專利名稱：使用TGF－β的基因治療的制作方法
背景技術(shù)：
1.發(fā)明領(lǐng)域本發(fā)明涉及將編碼轉(zhuǎn)化生長因子β超家族成員的至少一種基因引入至少一種哺乳動物結(jié)締組織中，用于哺乳動物宿主中結(jié)締組織再生的方法。本發(fā)明還涉及一種結(jié)締組織細胞系，它攜帶一種DNA載體分子，該載體含有編碼轉(zhuǎn)化生長因子β超家族成員的基因。
2.相關(guān)領(lǐng)域的簡述在矯形外科領(lǐng)域，變性關(guān)節(jié)炎或骨關(guān)節(jié)炎是最常見的伴有軟骨損傷的疾病。幾乎機體的每個關(guān)節(jié)，如膝、髖、肩、甚至是腕都會患。該疾病的發(fā)病機理是透明關(guān)節(jié)軟骨的變性(Mankin等，J.Bone Joint Surg，52A460-466，1982)。關(guān)節(jié)的透明軟骨變形、形成原纖維，最終凹陷。如果變性的軟骨能以某種方式再生，大多數(shù)病人將能重新享受生活，而沒有令人虛弱的疼痛。迄今尚未報道過能再生損傷透明軟骨的方法。
藥物遞送的傳統(tǒng)途徑(如口服、靜脈內(nèi)或肌肉內(nèi)給藥)對于將藥物攜帶到關(guān)節(jié)是無效的。關(guān)節(jié)內(nèi)注射藥物的半衰期通常較短。關(guān)節(jié)內(nèi)注射藥物的另一個缺點是需要頻繁重復(fù)注射，以在關(guān)節(jié)腔獲得可接受的藥物水平，用于治療慢性病如關(guān)節(jié)炎。因為迄今的治療藥物不能選擇性的靶向關(guān)節(jié)，必需使哺乳動物宿主接觸全身性高濃度的藥物，來實現(xiàn)持續(xù)的、關(guān)節(jié)內(nèi)治療劑量。而非靶器官接觸高濃度的藥物加重了抗關(guān)節(jié)炎藥物產(chǎn)生嚴重副作用(如哺乳動物宿主的胃腸道不適、和血液學(xué)、心血管、肝腎系統(tǒng)的變化)的傾向。
在矯形外科領(lǐng)域，已考慮將一些細胞因子作為治療矯形外科疾病的候選藥物。認為骨形態(tài)發(fā)生蛋白質(zhì)是骨形成的有效刺激劑(Ozkaynak等，EMBO J，92085-2093，1990；Sampath和Rueger，Complication in Ortho，101-107，1994)，并已報道TGF-β可作為骨發(fā)生和軟骨形成的刺激劑(Joyce等，J Cell Biology，1102195-2207，1990)。
認為轉(zhuǎn)化生長因子-β(TGF-β)是一種多功能細胞因子(Sporn和Roberts，Nature(London)，332217-219，1988)，并在細胞生長、分化和胞外基質(zhì)蛋白合成中起調(diào)節(jié)作用(Madri等，J Cell Biology，1061375-1384，1988)。TGF-β在體外抑制表皮細胞和成骨樣細胞的生長(Chenu等，Proc.Natl.Acad.Sci，855683-5687，1988)，但它在體內(nèi)刺激軟骨內(nèi)骨化和最終形成骨(Critchlow等，Bone，521-527，1995；Lind等，A Orthop Scand 64(5)553-556，1993；和Matsumoto等，In vivo，8215-220，1994)。TGF-β誘導(dǎo)的骨形成是通過它對骨膜下多能細胞的刺激所介導(dǎo)的，這些細胞最終分化成軟骨細胞(Joyce等，J Cell Biology，1102195-2207，1990；和Miettinen等，J Cell Biology，127-62021-2036，1994)。
已報道了TGF-β在矯形外科中的生物學(xué)作用(Andrew等，Calcif Tissue In.5274-78，1993；Borque等，Int J Dev Biol，37573-579，1993；Carrington等，J Cell Biology，1071969-1975，1988；Lind等，A Orthop Scand.64(5)553-556，1993；Matsumoto等，In vivo 8215-220，1994)。在小鼠胚胎中，染色顯示TGF-β與衍生自間充質(zhì)的組織(如結(jié)締組織、軟骨和骨)緊密相關(guān)。除了胚胎學(xué)的發(fā)現(xiàn)外，TGF-β還存在于骨形成和軟骨形成部位。它還能增強家兔脛骨骨折愈合。近來，報道了TGF-β的治療價值(Critchlow等，Bone，521-527，1995；和Lind等，A OrthopScand 64(5)553-556，1993)，但其短期作用和高成本限制了廣泛的臨床應(yīng)用。
TGF-β關(guān)節(jié)內(nèi)注射用于治療關(guān)節(jié)炎不理想，因為注射的TGF-β作用持續(xù)時間短，因為TGF在體內(nèi)降解成無活性形式。因此，需要一種長期釋放TGF-β的新方法，用于透明軟骨再生。
報道了自身移植軟骨細胞再生關(guān)節(jié)軟骨(Brittberg等，New Engl J Med 331889-895，1994)，但該方法包括兩次廣泛切除軟組織的手術(shù)。如果關(guān)節(jié)內(nèi)注射足以治療變性關(guān)節(jié)炎，這將對病人經(jīng)濟上和生理上有極大的好處。
基因治療是一種將特定蛋白轉(zhuǎn)移到特定部位的方法，它可以解決這個問題(Wolff和Lederberg，Gene Therapeutics，Jon A.Wolff編，3-25，1994；和Jerk，JNatl Cancer Inst，89(16)1182-1184，1997)。
美國專利5,858,355和5,766,585公開了制造一種IRAP(白細胞介素-1受體拮抗蛋白)基因的病毒或質(zhì)粒構(gòu)建物；用該構(gòu)建物轉(zhuǎn)染滑膜細胞(5,858,355)和骨髓細胞(5,766,585)；和將轉(zhuǎn)染細胞注射到家兔關(guān)節(jié)中，但未公開用屬于TGF-β超家族的基因再生結(jié)締組織。
美國專利號5,846,931和5,700,774公開了注射含有骨形態(tài)發(fā)生蛋白(BMP)(屬于TGFβ“超家族”)和截短的甲狀旁腺激素相關(guān)肽的組合物，來影響軟骨組織形成的維持并誘導(dǎo)軟骨組織。然而，未公開使用BMP基因作基因治療的方法。
盡管這些現(xiàn)有技術(shù)公開的內(nèi)容，對于將編碼產(chǎn)物的至少一種基因在體外或體內(nèi)引入哺乳動物宿主結(jié)締組織的至少一種細胞，用于治療哺乳動物宿主的方法仍然有非?，F(xiàn)實和基本的需要。另外，還需要一種方法，即采用編碼轉(zhuǎn)化生長因子β超家族成員的一種基因在哺乳動物宿主中再生結(jié)締組織。更具體說，需要一種方法，在體內(nèi)宿主結(jié)締組織細胞中表達編碼蛋白質(zhì)TGF-β超家族的基因。
發(fā)明簡述本發(fā)明滿足了本文上述需要。本發(fā)明提供了一種將至少一種編碼產(chǎn)物的基因引入哺乳動物結(jié)締組織的至少一種細胞中，用于治療哺乳動物宿主的方法。該方法包括用重組技術(shù)產(chǎn)生含有編碼該產(chǎn)物的基因的DNA載體分子，并將含有編碼該產(chǎn)物的基因的DNA載體分子引入結(jié)締組織細胞中。該DNA載體分子可以是任何能被傳遞并在靶細胞或組織中維持的DNA分子，從而編碼該感興趣產(chǎn)物的基因能穩(wěn)定表達。優(yōu)選用于本發(fā)明的DNA載體分子是病毒或質(zhì)粒DNA載體分子。該方法優(yōu)選包括將編碼該產(chǎn)物的基因引入哺乳動物結(jié)締組織的細胞，用于治療。
本發(fā)明涉及一種治療關(guān)節(jié)炎的方法，包括a)產(chǎn)生一種重組病毒或質(zhì)粒載體，該載體包含編碼蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)化生長因子超家族成員的DNA序列，該序列與一啟動子可操縱性連接；b)用所述重組載體體外轉(zhuǎn)染培養(yǎng)的結(jié)締組織細胞群，得到一群轉(zhuǎn)染的結(jié)締組織細胞；和c)將轉(zhuǎn)染的結(jié)締組織細胞通過關(guān)節(jié)內(nèi)注射移植到哺乳動物宿主的關(guān)節(jié)腔中，從而該DNA序列在關(guān)節(jié)腔內(nèi)的表達導(dǎo)致結(jié)締組織再生。
該重組載體可以是但不限于逆轉(zhuǎn)錄病毒載體，優(yōu)選逆轉(zhuǎn)錄病毒載體，載體還可以是質(zhì)粒載體。
本發(fā)明的方法包括在移植前儲藏一群轉(zhuǎn)染的結(jié)締組織細胞。細胞可在移植前液氮下儲藏在10％DMSO中。
結(jié)締組織細胞包括但不限于成纖維細胞、間充質(zhì)細胞、成骨細胞或軟骨細胞。成纖維細胞可以是NIH 3T3細胞或人包皮成纖維細胞。
結(jié)締組織包括但不限于軟骨、韌帶或腱。軟骨可以是透明軟骨。
本發(fā)明的方法使用轉(zhuǎn)化生長因子超家族的成員，包括轉(zhuǎn)化生長因子β(TGF-β)。轉(zhuǎn)化生長因子超家族的成員可以是TGF-β1、TGF-β2、TGF-β3、BMP-2、BMP-3、BMP-4、BMP-5、BMP-6或BMP-7。優(yōu)選，TGF-β是人或豬的TGF-β1、TGF-β2或TGF-β3。
本發(fā)明還涉及一種透明軟骨再生的方法，包括a)產(chǎn)生一種重組病毒或質(zhì)粒載體，該載體中包含編碼蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)化生長因子超家族成員的DNA序列，該序列與啟動子可操縱性連接；b)用該重組載體體外轉(zhuǎn)染一群培養(yǎng)的結(jié)締組織細胞，得到一群轉(zhuǎn)染的結(jié)締組織細胞；和c)通過關(guān)節(jié)內(nèi)注射將轉(zhuǎn)染的結(jié)締組織細胞移植到哺乳動物宿主的關(guān)節(jié)腔中，從而該DNA序列在關(guān)節(jié)腔內(nèi)的表達導(dǎo)致透明軟骨再生。
轉(zhuǎn)染的方法可通過脂質(zhì)體包裹、磷酸鈣共沉淀、電穿孔和DEAE-葡聚糖介導(dǎo)等方法進行。
本發(fā)明的方法包括使用優(yōu)選的質(zhì)粒pmTβ1。
本發(fā)明還涉及一種結(jié)締組織細胞系，它含有一種重組病毒或質(zhì)粒載體，該載體含有編碼轉(zhuǎn)化生長因子超家族成員的DNA序列。該結(jié)締組織細胞系可包括但不限于，成纖維細胞系、間充質(zhì)細胞系、軟骨細胞系、成骨細胞系或骨細胞系。成纖維細胞系可以是人包皮成纖維細胞系或NIH 3T3細胞系。
本發(fā)明的結(jié)締組織細胞系包含轉(zhuǎn)化生長因子超家族的成員。優(yōu)選的，轉(zhuǎn)化生長因子超家族的成員是TGF-β1、TGF-β2、TGF-β3、BMP-2、BMP-3、BMP-4、BMP-5、BMP-6或BMP-7。更優(yōu)選的，該成員是人或豬的TGF-β1、TGF-β2或TGF-β3。
本發(fā)明的結(jié)締組織細胞系還可以含有攜帶重組載體pmTβ1的細胞。
本發(fā)明的這些和其他目的將從本發(fā)明下面的描述、附圖和權(quán)利要求中獲得更全面的了解。
附圖簡述

圖1-TGF-β1 mRNA的表達。從NIH 3T3細胞或用pmTβ1(一種TGF-β1表達載體)穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的NIH 3T3細胞分離得到總RNA。這些細胞在鋅存在或不存在情況下生長。用TGF-β1 cDNA或β肌動蛋白cDNA作為對照探測總RNA(15毫克)。
圖2A-2B-再生軟骨的大體觀察2A.在股骨踝上制造矩形部分軟骨缺損，用未經(jīng)TGF-β1轉(zhuǎn)染的NIH 3T3細胞注射膝關(guān)節(jié)。該缺損沒能被覆蓋。
2B.注射NIH 3T3-TGF-β1細胞6周后缺損被新形成的組織覆蓋。再生組織的顏色幾乎與周圍軟骨相同。
圖3A-3D-再生軟骨的顯微鏡觀察(X 200)3A和3B.用對照細胞注射4和6周后缺損部分的蘇木精-伊紅(H&E)分析。無組織覆蓋最初的缺損區(qū)域。
3C和3D.注射TGF-β1-轉(zhuǎn)染細胞4和6周后缺損區(qū)域的蘇木精-伊紅(H&E)分析。在4周時，注射TGF-β1轉(zhuǎn)染的細胞后，部分缺損區(qū)域已被透明軟骨覆蓋。注射4周和6周后，再生組織變厚，6周時其高度幾乎與正常軟骨相同。在組織學(xué)上，再生的軟骨(箭頭)與周圍的透明軟骨相同。
圖4A-4B-家兔關(guān)節(jié)中/TGF-β1表達的免疫組織化學(xué)分析(x200)。
棕色(Brown)免疫過氧化物酶反應(yīng)產(chǎn)物表明在NIH 3T3 TGF-β1細胞中有高水平的重組TGF-β1表達(4B)。
4A顯示了注射對照細胞的家兔關(guān)節(jié)中的透明軟骨。
圖5A-5B-用H&E染色(A)和safranin-O染色(B)的再生組織的顯微鏡觀察(X200)。
5A.在部分損傷區(qū)域，H&E染色(黑色箭頭)顯示了再生的透明軟骨。
5B.在完全的剝離軟骨的區(qū)域，再生組織(白色箭頭)是纖維狀膠原。
圖6-pmTβ1的質(zhì)粒圖。
圖7A-7D-注射TGF-β1轉(zhuǎn)染細胞的家兔跟腱的總體形態(tài)學(xué)。
7A.注射對照細胞的腱。
7B.注射TGF-β1轉(zhuǎn)染細胞的腱，注射后6周。
7C.7A中的腱的橫切面圖。
7D.7B中的腱的橫切面圖。
圖8A-8F-H&E染色家兔跟腱中的再生組織的顯微鏡觀察。
8A、8B和8C顯示了注射對照細胞6周的腱。8A.放大50倍。8B.放大200倍。8C.放大600倍。
8D、8E和8F顯示了注射TGF-β1轉(zhuǎn)染細胞后6周的腱。8D.放大50倍。8E.放大200倍。8F.放大600倍。注射入該腱的TGF-β1轉(zhuǎn)染細胞看來比內(nèi)源性腱細胞更圓。通過作用的自分泌和旁分泌模式產(chǎn)生纖維狀膠原，腱增大。注射TGF-β1轉(zhuǎn)染細胞后腱增大。
圖9A-9B-對用H&E染色(A)和用TGF-β1抗體免疫組織化學(xué)染色(B)的家兔跟腱中的再生組織的顯微鏡觀察。棕色免疫過氧化物酶反應(yīng)產(chǎn)物表明，在NIH 3T3-TGF-β1細胞中高水平的重組TGF-β1表達。
發(fā)明詳述本文所用的術(shù)語“病人”指動物王國的成員，包括但不限于人類。
本文所用的術(shù)語“哺乳動物宿主”包括動物王國的成員，包括但不限于人類。
本文所用的術(shù)語“結(jié)締組織”是連接或支持其他組織或器官的組織，包括但不限于哺乳動物宿主的韌帶、軟骨、腱、骨和滑膜。
本文所用的術(shù)語“結(jié)締組織細胞”或“結(jié)締組織的細胞”包括在結(jié)締組織中發(fā)現(xiàn)的細胞，如成纖維細胞、軟骨細胞(chondrocyte)、和骨細胞(成骨細胞和骨細胞)，它們像脂肪細胞(adipocyte)和平滑肌細胞一樣分泌膠原性胞外基質(zhì)。優(yōu)選的結(jié)締組織細胞是成纖維細胞、軟骨細胞和骨細胞。更優(yōu)選的結(jié)締組織細胞是成纖維細胞。結(jié)締組織細胞還包括間充質(zhì)細胞，它們也稱為未成熟成纖維細胞。應(yīng)認識到本發(fā)明可采用結(jié)締組織細胞的混合培養(yǎng)物和單種類型細胞來實施。
本文所用的術(shù)語“結(jié)締組織細胞系”包括起源于共同親本細胞的多種結(jié)締組織細胞。
本文所用的術(shù)語“透明軟骨”指覆蓋關(guān)節(jié)表面的結(jié)締組織。僅作為舉例，透明軟骨包括但不限于關(guān)節(jié)軟骨、肋軟骨和鼻軟骨。
具體的，已知透明軟骨是自我更新的，對變化起反應(yīng)的，并使運動減少摩擦而穩(wěn)定。發(fā)現(xiàn)甚至在同一關(guān)節(jié)內(nèi)或關(guān)節(jié)之間厚度、細胞密度、基質(zhì)組成和機械性質(zhì)都不同，但保持著相同的總體結(jié)構(gòu)和功能。透明軟骨的某些功能包括對壓縮驚人的剛性、彈性，和突出的分散重量負荷的能力、最大程度減小軟骨下骨的高峰應(yīng)力的能力，以及強大的耐久性。
總體從組織學(xué)上說，透明軟骨看起來是能抵抗變形的一種光滑堅固表面。軟骨的胞外基質(zhì)含有軟骨細胞，但缺少血管、淋巴管和神經(jīng)。維持軟骨細胞和基質(zhì)之間的相互作用的精巧而高度有序的結(jié)構(gòu)起到了維持透明軟骨結(jié)構(gòu)和功能的作用，同時保持著低水平的代謝活動。O’Driscoll，J.Bone Joint Surg.，80A1795-1812，1998詳細描述了透明軟骨的結(jié)構(gòu)和功能，在此引入以供參考。
本文所用的術(shù)語“轉(zhuǎn)化生長因子-β(TGF-β)超家族”包含了一組結(jié)構(gòu)相關(guān)的蛋白質(zhì)，在胚胎發(fā)育過程中影響各式各樣的分化過程。該家族包括Müllerian抑制物質(zhì)(MIS)，它是正常雄性發(fā)育必需的(Behringer等，Nature，345167，1990)，果蠅十五褶(DPP)基因產(chǎn)物，它是背腹軸線形成和器官芽形態(tài)發(fā)生所必需的(Padgett等，Nature，32581-84，1987)，非洲爪蟾Vg-1基因產(chǎn)物，它位于卵子的植物極(Weeks等，Cell，51861-867，1987)，肌動蛋白(Mason等，Biochem，Biophys.Res.Commun.，135957-964，1986)，它能誘導(dǎo)非洲爪蟾胚胎的中胚層和前結(jié)構(gòu)的形成(Thomsen等，Cell，63485，1990)，和骨形態(tài)發(fā)生蛋白(BMP’s，如BMP-2、3、4、5、6和7，成骨素，OP-1)，它能誘導(dǎo)軟骨和骨從頭形成(Sampath等，J.Biol.Chem.，26513198，1990)。TGF-β基因產(chǎn)物可影響各種分化過程，包括脂肪形成、肌生成、軟骨生成、血細胞生成和表皮細胞分化(對于綜述，見Massague，Cell 49437，1987)，在此引入以供參考。
最初合成了作為大前體蛋白質(zhì)的TGF-β家族蛋白質(zhì)，然后經(jīng)過在離C-端約110-140個氨基酸的一簇堿性殘基處進行蛋白水解切割。這些蛋白質(zhì)的C-端區(qū)域都是結(jié)構(gòu)相關(guān)的，不同家族成員可根據(jù)其同源性程度分成不同亞組。雖然具體亞組內(nèi)的同源性范圍氨基酸序列相同性在70％-90％之間，但亞組之間的同源性明顯低得多，通常僅20％-50％。在各種情況下，活性種類看來是C-末端片段二硫鍵連接的二聚體。對于該家族大多數(shù)已研究過的成員，發(fā)現(xiàn)同二聚體具有生物活性，但對于其他家族成員，如抑制素(Ung等，Nature，321779，1986)和TGF-β(Cheifetz等，Cell，48409，1987)，也已檢測到異二聚體，這些異二聚體似乎與各個同二聚體具有不同的生物學(xué)性質(zhì)。
TGF-β基因超家族的成員包括TGF-β3、TGF-β2、TGF-β4(雞)、TGF-β1、TGF-β5(非洲爪蟾)、BMP-2、BMP-4、果蠅DPP、BMP-5、BMP-6、Vgr1、OP-1/BMP-7、果蠅60A、GDF-1、非洲爪蟾Vgf、抑制素-βA、抑制素-βB、抑制素-α和MIS。在Massague，Ann.Rev.Biochem.67753-791，1988中描述了這些基因，在此引入以供參考。
優(yōu)選TGF-β超家族的成員是TGF-β。更優(yōu)選的成員是TGF-β1、TGF-β2、TGF-β3、BMP-2、BMP-3、BMP-4、BMP-5、BMP-6或BMP-7。甚至更優(yōu)選的成員是人或豬的TGF-β。更優(yōu)選的成員是人或豬TGF-β1、TGF-β2或TGF-β3。最優(yōu)選的成員是人或豬TGF-β1。
本文所用的術(shù)語“可選擇標記”包括細胞表達的基因產(chǎn)物，該細胞能穩(wěn)定維持引入的DNA，該DNA導(dǎo)致細胞表達改變的表型如形態(tài)學(xué)的轉(zhuǎn)化或酶活性。分離表達某轉(zhuǎn)染基因的細胞可通過將第二種編碼可選擇標記的基因引入同一細胞來實現(xiàn)，例如引入具有能賦予對抗生素或其他藥物抗性的酶活性的標記。選擇性標記的例子包括但不限于胸腺嘧啶激酶、二氫葉酸還原酶、氨基糖苷磷酸轉(zhuǎn)移酶，它賦予對氨基糖苷抗生素(如卡那霉素、新霉素和遺傳霉素)的抗性、潮霉素B磷酸轉(zhuǎn)移酶、黃嘌呤-鳥嘌呤磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶、CAD(一種蛋白質(zhì)，具有尿嘧啶從頭生物合成的前三種酶活性-氨基甲酰磷酸合成酶、天冬氨酸轉(zhuǎn)氨基甲酰酶和二氫乳清酸酶(dihydroorotase))、腺嘌呤脫氨酶和天冬酰胺合成酶(Sambrook等，Molecular Cloning，16章，1989)，在此引入以供參考。
本文所用的術(shù)語“啟動子”可以是能控制真核生物中轉(zhuǎn)錄的有活性的任何DNA序列。啟動子可以在真核細胞或原核細胞中具有活性。優(yōu)選啟動子在哺乳動物細胞中具有活性。啟動子可以是組成型表達或可誘導(dǎo)的。優(yōu)選的啟動子是可誘導(dǎo)的。優(yōu)選的啟動子是可被外源刺激誘導(dǎo)的。更優(yōu)選的啟動子是被激素或金屬誘導(dǎo)的。最優(yōu)選的啟動子是金屬硫蛋白基因啟動子。類似的，可以將也能控制轉(zhuǎn)錄的“增強子元件”插入該DNA載體構(gòu)建物中，用于本發(fā)明的構(gòu)建物來增強感興趣基因的表達。
本文所用的術(shù)語“DC-chol”意味著一種含有陽離子膽固醇衍生物的陽離子脂質(zhì)體?！癉C-chol”分子包括叔氨基，中等長度的空間臂(兩個原子)和氨基甲酰基接頭鍵(Gao等，Biochem.Biophys.Res，Commun.，179280-285，1991)。
本文所用的術(shù)語“SF-chol”定義為一類陽離子脂質(zhì)體。
本文所用的與脂質(zhì)體相關(guān)的術(shù)語“生物學(xué)活性”指在靶細胞中引入功能性DNA和/或蛋白質(zhì)的能力。
本文所用的與核酸、蛋白質(zhì)、蛋白質(zhì)片段或其衍生物有關(guān)的術(shù)語“生物學(xué)活性”指核酸或氨基酸序列模仿野生型的核酸或蛋白質(zhì)引起的已知生物學(xué)功能的能力。
本文所用的術(shù)語“維持”當和脂質(zhì)體傳遞一起使用時，指引入的DNA保持在細胞內(nèi)的能力。當用于其他情況時，它指靶向DNA保持在靶細胞或組織中，從而賦予治療效果的能力。
本發(fā)明公開了在體外和體內(nèi)將感興趣的DNA序列傳遞到哺乳動物宿主的結(jié)締組織細胞的技術(shù)。活體外技術(shù)涉及培養(yǎng)靶結(jié)締組織細胞，在體外將DNA序列、DNA載體或其他感興趣的傳遞載體轉(zhuǎn)染入結(jié)締組織細胞，然后將修飾的結(jié)締組織細胞移植到該哺乳動物宿主的靶關(guān)節(jié)中，從而影響該感興趣基因產(chǎn)物的體內(nèi)表達。
作為體外成纖維細胞操縱的另選方法，將編碼感興趣的產(chǎn)物的基因引入脂質(zhì)體，直接注射到關(guān)節(jié)區(qū)域，其中脂質(zhì)體與結(jié)締組織細胞融合，導(dǎo)致體內(nèi)基因表達屬于TGF-β超家族的基因產(chǎn)物。
作為體外結(jié)締組織細胞操縱的另選方法，將編碼感興趣產(chǎn)物的基因作為裸露DNA引入關(guān)節(jié)區(qū)域。裸露DNA進入結(jié)締組織細胞，導(dǎo)致體內(nèi)基因表達屬于TGF-β超家族的基因產(chǎn)物。
本說明書公開的一種治療結(jié)締組織疾病的活體外方法包括首先產(chǎn)生一種重組病毒或質(zhì)粒載體，它含有編碼蛋白質(zhì)或其生物活性片段的DNA序列。然后用該重組載體感染或轉(zhuǎn)染一群體外培養(yǎng)的結(jié)締組織細胞，得到一群含有該載體的結(jié)締組織細胞。然后將這些結(jié)締組織細胞移植在哺乳動物宿主的靶關(guān)節(jié)腔中，影響該蛋白或蛋白片段在關(guān)節(jié)腔內(nèi)的隨后表達。該感興趣的DNA序列的表達對于減輕與結(jié)締組織疾病相關(guān)的有害關(guān)節(jié)病理變化是有用的。
本領(lǐng)域普通技術(shù)人員應(yīng)理解，治療人類患者的細胞的優(yōu)選來源是病人自己的結(jié)締組織細胞，如自身的成纖維細胞。
更具體的，作為基因，本方法包括使用一種能編碼轉(zhuǎn)化生長因子β超家族成員，或其生物活性衍生物或其片段，和一可選擇標記或其生物活性衍生物或片段的基因。
作為基因，本發(fā)明的另一個實施例包括使用能編碼至少一個轉(zhuǎn)化生長因子β超家族的成員，或其生物活性衍生物或片段的基因，和作為DNA質(zhì)粒載體，使用本領(lǐng)域普通技術(shù)人員已知的、能在靶細胞或組織內(nèi)，不論使用什么傳遞方法，都能在傳遞后穩(wěn)定維持的任何DNA質(zhì)粒載體。
一種方法是直接傳遞DNA載體分子到靶細胞或組織，不論它是病毒或質(zhì)粒DNA載體分子。作為基因，該方法還包括使用能編碼轉(zhuǎn)化生長因子β超家族成員或生物活性衍生物或其片段的基因。
本發(fā)明的另一個實施例提供了一種方法，將至少一種編碼產(chǎn)物的基因引入至少一種結(jié)締組織細胞，用于治療哺乳動物宿主。本發(fā)明方法包括使用非病毒物質(zhì)，將編碼該產(chǎn)物的基因引入結(jié)締組織細胞。更具體的，該方法包括脂質(zhì)體包裹、磷酸鈣共沉淀、電穿孔或DEAE-葡聚糖介導(dǎo)，以及作為基因，包括使用能編碼轉(zhuǎn)化生長因子超家族成員或生物活性衍生物或其片段，和一可選擇標記或生物活性衍生物或其片段的基因。
本發(fā)明的另一個實施例提供了另一種方法，來將至少一個編碼產(chǎn)物的基因引入至少一種結(jié)締組織細胞，用于治療哺乳動物宿主。該另一種方法包括使用能利用病毒將DNA載體分子傳遞給靶細胞或組織的生物學(xué)方法。優(yōu)選的，該病毒是一種擬病毒，其基因組已經(jīng)改變，使該擬病毒僅能傳遞并在靶細胞內(nèi)穩(wěn)定維持，但沒有在靶細胞或組織中復(fù)制的能力。用重組DNA技術(shù)進一步操縱改變的病毒基因組，使病毒基因組起到DNA載體分子的作用，它含有要在靶細胞或組織中表達的感興趣的異源基因。
本發(fā)明的優(yōu)選例是一種將TGF-β傳遞給靶關(guān)節(jié)腔的方法，該方法通過將TGF-β基因用逆轉(zhuǎn)錄病毒載體和本說明書中公開的活體外技術(shù)傳遞給哺乳動物宿主的結(jié)締組織。換言之，將編碼功能性TGF-β蛋白或蛋白片段的感興趣的DNA序列亞克隆入所選的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體中，然后使重組的病毒載體長到足夠的滴度，用于體外感染培養(yǎng)的結(jié)締組織細胞，并優(yōu)選通過關(guān)節(jié)內(nèi)注射將轉(zhuǎn)導(dǎo)的結(jié)締組織細胞移植到感興趣的關(guān)節(jié)中，優(yōu)選自身移植的細胞。
本發(fā)明的另一種優(yōu)選方法涉及將TGF-β超家族基因通過使用腺病毒載體、腺相關(guān)病毒(AAV)載體或單純皰疹病毒(HSV)載體直接體內(nèi)傳遞給哺乳動物結(jié)締組織。換言之，將感興趣的編碼功能性TGF-β蛋白質(zhì)或蛋白片段的DNA序列亞克隆入各病毒載體。然后使含TGF-β的病毒載體生長到足夠的滴度，優(yōu)選通過關(guān)節(jié)內(nèi)注射直接進入關(guān)節(jié)腔。
直接在關(guān)節(jié)內(nèi)注射含有感興趣基因的DNA分子導(dǎo)致受者結(jié)締組織細胞轉(zhuǎn)染，從而繞過了回收、體外培養(yǎng)、轉(zhuǎn)染、選擇和移植含該DNA載體的成纖維細胞，以促進感興趣的異源基因穩(wěn)定表達的要求。
將DNA分子遞呈給靶關(guān)節(jié)結(jié)締組織的方法包括但不限于將DNA分子包裹在陽離子脂質(zhì)體中，將感興趣的DNA序列亞克隆入逆轉(zhuǎn)錄病毒或質(zhì)粒載體，或?qū)NA分子本身直接注射入關(guān)節(jié)。不論DNA分子遞呈給膝關(guān)節(jié)的形式，DNA分子優(yōu)選以DNA載體分子(重組病毒DNA載體分子或重組DNA質(zhì)粒載體分子)的形式遞呈。將在真核細胞中有活性的啟動子片段插入到異源基因編碼區(qū)的直接上游，來確保感興趣的異源基因的表達。本領(lǐng)域普通技術(shù)人員可利用載體構(gòu)建的已知方法和技術(shù)來確保在DNA分子進入結(jié)締組織后的合適的表達水平。
在優(yōu)選例中，將從膝關(guān)節(jié)回收的成纖維細胞在體外培養(yǎng)，然后用作基因治療的傳遞系統(tǒng)。顯然申請人不限于使用已公開的特定結(jié)締組織?？赡苁褂闷渌M織來源，用于體外培養(yǎng)技術(shù)。使用本發(fā)明基因的方法可用于關(guān)節(jié)炎的預(yù)防或治療。應(yīng)明白申請人不限于僅治療膝關(guān)節(jié)的預(yù)防和治療用途。可能利用本發(fā)明預(yù)防性或治療性治療任何易感關(guān)節(jié)中的關(guān)節(jié)炎。
在本發(fā)明的另一個實施例中，提供了以治療有效量胃腸外給藥的一種化合物，它含有編碼TGF-超家族蛋白的基因和合適的藥物載體。
本發(fā)明的另一個實施例提供了胃腸外施給病人預(yù)防有效量的化合物，它含有編碼TGF-超家族蛋白的基因和合適的藥物載體。
本發(fā)明的另一個實施例包括本文前述的方法，包括體外將基因引入細胞。該方法還包括然后將感染的細胞移植入哺乳動物宿主。該方法包括在有效轉(zhuǎn)染結(jié)締組織細胞后，但在將感染細胞移植入哺乳動物宿主前，儲藏轉(zhuǎn)染的結(jié)締組織細胞。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)理解感染的結(jié)締組織細胞可在液氮下凍存于10％DMSO中。本方法包括使用基本上能防止高度易感關(guān)節(jié)炎的哺乳動物宿主中發(fā)生關(guān)節(jié)炎的方法。
本發(fā)明的另一個實施例包括一種方法，將至少一種編碼產(chǎn)物的基因引入哺乳動物宿主的至少一種結(jié)締組織細胞中，用于治療如前所述哺乳動物宿主，包括通過將含有編碼該產(chǎn)物基因的病毒載體直接引入哺乳動物宿主，實現(xiàn)體內(nèi)細胞的感染。優(yōu)選該方法包括通過關(guān)節(jié)內(nèi)注射實現(xiàn)直接引入哺乳動物宿主。該方法包括使用基本上能防止在高度易感關(guān)節(jié)炎的哺乳動物宿主發(fā)生關(guān)節(jié)炎的方法。該方法還包括將該方法用于治療患關(guān)節(jié)炎的哺乳動物宿主。另外該方法還包括如本文前述的使用該方法修復(fù)和再生結(jié)締組織。
本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)理解，使用脂質(zhì)體的病毒載體不限于如逆轉(zhuǎn)錄病毒所需的細胞分裂的限制，來實現(xiàn)結(jié)締組織細胞的感染和整合。作為基因，使用如本文前述的非病毒物質(zhì)的方法，包括使用編碼屬于TGF-β超家族成員的基因和可選擇標記基因(如抗生素抗性基因)。
本發(fā)明的另一個實施例是將編碼TGF-β超家族的成員的DNA序列通過本說明書公開的任一方法傳遞給哺乳動物宿主的結(jié)締組織，從而實現(xiàn)膠原的體內(nèi)表達，使結(jié)締組織(如軟骨)再生。
在作為例子公開的，而不是對本發(fā)明限制的具體方法中，將含有TGF-β編碼序列的DNA質(zhì)粒載體連接到金屬硫蛋白啟動子的下游。
結(jié)締組織是治療上難于靶向的器官。本領(lǐng)域已知的靜脈內(nèi)和口腔途徑的藥物傳遞很難到達這些結(jié)締組織，并有使哺乳動物宿主全身性接觸治療藥物的缺點。更具體的說，已知在關(guān)節(jié)內(nèi)注射蛋白質(zhì)能直接到達關(guān)節(jié)。然而，以包裹蛋白質(zhì)形式注射的藥物大部分在關(guān)節(jié)內(nèi)半衰期短。本發(fā)明通過將編碼可用于治療哺乳動物宿主的蛋白質(zhì)的基因引入哺乳動物宿主的結(jié)締組織解決了這些問題。更具體說，本發(fā)明提供了一種方法，將編碼具有抗-關(guān)節(jié)炎性質(zhì)的蛋白質(zhì)的哺乳動物宿主基因引入結(jié)締組織。
在本發(fā)明中，應(yīng)用基因治療解決了與TGF-β給藥相關(guān)的作用持續(xù)時間短和成本高的問題。轉(zhuǎn)染細胞可在組織培養(yǎng)物中存活6周以上而沒有形態(tài)變化。為了確定作用的耐久性和持續(xù)時間，將細胞注射到家兔跟腱中。如果對于體內(nèi)細胞營養(yǎng)供應(yīng)充足，該細胞可存活足夠長的時間，并產(chǎn)生TGF-β，來刺激周圍的細胞。該細胞在腱內(nèi)和關(guān)節(jié)內(nèi)兩種環(huán)境中都具有功能。
轉(zhuǎn)染細胞的濃度是局部作用的重要因素。在先前的實驗(Joyce等，見上，1990)中，TGF-β的劑量確定了形成的組織類型。特別是，軟骨形成與膜內(nèi)骨形成的比例隨著劑量的降低而下降。TGF-β在刺激原代成骨細胞和MC3T3細胞中還有二相性(Centrella等，Endicrinology，1192306-2312，1986)。即，根據(jù)濃度，它可以是刺激性的也可以是抑制性的(Chenu等，Proc.Natl.Acad.Sci，855683-5687，1988)。在本文提供的實施例中，NIH 3T3-TGF-β1細胞以104、105和106細胞/毫升的不同濃度刺激膠原合成。腱在106細胞/毫升的濃度下增大最多。
在實施例中，用0.3毫升106細胞/毫升濃度注射關(guān)節(jié)。收集注射后2-6周的標本。關(guān)節(jié)的環(huán)境與跟腱的不同。細胞可在關(guān)節(jié)內(nèi)自由移動。它們可移動到對該細胞具有特定親和力的區(qū)域?；?、半月板和軟骨缺損區(qū)域是細胞粘著的可能部位。注射6周后，在部分或完全損傷的軟骨缺損區(qū)域觀察到再生組織，但在滑膜和半月板處未觀察到。對于損傷區(qū)域的特異親和力是臨床應(yīng)用的另一個優(yōu)點。如果變性關(guān)節(jié)炎可僅用關(guān)節(jié)內(nèi)注射細胞而可治愈，那么可方便的治療病人，不用大手術(shù)。
注射細胞分泌的TGF-β可能以兩種方式刺激透明軟骨再生。一種是留在受傷區(qū)域的軟骨細胞在其細胞表面產(chǎn)生TGF-β受體(Brand等，J Biol Chem，2708274-8284，1995；Cheifetz等，Cell，48409-415，1987；Dumont等，MCellEndo，11157-66，1995；Lopez-Casillas等，Cell，67785-795，1991；Miettinen等，J Cell Biology，1276，2021-2036，1994；和Wrana等，Nature，370341-347，1994)。這些受體可能受到粘著在損傷區(qū)域的注射細胞分泌的TGF-β刺激。因為TGF-β在體內(nèi)以潛在形式分泌(Wakwfield等，J Biol Chem，263，7646-7654，1988)，潛在的TGF-β需要激活過程。另一種方式是潛在的TGF-β或轉(zhuǎn)染細胞分泌的TGF-β可能與TGF-β結(jié)合蛋白(LTBT)在部分損傷的軟骨層的胞外基質(zhì)上結(jié)合(Dallas等，J Cell Biol，131539-549，1995)。
不論作用機制如何，透明軟骨合成的發(fā)現(xiàn)表明長時期的高TGF-β能刺激透明軟骨再生。局部高濃度的該載體可能不是局部刺激的關(guān)鍵因素，但是理論上軟骨細胞可能是最合適的將TGF-β傳遞給軟骨受損區(qū)域的載體(Brittberg等，New EnglJ Med 331889-895，1994)。膠原雙層基質(zhì)是局部分布轉(zhuǎn)染細胞的另一種可能的載體(Frenkel等，J Bone J Surg(Br)79-B831-836，1997)。
用組織學(xué)方法確定了新形成的組織性質(zhì)。在H&E染色中，新形成的組織與周圍的透明軟骨相同(圖4)。為了評估新形成組織的性質(zhì)，用Safranin-O染色組織(Rosenburg，J Bone Joint Surg，53A69-82，1971)。與白色的纖維狀膠原相反，新形成的組織染成紅色，提示它是透明軟骨(圖5)。
完全損傷區(qū)域中的細胞產(chǎn)生了纖維狀膠原。由于存在對TGF-β刺激的骨樣基質(zhì)屏障，周圍成骨細胞可能未被刺激。NIH 3T3-TGF-β1細胞不刺激周圍細胞，而是通過自分泌刺激產(chǎn)生纖維狀膠原。自分泌和旁分泌激活刺激細胞的事實增加了用TGF-β1表達構(gòu)建物穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的軟骨細胞治療變性關(guān)節(jié)炎的可能性。
用TGF-β1表達構(gòu)建物穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的細胞系能在腱和膝關(guān)節(jié)內(nèi)存活。該細胞系在腱和完全損傷軟骨區(qū)域內(nèi)產(chǎn)生纖維狀膠原。然而，該細胞系在部分損傷的關(guān)節(jié)軟骨中產(chǎn)生透明軟骨。該作用的自分泌和旁分泌模式的刺激機制表明，用TGF-β超家族基因的成員進行基因治療是一種新的治療透明軟骨損傷的方法。
本發(fā)明通過轉(zhuǎn)染TGF-β1表達構(gòu)建物制備了穩(wěn)定的成纖維細胞(NIH 3T3-TGF-β1，和人包皮成纖維細胞TGF-β1)細胞系。這些產(chǎn)生TGF-β的細胞在體內(nèi)長時間的維持了高濃度的活性TGF-β。
要回答的關(guān)于基因治療，特別是細胞介導(dǎo)的基因治療的可能性的第一個問題是細胞在體內(nèi)的存活率。盡管TGF-β在體外能抑制免疫細胞，但細胞在具有高效免疫監(jiān)視系統(tǒng)的其他物種組織中可能不能存活。第二，應(yīng)評估基因在體內(nèi)表達的最佳濃度。我們將細胞以三種不同濃度注射到家兔的跟腱中，來回答這個問題。從腱內(nèi)注射的最佳濃度確定了要用的關(guān)節(jié)內(nèi)注射的濃度。第三個問題是細胞如何在關(guān)節(jié)內(nèi)刺激軟骨再生。
注射的細胞有兩種作用模式。一種是通過分泌TGF-β激活周圍細胞(旁分泌激活)(Snyder，Sci Am，253(4)132-140，1985)，另一種是自身激活(自分泌激活)。細胞濃度可影響這些途徑，但周圍環(huán)境可能是決定作用模式的最重要因素。關(guān)節(jié)內(nèi)關(guān)節(jié)液和韌帶內(nèi)部是兩種不同的環(huán)境，它們的血液供應(yīng)、營養(yǎng)供應(yīng)和圍繞的細胞都不同。將轉(zhuǎn)染的細胞注射到兩種不同環(huán)境中，以尋找出細胞的作用模式。該研究的整個目的是評估對矯形外科疾病的TGF-β-介導(dǎo)的基因治療，并明確體內(nèi)作用的模式。
提供下列實施例說明本發(fā)明，而不是限制。
實施例實施例I-材料和方法質(zhì)粒構(gòu)建為了產(chǎn)生金屬硫蛋白表達構(gòu)建物(pM)，用基因組DNA通過聚合酶鏈式擴增在用于擴增的寡核苷酸中構(gòu)建了XbaI和Bam HI限制性位點，產(chǎn)生了金屬硫蛋白I啟動子(-660/+63)。將擴增片段亞克隆入pBluescript(Stratagene，La Jolla，CA)的Xba I-Bam HI位點。通過將含有TGF-β1編碼序列和3’末端含生長激素聚腺苷酸化位點的1.2kb Bgl II片段亞克隆入pM的Bam HI-Sal I位點，產(chǎn)生了質(zhì)粒pmTβ1。
細胞培養(yǎng)和轉(zhuǎn)染-將TGF-β cDNA轉(zhuǎn)染入成纖維細胞(NIH 3T3-TGF-β1)或人包皮成纖維細胞/TGF-β1，在含有10％胎牛血清的Dulbecco改良Eagle培養(yǎng)基(GIBCO-BRL，Rockville，MD)中培養(yǎng)。將TGF-β1cDNA序列加入具有金屬硫蛋白基因啟動子的pmTβ1載體中。還將新霉素抗性基因序列插入該載體。
用磷酸鈣沉淀法將該載體插入所用的細胞。為了選擇具有轉(zhuǎn)染的基因序列的細胞，將新霉素(300微克/毫升)加到培養(yǎng)基中。然后，選擇存活的菌落并通過Northern分析和TGF-β1 ELISA(R&D系統(tǒng))試驗確認TGF-β1 mRNA的表達。將具有TGF-β1表達的細胞儲藏在液氮中，注射前進行培養(yǎng)。
Northern印跡分析-用異硫氰酸胍/苯酚/氯仿從細胞中分離出總RNA。在含有0.66M甲醛的1.0％瓊脂糖凝膠上電泳10微克RNA，轉(zhuǎn)移到DURALON-UV膜上，并與UV STRATALINKER(STRATAGENE)交聯(lián)。預(yù)雜交印跡，并在1％牛血清清蛋白、7％(w/v)SDS、0.5M磷酸鈉和1mM EDTA的溶液中65℃雜交。用0.1％SDS、1XSSC 50℃洗滌雜交印跡20分鐘，然后曝光底片。使RNA印跡與用于人TGF-β1的32P-標記的cDNA探針雜交。用β-肌動蛋白探針作樣品負荷的對照。
將細胞注射入家兔-選擇重2.0-2.5公斤的新西蘭白兔作為動物模型。用開他敏和roumpon麻醉后，用消毒巾覆蓋白兔。暴露跟腱，將0.2-0.3毫升濃度為104、105和106細胞/毫升的細胞注射到腱的正中部位。將硫酸鋅加到家兔飲用水中，用于表達轉(zhuǎn)染的DNA。用跟腱實驗確定最佳濃度后，進行關(guān)節(jié)內(nèi)注射。暴露膝關(guān)節(jié)，用手術(shù)刀制造部分和完全軟骨缺損。在透明軟骨層上制造部分缺損，注意不暴露軟骨下骨。除去所有透明軟骨后暴露軟骨下骨制造完全缺損?？p合手術(shù)傷口后，關(guān)節(jié)內(nèi)注射106細胞/毫升濃度的細胞，在飲用水中加入硫酸鋅。
組織學(xué)檢測-收集跟腱和膝關(guān)節(jié)后，用福爾馬林固定標本，用硝酸脫鈣。將它們包埋在石蠟塊中，切成0.8微米厚的切片。用蘇木精-伊紅和Safranin-O染色顯微鏡觀察再生的組織。
實施例II-結(jié)果穩(wěn)定的細胞系-用磷酸鈣共沉淀法(圖1)進行了轉(zhuǎn)染。大約80％存活的細胞集落表達轉(zhuǎn)基因mRNA。將這些選出的產(chǎn)生TGF-β1的細胞在硫酸鋅溶液中培育。當細胞在100μM硫酸鋅溶液中培育時，它們產(chǎn)生mRNA。TGF-β分泌率是約32納克/106細胞/24小時。
家兔關(guān)節(jié)軟骨缺損的再生-觀察了家兔跟腱以核查NIH 3T3-TGF-β1細胞的存活率。在106細胞/毫升濃度，跟腱比其他104和105兩種濃度都要厚。造成部分和完全軟骨缺損后，將0.3毫升106細胞/毫升的NIH 3T3-TGF-β1細胞注射到膝關(guān)節(jié)中。注射后2-6周檢查關(guān)節(jié)。在部分損傷的軟骨中，我們發(fā)現(xiàn)新形成的透明軟骨；注射后兩周，透明軟骨出現(xiàn)，注射后6周，軟骨缺損被透明軟骨覆蓋(圖2)。再生軟骨的厚度隨著時間過去而增厚(圖3)。注射細胞分泌的TGF-β1，可通過用TGF-β1抗體免疫組織化學(xué)染色觀察到(圖3)。用未經(jīng)TGF-β1轉(zhuǎn)染的正常成纖維細胞注射的對側(cè)關(guān)節(jié)未觀察到透明軟骨覆蓋。在部分損傷的區(qū)域，在Safrain-O染色中再生透明軟骨呈紅色(圖4)。(新形成的軟骨深度幾乎與缺損的深度相同)。該發(fā)現(xiàn)提示注射的細胞通過旁分泌作用模式激活周圍正常軟骨細胞。
完全損傷的軟骨中再生組織不是透明軟骨而是纖維狀膠原。它們的顏色在Safrain-O染色中呈白色，而不是透明軟骨獲得的紅色(圖5)。軟骨被纖維狀組織覆蓋，意味著僅通過自分泌模式激活這些細胞?？杀籘GF-β激活的周圍骨細胞看來由于存在厚的鈣化骨基質(zhì)而阻擋了TGF-β對其的刺激。注射的細胞可能由于該屏障不能刺激骨細胞。
將TGF-β1轉(zhuǎn)染的細胞注射到家兔跟腱中。這樣操作的腱顯示比對照腱總體更厚的形態(tài)學(xué)(圖7)。對該跟腱的切片作H&E染色，在顯微鏡下檢查，注入的NIH3T3-TGF-β1細胞存活并在家兔的跟腱中產(chǎn)生纖維狀膠原(圖8)。顯微鏡檢查用TGF-β1抗體作免疫組織化學(xué)染色的再生的腱組織，顯示TGF-β1在腱中的表達(圖9)。
為了說明雖然已描述了本發(fā)明的具體實施例，對于本領(lǐng)域技術(shù)人員來說本發(fā)明的細節(jié)顯然可作許多變化，然而這些變化不違背本發(fā)明權(quán)利要求所確定的范圍。
本文引用的所有參考文獻在此引入以供參考。
參考文獻Andrew JG，Hoyland J，Andrew SM，F(xiàn)reemont AJ和Marsh D在正常骨折愈合中通過原位雜交顯示TGF-β1 mRNA。Calcif Tissue Int，5274-78，1993。
Bourque WT，Gross M和Hall BK在骨折修復(fù)過程中四種生長因子的表達。Int J Dev Biol，37573-579，1993。
Brand T和Schneider MD無活性II型和I型受體TGF-β是TGF-β依賴轉(zhuǎn)錄的優(yōu)勢抑制劑。J Biol Chem，2708274-8284，1995。
Brittberg M，Lindahl A，Nilsson A，Ohlsson C，Isaksson O和PetersonL用自身軟骨細胞移植治療膝關(guān)節(jié)中的深度軟骨缺損。New Engl J Med 331889-895，1994。
Carringtong JL，Roberts AB，F(xiàn)lankers KC，Roche NS和Reddi AH在軟骨內(nèi)骨發(fā)育中TGF-β的積聚、定位和區(qū)室化J Cell Biology，1071969-1975，1988。
Centrella M，Massague J和Canalis E人血小板衍生的轉(zhuǎn)化生長因子-β刺激胎鼠顱骨中的骨生長。Endocrinology，1192306-2312，1986。
Cheifetz S，Weatherbee JA，Tsang MLS，Anderson JK，Lucas R，MassagueJ轉(zhuǎn)化生長因子β系統(tǒng)，交叉反應(yīng)配體和受體的復(fù)雜模式。Cell，48409-415，1987。
Chenu C，Pfeilschifter J，Mundy GR和Roodman GDTGF-β抑制長期人骨髓培養(yǎng)物中的成骨樣細胞形成。Proc.Natl.Acad.Sci，855683-5687，1988。
Critchlow MA，Bland YS和Ashhurst DE外源轉(zhuǎn)化生長因子-β2對家兔骨折愈合上的效果。Bone，521-527，1995。
Dallas SL，Miyazono K，Skerry TM，Mundy GR和Bonewald LF潛在的轉(zhuǎn)化生長因子β結(jié)合蛋白(LTBP)在潛在的TGF-β儲藏于胞外基質(zhì)中和作為結(jié)構(gòu)基質(zhì)蛋白質(zhì)的雙重作用。J Cell Biol，131539-549，1995。
Dumont N，O’Connor M和Philip A人子宮內(nèi)膜細胞上的轉(zhuǎn)化生長因子受體I型和II型受體以及糖基化-磷酯酰肌醇錨定的TGF-β結(jié)合蛋白質(zhì)的鑒定。MCell Endo，11157-66，1995。
Frenkel SR，Toolan B，Menche D，Pitman MI和Pachence JM用于軟骨修復(fù)的膠原雙層基質(zhì)軟骨細胞移植。J Bone J Surg[Br]79-B831-836，1997。
Heine UI，Munoz EF，F(xiàn)landers KC，Ellingsworth LR，Peter Lam H-Y，ThompsonNL，Roberts AB和Sporn MB轉(zhuǎn)化生長因子-β在小鼠胚胎發(fā)育中的作用J CellBiology，1052861-2876，1987。
Jenks S基因治療掌握基礎(chǔ)，限定細節(jié)[新聞]J Natl Cancer Inst，89(16)1182-1184，1997。
Joyce Me，Roberts AB，Sporn MB和Bolander ME轉(zhuǎn)化生長因子-β和大鼠股骨中軟骨生成和骨生成的引發(fā)。J Cell Biology，1102195-2207，1990。
Lind M，Schumacker B，Soballe K，Keller J，Melsen F和Bunger轉(zhuǎn)化生長因子β增強家兔脛骨的骨折愈合。A Orthop Scand，64(5)553-556，1993。
Lopez-Casillas F，Chifetz S，Doody J，Andres JL，Lane WS MAssague JTGF-β受體系統(tǒng)膜蛋白多糖成分的結(jié)構(gòu)和表達。Cell，67785-795，1991。
Madri JA，Pratt BM和Tucker AM轉(zhuǎn)化生長因子β對子宮內(nèi)膜細胞的表型調(diào)節(jié)依賴于胞外基質(zhì)的組成和結(jié)構(gòu)。J Cell Biology，1061375-1384，1988。
Mankin HJ關(guān)節(jié)軟骨對機械損傷的反應(yīng)。J Bone Joint Surg，52A460-466，1982。
Massague，Ann.Rev.Biochem.67753-791，1998。
Matsumoto K，Matsunaga S，Imamura T，Ishidou Y，Yosida H Sakou T骨折愈合過程中轉(zhuǎn)化生長因子β的表達和分布，In vivo，8215-220，1994。
Miettinen PJ，Ebner R，Lopez AR和Derynck RTGF-β誘導(dǎo)哺乳動物表皮細胞轉(zhuǎn)分化成間充質(zhì)細胞涉及I型受體。J Cell Biology，127-62021-2036，1994。
O’Driscoll，J.Bone Joint Surg.，80A1795-1812，1998。
zkaynak E，Rueger DC，Drier EA，Corbett C和Ridge RJOP-1 cDNA編碼TGF-β家族的成骨蛋白。EMBO J，92085-2093，1990。
Rosenburg L關(guān)節(jié)軟骨研究中Safranin-O組織學(xué)用途的化學(xué)基礎(chǔ)。J BoneJoint Surg，53A69-82，1971。
Sampath TK，Rueger DC骨生成蛋白-1(OP-1)的結(jié)構(gòu)、功能和矯形手術(shù)應(yīng)用。Complications in Ortho，101-107，1994。
Snyder SH細胞之間通訊的分子基礎(chǔ)。Sci Am，253(4)132-140，1985。
Sporn MB和Roberts AB肽生長因子是多功能的。Nature(London)，332217-219，1988。
Wakefield LM，Smith DM，F(xiàn)landers KC和Sporn MB來自人血小板的潛在轉(zhuǎn)化生長因子-β。J Biol chem，263，7646-7654，1988。
Wolff JA和Lederberg J基因轉(zhuǎn)移和治療的歷史。John A.Wolff編。GeneTherapeutics，3-25-1994.Birkhauser，Boston。
Wrana JL，Attisano L，Wieser R，Ventura F和Massague JTGF-β受體激活的機制。Nature，370341-347，1994。
權(quán)利要求
1.一種治療關(guān)節(jié)炎的方法，其特征在于，該方法包括a)產(chǎn)生一種重組病毒或質(zhì)粒載體，該載體含有與一啟動子可操縱性連接的，編碼蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)化生長因子超家族成員的DNA序列；b)用所述重組載體體外轉(zhuǎn)染一群培養(yǎng)的結(jié)締組織細胞，得到一群轉(zhuǎn)染的結(jié)締組織細胞；和c)通過關(guān)節(jié)內(nèi)注射將所述轉(zhuǎn)染的結(jié)締組織細胞移植到哺乳動物宿主的關(guān)節(jié)腔，從而所述DNA序列在所述關(guān)節(jié)腔中的表達導(dǎo)致結(jié)締組織再生。
2.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述重組病毒載體是逆轉(zhuǎn)錄病毒載體。
3.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述重組載體是質(zhì)粒載體。
4.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，在移植前先儲藏所述轉(zhuǎn)染的結(jié)締組織細胞群。
5.如權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于，在移植前將所述轉(zhuǎn)染的結(jié)締組織細胞群在液氮下儲藏在10％DMSO中。
6.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述結(jié)締組織細胞是成纖維細胞、間充質(zhì)細胞、成骨細胞或軟骨細胞。
7.如權(quán)利要求6所述的方法，其特征在于，在所述成纖維細胞中，成纖維細胞是NIH 3T3細胞或人包皮成纖維細胞。
8.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述結(jié)締組織是軟骨、韌帶或腱。
9.如權(quán)利要求8所述的方法，其特征在于，在所述軟骨中，所述軟骨是透明軟骨。
10.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述轉(zhuǎn)化生長因子超家族的成員是轉(zhuǎn)化生長因子β。
11.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述轉(zhuǎn)化生長因子超家族的成員是轉(zhuǎn)化生長因子-β1、轉(zhuǎn)化生長因子-β2、轉(zhuǎn)化生長因子-β3、骨形態(tài)發(fā)生蛋白-2、骨形態(tài)發(fā)生蛋白-3、骨形態(tài)發(fā)生蛋白-4、骨形態(tài)發(fā)生蛋白-5、骨形態(tài)發(fā)生蛋白-6或骨形態(tài)發(fā)生蛋白-7。
12.如權(quán)利要求10所述的方法，其特征在于，所述轉(zhuǎn)化生長因子-β是人或豬的轉(zhuǎn)化生長因子-β1、轉(zhuǎn)化生長因子-β2或轉(zhuǎn)化生長因子-β3。
13.一種透明軟骨再生的方法，其特征在于，該方法包括a)產(chǎn)生重組病毒或質(zhì)粒載體，該載體含有與啟動子可操縱性連接的，編碼蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)化生長因子超家族成員的DNA序列；b)用所述重組載體體外轉(zhuǎn)染一群培養(yǎng)的結(jié)締組織細胞，得到一群轉(zhuǎn)染的結(jié)締組織細胞；和c)通過關(guān)節(jié)內(nèi)注射將所述轉(zhuǎn)染的結(jié)締組織細胞移植到哺乳動物宿主的關(guān)節(jié)腔，從而所述DNA序列在所述關(guān)節(jié)腔中的表達導(dǎo)致透明軟骨再生。
14.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述轉(zhuǎn)染是通過脂質(zhì)體包裹、磷酸鈣共沉淀、電穿孔和DEAE-葡聚糖介導(dǎo)完成的。
15.如權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于，所述質(zhì)粒是pmTβ1。
16.一種結(jié)締組織細胞系，其特征在于，該細胞系含有重組病毒或質(zhì)粒載體，所述載體含有編碼轉(zhuǎn)化生長因子超家族成員的DNA序列。
17.如權(quán)利要求16所述的結(jié)締組織細胞系，其特征在于，所述結(jié)締組織細胞系是成纖維細胞系、間充質(zhì)細胞系、軟骨細胞系、成骨細胞系或骨細胞系。
18.如權(quán)利要求17所述的結(jié)締組織細胞系，其特征在于，在所述成纖維細胞系中，成纖維細胞系是人包皮成纖維細胞系或NIH 3T3細胞系。
19.如權(quán)利要求16所述的結(jié)締組織細胞系，其特征在于，所述轉(zhuǎn)化生長因子超家族的成員是轉(zhuǎn)化生長因子-β。
20.如權(quán)利要求16所述的結(jié)締組織細胞系，其特征在于，所述轉(zhuǎn)化生長因子超家族的成員是轉(zhuǎn)化生長因子-β1、轉(zhuǎn)化生長因子-β2、轉(zhuǎn)化生長因子-β3、骨形態(tài)發(fā)生蛋白-2、骨形態(tài)發(fā)生蛋白-3、骨形態(tài)發(fā)生蛋白-4、骨形態(tài)發(fā)生蛋白-5、骨形態(tài)發(fā)生蛋白-6或骨形態(tài)發(fā)生蛋白-7。
21.如權(quán)利要求19所述的結(jié)締組織細胞系，其特征在于，所述轉(zhuǎn)化生長因子-β是人或豬的轉(zhuǎn)化生長因子-β1、轉(zhuǎn)化生長因子-β2或轉(zhuǎn)化生長因子-β3。
22.如權(quán)利要求16所述的結(jié)締組織細胞系，其特征在于，所述重組載體是pmTβ1。
全文摘要
本發(fā)明涉及使用屬于轉(zhuǎn)化生長因子－β(TGF－β)超家族成員的細胞介導(dǎo)的基因治療,治療矯形外科疾病。證實了TGF－β基因治療可作為變性關(guān)節(jié)炎的新療法。在將TGF－β cDNA表達載體轉(zhuǎn)染入成纖維細胞(NIH 3T3－TGF－β1)后,將該細胞注射入家兔跟腱和具有人為造成的軟骨缺損的膝關(guān)節(jié)中。進行腱內(nèi)注射來確定其體內(nèi)表達的最佳濃度。制造了部分缺損軟骨模型來模仿膝關(guān)節(jié)的變性關(guān)節(jié)炎。新形成的透明軟骨覆蓋了用細胞－介導(dǎo)的基因治療方法治療的部分軟骨缺損,表明細胞存活并在該區(qū)域內(nèi)刺激基質(zhì)形成。完全除去軟骨的區(qū)域被纖維狀膠原覆蓋。
文檔編號A61K48/00GK1371289SQ00807074
公開日2002年9月25日 申請日期2000年5月3日 優(yōu)先權(quán)日1999年5月3日
發(fā)明者盧文鐘, 康庚愛, 李寬熙 申請人:組織基因公司