專利名稱：適用于制備藥物和化妝品組合物的亞細亞酸鹽和羥基積雪草酸鹽的制作方法
技術(shù)領域：
本發(fā)明涉及適用于制備藥物和化妝品組合物的亞細亞酸鹽和羥基積雪草酸(madecassic acid)鹽的制備。
現(xiàn)有技術(shù)亞細亞(2α，3β，23-三羥基脲(trihydroxyurs)-12-烯-28-酸)酸(1)，羥基積雪草酸(2)和積雪草苷(3)是積雪草(CentellaAsiatica)三萜總餾分(FTT)的主要組成成份。
所述FTT的消化、利尿、再生、降溫、營養(yǎng)，退熱和結(jié)瘢等特性已為人們所認識。但是藥理學興趣主要集中在最后一種特性上。
實際上已經(jīng)證明，通過對成纖維細胞以及對膠原代謝所必需的兩種氨基酸--脯氨酸和丙氨酸產(chǎn)生作用，積雪草FTT可以對結(jié)締組織提供獨特的調(diào)節(jié)活性。
所有上述作用將導致較強生物刺激作用的傷口愈合過程產(chǎn)生，并導致較好的上皮再形成。
因此，積雪草FTT的治療用途被定位于治療紅斑，靜脈曲張性潰瘍，褥瘡，結(jié)瘢緩慢，灼傷，外傷和手術(shù)創(chuàng)傷，全身和局部發(fā)炎過程。
文獻資料一致認為在成纖維細胞刺激以及隨后促進上皮再形成的過程中，亞細亞酸是積雪草FTT中最具活性的成分(F.Bonte，M.Dumas，C.Chaudagne，A.Meybeck.Planta Med.60，133，1994.F.X.Maquart，G.Bellon，P.Gillery，Y.Wegrowski，J.Borcel，ConnetTissue Res.24，107，1990)，但是在制備適用于進行局部治療的組合物的過程中存在相當?shù)膯栴}。同樣，羥基積雪草酸也有類似的問題。
實際上，雖然在它們的分子結(jié)構(gòu)中存在4個親水功能基團(4個羥基中3個基團為醇基，一個基團為酸)，但是亞細亞酸和羥基積雪草酸的可濕性都比較差，幾乎不溶于水，其理化特性要求在配制用于局部使用的制劑、尤其是親水型制劑時需要使用獨特方法和特殊的賦形劑。另外，人們還了解到皮膚吸收主要以經(jīng)表皮的方式(在細胞內(nèi)和通過細胞)進行，并且主要通過有效組分對主要由角蛋白和水組成的角質(zhì)層的作用來控制。
因此，除了配制方面的問題以外，亞細亞酸和羥基積雪草酸在表皮水平上具有適當?shù)纳锢枚冗@個問題也仍然未能解決(P.-J.Shim，J.-H.Park，M.-Sun Chang，M.-J.Lim，D.Kim，Y.H.Yung，S.-S.Jew，E.H.Pavk，H.-Doo Kim，Bio Organic and MedicalChemistry Letters 24，2937，1996)。
圖表說明表1顯示了使用不同劑量的Asialene(a)和L-Asialene(b)所觀察到的水腫抑制百分比。
發(fā)明概述目前發(fā)現(xiàn)積雪草三萜餾分中酸類的鹽，如本發(fā)明所述的與藥學上可接受的有機堿成鹽的亞細亞酸和羥基積雪草酸的鹽類可以解決現(xiàn)有技術(shù)中的問題。
實際上，上述鹽類可以a)用來容易地制備有利于局部用組合物配制的親水性凝膠；b)增強亞細亞酸和羥基積雪草酸在表皮水平上的局部生物利用度；另外還適用于制備用于系統(tǒng)治療的藥物組合物。
本發(fā)明所述的亞細亞酸和羥基積雪草酸鹽類的上述及其它特性將主要在以下詳細描述中進行說明。
本發(fā)明的詳細描述本發(fā)明涉及與藥學上可接受的有機堿形成的亞細亞酸鹽和羥基積雪草酸鹽，其適用于制備藥物和化妝品組合物。
所述堿類包括乙二胺，乙醇胺，二乙醇胺，賴氨酸，氫氧化芐基三甲基銨和氫氧化四甲基銨。
根據(jù)以下幾個步驟制備所述鹽類a)在室溫條件下，在例如氯仿或乙醇等有機溶劑中制備上述有機堿溶液；b)在例如甲醇等有機溶劑中制備亞細亞酸或羥基積雪草酸溶液，并加熱至60-80℃；c)在室溫條件和攪拌下，將亞細亞酸或羥基積雪草酸溶液慢慢加入到有機堿溶液中；d)將通過步驟c)制得的混合物加熱至60-70℃并持續(xù)10至30分鐘；e)在真空和55-60℃的條件下除去溶劑；f)用有機溶劑洗滌得到的殘渣，然后用合適的有機溶劑進行結(jié)晶。
反應中使用的有機堿和亞細亞酸或羥基積雪草酸的摩爾比在3∶1到1∶1范圍之間。
所得鹽類除通過實施例中將要報告的常用分析方法進行定性之外，還使用PERKIN ELMER 398分光光度計通過紅外分光光度法進行了定性。
所得鹽類的紅外(K Br)光譜表明，由于羧基化基團的不對稱和對稱攪動頻率的原因，分別在1540和1380cm-1的位置上存在很強的吸收帶，其可作為已發(fā)生成鹽作用的分光光譜證據(jù)。
另外，還可以在3600和3100cm-1之間觀察到由氨和醇帶形成的強吸收帶。
在2500和2000cm-1之間這個區(qū)域中主要由伯氨基團引起的泛頻峰帶或混合峰帶存在于實施例中所描述的鹽類4，5a，5c，7和8a的光譜中。
如按照鹽與水1∶12到1∶20的比例(重量比)，用水對本發(fā)明所描述的鹽類進行處理，就可以形成凝膠。這種特性有助于帶有親水性凝膠的局部用組合物的制備。
另外，上述鹽類還可以通過具有(羥基或α-氨基酸)極性基團或(四甲基或芐基三甲基)非極性取代基的有機堿的適當選擇來調(diào)節(jié)親水性-親脂性之間的平衡。
本發(fā)明所述的鹽類具有比積雪草三萜總餾分(FTT)出乎意料高的抗炎和結(jié)瘢功效，因此可以成功地用于局部治療紅斑，靜脈曲張性潰瘍，靜脈供血不足，褥瘡，結(jié)瘢緩慢，灼傷，外傷和手術(shù)創(chuàng)傷，眼部和皮膚營養(yǎng)疾病(alloeosises)，以及發(fā)炎過程的藥物和化妝品組合物的制備。另外，上述鹽類還可用于制備具有同樣的治療和化妝目的的全身用口服和非腸道組合物。
上述組合物含有與藥學上可接受的或化妝上適合的賦形劑和/或稀釋物質(zhì)相混合的并具有治療有效或化妝適合劑量的本發(fā)明所述的鹽類。
現(xiàn)報告以下實施例來說明本發(fā)明實施例1與乙二胺成鹽的亞細亞酸鹽的制備(4)
根據(jù)下列反應進行制備- + +-(4)其中亞細亞酸用HAs表示。這個縮寫在以下實施例中還將會用到，含義相同。
在室溫和攪拌條件下，將在60℃條件下制得的亞細亞酸(4.89g，10mmol)的甲醇溶液(50ml)逐滴加至乙二胺(1.80 g，30mmol)的氯仿溶液(30ml)中。
滴加完成后，將混合物在60-65℃下加熱20分鐘。真空除去溶劑以后，所得粘稠殘渣用乙醚(30ml X2)洗滌兩次，再用乙腈(30ml)洗滌一次，最后用乙醇(95％)熱結(jié)晶。得到白色無定型固體，其與兩個水分子形成結(jié)晶，M.p.311-317℃。C62H108N2O12理論值C69.37；H10.14；N2.61實測值C69.16；H10.10；N2.59使用Fisher-John儀來測定熔點，使用FISON INSTRUMENTS S.p.Asociety(米蘭)公司的EA1110元素分析儀進行元素分析。
實施例2分別與乙醇胺(5a)、二乙醇胺(5b)和賴氨酸(5c)形成的亞細亞酸鹽的制備根據(jù)下列反應進行制備 在室溫和攪拌條件下，將亞細亞酸(4.89g，10mmol)的甲醇溶液(80ml)分別加至有機堿(12mmol)乙醇胺，二乙醇胺和賴氨酸的甲醇溶液(80ml)中。
加入開始15分鐘后，將所得混合物在50-60℃下加熱20分鐘。
在真空條件下蒸除甲醇以后，用合適的有機溶劑對所得殘渣進行結(jié)晶，特別地，化合物5a和5b使用甲醇-丙酮的混合物進行結(jié)晶，化合物5c使用甲醇進行結(jié)晶。制得的三種化合物的熔點如下5a241-245℃；5b299-305℃；5c300-314℃；制得的三種化合物的元素分析結(jié)果如下5aC32H59NO8理論值C65.61；H10.15；N2.39實測值C65.41；H10.07；N2.455bC34H63NO9理論值C64.83；H10.08；N2.22實測值C64.95；H9.98；N2.305cC36H66N2O9理論值C64.45；H9.92；N4.18實測值C64.65；H9.99；N4.07實施例3與氫氧化四甲基銨(6a)和氫氧化芐基三甲基銨(6b)成鹽的亞細亞酸鹽的制備根據(jù)下列反應進行制備 6aR3＝CH36bR＝C6H5CH2在室溫和攪拌條件下，將亞細亞酸(4.89g，10mmol)的甲醇溶液(80ml)分別加入氫氧化四甲基銨和氫氧化芐基三甲基銨(12mmol)的甲醇溶液(80ml)中。
15分鐘后，將所得混合物在50-60℃條件下加熱20分鐘。
真空條件下除去甲醇以后，用合適的溶劑將所得殘渣進行結(jié)晶，特別地，化合物6a使用甲醇-丙酮的混合物進行結(jié)晶，化合物6b使用甲醇-乙腈的混合物進行結(jié)晶。制得的兩種化合物的熔點如下6a214-220℃；6b203-209℃；制得的兩種化合物的元素分析結(jié)果如下6aC34H63NO7理論值C68.30；H10.62；N2.34實測值C68.12；H10.43；N2.386bC40H67NO7理論值C71.28；H10.02；N2.08實測值C71.54；H10.21；N1.98實施例4與乙二胺(7)成鹽的羥基積雪草酸鹽的制備根據(jù)下列反應進行制備- +(7)其中羥基積雪草酸用HMAD表示。這個縮寫在以下實施例中還將會用到。
制備過程與實施例1相同，但用羥基積雪草酸(5.05g，10mmol)的甲醇溶液(50ml)代替亞細亞酸。
鹽與一個水分子形成結(jié)晶，M.p.170-178℃。
制得的化合物的元素分析結(jié)果如下C32H58N2O7理論值C65.95；H10.03；N4.81實測值C65.66；H9.78；N4.74
實施例5與乙醇胺(8a)和二乙醇胺(8b)成鹽的羥基積雪草酸鹽的制備按照下列反應進行制備 8a-8b8aR1＝H，R2＝CH2CH2OH8bR1＝R2＝CH2CH2OH制備過程與實施例2相同，但用羥基積雪草酸(5.05g，10mmol)的甲醇溶液(80ml)代替亞細亞酸。
在甲醇-丙酮混合物中進行結(jié)晶。
制得的兩種化合物的元素分析結(jié)果證實了以下分子式8aC32H58NO888C36H61NO9實施例6與氫氧化四甲基銨(9a)和氫氧化芐基三甲基銨(9b)成鹽的羥基積雪草酸鹽的制備按照下列反應進行制備 9aR3＝CH39b＝R3＝CH2C6H5制備過程與實施例3相同，但用羥基積雪草酸(5.05g，10mmol)的甲醇溶液(80ml)代替亞細亞酸。
9a的結(jié)晶在甲醇-丙酮混合物中進行，9b的結(jié)晶在乙醇-乙腈混合物中進行。
制得的兩種化合物的元素分析結(jié)果證實了以下分子式9aC34H61NO79bC41H65NO7實施例7與乙二胺成鹽的亞細亞酸鹽凝膠的制備將按照實施例1所述方法制得的1g乙二胺與亞細亞酸鹽所成—鹽(4)，裝入配備有磁力攪拌器的燒瓶中。在室溫條件下加入15ml水，然后開始低速(每分鐘100-150轉(zhuǎn))攪拌。
在攪拌轉(zhuǎn)速逐漸加快至每分鐘1000-1500轉(zhuǎn)的同時，逐漸向鹽中加水以便形成凝膠。經(jīng)過4-6分鐘后，制得一種具有半固體稠度的凝膠，繼續(xù)攪拌5-8分鐘后其呈半透明狀。
生物實驗為了通過與現(xiàn)有技術(shù)的產(chǎn)品進行比較來證實本發(fā)明所述鹽類的結(jié)瘢和血小板抗凝集活性，對按照實施例1所述方法制得的表示為Asialene的鹽和表示為FTT的積雪草三萜總餾分進行了對比實驗。
另外，還對Asialene和按照實施例2所述方法制得的L-Asialene即與賴氨酸成鹽的亞細亞酸鹽同NSAID吲哚美辛的抗炎活性進行了對比評估。
1.來自人類培養(yǎng)內(nèi)皮細胞的PG1和纖連蛋白的生成實驗。
用可以推斷該物質(zhì)的血管滲透性和結(jié)瘢功效的體外實驗對表示為Asialene的按照實施例1所述方法制得的鹽的結(jié)?；钚赃M行了評估。
該項實驗在于對人類臍帶靜脈膠原酶提取的細胞的PG1生成的評價，所述細胞懸浮并接種于合適的培養(yǎng)基(E199+FCS 20％+L-谷氨酰胺2mM+青霉素200U/ml+鏈霉素200μg/ml)上，并在75ml或25ml燒瓶中培養(yǎng)48-72小時。
用0.05％的胰蛋白酶和0.02％的EDTA除去細胞，然后再用接種在35mmPetri皿中的次級培養(yǎng)物制備傳代培養(yǎng)物，置于帶有5％CO2100％濕度的培養(yǎng)箱中。為了評估細胞的形態(tài)和融合以及PG1的生成，使用約300,000細胞/毫升的培養(yǎng)基按照以下三種方案在Burker室中進行計數(shù)1.細胞+培養(yǎng)基+EtOH(0.75g/dl)2.細胞+培養(yǎng)基+EtOH(0.75g/dl)+FTT(15μg/ml)3.細胞+培養(yǎng)基+EtOH(0.75g/dl)+Asialene(1.5μg/ml)在24小時和48小時時，用倒置光學顯微鏡對培養(yǎng)物進行評估，監(jiān)測細胞的附著和生長情況，同時還要用RIA方法對上清液等分試樣中的前列環(huán)素(6-Keto PGF1)的穩(wěn)定代謝進行測定。
下面的表格中給出了以μg/ml為單位的6-Keto PGF1數(shù)值(結(jié)瘢活性與6-Keto PGF1的水平相互關聯(lián))。
為了對纖連蛋白進行評估，將初級培養(yǎng)物再次懸浮于0.05％的胰蛋白酶/0.02％的EDTA中。對用Hanks溶液洗滌兩次的細胞進行計數(shù)，以保證至少達到300,000細胞/毫升并進行接種。48小時后除去上層清液，制備載玻片，用PBS洗滌兩次后進行干燥，并于醋酸/乙醇中固定30分鐘；然后再用PBS洗滌一次，加入多克隆兔抗人纖連蛋白抗體(1∶40，Dako)。室溫條件下孵育30分鐘后，用PBS進行洗滌，然后加入熒光化的抗兔免疫球蛋白抗體(1∶100，Dako)。將載玻片孵育30分鐘后置于物鏡架上，并用熒光電子顯微鏡進行讀取觀察。
在下面的表格中列出了與纖連蛋白細胞間絲(1∶100比例)有關的數(shù)目。
2.對血小板聚集抑制作用的評價按照1∶9的比例，將從一周內(nèi)未曾接受過任何藥物治療的健康志愿者身上抽取血液收集到裝有3.8％檸檬酸鈉的試管中，在1000g下離心10分鐘，以獲得高血小板濃度的血漿(PRP)，并在3000g下離心15分鐘，以獲得低血小板濃度血漿(PPP)。在37℃并分別在100μl FTT(700μg/ml)和10μl Asialene(70μg/ml)存在下，將兩份400μlPRP樣品(最終濃度為300,000+/-10000血小板/毫升)培養(yǎng)60秒。然后將每份樣品分為三份，分別用10μl的血小板聚集劑，ADP(最終濃度為4mM)，膠原(最終濃度為4μg/ml)和花生四烯酸(最終濃度為0.2mg/ml)進行處理，然后紀錄下4分鐘內(nèi)的聚集情況。
所得結(jié)果報告如下表中。
3.局部抗炎活性實驗通過與NSAID吲哚美辛的抗炎活性相對比來進行Asialene和L-Asialene的抗炎活性的評估。采用誘發(fā)于小鼠耳部的巴豆油皮炎作為試驗模型(Tubaro et al.，Agents & Actions 17347-349)。
在經(jīng)麻醉的小鼠(145mg/kg氯胺酮鹽酸鹽i.p.)的右耳(表面積約1平方厘米)上使用溶于15μl丙酮中的80μg巴豆油(Sigma-Italy)誘發(fā)試驗用炎癥，而小鼠左耳則不做任何處理。將受試物質(zhì)溶于巴豆油溶液中。皮炎誘發(fā)六個小時后，將動物處死，切孔經(jīng)處理和未經(jīng)處理的耳部(直徑6mm)并稱重。通過測定處理后和未處理的(另一側(cè))耳部樣品重量差異，對巴豆油誘發(fā)的水腫進行定量。用受試物質(zhì)處理的動物與只接受刺激劑處理的動物相比較的水腫反應百分抑制來表示抗水腫活性。采用重量為20-32g的雄性白化病瑞士小鼠CD-1(Harlan-Italy)進行試驗。在試驗過程中，每種物質(zhì)和劑量水平均使用10只動物。
將對血管反應的作用評價為水腫百分抑制。通過Student’s“t”檢驗對試驗結(jié)果進行分析，P值小于0.05為具顯著性。通過線性內(nèi)插法，從劑量-反應關系計算每種物質(zhì)可降低水腫反應50％的劑量(ID50)。
以等摩爾劑量給予Asialene和L-Asialene。所得試驗結(jié)果見下表。
*在Student’s“t”檢驗中為0.05這兩種產(chǎn)品對巴豆油誘發(fā)的水腫都以劑量依賴關系表現(xiàn)出了很強的抑制作用。在受試的最低劑量(30μg/cm2)下，Asialene具有顯著的水腫抑制作用，其抑制作用在300μg/cm2幾乎達到最高值。如

圖1所示，Asialene的劑量-活性關系顯示為經(jīng)典S曲線中的升高部分，在30至300μg/cm2這個區(qū)間里為線性關系，而在1000μg/cm2時活性顯示為曲線的漸近線部分。從線性部分可以計算出ID50數(shù)值為62μg/cm2。L-Asialene表現(xiàn)出的實際上是一種疊加作用，從中獲得ID50值為60μg/cm2。對照藥物吲哚美辛在劑量達到90μg/cm2時可以抑制水腫反應幾乎50％；根據(jù)以往數(shù)據(jù)，我們可以認定這個劑量代表著吲哚美辛的ID50值。
通過對比受試物質(zhì)的ID50數(shù)值可以確定Asialene和L-Asialene具有基本相同的功效，至少在本試驗模型中顯示比對照藥物高出50％。
權(quán)利要求
1.與藥學上可接受的有機堿形成的亞細亞酸鹽和羥基積雪草酸鹽。
2.權(quán)利要求1中所述的亞細亞酸鹽和羥基積雪草酸鹽，其特征在于所述的有機堿包括乙二胺，乙醇胺，二乙醇胺，賴氨酸，氫氧化芐基三甲基銨和氫氧化四甲基銨。
3.權(quán)利要求1中所述的亞細亞酸鹽和羥基積雪草酸鹽，其特征在于它們可以1∶12至1∶20的鹽/水比例形成凝膠。
4.適用于局部和全身性治療紅斑，靜脈曲張性潰瘍，靜脈供血不足，褥瘡，結(jié)瘢緩慢，灼傷，外傷和手術(shù)創(chuàng)傷，皮膚營養(yǎng)疾病(alloeosises)，眼疾病(alloeosises)和發(fā)炎過程的藥物和化妝品組合物，其中含有藥學上有效量或化妝上適合量的與藥學上可接受的或化妝上適合的賦形劑和/或稀釋物質(zhì)相混合的權(quán)利要求1中所述的鹽。
5.權(quán)利要求1中所述的與藥學上可接受的有機堿形成的亞細亞酸或羥基積雪草酸鹽的制備方法，其中包括a)在有機溶劑中制備所述的有機堿溶液；b)在有機溶劑中制備亞細亞酸或羥基積雪草酸溶液；c)將亞細亞酸或羥基積雪草酸溶液加入到有機堿溶液中；d)將經(jīng)步驟c)制得的混合物在40至70℃條件下進行加熱；e)除去溶劑并用有機溶劑洗滌殘渣，然后從有機溶劑中結(jié)晶出來。
6.權(quán)利要求5中所述的方法，其特征在于有機堿和亞細亞酸或羥基積雪草酸的摩爾比為3∶1到1∶1。
全文摘要
與藥學上可接受的有機堿形成的亞細亞酸鹽和羥基積雪草酸鹽,其適用于制備用于紅斑,靜脈曲張性潰瘍,靜脈供血不足,褥瘡,結(jié)瘢緩慢,灼傷,外傷和手術(shù)創(chuàng)傷,皮膚營養(yǎng)疾病(alloeosises),眼疾病(alloeosises)和發(fā)炎過程局部和全身性治療的藥物和化妝品組合物。
文檔編號A61K8/00GK1347398SQ00806451
公開日2002年5月1日 申請日期2000年4月19日 優(yōu)先權(quán)日1999年4月21日
發(fā)明者P·科維莫拉, A·拉尼塞 申請人:歐洲制藥集團有限責任公司