止激活劑誘導(dǎo)的人肥大細(xì)胞和嗜堿性粒細(xì)胞IgE依賴性組胺釋放。BSW17或BSW17樣抗體在血管系統(tǒng)中循環(huán)，通過以下方式防止變態(tài)反應(yīng)發(fā)生a)通過競爭性抑制IgE/IgERI相互作用而抑制肥大細(xì)胞和嗜堿性粒細(xì)胞激活，和b)通過在B細(xì)胞水平上下調(diào)IgE合成而降低血清IgE水平。作為抗-IgE抗體表位的結(jié)構(gòu)模擬物，化學(xué)合成的BSW17模擬表位肽誘生導(dǎo)致在宿主體內(nèi)產(chǎn)生BSW17樣抗體的免疫應(yīng)答。由于BSW17無過敏原性、抑制IgE/IgERI結(jié)合以及B細(xì)胞的IgE合成，BSW17模擬表位肽疫苗誘生的這些抗體具有相似的保護(hù)性特性。這類BSW17模擬表位肽疫苗的一個(gè)可能缺點(diǎn)是化學(xué)合成肽需要偶聯(lián)到載體蛋白上以增強(qiáng)肽的免疫原性。而且，短肽的結(jié)構(gòu)靈活性使它們具有多種不同立體構(gòu)象。這樣，只有部分多克隆抗模擬表位免疫應(yīng)答具有與人IgE交叉反應(yīng)的治療活性。
本發(fā)明避免了模擬表位肽方法內(nèi)在的可能缺點(diǎn)。它基于干擾IgE結(jié)合到高親和性受體的抗體的抗獨(dú)特型抗體或抗體片段，特別是針對(duì)BSW17的重組抗獨(dú)特型抗體。根據(jù)Jerne的網(wǎng)絡(luò)理論(Jerne N，Ann.Immunol.125C373)，抗體(Ab1)高變區(qū)本身可作為抗原。以這種方式產(chǎn)生的抗體稱為抗獨(dú)特型抗體(Ab2)，因?yàn)樗鼈兘Y(jié)合到第一種抗體的獨(dú)特型區(qū)域(圖3)。這種抗獨(dú)特型抗體針對(duì)第一種抗體(Ab1)的結(jié)合位點(diǎn)(抗原互補(bǔ)位)，這樣代表了初始抗原的“內(nèi)影像(internal image)”。隨后，稱為內(nèi)影像抗體或Ab2β的抗獨(dú)特型抗體(Ab2)也能夠通過其高變區(qū)誘導(dǎo)抗體形成。這些抗-抗獨(dú)特型抗體(Ab3)結(jié)構(gòu)上模擬了Ab1的抗原互補(bǔ)位，因此具有與Ab1相似的生物學(xué)特性。在hIgE/BSW17系統(tǒng)中，IgE代表初始抗原，BSW17代表Ab1。因此抗-BSW17獨(dú)特型抗體Ab2的抗原互補(bǔ)位代表了BSW17識(shí)別的hIgE區(qū)域(表位)的結(jié)構(gòu)模擬。在結(jié)構(gòu)上，Ab2抗原互補(bǔ)位等同于上述化學(xué)合成的BSW17模擬表位肽。如果這種(重組)抗-BSW17獨(dú)特型抗體用作疫苗，將在接種患者中誘生BSW17樣免疫應(yīng)答(Ab3)。象BSW17一樣，這些(多克隆)Ab3免疫球蛋白將干擾IgE與其高親和性受體的結(jié)合，因此可以作為抗變態(tài)反應(yīng)藥劑。與靈活的合成模擬表位肽相反，Ab2抗原互補(bǔ)位將以結(jié)構(gòu)上確定的構(gòu)象在環(huán)境中出現(xiàn)。因此，針對(duì)確定的hIgE表位的免疫反應(yīng)將更具特異性。而且不需要異源的免疫原性載體蛋白。因此可避免載體蛋白如破傷風(fēng)類毒素或白喉類毒素引起的可能副反應(yīng)。
本發(fā)明包含如E25(olizumab)、CGP56901或優(yōu)選的BSW17等干擾IgECε3區(qū)與IgE高親和性受體結(jié)合的抗體的抗獨(dú)特型抗體或抗體片段。以下它們簡稱為“本發(fā)明的模擬抗體(mimobodies)”。當(dāng)它們?yōu)锽SW17的抗獨(dú)特型抗體時(shí)，以下簡稱為“BSW17模擬抗體”。
因此，本發(fā)明的模擬抗體是這樣的抗獨(dú)特型抗體或抗體片段，即它們能夠特異性結(jié)合作為抗-IgE抗體的抗原互補(bǔ)位的表位，該抗-IgE抗體識(shí)別結(jié)合IgE高親和性受體(FcεRI)的IgE分子Cε3區(qū)域上的位點(diǎn)。
就人體應(yīng)用而言，本發(fā)明的模擬抗體原則上是人來源的。優(yōu)選地它們?yōu)橹亟M抗體。優(yōu)選地它們?yōu)閱慰寺】贵w。優(yōu)選地它們?yōu)榭贵w片段，例如由如下部分組成或包含如下部分-重鏈和輕鏈(如Fab段)，或單個(gè)重鏈或輕鏈(如輕鏈二聚體)，優(yōu)選地和它們的恒定區(qū)成分一起，如圖4所定義的(seq.id.no.35，36，37和38)，其中“恒定區(qū)”也包括小的立體修飾，如同種異型變異體中存在的，如恒定部分1-5位氨基酸，通常僅為一個(gè)。-或其部分，尤其是至少其特異性決定部分，如圖5a-5d所確定的(seq.id.no.2，4，6，8)。-或其小部分(subpart)，尤其是至少其高變區(qū)的小部分，例如至少包含一個(gè)CDR的氨基酸序列段組成的肽，如該氨基酸序列段包含圖5a、5b、5c和5d(seq.id.no.2，4，6，8)中至少一個(gè)CDR，優(yōu)選兩個(gè)，更優(yōu)選三個(gè)CDR，它們?nèi)芜x地與鄰近構(gòu)架區(qū)序列一起，如在CDR的一個(gè)或兩個(gè)末端不超過約10個(gè)氨基酸的序列。
本發(fā)明的模擬抗體是分離的和大體上純的抗體或抗體片段，來源于天然產(chǎn)生的抗-獨(dú)特型抗-IgE抗體。特別是它們大體上無其它抗體?！按篌w上純”指按重量比純度為至少約60％，優(yōu)選大約90％，更優(yōu)選大約99％或更多。
本發(fā)明涉及藥物組合物，特別是疫苗，其包含本發(fā)明的模擬抗體，或?yàn)閱蝹€(gè)分子實(shí)體或?yàn)榛瘜W(xué)偶聯(lián)到免疫原性載體分子上的蛋白偶聯(lián)物，適當(dāng)?shù)?，與佐劑和常規(guī)賦形劑一起使用。
本發(fā)明還涉及本發(fā)明的模擬抗體用作藥物，特別是疫苗，特別是用于治療IgE介導(dǎo)的疾病。
本發(fā)明還涉及通過傳統(tǒng)的方法如噬菌體展示技術(shù)，用干擾IgE Cε3區(qū)結(jié)合到IgE高親和性受體的抗體如BSW17來鑒定本發(fā)明的模擬抗體。
本發(fā)明還涉及治療IgE介導(dǎo)的疾病的方法，特別是通過疫苗接種的治療方法，包括給予需要這種治療或接種的患者以有效治療劑量的本發(fā)明的模擬抗體。
本發(fā)明還涉及本發(fā)明的模擬抗體在制備防治IgE介導(dǎo)的疾病的藥物(特別是疫苗)中的用途。
本發(fā)明還涉及本發(fā)明模擬抗體在生產(chǎn)用于被動(dòng)免疫的多克隆或單克隆抗該模擬抗體的抗體中的用途；或者通過用本發(fā)明的模擬抗體免疫合適的非人動(dòng)物并分離純化由此產(chǎn)生的抗體，或者通過常規(guī)雜交瘤技術(shù)，來制備用于被動(dòng)免疫的抗本發(fā)明模擬抗體的多克隆或單克隆抗體；以及以任何方式獲自本發(fā)明模擬抗體的多克隆或單克隆抗體在通過被動(dòng)免疫治療IgE介導(dǎo)的疾病中的應(yīng)用。
本發(fā)明還涉及鑒定本發(fā)明模擬抗體的方法，包括-鑒定天然產(chǎn)生的抗-獨(dú)特型抗-IgE抗體；-分離其片段；和-通過結(jié)合合適的抗-IgE單克隆抗體，如干擾IgE Cε3區(qū)結(jié)合到IgE高親和性受體的BSW17，來選擇其重組片段。
一旦鑒定和表征，本發(fā)明的模擬抗體可用常規(guī)方式，如通過重組DNA技術(shù)或化學(xué)合成來制備。
為了鑒定顯示與上述模擬表位肽(即選擇的IgE表位)特異性相同的抗獨(dú)特型抗體，可使用表達(dá)人抗體庫Fab部分的噬菌體展示文庫。該文庫從例如獲自人扁桃體的B細(xì)胞庫構(gòu)建而成，固定化BSW17抗體用作生物淘洗的靶標(biāo)。分離和富集特異性識(shí)別BSW17的表達(dá)人Fab的噬菌體顆粒。這些重組Fab片段即為本發(fā)明的模擬抗體并代表抗BSW17高變區(qū)的抗獨(dú)特型。當(dāng)用作疫苗時(shí)，它們?cè)谧儜B(tài)反應(yīng)患者中誘生免疫應(yīng)答，導(dǎo)致BSW17樣抗體的產(chǎn)生。由于BSW17無過敏原性并抑制IgE/IgERI結(jié)合和B細(xì)胞的IgE合成，患者中誘生的抗BSW17抗-獨(dú)特型Fab疫苗的多克隆抗體也有相似特性。由于與“經(jīng)典疫苗方法”相反，疫苗中不含在免疫患者中可能誘生交聯(lián)抗體的IgE來源的蛋白片段而且其組合物可以設(shè)想不含載體，所以免疫應(yīng)答是非常特異和安全的。
這些BSW17模擬抗體是由來源于人免疫球蛋白G的可變區(qū)(V-區(qū))和恒定區(qū)(C-區(qū))組成的重組抗體或抗體片段。通過用固定化BSW17抗體對(duì)抗體噬菌體文庫進(jìn)行生物淘洗，已鑒定了其表面展示不同模擬抗體片段的兩個(gè)克隆(克隆52和43)。模擬人IgE上BSW17表位的模擬抗體結(jié)構(gòu)位于V-結(jié)構(gòu)域的高變區(qū)(CDR)和鄰近構(gòu)架區(qū)(FR)中?？寺?2和克隆43重鏈和輕鏈V-結(jié)構(gòu)域的cDNA和氨基酸序列見圖5a-5d(seq.id.no.1-8)?？寺?2輕鏈結(jié)構(gòu)(L.C.)2由一個(gè)二聚體“Fab-樣”輕鏈片段組成。這些BSW17模擬抗體的完整結(jié)構(gòu)圖示于圖4A-4C，其中其恒定區(qū)部分也包括上述小的立體修飾，如同種異型變異體中存在的這種修飾。這些克隆的每個(gè)完整重鏈和輕鏈的氨基酸序列見圖12a-12d(Seq.id.no.35-38)。
本發(fā)明的模擬抗體具有藥理學(xué)活性。因此它們適于用作藥物，如作為疫苗的抗原。它們能夠誘生與IgE Fc區(qū)靶標(biāo)氨基酸序列有強(qiáng)烈血清學(xué)交叉活性的抗體，盡管基本上不能介導(dǎo)非細(xì)胞裂解性組胺釋放。
本發(fā)明模擬抗體的初始劑量為，如從大約0.05mg到大約5mg，優(yōu)選大約1mg；它通過如鼻腔、皮下或肌內(nèi)等途徑給藥，隨后如14-28天后以相同劑量重復(fù)給藥(加強(qiáng))。使用的劑量在一定程度上根據(jù)患者的年齡、體重和總體健康狀況，并可調(diào)整為合適劑量。
用本發(fā)明的模擬抗體進(jìn)行直接免疫(即主動(dòng)免疫)，優(yōu)選使用可在各種不同宿主表達(dá)系統(tǒng)如細(xì)菌、真菌或真核細(xì)胞中以常規(guī)方式生產(chǎn)的重組肽(Fab片段、輕鏈或重鏈)來進(jìn)行。
優(yōu)選給予游離的重組模擬抗體。然而，也可通過化學(xué)偶聯(lián)到免疫原性載體上，進(jìn)一步增強(qiáng)此免疫原的免疫原性。術(shù)語“免疫原性載體材料”在此包括具有在宿主動(dòng)物中能夠獨(dú)立引起免疫原性應(yīng)答特性的那些物質(zhì)，它們能或者直接通過在多肽的游離羧基、氨基或羥基和免疫原性載體物質(zhì)的相應(yīng)基團(tuán)之間形成肽鍵和酯鍵，或者通過常規(guī)的雙功能交聯(lián)基團(tuán)，被共價(jià)偶聯(lián)到多肽上。這類載體的實(shí)例包括動(dòng)物血清白蛋白、動(dòng)物血清球蛋白、動(dòng)物甲狀腺球蛋白、動(dòng)物血紅蛋白、動(dòng)物血藍(lán)蛋白(特別是匙孔血藍(lán)蛋白[KLH])、從蛔蟲提取的蛋白，如那些在免疫學(xué)雜志(J.Immun.)111260-280、免疫學(xué)雜志122302-308、免疫學(xué)雜志98893-900和美國生理學(xué)雜志(Am.J.Physiol.)199575-578中描述的蛔蟲提取物或其純化產(chǎn)物；多聚賴氨酸、多聚谷氨酸、賴氨酸-谷氨酸共聚物、含有賴氨酸或鳥氨酸的共聚物，等等。最近，已使用白喉類毒素如CRM197或破傷風(fēng)類毒素作為免疫原性載體材料來生產(chǎn)疫苗(Lepow ML等，傳染病學(xué)雜志(J.Infectious Diseases)150402-406；和Coen Beuvery，E等，傳染與免疫(Infection andImmunity)4039-45)，這些類毒素材料也可用于此。與化學(xué)脫毒的白喉毒素相比，優(yōu)選使用重組突變的白喉毒素CRM197。在CRM197中第52位甘氨酸殘基被谷氨酸所代替，導(dǎo)致無毒產(chǎn)物。CRM197是闡述得很清楚的無毒載體蛋白并用于注冊(cè)的人用疫苗。純化的結(jié)核菌素蛋白衍生物(PPD)也可用于“主動(dòng)”免疫方案中，因?yàn)?1)它本身不誘導(dǎo)T細(xì)胞應(yīng)答(即實(shí)際上它是一個(gè)“T細(xì)胞半抗原”)，但仍表現(xiàn)為完全加工的抗原并被T細(xì)胞所識(shí)別；(2)在偶聯(lián)識(shí)別模型中，已知它是最強(qiáng)的半抗原“載體”之一；和(3)不需要進(jìn)一步試驗(yàn)就可用于人體。
作為半抗原-載體結(jié)合劑，可使用在抗原制備中常規(guī)使用的那些?？捎贸Ｒ?guī)方式共價(jià)偶聯(lián)本發(fā)明的模擬抗體和免疫原性載體材料。例如，對(duì)于直接共價(jià)偶聯(lián)，可能使用雙-N-琥珀酰亞胺衍生物作為偶聯(lián)劑，最優(yōu)選以雙(磺化琥珀酰亞胺)辛二酸為偶聯(lián)劑，或用戊二醛或碳二亞胺，最優(yōu)選(二環(huán)已基)碳二亞胺或1-乙基-3-(3-二甲基氨丙基)碳二亞胺。
半抗原、半抗原-載體結(jié)合劑和載體的比率可適當(dāng)確定，但優(yōu)選載體量為半抗原重量的約1-約6倍，優(yōu)選為約1-約5倍，而半抗原-載體結(jié)合劑的量為半抗原摩爾當(dāng)量的約5-約10倍。通過上述偶聯(lián)反應(yīng)，載體通過半抗原-載體結(jié)合劑結(jié)合到半抗原上，從而獲得由本發(fā)明的模擬表位和載體的肽-載體復(fù)合物構(gòu)成的期望抗原。
反應(yīng)完成后，產(chǎn)生的免疫原可通過透析、凝膠過濾和分級(jí)沉淀等常規(guī)方式分離和純化。
本發(fā)明本質(zhì)上涉及通過直接疫苗接種而進(jìn)行主動(dòng)免疫。然而也探討了被動(dòng)免疫。在該情況下，將本發(fā)明的模擬抗體給予合適的非人動(dòng)物，分離和純化產(chǎn)生的抗抗體，然后施用給人體以減輕過敏癥狀。
本發(fā)明的模擬抗體可用作藥物，特別是疫苗，特別是用于治療變態(tài)反應(yīng)等IgE-介導(dǎo)的疾病，如哮喘、特應(yīng)性皮炎、過敏性形式的嗜酸性粒細(xì)胞增多、鼻炎、慢性蕁麻疹和食物過敏。
“治療”應(yīng)理解為包括預(yù)防性和治療性處理。優(yōu)選的宿主為人，但本發(fā)明可根據(jù)實(shí)際情況作必要改變用于基本上任何動(dòng)物，如貓或狗。


圖1IgE與其高親合力受體之間的相互作用。圖2單克隆抗-hIgE抗體BSW17的特性。圖3抗獨(dú)特型網(wǎng)絡(luò)。
BSW17識(shí)別的hIgE表位和抗獨(dú)特型抗原互補(bǔ)位用黑點(diǎn)表示。黑圓圈表示抗體BSW17(Ab1)和通過用抗獨(dú)特型抗體Ab2免疫而誘生的多克隆抗體3(Ab3)的同源高變區(qū)。圖4三種重組BSW17模擬抗體的結(jié)構(gòu)A抗-獨(dú)特型-BSW17，克隆52(SDS426)；輕鏈(L.C.)2(Seq.id.no.36)B抗-獨(dú)特型-BSW17，克隆52(SDS427)；FabFAB(Seq.id.no.35和36)C抗-獨(dú)特型-BSW17，克隆43(SDS463)；FabFAB(Seq.id.no.37和38)圖5抗-BSW17 Fab克隆噬菌體展示的人免疫球蛋白DNA序列及推導(dǎo)的氨基酸序列高變區(qū)(互補(bǔ)決定區(qū)；CDR)用斜體表示圖5a克隆52；可變重鏈(Seq.id.no.1和2)(CDR1Seq.id.no.39和40；CDR2Seq.id.no.41和42；CDR3Seq.id.no.43和44)；圖5b克隆52；可變輕鏈(Seq.id.no.3和4)(CDR1Seq.id.no.45和46；CDR2Seq.id.no.47和48；CDR3Seq.id.no.49和50)；圖5c克隆43；可變重鏈(Seq.id.no.5和6)(CDR1Seq.id.no.51和52；CDR2Seq.id.no.53和54；CDR3Seq.id.no.55和56)；圖5d克隆43；可變輕鏈(Seq.id.no.7和8)(CDR1Seq.id.no.57和58；CDR2Seq.id.no.59和60；CDR3Seq.id.no.61和62)；圖6抗BSW17 rFab和人hIgE Cε3結(jié)構(gòu)域之間的氨基酸序列同源性
A分別為抗-獨(dú)特型Fab，克隆52，重鏈(hIgE，Cε3Seq.id.no.25；克隆52Seq.id.no.26)；抗-獨(dú)特型Fab，克隆52，輕鏈，比對(duì)1(hIgE，Cε3Seq.id.no.27；克隆52Seq.id.no.28)；抗-獨(dú)特型Fab，克隆52，輕鏈，比對(duì)2(hIgE，Cε3Seq.id.no.29；克隆52Seq.id.no.30)；B分別為抗-獨(dú)特型Fab，克隆43，重鏈(hIgE，Cε3Seq.id.no.31；克隆43Seq.id.no.32)；抗-獨(dú)特型Fab，克隆43，輕鏈(hIgE，Cε3Seq.id.no.33；克隆43Seq.id.no.34)。
氨基酸序列比對(duì)相同殘基用黑框表示，相似氨基酸用灰框表示(Lipman和Pearson)。Fcε殘基的位置標(biāo)在每個(gè)比對(duì)上方。每對(duì)序列下方標(biāo)出了重組Fab片段的高變區(qū)(CDR)和構(gòu)架區(qū)(FR)。圖7異硫氰酸熒光素標(biāo)記的BSW17與抗-獨(dú)特型BSW17 rFab競爭性結(jié)合IgE致敏的CHOα細(xì)胞。圖8親合純化的兔抗-BSW17模擬抗體免疫球蛋白與人IgE的結(jié)合。
用夾心ELISA法測(cè)定hIgE/抗-模擬抗體復(fù)合物hIgE和免疫親和純化的抗-BSW17模擬抗體制備物等摩爾濃度混合，4℃孵育過夜。然后將混合物加入包被有捕獲抗體單克隆抗-hIgE抗體LE27(1μg/ml)的微量滴定板中。用辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔-IgG檢測(cè)結(jié)合的模擬抗體IgG。□＝hIgE/SDS410復(fù)合物；○＝hIgE/SDS411復(fù)合物；圖9Balb/c小鼠中抗BSW17的模擬抗體免疫反應(yīng)■＝小鼠1；●＝小鼠2；＝小鼠3；▲＝小鼠4；◆＝小鼠5A抗-獨(dú)特型-BSW17.52；輕鏈(SDS426)；B抗-獨(dú)特型-BSW17.52；Fab(SDS427)；C抗-獨(dú)特型-BSW17.43；Fab(SDS463)；O.D.值代表讀出的光密度值，已用未包被孔的背景結(jié)合校正。所示為兩次重復(fù)測(cè)量的平均值。變異通常小于0.05O.D。圖10用免疫親合純化的抗-模擬抗體的抗體抑制hIgE/FcεRIα的結(jié)合A■＝BSW17●＝抗克隆52；輕鏈(SDS410)△＝抗克隆52；Fab(SDS411)＝抗克隆52；輕鏈(柱流通物)B■＝BSW17●＝抗克隆43，F(xiàn)ab(SDS476)圖11不同模擬抗體制備物免疫的恒河猴組(n＝2)的PCA分值圖譜A 免疫原 抗-獨(dú)特型-BSW17.52；輕鏈(SDS426)；B 免疫原 抗-獨(dú)特型-BSW17.52；Fab(SDS427)；C 免疫原 抗-獨(dú)特型-BSW17.43；Fab(SDS463)。
免疫后不同時(shí)間點(diǎn)恒河猴皮膚的被動(dòng)皮膚過敏反應(yīng)(PCA)。PCA分值代表通過皮膚藍(lán)點(diǎn)直徑對(duì)注射的IgE(JW8)濃度作圖產(chǎn)生的曲線下方面積(AUC)計(jì)算而來的PCA強(qiáng)度。分值為每組中相同模擬抗體制備物免疫的兩只猴子的平均數(shù)，從表4所示的單個(gè)猴子數(shù)值計(jì)算而來。變異用誤差線表示。統(tǒng)計(jì)學(xué)P值標(biāo)在誤差線上方。加強(qiáng)免疫注射時(shí)間點(diǎn)標(biāo)在X軸下方。圖12三種重組BSW17-模擬抗體重鏈和輕鏈的完整氨基酸序列圖12a抗-獨(dú)特型-BSW17，克隆52重鏈可變區(qū)與第一恒定區(qū)(Seq.id.no.35)；圖12b抗-獨(dú)特型-BSW17，克隆52κ輕鏈可變區(qū)與恒定區(qū)(Seq.id.no.36)；圖12c抗-獨(dú)特型-BSW17，克隆43重鏈可變區(qū)與第一恒定區(qū)
(Seq.id.no.37)；圖12d抗-獨(dú)特型-BSW17，克隆43λ輕鏈可變區(qū)與恒定區(qū)(Seq.id.no.38)。
模擬抗體(L.C.)2克隆52包含二硫橋連接的圖12b的輕鏈(Seq.id.no.36)的輕鏈，如圖4A所示。
模擬抗體Fab克隆52包含二硫橋連接的圖12b的輕鏈(Seq.id.no.36)和圖12a的重鏈(Seq.id.no.35)，如圖4B所述。
模擬抗體Fab克隆43包含二硫橋連接的圖12d的輕鏈(Seq.id.no.38)和圖12c的重鏈(Seq.id.no.37)，如圖4C所示。
下述實(shí)施例用于說明本發(fā)明且無限制性。溫度為攝氏溫度。使用下述簡寫anti-id ＝ 抗-獨(dú)特型ABTS ＝ [2，2′-連氮基-二(3-乙基-苯基噻唑啉)磺酸]BSA ＝ 牛血清白蛋白BSW17＝ 抗-人IgE鼠單克隆抗體；Cε3特異的CDR ＝ 互補(bǔ)決定區(qū)Cε3 ＝ IgE第三個(gè)重鏈恒定區(qū)結(jié)構(gòu)域Cε4 ＝ IgE第四個(gè)重鏈恒定區(qū)結(jié)構(gòu)域CεE ＝ 模擬BSW17Cε3表位區(qū)的模擬表位肽CεM ＝ 模擬BSW17Cε4表位區(qū)的模擬表位肽cfu ＝ 集落形成單位ELISA＝ 酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)Fab ＝ 缺乏重鏈恒定區(qū)2和3的抗體片段FcεRI；IgERI＝ IgE高親和性受體FcεRIα ＝ IgE高親和性受體α鏈FCS ＝ 胎牛血清FR ＝ 構(gòu)架區(qū)FITC ＝ 異硫氰酸熒光素結(jié)合的HRP ＝ 辣根過氧化物酶HSA ＝ 人血清白蛋白(h)IgE＝ (人)免疫球蛋白EmAb ＝ 單克隆抗體MNC ＝ 單核細(xì)胞NIP ＝ 3-硝基-4-羥基碘苯乙酸p.c. ＝ 多克隆Phab ＝ 展示Fab片段的噬菌體(表達(dá)Fab的噬菌體)PBS ＝ 磷酸鹽緩沖液PCA ＝ 被動(dòng)皮膚過敏PWM ＝ 美洲商陸有絲分裂原r ＝ 重組RT＝ 室溫SPR ＝ 表面等離子共振(surface plasmon resonance)實(shí)施例1噬菌體展示文庫的構(gòu)建a)淋巴細(xì)胞的來源從兩個(gè)成年男性供體外周血制備單核細(xì)胞(NMC)。肌內(nèi)注射0.5ml鋁佐劑吸附的破傷風(fēng)類毒素(Te Anatoxal Bern，瑞士血清和疫苗研究所，Bern，瑞士)加強(qiáng)免疫具有變態(tài)反應(yīng)臨床癥狀的第一個(gè)男性成年特應(yīng)性供體。七天后用Ficoll(美國威斯康星州Milwaukee，Pharmacia，Lymphoprep)梯度離心分離MNC。然后用含103U/ml白細(xì)胞介素2(Sigma，St-Louis，MO，美國)、50μg/ml Pansorbin細(xì)胞(Staphylococcus aureusCowan株1，Calbiochem，La Jolla，加州，美國)和用RPMI-1640培養(yǎng)基1∶1000稀釋的破傷風(fēng)類毒素的RPMI-1640(Seromed，瑞士Basel)培養(yǎng)基中培養(yǎng)3天。用苯酚-氯仿異硫氰酸胍步驟從這些細(xì)胞中制備總RNA(Chomczynsi，P.和Sacci，N.，Anal.Biochem.162 156)。第二個(gè)成年男性供體，一個(gè)超免疫的RhD供體，通過靜脈注射2ml來源于已知RhD陽性男性供體的壓緊紅細(xì)胞來加強(qiáng)免疫。加強(qiáng)后十八天用Ficoll梯度離心分離MNC。在提取RNA之前，細(xì)胞先在含103U/ml白細(xì)胞介素2和10μg/ml美洲商陸有絲分裂原(PWM；SigmaL9379，Buchs，瑞士)的RPMI-1640培養(yǎng)基中培養(yǎng)3天。
人扁桃體樣品從三例扁桃體摘除兒童獲得。扁桃體在無菌培養(yǎng)皿中用RPMI-1640浸軟并切成小塊。再將組織、細(xì)胞和培養(yǎng)基轉(zhuǎn)移到無菌試管中，讓組織碎片沉降，用Ficoll梯度離心從上清中分離MNC。用包被CD19的順磁珠與MNC孵育以選擇B細(xì)胞，然后按照上述苯酚-氯仿異硫氰酸胍步驟制備RNA。
用于克隆所有模擬抗體鏈的pComb3載體獲自美國加州La Jolla的Scripps研究所(Barbas III，C.F.和Lerner，R.A.，Companion MethodsEnzymol.2 119)。用于轉(zhuǎn)化pComb3載體的大腸桿菌菌株XL1-Blue和輔助噬菌體VCSM13購自Stratacyte(美國加州La Jolla)。
b)噬菌體文庫構(gòu)建構(gòu)建了三個(gè)獨(dú)立的文庫第一個(gè)稱為BS，來自從第一個(gè)男性特應(yīng)性供體分離的MNC；第二個(gè)稱為LD2，來自從第二個(gè)男性供體靜脈注射加強(qiáng)18天后獲得的MNC；第三個(gè)稱為CT，來自從兒童扁桃體分離的MNC的B細(xì)胞富集亞群。用苯酚-氯仿異硫氰酸胍步驟從這些細(xì)胞中提取總RNA。用10μg這種RNA按照供應(yīng)商(Boehringer Mannheim，德國)的指定條件使用寡聚(dT)引物(400ng)和M-MuLV逆轉(zhuǎn)錄酶通過逆轉(zhuǎn)錄制備cDNA。PCR擴(kuò)增按Vogel，M等，歐洲免疫學(xué)雜志(E.J.of Immunol).24(1994)1200描述進(jìn)行。簡述為，100μl PCR反應(yīng)液中含有Perkin-Elmer緩沖液，10mMMgCl2，5μl cDNA，150ng每種合適的5’和3’引物，四種dNTP各200μM和2U/ml Taq聚合酶(美國新澤西州Perkin Elmer)。用一套來自Stratacyte(詳見下述)的引物分別PCR擴(kuò)增Fab分子的重鏈和輕鏈。對(duì)于重鏈，使用與六個(gè)家族的VH基因分別雜交的六個(gè)上游引物。而對(duì)于輕鏈，使用一個(gè)κ鏈和一個(gè)λ鏈引物。下游引物設(shè)計(jì)為與重鏈恒定區(qū)γ1和γ3的鉸鏈區(qū)匹配。對(duì)于輕鏈，下游引物與κ鏈和λ鏈恒定區(qū)的3’末端匹配。分別合并重鏈和輕鏈的PCR產(chǎn)物，凝膠純化并分別用XhoI/SpeI和SacI/XbaI限制性內(nèi)切酶(Boehringer Mannheim，德國)酶切。消化之后，PCR產(chǎn)物用苯酚/氯仿/異戊醇抽提一次，凝膠切割純化。插入XhoI/SpeI消化的Fd片段，然后連接SacI/XbaI消化的輕鏈到pComb3載體上，轉(zhuǎn)化XL1-Blue細(xì)胞和噬菌體產(chǎn)生均按照Barbas III，C.F.和Lerner，R.A.，Companion Methods Enzymol.2 119的描述進(jìn)行。轉(zhuǎn)化大腸桿菌XL1-Blue細(xì)胞后，取樣并在平板上滴定以測(cè)定文庫容量。結(jié)果表明BS，LD2和CT表達(dá)文庫分別為1×107，7.7×106和3×106cfu(集落形成單位)。
c) PCR引物VHI 5′-CAC TCC CAG GTG CAG CTG CTC GAG TCT GG-3′(Seq.id.no.9)；VHII5′-GTC CTG TCC CAG GTC AAC TTA CTC GAG TCT GG-3′(Seq.id.no.10)；VHIII 5′-GTC CAG GTG GAG GTG CAG CTG CTC GAG TCT GG-3′(Seq.id.no.11)；VHIV5′-GTC CTG TCC CAG GTG CAG CTG CTC GAG TCG GG-3′(Seq.id.no.12)；VHV 5′-GTC TGT GCC GAG GTG CAG CTG CTC GAG TCT GG-3′(Seq.id.no.13)；VHVI5′-GTC CTG TCA CAG GTA CAG CTG CTC GAG TCA GG-3′(Seq.id.no.14)；CHI(γI)5′-AGC ATC ACT AGT ACA AGA TTT GGG CTC-3′(Seq.id.no.15)；VL(κ) 5′- GT GCC AGA TGT GAG CTC GTG ATG ACC CAG TCT CCA-3′(Seq.id.no.16)；CL(κ) 5′- T CCT TCT AGA TTA CTA ACA CTC TCC CCT GTT GAA GCTCTT TGT GAC GGG CGA ACT C-3′(Seq.id.no.17)；VL(λ) 5′- C TGC ACA GGG TCC TGG GCC GAG CTC GTG GTG ACT CA-3′(Seq.id.no.18)；CL(λ) 5′- G CAT TCT AGA CTA TTA TGA ACA TTC TGT AGG GGC-3′(Seq.id.no.19).
實(shí)施例2從噬菌體文庫中篩選重組BSW17-特異性抗體片段(BSW17-模擬抗體)通過四輪淘洗進(jìn)行BSW17特異性噬菌體篩選。每輪中，在抗-IgE mAbBSW17吸附之前，用抗IgE-mAb Le27進(jìn)行兩次預(yù)吸附。預(yù)吸附按如下進(jìn)行兩只免疫管(Maxisorp，Nunc)用4ml Le27(20μg/ml)4℃包被過夜，然后在37℃下用4ml PBS/2％脫脂奶封閉2小時(shí)。第一只管子用4ml含有2×1012cfu每種噬菌體文庫(BS，LD2和CT)的封閉液室溫振蕩孵育30分鐘。噬菌體再轉(zhuǎn)入第二只管子，重復(fù)一遍該步驟。第二次預(yù)吸附后，非Le27-特異性的噬菌體加入到包被了4ml BSW17(20μg/ml)并用上述PBS/2％脫脂奶封閉的試管中。室溫振蕩孵育2小時(shí)后。連續(xù)用PBS/0.1％Tween和PBS洗管子各10遍。連續(xù)洗脫粘附的噬菌體先用500ul 0.1M三乙胺洗，然后PBS洗三遍后，500ul用甘氨酸調(diào)pH到2.2的含1mg/ml牛血清白蛋白的0.1M HCl洗脫。每步洗脫室溫進(jìn)行10分鐘，洗脫的噬菌體分別用250ul1M Tris.Cl(pH7.4)和30ul 2M Tris堿中和。按Barbas和Lerner，同上(1991)所述用大腸桿菌XL1-Blue細(xì)胞擴(kuò)增篩選的噬菌體，然后用于隨后的三輪淘洗。每輪淘洗后，用cfu測(cè)定確定洗脫的噬菌體的滴度(見表2)表2.
連續(xù)幾輪淘洗富集BSW17特異性Phabs淘洗輪數(shù)a)洗脫的噬菌體數(shù)目(cfu)1 3×1052 2×1043 3×1054 5×107a)對(duì)于每輪淘洗，將6×1012噬菌體顆粒在包被了20ug/ml Le27的管中預(yù)吸附兩次，然后在一個(gè)包被了20ug/ml BSW17的管中孵育實(shí)施例3重組BSW17-模擬抗體的核苷酸序列用Nucleotrap kit(Machery-Nagel，Duren，德國)從選擇的噬菌體克隆制備質(zhì)粒DNA。并用PRISM Ready Reactin DyeDeoxy Terminator CycleSequencing Kit(Applied Biosystems，德國)試劑盒在ABI 373A測(cè)序系統(tǒng)上進(jìn)行核酸序列測(cè)定。
用于重鏈序列測(cè)定的引物是
CHγ1 (5′-CGCTGTGCCCCCAGAGGT-3′)(Seq.id.no.20)和pCH(5′-GGCCGCAAATTCTATTTCAAGG-3′)(Seq.id.no.21).
為得到輕鏈序列，使用了下述引物Cλ(5′-GAGACACACCAGTGTGGC-3′)(Seq.id.no.22)，Cκ(5′-CACAACAGAGGCAGTTCC-3′)(Seq.id.no.23)和pCL(5′-CTAAACTAGCTAGTCGCC-3′)(Seq.id.no.24).
引物由Microsynth(Balgach，瑞士)合成。從選出的不同噬菌體克隆的DNA序列，推導(dǎo)出BSW17特異性重組抗體重鏈和輕鏈的兩個(gè)不同氨基酸序列(克隆52，克隆43)。這些序列以及高變區(qū)(CDR)和構(gòu)架區(qū)序列的位置見圖5a-5d(Seq.id.no.1-8)。
克隆52和克隆43的BSW17-特異性重組抗體片段氨基酸序列與人IgE的比對(duì)表明與結(jié)合高親和性受體有關(guān)的人Cε3區(qū)域有同源性(圖6)(Seq.id.no.25-34)。因此，重組抗體顯示的抗原互補(bǔ)位模擬了人IgE的確定結(jié)構(gòu)(“模擬抗體”)。因此用這些重組模擬抗體接種過敏反應(yīng)患者產(chǎn)生的抗體將識(shí)別人IgE并通過抑制IgE/IgERI結(jié)合防止過敏反應(yīng)。
實(shí)施例4重組BSW17-模擬抗體的制備和純化制備來源于噬菌體克隆43和52(圖5)(Seq.id.no.1-8)的可溶性模擬抗體。為生產(chǎn)可溶性Fab片段，去掉編碼噬菌體顆粒pIII尾部蛋白的pIII序列，并用六組氨酸的標(biāo)簽代替，以便用Ni2+-螯合親合層析純化Fab片段。
用Nucleotrap kit(Machery-Nagel，Duren，德國)制備噬菌粒DNA。并用SpeI和NheI消化。缺乏gIII部分的4.7kb DNA片段用堿性磷酸酶處理，瓊脂糖凝膠電泳純化。將一編碼6組氨酸DNA片段分別與線性化DNA的5’和3’端的SpeI和NheI限制性位點(diǎn)連接。DNA連接后，轉(zhuǎn)化到大腸桿菌XL1-Blue細(xì)胞中，選擇產(chǎn)生可溶性模擬抗體的單個(gè)克隆。選其中一個(gè)克隆以用于大規(guī)模純化。37℃下在含有50ug/ml羧芐青霉素的1升SB(Super Broth)中培養(yǎng)到600nm的OD為1.0。培養(yǎng)物再用1mM異丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)(Biofinex，Praroman，瑞士)37℃誘導(dǎo)4小時(shí)。細(xì)菌于4℃6000rpm離心20分鐘，重懸于30ml超聲緩沖液(0.1MNaPO4，8M尿素，pH8.0)。然后在冰上超聲。4℃15000rpm離心30分鐘去除不可溶成分，含F(xiàn)ab的上清在1ml鎳-氮川乙酸鹽(nickel-nitriloacetate)柱上純化。柱子用超聲緩沖液洗去污染物，然后分別用pH5.1和pH4.9超聲緩沖液進(jìn)行兩步洗脫。組分監(jiān)測(cè)用OD280nm，并用SDS-PAGE(12％非還原)分析小樣以證實(shí)模擬抗體的純度和特征性。然后合并含模擬抗體的組分，濃縮并用PBS透析。
通過SDS-PAGE測(cè)定樣品來評(píng)估最終模擬抗體制備物的純度(具體如圖4和12所示)(Seq.id.no.35，36，37，38)?？捡R斯亮藍(lán)染色檢測(cè)蛋白帶。通過比較考馬斯亮藍(lán)染色的模擬蛋白帶和已知含量的標(biāo)準(zhǔn)蛋白(BSA)或通過光密度檢測(cè)來定量蛋白濃度。然后這些模擬抗體制備物用于競爭性結(jié)合試驗(yàn)和免疫兔子。
實(shí)施例5用重組BSW17-模擬抗體抑制BSW17介導(dǎo)的受體結(jié)合IgE的取代BSW17識(shí)別并取代結(jié)合到其高親和性受體上的IgE。為確定抗獨(dú)特型BSW17 rFab片段能抑制該取代反應(yīng)，用結(jié)合到細(xì)胞表面暴露的IgERI的IgE進(jìn)行競爭性結(jié)合試驗(yàn)。穩(wěn)定轉(zhuǎn)染了編碼人IgERIα鏈的DNA的重組中國倉鼠卵巢細(xì)胞系(CHO)被用于該試驗(yàn)[CHOα細(xì)胞系；Blan k，U等，歐洲生物化學(xué)雜志(Eur.J.Biol.Chem.)266(1991)2639]。一系列含5×104CHOα細(xì)胞的測(cè)試樣品在含48ng IgE B11雜交瘤(Zurcher，A.W.等，Immunol.Lett.46(1995)49-57)的FACS緩沖液(PBS，0.3％BSA，0.02％NaN3)里室溫孵育15分鐘。用FACS緩沖液洗一遍后，樣品在室溫下與異硫氰酸熒光素結(jié)合的BSW17(BSW17-FITC)和遞增量抗獨(dú)特型BSW17rFabs的預(yù)制復(fù)合物共同孵育15分鐘。該復(fù)合物制備如下用不同量的抗獨(dú)特型BSW17rFabs(40nM；200nM；1uM；4uM；40uM)和濃度為1.3nM的50ulBSW17-FITC室溫孵育30分鐘。只含CHOα細(xì)胞的對(duì)照樣品與BSW17-FITC在室溫孵育30分鐘以確定非特異性結(jié)合。將CHOα細(xì)胞用FACS緩沖液洗一次。加入100ul FACS緩沖液后，用配有氬激光(調(diào)到488nm)的FACSCalibur流式細(xì)胞儀(Becton Dickinson)分析。前散射/側(cè)散射的“門控”放在單細(xì)胞附近定量熒光并表述為平均通道熒光(mcf)。陽性細(xì)胞百分比計(jì)算為結(jié)合到CHOα細(xì)胞的BSW17百分比。如圖7所示，隨著抗獨(dú)特型BSW17rFabs抗體片段濃度的增加，結(jié)合到CHOα細(xì)胞的BSW17減少。表明兩個(gè)抗獨(dú)特型BSW17rFabs能抑制BSW17結(jié)合到IgE。
實(shí)施例6用重組BSW17模擬抗體免疫兔子本實(shí)施例描述了用抗-BSW17rFab(如圖4B、圖12a和12b所示由克隆52的重鏈和輕鏈組成)(Seq.id.no.35和36)或僅由輕鏈組成的重組模擬抗體(圖4A和圖12b)(Seq.id.no.36)進(jìn)行免疫，在兔子中誘生了與人IgE有交叉反應(yīng)的體液免疫應(yīng)答。兩只雌性新英格蘭白兔皮下注射300ug/ml用弗氏完全佐劑1∶1乳化的抗BSW17rFab或克隆52的輕鏈片段進(jìn)行初次免疫。然后用弗氏不完全佐劑1∶1乳化的同樣量模擬抗體加強(qiáng)三次，每兩周一次。0天時(shí)(預(yù)取血)收集血清，最后一次注射7天后放血。
用化學(xué)交聯(lián)到Sepharose 4B柱上的人IgE(SUS-11IgE)免疫親和層析以純化兔免疫血清。通過這種方法可以從總的免疫球蛋白中分離抗hIgE組分，使得能夠就抗體滴度和親和力準(zhǔn)確評(píng)價(jià)治療上相關(guān)免疫反應(yīng)。
免疫親和純化與人IgE有交叉反應(yīng)的抗-模擬抗體的抗體由兩個(gè)步驟組成。第一步，用硫酸銨沉淀從兔抗血清分離IgG組分；第二步，hIgE-特異性的抗BSW17模擬抗體的抗體結(jié)合到人IgE(SUS-11 IgE)上，與CH-Sepharose 4B共價(jià)偶聯(lián)的，然后洗脫、透析和濃縮。
ELISA證實(shí)了免疫親和純化的免疫球蛋白與人IgE在溶液中形成濃度依賴的復(fù)合物SUS-11 IgE與等摩爾量的抗-模擬抗體免疫球蛋白在4℃孵育過夜。溶液中形成的復(fù)合物被加到包被有作為捕獲抗體的抗-IgE抗體LE27的微量滴定板孔中。用多克隆抗-兔IgG-HRP檢測(cè)結(jié)合的抗-模擬抗體IgG。結(jié)果見圖8。
實(shí)施例7用重組BSW17模擬抗體免疫小鼠克隆43和克隆52來源的重組模擬抗體能誘生抗-模擬抗體的抗體。在小鼠中進(jìn)行免疫。五只Balb/c小鼠一組，每只小鼠皮下注射5ug在大腸桿菌中生產(chǎn)的并用鎳親合層析純化的重組BSW17模擬抗體。氫氧化鋁用作佐劑
第一組用SDS426批次免疫＝抗獨(dú)特型-BSW17.52；輕鏈。
第二組用SDS427批次免疫＝抗獨(dú)特型BSW17.52；Fab。
第三組用SDS463批次免疫＝抗獨(dú)特型BSW17.43；Fab。
初次免疫后第21和41天，加強(qiáng)注射兩次(每只鼠5ug)。初次接種后第0，20，28，35，42，49和56天取血樣。制備血清并用ELISA檢測(cè)抗-模擬抗體的抗體的存在。
用1ug/ml多克隆人IgG包被微量滴定板孔。并與初次免疫后在指定時(shí)間點(diǎn)所取血樣制備的1∶50稀釋的小鼠血清孵育。用辣根過氧化物酶結(jié)合的羊抗鼠IgG(gamIgG-HRP)檢測(cè)結(jié)合的抗-模擬抗體的抗體(ahIgG，抗人構(gòu)架區(qū)和恒定區(qū))。用ABTS生色底物顯色。
所有重組模擬抗體制備物第二次加強(qiáng)免疫后，所有小鼠均產(chǎn)生了抗模擬抗體的抗體(圖9)。
實(shí)施例8兔體內(nèi)產(chǎn)生的抗重組BSW17模擬抗體的免疫球蛋白對(duì)人IgE的高親和性的結(jié)合接種重組BSW17模擬抗體誘發(fā)對(duì)人IgE具有高親和性的體液免疫應(yīng)答。表示免疫親和純化的抗模擬抗體的免疫球蛋白與人IgE結(jié)合的的動(dòng)力學(xué)參數(shù)用表面等離子共振(SPR)來分析。
SPR檢測(cè)在BIAcore儀器(Biacore，Uppsala，瑞士)上進(jìn)行。根據(jù)廠商指導(dǎo)，用氨偶聯(lián)將人IgE或鼠IgG3偶聯(lián)到CM5傳感芯片上，從而制備特異性結(jié)合表面。通過這種程序，生物分子通過伯氨基基團(tuán)連接到傳感芯片的羧甲基化葡聚糖表面上。10pmol人骨髓瘤IgE或SUS-11 IgE被偶聯(lián)到芯片獨(dú)立流動(dòng)池中。鼠IgG3mAb ABL364(ATCC HB 9324)固定到相同傳感片的獨(dú)立通道上。ABL364用作參考以確定抗模擬抗體與非hIgE免疫球蛋白結(jié)構(gòu)的結(jié)合，并用來校正由緩沖液改變而引起的可能的折射率改變。偶聯(lián)密度大約為13000RU。
所有用BioCore儀器測(cè)量的生物分子相互作用在25℃進(jìn)行，用HBS(10mM Hepes，pH＝7.4，150mM NaCl，3.4mM EDTA，0.005％v/v表面活性劑P-20)作為連續(xù)流動(dòng)緩沖液。用于動(dòng)力學(xué)分析的流經(jīng)傳感芯片表面的分析物的濃度范圍從33nM到499nM。流速是5ul/min。分析物進(jìn)樣1200秒，隨后HBS進(jìn)樣大約1800秒以監(jiān)測(cè)結(jié)合的分析物的解離。用10mM HCl處理120秒對(duì)芯片進(jìn)行再生。通過將分析物流經(jīng)ABL364對(duì)照通道來監(jiān)測(cè)非特異性結(jié)合，并在動(dòng)力學(xué)分析之前從特異性結(jié)合中減去。
SPR測(cè)定產(chǎn)生的結(jié)合曲線用BIAevaluation 3.0分析軟件包分析。用單相模型相對(duì)比較抗模擬抗體/IgE的相互作用。分析每條曲線的結(jié)合常數(shù)Ka、解離常數(shù)Kd和平衡解離常數(shù)KD＝1/KA(KA＝親和力常數(shù))，總結(jié)見表3。
表3多克隆(p.c.)兔抗模擬抗體Ig制備物和hIgE之間相互作用的動(dòng)力學(xué)常數(shù)(SPR/BIAcore)骨髓瘤IgE SUS-11 IgEKa(1/Ms) 未測(cè)定 0.8±0.3×104BSW17 Kd(1/s)未測(cè)定 4.2±0.9×10-6KD(nM) 未測(cè)定 0.53±0.33抗(抗獨(dú)特型-BSW17.52；Ka(1/Ms) 2.1±0.8×1042.2±0.9×104輕鏈)1)Kd(1/s)2.8±0.5×10-42.3±0.2×10-4(SDS410) KD(nM) 13.3±6.810.7±3.3抗(抗獨(dú)特型-BSW17.52；Ka(1/Ms) 4.6±2.7×1042.5±1.0×104Fab)2)Kd(1/s)2.3±0.3×10-41.5±0.1×10-4(SDS411) KD(nM) 5.0±2.2 6.0±1.8抗(抗獨(dú)特型-BSW17.43；Ka(1/Ms) 未測(cè)定 2.2±0.4×104Fab)3)Kd(1/s)未測(cè)定 1.6±0.1×10-5(SDS476) KD(nM) 未測(cè)定 0.75±0.021)即抗-SDS4262)即抗-SDS4273)即抗-SDS463上述結(jié)果表明用重組BSW17模擬抗體免疫兔子可以誘生抗人IgE的高親和性抗體(KD值在納摩爾范圍)?？寺?3來源的Fab(SDS463；圖4C；抗獨(dú)特型-BSW17.43)具有誘生對(duì)人IgE有很高親和性的免疫應(yīng)答的能力(KD＜1nM)。
這樣通過使用單克隆抗獨(dú)特型抗體可能誘生人類疫苗接種策略所期望的抗IgE的強(qiáng)烈多克隆應(yīng)答。
實(shí)施例9抗重組BSW17-模擬抗體的兔子免疫球蛋白抑制人IgE與其高親和性受體的結(jié)合作為有活性的抗過敏反應(yīng)疫苗，抗模擬抗體和hIgE形成復(fù)合物將預(yù)期阻止IgE與其高親和性受體結(jié)合。與BSW17模擬抗體CDR的氨基酸序列同源的Val(370)-Asn(383)序列中的Cε3表位區(qū)域Val(370)-Gly(379)(圖6)(Seq.id.no.25)涉及與高親和性受體的結(jié)合。因此，預(yù)期抗重組BSW17模擬抗體的IgE特異性抗體通過封閉結(jié)合域抑制IgE與其高親和性受體結(jié)合而發(fā)揮治療作用。為證實(shí)這一點(diǎn)，通過競爭性ELISA測(cè)試從免疫兔子獲得的純化抗-模擬抗體的抗體對(duì)hIgE/FcεRIα結(jié)合的抑制。作為疾病相關(guān)讀數(shù)，檢測(cè)游離IgE與重組FcεRIα(RIα-HSA-RIα雙融合蛋白；DFP)的結(jié)合能力(圖10)。
hIgE(SUS-11；圖10A 1ug/ml和圖10B 0.1ug/ml)與遞增量的抗模擬抗體免疫球蛋白或mAb BSW17(作為參考)在+4℃預(yù)孵育16小時(shí)。SDS410制備時(shí)免疫親和柱上流通的大量免疫球蛋白作為陰性對(duì)照。形成的復(fù)合物被加到包被了1ug/ml抗IgE抗體Le27作為捕獲抗體的微量滴定板上，用辣根過氧化物酶標(biāo)記的FcεRIα-HSA-FcεRIα雙融合蛋白(DFP)在37℃孵育1小時(shí)。用生色底物檢測(cè)結(jié)合的DFP。O.D.值表述為％結(jié)合。與無競爭物的SUS-11 IgE的結(jié)合被設(shè)為100％。顯示的是平行兩次所測(cè)值的平均數(shù)。變異通常低于2％。
結(jié)果表明用BSW17模擬抗體免疫嚙齒動(dòng)物導(dǎo)致產(chǎn)生特異性的高親和性抗-hIgE抗體。在體外，這些抗-模擬抗體的抗體抑制IgE與其高親和性受體結(jié)合，表明了BSW17-模擬抗體接種策略對(duì)抗過敏反應(yīng)疫苗研制的價(jià)值。
實(shí)施例10通過重組BSW17模擬抗體接種恒河猴抑制被動(dòng)皮膚過敏反應(yīng)抑制猴被動(dòng)皮膚過敏反應(yīng)(PCA)可被用來檢測(cè)體內(nèi)此化合物的抗過敏反應(yīng)活性。
模擬抗體接種導(dǎo)致在恒河猴抑制皮膚過敏反應(yīng)。每組兩只猴子皮下注射500ug/只動(dòng)物的重組抗BSW17模擬抗體。初次免疫后，給予兩次加強(qiáng)注射。每次加強(qiáng)后大約10天，進(jìn)行PCA試驗(yàn)。最后一次加強(qiáng)三個(gè)月后，猴VI91、VI92、VI93和VI95再次檢測(cè)PCA反應(yīng)。免疫方案總結(jié)于下表1。
表1

用小劑量鹽酸酮胺(10-15mg/kg，i.m.)(Ketalar，Parke Davis，GB)預(yù)處理恒河猴使其麻醉，腹部皮內(nèi)注射不同劑量的IgE(JW8)(英國牛津Serotec)。IgE(JW8)為半抗原NIP特異的鼠抗原結(jié)合部分和人Fcε重鏈的嵌合抗體。體積100ul遞增劑量(0，2，10，50，250ng/ml生理鹽水)的IgE(JW8)用30號(hào)針頭以頭尾序列(cephalocaudal series)注射。兩小時(shí)后，每只動(dòng)物靜脈內(nèi)注射25mg BSA偶聯(lián)的NIP。NIP-BSA偶聯(lián)物靜脈攻擊后再次麻醉動(dòng)物。為觀察皮膚反應(yīng)，抗原攻擊后馬上靜脈內(nèi)注射伊文氏藍(lán)(Evans blue)染料(1％，0.5ml/kg)。抗原注射20分鐘后通過測(cè)量藍(lán)點(diǎn)的兩個(gè)直徑并計(jì)算平均值(用毫米來表示)來檢測(cè)皮膚反應(yīng)。
在初次免疫和加強(qiáng)免疫后指定時(shí)間點(diǎn)檢測(cè)PCA反應(yīng)。用通過藍(lán)皮膚區(qū)直徑對(duì)注射的IgE(JW8)濃度作圖產(chǎn)生的曲線下的面積(AUC)來計(jì)算PCA強(qiáng)度。表4所示每個(gè)猴子的PCA分值表示計(jì)算出的AUC值。
表4BSW17模擬抗體接種對(duì)恒河猴被動(dòng)皮膚過敏的作用A

B

1)PCA分值，按上述(77)通過藍(lán)皮膚區(qū)直徑對(duì)注射的IgE(JW8)濃度作圖產(chǎn)生的曲線下的面積(AUC)計(jì)算。
2)相對(duì)于免疫前數(shù)值的PCA強(qiáng)度。0天PCA＝100％用各自的免疫前PCA分值(0天值)作為對(duì)照，所有猴子對(duì)BSW17模擬抗體接種都有應(yīng)答，PCA強(qiáng)度降低。克隆52的輕鏈結(jié)構(gòu)(SDS426)(圖4A)結(jié)果最好，抑制率為60-83％(PCA分值40和17)?？寺?2 Fab(SDS427批次)(圖4B)接種的猴子抑制PCA達(dá)55-65％(PCA分值45和35)。克隆43Fab(SDS463批次)(圖4C)觀察到略微低的PCA抑制率18-38％(PCA分值82和62)，盡管其在BSW17結(jié)合和在兔中誘導(dǎo)高親和性抗hIgE方面比克隆52模擬抗體要好。
按照該免疫程序，用克隆52模擬抗體接種在第三次加強(qiáng)注射后(除了猴VI92)有效，3個(gè)多月后仍觀察到部分PCA抑制。相反，克隆43Fab在第二次加強(qiáng)注射后就有效，而第三次模擬抗體攻擊無作用。
圖11說明了從表4單個(gè)猴子的值計(jì)算出的用同一模擬抗體制備物接種的每組兩只猴子的平均PCA分值圖。
接種猴的陽性PCA結(jié)果(相對(duì)于各自處理前分值或未處理對(duì)照動(dòng)物)清楚地顯示了模擬抗體接種的有效性，并證實(shí)了這種機(jī)理概念的正確性。用重組BSW17模擬抗體接種恒河猴導(dǎo)致產(chǎn)生體內(nèi)抑制PCA的高親和性抗人IgE抗體。
權(quán)利要求
1.干擾IgE的Cε3區(qū)與IgE高親和性受體結(jié)合的抗體的抗獨(dú)特型抗體或抗體片段(模擬抗體)。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的模擬抗體，其是針對(duì)抗體BSW17的抗獨(dú)特型重組單克隆抗體片段。
3.根據(jù)權(quán)利要求1的模擬抗體，其包含或由圖4(Seq.id.no.35、36、37和38)的輕鏈二聚體或兩種Fab片段之一組成，其中恒定區(qū)也包括小的立體修飾，如同種異型變異體中發(fā)現(xiàn)的小立體修飾。
4.根據(jù)權(quán)利要求1的模擬抗體，其包含或由圖5a、5b、5c和5d(Seq.id.no.2、4、6和8)的氨基酸序列組成。
5.根據(jù)權(quán)利要求1的模擬抗體，其包含或由圖5a(Seq.id.no.2和Seq.id.no.40、42及44)、圖5b(Seq.id.no.4和Seq.id.no.46、48及50)、圖5c(Seq.id.no.6和Seq.id.no.52、54及56)或圖5d(Seq.id.no.8和Seq.id.no.58、60及62)的至少一個(gè)，優(yōu)選兩個(gè)，更優(yōu)選三個(gè)CDR，以及任選的CDR一個(gè)或兩個(gè)末端不超過約10個(gè)氨基酸的鄰近構(gòu)架序列組成。
6.根據(jù)權(quán)利要求1的模擬抗體，其包含或由至少一個(gè)圖6定義的與人IgE Cε3結(jié)構(gòu)域同源的克隆52和克隆43的序列(Seq.id.no.26、28、30、32和34)組成。
7.藥物組合物，如疫苗，其包含或由根據(jù)權(quán)利要求1-6之任意一項(xiàng)的單一分子實(shí)體形式或化學(xué)偶聯(lián)到免疫原性載體分子上的蛋白質(zhì)結(jié)合物形式的模擬抗體組成，適當(dāng)?shù)?，與佐劑和其它常規(guī)賦形劑一起使用。
8.根據(jù)權(quán)利要求1-6之任意一項(xiàng)的模擬抗體，用作藥物，特別是用于治療IgE介導(dǎo)的疾病，如變態(tài)反應(yīng)，特別是哮喘、特應(yīng)性皮炎、鼻炎、慢性蕁麻疹和食物過敏，或根據(jù)權(quán)利要求1-6之任意一項(xiàng)的模擬抗體在制備治療IgE介導(dǎo)的疾病的藥物，特別是疫苗，中的用途。
9.通過特別是疫苗接種，治療IgE介導(dǎo)的疾病的方法，包括給需要這種治療或疫苗接種的患者施用有效治療劑量的根據(jù)權(quán)利要求1-6之任意一項(xiàng)的模擬抗體。
10.根據(jù)權(quán)利要求1-6之任意一項(xiàng)的模擬抗體在通過被動(dòng)免疫誘生抗此模擬抗體的多克隆或單克隆抗體中的用途；抗根據(jù)權(quán)利要求1-6之任意一項(xiàng)的模擬抗體的單克隆或多克隆抗體的制備，方法是通過給適當(dāng)?shù)姆侨藙?dòng)物施用根據(jù)權(quán)利要求1-6之任意一項(xiàng)的模擬抗體并分離和純化產(chǎn)生的抗此模擬抗體的抗體，或通過常規(guī)的雜交瘤技術(shù)；以無論何種方式從根據(jù)權(quán)利要求1-6之任意一項(xiàng)的模擬抗體獲得的多克隆或單克隆抗體在通過被動(dòng)免疫治療IgE介導(dǎo)的疾病中的用途；或如BSW17等干擾IgE的Cε3區(qū)與IgE高親和性受體結(jié)合的抗體在鑒定根據(jù)權(quán)利要求1-6之任意一項(xiàng)的模擬抗體中的用途。
全文摘要
本發(fā)明描述了干擾IgE的Cε3區(qū)與其高親和性受體結(jié)合的抗體的抗獨(dú)特型抗體或抗體片段(模擬抗體),特別是BSW17的抗獨(dú)特型抗體(BSW17－模擬抗體),以及它們?cè)谥委烮gE介導(dǎo)的疾病的藥物,特別是疫苗中的用途。
文檔編號(hào)A61P17/02GK1346372SQ00806155
公開日2002年4月24日 申請(qǐng)日期2000年4月12日 優(yōu)先權(quán)日1999年4月14日
發(fā)明者F·克里塞克, B·斯塔德勒, M·沃格爾 申請(qǐng)人:諾瓦提斯公司