專利名稱：用glp－1進行代謝介入以提高缺血和再灌注組織的功能的制作方法
相關(guān)申請的交叉參考本申請是1998年10月8日遞交的60/103,498號臨時申請的部分繼續(xù)。
作為正常需氧呼吸的副產(chǎn)物，通常從線粒體電子轉(zhuǎn)移鏈中失去電子。此等電子與分子氧相互作用，產(chǎn)生活性游離基超氧化物，該超氧化物在其他反應步驟中在過氧化氫和鐵存在時產(chǎn)生極為活性而且毒性的羥基游離基。代謝活性的需氧組織具有防御機制，用于在這些活性氧物質(zhì)與細胞器、酶或DNA相互作用之前分解毒性游離基，而該相互作用的后果是在沒有所述保護機制時導致細胞死亡。這些防御機制包括使超氧化物歧化的酶超氧化物歧化酶(SOD)，分解過氧化氫的過氧化氫酶，以及作為非特異性游離基清除劑的肽谷胱甘肽。
雖然尚未完全理解，但認為在代謝組織缺血以及隨后的再灌注時，發(fā)生復雜的過程。首先在缺血階段，細胞內(nèi)抗氧酶的活性出現(xiàn)下降，包括SOD、過氧化氫酶和谷胱甘肽的活性。還有跡象表明，黃嘌呤氧化酶的活性在缺血過程中同時在血管內(nèi)皮組織中增加。產(chǎn)生氧游離基的能力增強(通過增強的黃嘌呤氧化酶活性)以及清除相同氧游離基的能力下降(通過SOD、過氧化氫酶和谷胱甘肽活性降低)，如果缺血細胞隨后再灌注血液以及氧，則大大增加了這些缺血細胞對氧化性突發(fā)情況的敏感性。該氧化性突發(fā)情況通常在再灌注的數(shù)秒-數(shù)分鐘內(nèi)發(fā)生，有可能對內(nèi)皮細胞以及構(gòu)成缺血-再灌注器官基質(zhì)的其他細胞導致可逆和不可逆性損傷。例如，如果心臟是該情況下的器官，可逆性氧化性損傷會使心肌暈眩(stunning)，而不可逆的損傷本身表現(xiàn)為心肌梗死。伴隨該首先發(fā)生的氧化性突發(fā)情況，是對細胞膜的氧化性損傷。細胞膜中脂質(zhì)氧化在中性白血病趨化性為缺血后區(qū)域中似乎發(fā)揮作用。此等經(jīng)活化的中性白血病粘附在血管內(nèi)皮上，誘導黃嘌呤脫氫酶在所述內(nèi)皮細胞中轉(zhuǎn)化為黃嘌呤氧化酶，并進一步加劇內(nèi)皮完整性的喪失。經(jīng)活化的中性白血病還從脈管系統(tǒng)中移出，進入心肌間隙空間，在此炎性細胞可直接殺死心肌細胞。另外，由于缺血-再灌注，正常鈣從肌質(zhì)網(wǎng)中的流動受到介入，產(chǎn)生可逆性心肌功能障礙，稱為心肌暈眩。
缺血-再灌注過程的后果是可逆及不可逆性細胞損傷、細胞死亡以及器官功能下降。更具體而言，對于心肌再灌注損傷，其后果包括心肌暈眩、心律不齊、以及梗死，結(jié)果產(chǎn)生生齲中風和潛在的充血性心臟衰竭。
與有限時間缺血性缺氧相關(guān)的細胞損傷以及隨后再灌注之間的反論是細胞損傷和死亡似乎不僅直接由于失氧期，而且還由于組織的重新加氧使得對缺氧期間氧化性損傷高度敏感。再灌注損傷開始于回流時立即產(chǎn)生的初始氧化性突發(fā)情況，而且隨著相同的缺血后組織中炎癥發(fā)展繼續(xù)惡化數(shù)小時。使缺氧后的細胞對氧化性損傷的敏感性下降的努力，以及降低這些相同組織中炎性反應的努力，都表明降低了對缺氧后再灌注器官的可逆性及不可逆性損傷。降低初始氧化性突發(fā)情況以及隨后與炎癥有關(guān)的損傷的方法組合可對再灌注損傷提供協(xié)同保護作用。
在治療患有缺血及MI的患者時，現(xiàn)在通常使用的常規(guī)治療方法是使用溶栓劑如鏈激酶和t-PA以及血管成形術(shù)。第4,976,959號美國專利公開了給藥t-PA和SOD以抑制在同時患有缺血的再灌注和/或透皮穿腔冠狀血管成形術(shù)期間的組織損傷，恢復區(qū)域血流。因此，越來越多的患者都有經(jīng)受再灌注損傷及其作用的可能性，特別是心臟病患者。
對除心臟外器官的再灌注損傷自身通常表現(xiàn)為功能效率大大降低，其后果是器官的早熟性退化或者簡單關(guān)閉。另外，如果有顯著的再灌注損傷，移植器官過程會增加排斥率。
如以上簡單討論的，雖然再灌注損傷的精確機理尚未完全清除，但在各種心臟病模型研究中匯集的大多數(shù)數(shù)據(jù)表明，產(chǎn)生源自于氧的游離基，包括超氧陰離子(O2)-、羥基游離基(·OH)和H2O2，是由于再灌注時重新引入分子氧，而且在組織壞死中起到重要的作用。降低這些氧衍生的游離基的產(chǎn)生的藥物(包括別嘌呤醇和deferroxamine)或者增加這些物質(zhì)的降解的藥物如超氧化物歧化酶、過氧化氫酶、谷胱甘肽以及銅絡合物，似乎可限制梗死面積，而且也可增強左心室功能從心臟暈眩中恢復。
特別是在急性心肌梗死期間使用代謝介入作為治療方法是已知的，但并非無可爭議。有許多試驗和臨床證據(jù)支持在急性MI后使用葡萄糖-胰島素-鉀(GIK)輸注(代謝介入的主要形式)，特別是在瑞典DIGAMI研究(Malmberg，K.和DIGAMI研究組(1997)Prospective randomizedstudy of intensive insulin treatment on long term survival after acutemyocardial infarction in patients with diabetes mellitus.Brit.Med.J.314，1512-1515)成功后。DIGAMI研究強調(diào)了葡萄糖-胰島素輸注對于糖尿病患者中急性MI的效力，但該類型的治療方法對于再灌注已不再被推薦或者使用。
因此可以看出仍需要安全有效而且對預防或者緩解缺血和再灌注對組織、特別是器官組織的有害作用具有更寬適用性的組合物，所述器官組織包括但不限于心肌。本發(fā)明的主要目的在于實現(xiàn)該需要。
本發(fā)明的另一個目的在于提供治療缺血和再灌注但沒有目前方法通常所具有的副作用的方法。
本發(fā)明的又一個目的是提供可用于靜脈給藥本發(fā)明組合物的藥物學上可接受的載體組合物，但該組合物沒有任何顯著的非所希望的副作用，而且不會負面影響抗原或者免疫刺激性質(zhì)。
從以下的進一步描述及所附的權(quán)利要求書，本發(fā)明的這些目的以及其他目的對本領(lǐng)域技術(shù)人員將更顯而易見。
發(fā)明簡述需要治療缺血和/或再灌注的個體用包括能夠結(jié)合胰高血糖素樣肽-1之受體的化合物的組合物進行治療，優(yōu)選通過靜脈給藥。本發(fā)明涉及用于此等治療的方法及組合物。發(fā)明詳細描述GLP-1是葡萄糖依賴性促胰島素激素，其有效地增強周圍葡萄糖攝入，但不誘導危險的低血糖病。另外，GLP-1強烈地抑制胰高血糖素分泌，獨立于其促胰島素作用，而且由此強效地降低血漿游離脂肪酸(FFA)水平，大大超過用胰島素治療時的作用。高FFA水平有可能是心肌缺血期間的主要毒性因素。
我們現(xiàn)在發(fā)現(xiàn)GLP-1可作為用于治療缺血-再灌注損傷的代謝方法。該發(fā)現(xiàn)是基于以下事實有兩種臨床情況，其中缺血-再灌注是常規(guī)而且潛在危險的事情用于急性MI的溶栓法，以及心臟手術(shù)期間缺血心麻痹后的心臟再灌注。另外，近來的試驗和臨床數(shù)據(jù)表明，缺血-再灌注現(xiàn)象對于用GIK輸注的代謝療法有特別的應答，甚至大大高于沒有再灌注的離體缺血(Apstein，CS(1998)Glucose-insulin-potassium foracute myocardial infacfion.Remarkable results from a new prospective，randomized trial.Circulation 98，2223-2226)。
在過去的十年中，治療伴隨MI的急性缺血的兩個重要治療進展是引入了血栓溶解和β-阻斷。但是，盡管該總的成功，血栓溶解的一些研究發(fā)現(xiàn)了早期過高死亡率，這歸因于再灌注誘發(fā)的損傷以及心肌暈眩。產(chǎn)生暈眩的機理是復雜的，但一致的觀點是認為其有可能與導致功能障礙性肌纖維膜Ca2+泵和胞液Ca2+過量負載的細胞內(nèi)酸中毒有關(guān)。凈結(jié)果是被損害的心肌收縮功能，導致機械效率下降，以及再灌注心室心律不齊。另外，最近的研究表明，細胞內(nèi)酸中毒又是由于糖酵解和完全葡萄糖氧化之間的不平衡，其意義是在TCA循環(huán)中糖酵解率與丙酮酸(糖酵解的終產(chǎn)物)的氧化不匹配。由于丙酮酸轉(zhuǎn)化為乳酸，該不匹配導致凈H+產(chǎn)生。該不平衡的最大可能原因是存在高血漿游離脂肪酸(FFA)水平，其優(yōu)先進入線粒體中，并抑制丙酮酸氧化。這是與灌注葡萄糖的心臟相比，灌注有FFA的心臟更不易在再灌注期恢復的機理。這在此已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，而且是以下治療發(fā)明的基礎之一GLP-1抑制FFA，超過用胰島素時的預期水平，其中用胰島素時抑制50％，而GLP-1可抑制FFA高達90％。
這些考慮增強了我們對用胰高血糖素樣肽治療缺血-再灌注的信心。已知的是，在正常灌注并充足加氧期間，心臟依賴于需氧代謝，而且使用FFA作為其優(yōu)選的燃料。相反，在缺血(血流下降)或者低氧(O2張力下降)期間，脂肪酸的β-氧化被損害(因為其是嚴格需氧的)，而且持續(xù)提供ATP更加依賴于無氧糖酵解。在缺血期間，葡萄糖-胰島素是有益的，這是因為其能夠增強葡萄糖的攝入并刺激糖酵解，由此提供ATP用于維持基本的膜功能，特別是離子轉(zhuǎn)運的功能。另外，葡萄糖-胰島素抑制脂肪組織的脂解，由此降低血漿FFA水平以及FFA向心肌中的攝入。由于對膜的直接去垢作用和cAMP的增加，以及acylcamitine的累積，高的FFA水平對于缺血心肌是毒性的。而acylcamitine的累積抑制Ca2+泵。凈作用是干擾了離交換、胞液Ca2+過量負載、以及產(chǎn)生收縮功能障礙和心律不齊。
在再灌注期間，葡萄糖-胰島素是有益的，這是因為如上所述，該療法可緩解產(chǎn)生暈眩的代謝不平衡。這是通過直接刺激PDH并由此刺激丙酮酸氧化，以及間接通過降低FFA攝入并由此提高丙酮酸與FFA氧化的比例而實現(xiàn)的。
由以上討論可以看出，葡萄糖-胰島素增強葡萄糖攝入和代謝以及降低FFA水平的雙重作用，在再灌注中具有顯著的治療效力。一些人已表達了以下憂慮在深的、基本上零流動的缺血中，糖酵解最終產(chǎn)物，即、乳酸，會由于不充分的“清洗”而發(fā)生累積。乳酸累積又會導致高的細胞內(nèi)質(zhì)子濃度，而且不能氧化還原NADH；高的[H+]以及NADH/NAD+比例抑制生產(chǎn)性糖酵解。在此情況下，葡萄糖對于細胞則為毒性的，因為ATP實際上是在產(chǎn)生果糖-1，6-二磷酸酯時被消耗，而高的[H+]會加劇心肌細胞壞死(Neely，JR和Morgan，HE(1974)Relationship between carbohydrate and lipid metabolism and the energybalance of heart muscle.Ann.Rev.Physiol.36，413-459)。但是，這些憂慮并沒有由于證明葡萄糖-胰島素產(chǎn)生有益結(jié)果的試驗及臨床數(shù)據(jù)的重量而消除。雖然不希望囿于任何理論，對此可能的解釋是，在人中，急性自發(fā)性缺血不是零流動缺血的癥狀，但相反代表了低流動缺血區(qū)域，其中殘留的灌注對于基礎轉(zhuǎn)運和乳酸清洗是足夠的。該事實現(xiàn)在為在缺血-再灌注中使用代謝療法提供了強有力的生理學邏輯。
現(xiàn)代的心臟手術(shù)涉及心瓣替換或者冠狀動脈分流接入(CABG)，通常需要低溫心麻痹性暫停、主動脈交叉鉗住以及手術(shù)期間的心肺分流。因此，常規(guī)心臟手術(shù)會有效地誘發(fā)選擇性的全面缺血以及隨后的再灌注，這潛在地使心臟暴露于所有可能的風險和損傷中，特別是對心肌缺血-再灌注。所以，防止心肌在心臟手術(shù)期間以及之后的損傷仍是最大問題。再灌注前的選擇性心麻痹缺血明顯與再血管化前在急性MI期間遇到的缺血-再灌注并行，而且因此許多以前考慮的病理學原則在心臟手術(shù)期間也是適用的。但是，在手術(shù)性心麻痹缺血-再灌注以及與MI有關(guān)的缺血-再灌注之間有一些顯著不同。在手術(shù)期間，心臟停止(心麻痹)并輸注冷(低溫)的溶液，用于最佳地保護心肌。在手術(shù)完成后，重新激活心臟，并再灌注與體溫相同溫度的加氧血液。這產(chǎn)生了以下順序低溫缺血以及常溫再灌注，防止了H+和乳酸的高組織累積水平。另外，與急性MI不同，低溫心麻痹是一種全身性的零流動缺血，然后是全身性再灌注。
在我們的以前申請(第60/103,498號，本申請是該在先申請的部分繼續(xù))中，已綜述了葡萄糖-胰島素輸注的缺點以及用GLP-1輸注替代它們的優(yōu)點，后者更為安全。總之，GIK輸注有低血糖和高血糖的顯著風險，而且技術(shù)上要求較高并需要許多人力。低血糖的危險是顯而易見的。
相反，這些風險在使用GLP-1輸注時都不存在。胰高血糖素樣肽(7-36)酰胺(GLP-1)是天然的、由腸中得到的、促胰島素肽，其是所謂腸降血糖素作用的主要成分。GLP-1在胰內(nèi)分泌細胞中發(fā)揮其主要作用，在胰內(nèi)分泌細胞中其(1)以葡萄糖依賴性的方式調(diào)節(jié)胰島素表達以及從β-細胞中的分泌；(2)刺激促生長素抑制素的分泌；以及(3)抑制胰高血糖素從α細胞中的分泌。雖然沒有正式解決，但強的胰高血糖素抑制(glucagonostatic)作用假設是由于以下原因之-或者全部(1)通過刺激α細胞上的GLP-1受體直接抑制，雖然這不太有可能；(2)通過小島內(nèi)釋放促生長素抑制素旁分泌抑制胰高血糖素分泌；或者(3)通過小島內(nèi)釋放胰島素旁分泌抑制。無論何種細胞機理，GLP-1在其同時刺激胰島素分泌以及抑制胰高血糖素釋放的能力方面都是獨特的。雖然治療性輸注胰島素也抑制胰高血糖素的釋放，但該作用沒有GLP-1作用那么強，后者直接、小島內(nèi)旁分泌地抑制胰高血糖素分泌。
GLP-1強有力地刺激胰島素釋放以及抑制胰高血糖素分泌的雙重能力，以及該促胰島素性作用對葡萄糖的嚴格依賴性，使得該分子在治療缺血-再灌注中具有獨特的治療效力。首先，GLP-1強烈刺激內(nèi)源性胰島素的分泌，并因此可用于實現(xiàn)對代謝治療缺血-再灌注中胰島素輸注有益的作用。雖然高劑量的GIK輸注通常包含25-33％葡萄糖和50-100U胰島素/L，但需要引入高血糖以實現(xiàn)治療效力，相反僅提供用于安全給藥高劑量胰島素的代謝環(huán)境，都仍不清除。有可能的是，需要足夠的葡萄糖血液濃度以保證底物轉(zhuǎn)運，但這并不一定意味著需要高血糖，而且不應偏離胰島素除葡萄糖攝入外還具有重要作用這一事實。因此，治療性GLP-1輸注有可能僅需要中等(如5％)的葡萄糖共同輸注，以維持葡萄糖血液濃度略高于生理濃度，引發(fā)胰島素釋放。葡萄糖不是必須的安全措施，因為小于等于3.5mM的血液濃度消除GLP-1的胰島素刺激活性，由此完全避免低血糖的危險。
其次，GLP-1發(fā)揮強有力的胰高血糖素抑制作用，與其促胰島素作用一起對FFA產(chǎn)生強的抑制作用。葡萄糖-胰島素輸注的主要優(yōu)點之一是降低了循環(huán)中FFA的濃度，以及抑制FFA攝入。當產(chǎn)生暈眩時，F(xiàn)AA及其代謝物對缺血心肌以及在再灌注期間具有直接毒性作用。因此降低FFA濃度是缺血-再灌注中代謝介入的主要治療目標、缺血-再灌注中代謝介入的目標。因為胰高血糖素對于脂肪組織脂解以及FFA產(chǎn)生是有力的刺激因素，GLP-1介導的胰高血糖素抑制作用進-步增強了胰島素誘導的FFA循環(huán)濃度降低。因此，GLP-1治療在這方面優(yōu)于葡萄糖-胰島素輸注。的確，健康自愿者中的初步數(shù)據(jù)表明GLP-1靜脈輸注將降低血漿FFA水平至低于對照值的10％。
GLP-1應在絕大多數(shù)患者中是有效的，不需要同時給藥葡萄糖。但是，小部分患者有可能需要葡萄糖/GLP-1以引發(fā)足夠的胰島素反應。另外，還有可能需要給藥鉀以校正在葡萄糖與GLP-1共同給藥時鉀在細胞內(nèi)室中的過度轉(zhuǎn)移。
除GLP-1或其生物類似物外，治療法還包括使用游離基清除劑如谷胱甘肽、褪黑素、維生素E、以及超氧化物歧化酶。在此等組合中，再灌注損傷風險被進一步減弱。
術(shù)語“GLP-1”或者胰高血糖素樣肽，包括模擬物，而且在本發(fā)明中包括胰高血糖素樣肽以及結(jié)合胰高血糖素樣肽-1(GLP-1)受體蛋白如GLP-1(7-36)酰胺受體蛋白并對胰島素分泌具有與GLP-1(7-36)酰胺相應的生物作用的相關(guān)肽和胰高血糖素樣肽-1的類似物，所述GLP-1(7-36)酰胺是GLP-1的天然生物活性形式。見Goke，B和Byrne，M，Diabetic Medicine，1996，13854-860。GLP-1受體是例如存在于產(chǎn)生胰島素的胰β-細胞上的細胞表面蛋白。胰高血糖素樣肽及類似物包括具有促胰島素活性的物質(zhì)以及作為GLP-1受體分子激動劑(即、活化)而且對產(chǎn)生胰島素的β-細胞具有第二信使活性的物質(zhì)。在以下文獻中描述了通過其受體表現(xiàn)活性的胰高血糖素樣肽的激動劑EP 0708179A2；Hjorth，S.A.等人，J.Biol.Chem.269(48)30121-30124(1994)；Siegel E.G.等人，Amer.Diabetes Assoc.57thScientific Sessions.Boston(1997)；Hareter，A.等人，Amer.Diabetes Assoc.57thScientificSessions，Boston(1997)；Adelhorst，K.等人，J.Bioil.Chem.269(9)6275-6278(1994)；Deacon C.F.等人，16thInternational Diabetes FederationCongress Abstracts，Diabetologia Supplemetn(1997)；Irwin，D.M.等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA.947915-7920(1997)；Mosjov，S.，Int.J.PeptideProtein Res.40333-343(1992)。胰高血糖素樣分子包括表達GLP-1激動劑(即、GLP-1受體分子的活化劑)及其在產(chǎn)生胰島素的β-細胞上存在的第二信使活性的多核苷酸。也是激動劑的GLP-1模擬物包括例如具體設計成活化GLP-1受體的化學合成的化合物。胰高血糖素樣肽-1拮抗劑也是已知的，例如參見Watanabe，Y等人，J.Endocrinol.140(1)45-52(1994)，并包括exendin(9-39)胺，其是exendin類似物，為GLP-1受體的強效拮抗劑(見例如WO 97/46584)。最近一些出版物公開了Black Widow GLP-1和Ser2GLP-1，見G.G.Holz，J.F.Hakner/Comparative Biochemistry and Physiology，Part B 121(1998)177-184；以及Ritzel等人，A synthetic glucagon-like peptide-1 analog withimproved plasma stability，J.Endocrinol 1998 Oct.159(1)93-102。
其他實施方案包括化學合成的胰高血糖素樣多肽以及基本上同源性的任何多肽或片段?！盎旧贤葱浴笔侵负怂峒鞍被嵝蛄?，代表具體的受試序列，例如突變序列，由于一個或多個取代、缺失或者增加而由參考序列發(fā)生變化，其凈效果不在參考序列和受試序列之間產(chǎn)生不利的功能相異性。為本發(fā)明的目的，具有超過50％同源性、優(yōu)選超過90％同源性、在增強β細胞對血漿葡萄糖濃度應答方面具有相同生物活性、以及具有相同表達特性的序列被認為是基本上同源的。為測定同源性，成熟序列的截短不應被考慮。同源性較低但具有可比生物活性以及相同表達特性的序列被認為是等價的。
哺乳動物GLP肽和胰高血糖素是由相同基因編碼的。在回腸中，表型被處理為兩種主要類別的GLP肽激素，即、GLP-1和GLP-2。已知有四種由表型肽處理得到的GLP-1相關(guān)肽。GLP-1(1-37)具有以下序列；His Asp Glu Phe Glu Arg His Ala Glu Gly Thr Phe Thr SerAsp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Gly Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp LeuVal Lys Gly Arg Gly(SEQ ID NO1)。GLP-1(1-37)通過翻譯后處理被酰胺化，產(chǎn)生GLP(1-36)NH2，其具有以下序列His Asp Glu PheGlu Arg His Ala Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu GlyGin Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Gls Gly Arg(NH2)(SEQ IDNO2)；或者其經(jīng)酶解后產(chǎn)生具有以下序列的GLP-1(7-37)His AlaGlu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Gly Gln Ala Ala LysGlu Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys Gly Arg Gly(SEQ ID NO3)。GLP-1(7-37)也可被酰胺化，產(chǎn)生GLP-1(7-36)酰胺，其是GLP-1分子的天然形式，而且具有以下序列His Ala Glu Gly Thr Phe Thr Ser AspVal Ser Ser Tyr Leu Glu Gly Gin Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu ValLys Gly Arg(NH2)(SEQ ID NO4)，而且為GLP-1分子的天然形式。
腸L細胞分別以1-5的比例分泌GLP-1(7-37)(SEQ ID NO3)和GLP-1(7-36)NH2(SEQ ID NO4)。這些截短形式的GLP-1在原位具有短的半衰期，低于10分鐘，而且被氨基二肽酶IV滅活，分別產(chǎn)生Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Gly Gln AlaAla Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys Gly Arg Gly(SEQ ID NO5)；以及Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Gly Gln Ala AlaLys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys Gly Arg(NH2)(SEQ ID NO6)。肽Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Gly Gln Ala Ala LysGlu Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys Gly Arg Gly(SEQ ID NO5)和Glu GlyThr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Gly Gln Ala Ala Lys Glu PheIle Ala Trp Leu Val Lys Gly Arg(NH2)(SEQ ID NO6)被認為可以影響肝葡萄糖產(chǎn)生，但不刺激胰島素由胰腺中的產(chǎn)生或者釋放。
在Gila畸形體毒液中有六種肽與GLP-1是同源性的。在表1中顯示了它們的序列與GLP-1序列的對比。表1a.HAEGTFTSDVSSYLEGQAAKEFIAWLVKGRNH2b.HSDGTFTSDLSKQMEEEAVRLFIEWLKNGGPSSGAPPPSNH2c.DLSKQMEEEAVRLFIEWLKNGGPSSGAPPPSNH2d.HGEGTFTSDLSKQMEEEAVRLFIEWLKNGGPSSGAPPPSNH2e.HSDATFTAEYSKLLAKLALQKYLESILGSSTSPRPPSSf.HSDATFTAEYSKLLAKLALQKYLESILGSSTSPRPPSg.HSDAIFTEEYSKLLAKLALQKYLASILGSRTSPPPNH2h.HSDAIFTQQYSKLLAKLALQKYLASILGSRTSPPPNH2a＝GLP-1(SEQ.ID NO4).b＝Exendin 3(SEQ.ID NO7).c＝Exendin 4(9-39(NH2(SEQ.ID NO8).d＝Exendin 4(SEQ.ID NO9).e＝Helospectin I(SEQ.ID NO10).f＝Helospectin II(SEQ.ID NO11).g＝Helodermin(SEQ.ID NO12).h＝Q8，Q9Helodermin(SEQ.ID No13).
表1中概括區(qū)域表示的主要同源性是肽c和h分別衍生于b和g。所有6種天然肽(a、b、d、e、f、和g)在1、7、11和18位是同源的。GLP-1和exendin3及4(a、b和d)進一步在4、5、6、8、9、15、22、23、25、26和29位是同源的。在2位，A、S和G在結(jié)構(gòu)上是類似的。在3位，殘基D和E(Asp和Glu)在結(jié)構(gòu)上是類似的。在22和23位，F(xiàn)(Phe)和I(Ile)在結(jié)構(gòu)上分別類似于Y(Tyr)和L(Leu)。同樣，在26位，L和I在結(jié)構(gòu)上是等價的。
因此，在GLP-1的30個殘基中，exendin 3和4在15位是相同的，而且在5個其他位置處是等價的。僅在殘基16、17、19、21、24、27、28和30處基團結(jié)構(gòu)變化是明顯的。Exendin在羧基端還具有額外的殘基。
GLP-1樣肽可通過固相化學肽合成法制備。GLP-1也可通過常規(guī)的重組技術(shù)來制備，其中可使用例如Sambrook和Maniaitis中描述的標準程序。在此所用術(shù)語“重組”是指蛋白得自于重組(如微生物或者哺乳動物)表達體系，而所述表達體系可進行遺傳改性，包含用于GLP-1或其生物活性類似物的表達基因。
GLP-1樣肽可由重組細胞培養(yǎng)基中通過以下方法回收并純制硫酸銨或乙醇沉淀、酸抽提、陰離子或陽離子交換色譜、磷酸纖維素色譜、疏水性相互作用色譜、親和性色譜、羥基磷灰石色譜以及卵磷脂色譜。對于最終純制步驟，可使用高效液相色譜(HPLC)。
本發(fā)明的多肽可為天然純制形式，或者是化學合成產(chǎn)物，或者是通過重組技術(shù)由原核或真核宿主(例如細菌、酵母、高級植物、昆蟲和哺乳動物細胞在培養(yǎng)基中或者于體內(nèi))產(chǎn)生的物質(zhì)。取決于重組制備程序中所使用的宿主，本發(fā)明的多肽通常是非糖基化的，但也可是糖基化的。
GLP-1活性可通過標準方法測定，通常是通過受體結(jié)合活性篩選法測定，該方法涉及提供在其表面上表達GLP-1受體的合適細胞，例如胰島瘤細胞系，如RINmSF細胞或者INS-1細胞。也可參見Mosjov，S.(1992)和EP 0708170A2。除使用放射免疫分析法測定示蹤物與膜的特異性結(jié)合外，也可測定cAMP活性或者葡萄糖依賴性的胰島素產(chǎn)生。在一個方法中，使用編碼本發(fā)明受體的多核苷酸，以轉(zhuǎn)染細胞，并由此表達GLP-1受體蛋白。因此，例如，這些方法可用于篩選受體激動劑，其中包括使所述細胞與待篩選的化合物相接觸，然后測定該化合物是否產(chǎn)生信號，即、活化受體。
多克隆及單克隆抗體可用于檢測、純制和鑒別在本發(fā)明方法中使用的GLP-1樣肽。諸如ABGA1178的抗體檢測完整未剪接的GLP-1(1-37)或者N端截短的GLP-1(7-37)或(7-36)酰胺。其他抗體檢測前體分子C端的末端，其是通過減法來計算生物活性的截短肽的量，即、GLP-1(7-37)或者(7-36)酰胺(Orskov等人，Diabetes，1993，42658-661；Orskov等人，J.Clin.Invest.1991，87415-423)。
其他篩選技術(shù)包括在測量由于受體活化導致的細胞外pH或離子交換的體系中使用表達GLP-1受體的細胞，例如經(jīng)轉(zhuǎn)染的CHO細胞。例如，潛在的激動劑與表達GLP-1蛋白受體的細胞接觸，然后測量第二信使應答，如信號傳導或者離子或pH變化，以測定該潛在的激動劑是否有效。
本發(fā)明的胰高血糖素樣肽受體結(jié)合蛋白可與合適的藥物載體組合使用。此等組合物包括治療有效量的所述多肽以及藥物學上可接受的載體或賦形劑。所述載體包括但不限于鹽水、緩沖鹽水、葡萄糖、水、甘油、乙醇、乳糖、磷酸鹽、甘露醇、精氨酸、海藻糖以及它們的混合物。劑型應適合于給藥方式，而且本領(lǐng)域技術(shù)人員可容易確定。GLP-1肽也可與本領(lǐng)域中體內(nèi)增強所述肽的半衰期的已知物質(zhì)組合使用，以增強或者延長肽的生物活性。例如，在給藥前，分子或者化學基團可共價鍵地連接在本發(fā)明的組合物上?；蛘撸鰪妱┛膳c所述組合物共同給藥。另外，所述物質(zhì)可包括已知抑制GLP-1樣肽的酶降解的分子，并可與GLP-1肽組合物共同給藥或者在其后給藥。所述分子可例如通過口服或者注射給藥。
給藥GLP-1或其類似物以及在此所述的載體體系的患者，特別是那些在計劃手術(shù)之前或者在缺血情況后頭4個小時內(nèi)進行治療的患者，觀察他們具有非常低的心律不齊、較低的組織損傷以及較少的不適感，而且沒有副作用。
由以上考慮來看，顯然輸注GLP-1可在心肌再灌注上發(fā)揮主要的治療作用。GLP-1可通過IV或者皮下給藥進行連續(xù)輸注，其中優(yōu)選的給藥水平是，靜脈(IV)給藥為0.1pmol/kg/min-10pmol/kg/min，皮下(SC)給藥為0.1pmol/kg/min-75pmol/kg/min，而對于IV單次注射(團塊)為0.005nmol/kg-20nmol/kg，SC為0.1nmol/kg-100nmol/kg。如果需要將血液葡萄糖水平維持在大于等于5mM(以維持有效的胰島素分泌)，GLP-1輸注可與葡萄糖(5％)共同給藥。類似地，也可以考慮共同給藥鉀(K+)，這取決于激活膜Na+/K+ATP酶使K+遷移至細胞內(nèi)空間的程度。在家或者救護車中，在例如急性自發(fā)性缺血后盡可能早地于缺血后期以及再灌注治療前開始GLP-1治療，而且之后繼續(xù)進行。如果是心臟手術(shù)，GLP-1輸注應在手術(shù)前12-24小時前、開始麻醉至主動脈交叉夾緊的手術(shù)期間、以及手術(shù)后松開夾鉗后至少72小時立即開始。如以上所述，共同給藥游離基清除劑可進一步有助于再灌注恢復。
從以上描述可以看出，本發(fā)明可實現(xiàn)所有目的。
權(quán)利要求
1.一種用于緩解由于缺血后血流再灌注導致的器官組織損傷的方法，其包括向需要此等治療的個體給藥有效量的組合物，該組合物包括結(jié)合胰高血糖素樣肽-1之受體的化合物以及藥物載體。
2.如權(quán)利要求1所述的方法，其中，所述胰高血糖素樣肽-1是GLP-1或其生物活性類似物。
3.如權(quán)利要求1所述的方法，其中，所述藥物載體選自于以下組中鹽水、緩沖鹽水、葡萄糖、水、甘油、乙醇、乳糖、磷酸鹽、甘露醇、精氨酸、海藻糖以及它們的混合物。
4.如權(quán)利要求1所述的方法，其中，給藥劑量為0.1pmol/kg/min-10pmol/kg/min。
5.如權(quán)利要求4所述的方法，其中，共同給藥葡萄糖。
6.如權(quán)利要求5所述的方法，其中，共同給藥鉀。
7.如權(quán)利要求4所述的方法，其中，共同給藥游離基清除劑。
8.如權(quán)利要求1所述的方法，其中，在缺血情況后4小時內(nèi)開始給藥。
9.如權(quán)利要求8所述的方法，其中，缺血情況后4小時內(nèi)開始給藥而且之后繼續(xù)進行。
10.如權(quán)利要求1所述的方法，其中，通過靜脈給藥。
11.如權(quán)利要求1所述的方法，其中，通過皮下或者微壓注射、深度肺吸入、外部泵或植入泵、緩釋注射、以及其他持續(xù)釋放裝置、口服、和藥貼、頰和其他透皮及透膜裝置給藥。
12.如權(quán)利要求1所述的方法，其中，器官組織是心肌。
13.如權(quán)利要求8所述的方法，其中，在情況發(fā)生后盡可能快地給藥。
14.一種用GLP-1進行代謝介入以提高缺血及再灌注組織的功能的方法，所述方法包括向需要此等治療的個體給藥有效量的組合物，該組合物包括結(jié)合胰高血糖素樣肽-1之受體的化合物以及藥物載體。
15.如權(quán)利要求14所述的方法，其中，所述胰高血糖素樣肽-1是GLP-1或其生物活性類似物。
16.如權(quán)利要求14所述的方法，其中，所述藥物載體選自于以下組中鹽水、緩沖鹽水、葡萄糖、水、甘油、乙醇、乳糖、磷酸鹽、甘露醇、精氨酸、海藻糖以及它們的混合物。
17.如權(quán)利要求14所述的方法，其中，給藥劑量為0.1pmol/kg/min-10pmol/kg/min。
18.如權(quán)利要求17所述的方法，其中，共同給藥葡萄糖。
19.如權(quán)利要求14所述的方法，其中，在缺血情況后4小時內(nèi)開始給藥。
20.如權(quán)利要求19所述的方法，其中，缺血情況后4小時內(nèi)開始給藥而且之后繼續(xù)進行。
21.如權(quán)利要求14所述的方法，其中，需要通過代謝介入來緩解的組織損傷是由于選自于以下組中的手術(shù)醫(yī)療過程產(chǎn)生的心臟手術(shù)、器官移植、創(chuàng)傷性截肢以及再接肢。
22.如權(quán)利要求14所述的方法，其中，所述手術(shù)醫(yī)療過程涉及缺血性再灌注，而該再灌注與腸梗塞和心肌梗死同時發(fā)生。
23.一種用于用GLP-1進行代謝介入以提高缺血及再灌注組織的功能的組合物，其包括有效量的GLP-1以及藥物學有效的載體。
全文摘要
本發(fā)明涉及用包含與胰高血糖素樣肽－1之受體結(jié)合的化合物的組合物治療與缺血相關(guān)的再灌注,優(yōu)選通過靜脈給藥所述化合物。本發(fā)明涉及用于此等治療的方法及組合物。
文檔編號A61K38/26GK1349409SQ00806951
公開日2002年5月15日 申請日期2000年4月27日 優(yōu)先權(quán)日1999年4月30日
發(fā)明者托馬斯·R·庫利奇, 馬里奧·R·W·埃勒斯 申請人:比昂布拉斯卡公司