專利名稱：血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子變體及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子(VEGF)變體，制備所述變體的方法，使用所述變體的方法，組合物和測(cè)定法。更具體地說(shuō)，本發(fā)明涉及對(duì)VEGF受體，KDR和FLT-1具有不同于天然VEGF的結(jié)合親和力的VEGF變體。
背景技術(shù)：
血管的兩種主要細(xì)胞成分是內(nèi)皮和平滑肌細(xì)胞。內(nèi)皮細(xì)胞形成所有血管內(nèi)表面的襯里并構(gòu)成血液和組織之間的非血栓形成性界面。另外，內(nèi)皮細(xì)胞是形成新的毛細(xì)血管和血管的重要成分。因此，內(nèi)皮細(xì)胞在與腫瘤生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移以及各種非致瘤性疾病或紊亂相關(guān)的血管發(fā)生或新血管形成期間增生。
已報(bào)道各種天然存在的多肽誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞的增生。這些多肽中有堿性和酸性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(FGF)，Burgess和Maciag，生物化學(xué)年鑒，58575(1989)，血小板衍生的內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子(PD-ECGF)，Ishikawa等，自然，338557(1989)和血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)，Leung等，科學(xué)，2461306(1989)；Ferrara和Henzel，生物化學(xué)和生物物理研究通訊，161851(1989)；Tischer等，生物化學(xué)和生物物理研究通訊，1651198(1989)；Farrara等，PCT專利公開號(hào)WO90/13649(1990年11月15日公開)。
VEGF首先在牛垂體濾泡或?yàn)V泡星形細(xì)胞的條件培養(yǎng)基中證實(shí)。生化分析表明牛VEGF是二聚體蛋白質(zhì)，具有大約45,000道爾頓的表觀分子量和具有對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞的表觀促細(xì)胞分裂特異性。使用以該蛋白質(zhì)氨基末端氨基酸序列為基礎(chǔ)的寡核苷酸作雜交探針經(jīng)過(guò)篩選從該細(xì)胞制備的cDNA文庫(kù)分離了編碼牛VEGF的DNA。
使用牛VEGF cDNA作雜交探針經(jīng)過(guò)首次篩選從人細(xì)胞制備的cDNA文庫(kù)獲得了人VEGF。由此鑒定的一個(gè)cDNA編碼與牛VEGF具有超過(guò)95％同源性的165個(gè)氨基酸的蛋白質(zhì)；該165個(gè)氨基酸的蛋白質(zhì)一般稱為人VEGF(hVEGF)或VEGF165。經(jīng)過(guò)在哺乳動(dòng)物宿主細(xì)胞中表達(dá)人VEGF cDNA證實(shí)了人VEGF的促細(xì)胞分裂活性。用人VEGF eDNA轉(zhuǎn)染的細(xì)胞為條件的培養(yǎng)基可促進(jìn)毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞的增生，而對(duì)照細(xì)胞不能。[見Leung等，科學(xué)，2461306(1989)]。
盡管可從天然來(lái)源分離和純化血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子用于隨后的治療用途，但回收VEGF時(shí)在濾泡細(xì)胞中相對(duì)低的該蛋白質(zhì)濃度和在勞力和花費(fèi)方面的高成本證實(shí)在商業(yè)上不可行。因此，進(jìn)行了進(jìn)一步的努力以便經(jīng)過(guò)重組DNA技術(shù)來(lái)克隆和表達(dá)VEGF。[參見，例如，實(shí)驗(yàn)室調(diào)查，72615(1995)，并在此引用該參考文獻(xiàn)]。
已報(bào)道VEGF用于治療在不存在過(guò)度組織生長(zhǎng)的情況下，對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞的選擇性作用重要的病情，例如，糖尿病型潰瘍和由諸如皮下傷口的創(chuàng)傷引起的血管損傷。VEGF，即血管(動(dòng)脈和靜脈)內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子可恢復(fù)損傷的細(xì)胞(稱為血管發(fā)生的過(guò)程)和可刺激新血管形成(稱為血管形成的過(guò)程)。[參見，例如，F(xiàn)errara等，內(nèi)分泌學(xué)回顧，184-25(1997)]。
VEGF在各種組織中由于可選擇的RNA剪接導(dǎo)致以多種同型二聚體形式表達(dá)(每個(gè)單體121，165，189和206個(gè)氨基酸)。VEGF121是一種不結(jié)合肝素的可溶性促細(xì)胞分裂劑；更長(zhǎng)的VEGF形式以逐漸更高的親和力結(jié)合肝素。VEGF的肝素結(jié)合形式可被纖溶酶在羧基末端裂解釋放出VEGF的可擴(kuò)散形式。纖溶酶裂解后鑒定的羧基末端肽的氨基酸測(cè)序?yàn)锳rg110-Ala111。氨基末端“核心”蛋白，即作為同型二聚體分離的VEGF(1-110)與完整的VEGF165同型二聚體相比以相似的親和力結(jié)合單克隆中和抗體(例如稱為4.6.1和3.2E3.1.1的抗體)和FLT-1以及KDR受體的可溶性形式。
VEGF含有分別負(fù)責(zé)結(jié)合KDR(激酶結(jié)構(gòu)域區(qū))和FLT-1(FMS樣酪氨酸激酶)受體的兩個(gè)位點(diǎn)。據(jù)信這些受體僅存在于內(nèi)皮(血管)細(xì)胞上。在由，例如創(chuàng)傷等引起的缺氧的細(xì)胞中VEGF生產(chǎn)增加，從而允許VEGF與各自的受體結(jié)合以觸發(fā)產(chǎn)生生物學(xué)反應(yīng)的信號(hào)途徑。例如，VEGF與該受體的結(jié)合可導(dǎo)致增加血管通透性，引起細(xì)胞分裂和擴(kuò)展以形成新的血管通道，即血管發(fā)生和血管形成。[參見，例如，Malavaud等，心血管研究，36276-281(1997)]。據(jù)報(bào)道VEGF誘導(dǎo)的通過(guò)KDR 受體的信號(hào)負(fù)責(zé)VEGF的促細(xì)胞分裂效應(yīng)且可能在很大程度上負(fù)責(zé)VEGF的血管形成活性。[Waltenberger等，生物學(xué)和化學(xué)雜志，26926988-26995(1994)]。然而，F(xiàn)LT-1的生物學(xué)作用尚未完全明白。
已鑒定了VEGF蛋白質(zhì)與受體結(jié)合有關(guān)的位點(diǎn)或區(qū)域且發(fā)現(xiàn)位置接近。[參見，Weismann等，細(xì)胞，28695-704(1997)；Muller等，美國(guó)國(guó)家科學(xué)院院報(bào)，947192-7197(1997)；Muller等，結(jié)構(gòu)，51325-1338(1997)；Fuh等，生物學(xué)化學(xué)雜志，27311197-11204(1998)]。已發(fā)現(xiàn)KDR受體主要通過(guò)位于含有VEGF上第82位的精氨酸(Arg或R)，第84位的賴氨酸(Lys或K)，和第86位的組氨酸(His或H)的環(huán)上的位點(diǎn)結(jié)合VEGF。已發(fā)現(xiàn)FLT-1受體主要通過(guò)位于含有第63位的天冬氨酸(Asp或D)，第64位的谷氨酸(Glu或E)，和第67位的谷氨酸(Glu或E)的環(huán)上的位點(diǎn)結(jié)合VEGF。[Keyt等，生物學(xué)化學(xué)雜志，2715638-5646(1996)]。根據(jù)VEGF的晶體結(jié)構(gòu)和VEGF的KDR結(jié)合位點(diǎn)的功能定位，還發(fā)現(xiàn)了VEGF使用位于分子相反端的兩個(gè)對(duì)稱結(jié)合位點(diǎn)結(jié)合KDR受體。每個(gè)位點(diǎn)由兩個(gè)用于結(jié)合的“熱點(diǎn)”組成，該“熱點(diǎn)”由VEGF同型二聚體的兩個(gè)亞基上的殘基組成。[Muller等，出處同上]。這些結(jié)合決定簇中的兩個(gè)位于短的，3-鏈β-折疊上的決定簇?zé)狳c(diǎn)內(nèi)，該β-折疊在轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β2(TGF-β)和血小板衍生生長(zhǎng)因子(PDGF)中是保守的。
已鑒定了相對(duì)于其它受體選擇性地結(jié)合一種受體的某些VEGF相關(guān)分子。一種分子，即P1GF，與VEGF的PDGF樣結(jié)構(gòu)域具有53％的相同性。P1GF表現(xiàn)出以高親和力結(jié)合F1t-1而不能與KDR反應(yīng)。如文獻(xiàn)所述，P1GF在對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞的促細(xì)胞分裂活性中表現(xiàn)出極大的可變性[Maglione等，美國(guó)國(guó)家科學(xué)院院報(bào)，889267-9271(1991)；Park等，生物學(xué)化學(xué)雜志，26925646-25654(1994)；Sawano等，細(xì)胞生長(zhǎng)和分化，7213-221(1996)；Landgren等，癌基因，16359-367(1998)]。
最近，Ogawa等描述了一種編碼與哺乳動(dòng)物VEGF具有大約25％的氨基酸相同性的多肽(稱為VEGF-E)的基因。VEGF-E在Orf病毒(NZ-7菌株)基因組中鑒定，該病毒是一種感染綿羊和山羊且偶爾也感染人類產(chǎn)生具有血管形成的病灶的副痘病毒。研究人員進(jìn)行了細(xì)胞增生試驗(yàn)且報(bào)道了VEGF-E幾乎以與人VEGF相同的程度刺激人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞和大鼠肝竇狀隙內(nèi)皮細(xì)胞的生長(zhǎng)。結(jié)合研究也有報(bào)道。經(jīng)過(guò)將過(guò)度表達(dá)KDR受體或FLT-1受體的細(xì)胞與固定量的125I-標(biāo)記的人VEGF或VEGF-E一起培養(yǎng)，然后加入增加量的未標(biāo)記的人VEGF或VEGF-E進(jìn)行了競(jìng)爭(zhēng)實(shí)驗(yàn)。研究人員報(bào)道了與FLT-1相比VEGF-E選擇性地結(jié)合KDR受體。[Ogawa等，生物學(xué)化學(xué)雜志，27331273-31281(1998)]。
Meyer等，EMBO J.，18363-374(1999)也鑒定了VEGF家族的一個(gè)成員，稱為VEGF-E。Meyer等報(bào)道的VEGF-E分子在Orf病毒株D1701的基因組中鑒定。在體外，發(fā)現(xiàn)VEGF-E刺激組織因子的釋放且刺激血管內(nèi)皮細(xì)胞的增生。在兔體內(nèi)模型中，VEGF-E刺激兔角膜中的血管形成。Meyer等報(bào)道了VEGF-E分子結(jié)合特性的分析，在一些測(cè)定中揭示了與FLT-1受體相比該分子選擇性地結(jié)合KDR受體。也參見Wise等，美國(guó)國(guó)家科學(xué)院院報(bào)，963071-3076(1999)。
Olofsson等，美國(guó)國(guó)家科學(xué)院院報(bào)，9511709-11714(1998)報(bào)道了稱為“VEGF-B”的蛋白質(zhì)選擇性地結(jié)合FLT-1。研究人員公開了VEGF-B中Asp63，Asp64和Glu67殘基突變成丙氨酸殘基的誘變實(shí)驗(yàn)。對(duì)VEGF-B的突變形式的結(jié)合特性分析揭示突變蛋白表現(xiàn)出對(duì)FLT-1的親和力降低。
發(fā)明簡(jiǎn)述申請(qǐng)人鑒定了包括至少一個(gè)氨基酸突變(與天然VEGF的氨基酸序列相比)，特別是在氨基酸位置17至25和/或位置63至65處或之間至少一個(gè)氨基酸突變的VEGF變體。申請(qǐng)人還鑒定了在位置43，46，79或83處包括至少一個(gè)氨基酸突變(與天然VEGF的氨基酸序列相比)，特別是在位置43，46，79或83各處的氨基酸取代為丙氨酸的VEGF變體。申請(qǐng)人驚奇地發(fā)現(xiàn)各種VEGF變體對(duì)KDR和FLT-1受體表現(xiàn)出改變的結(jié)合親和力(與天然VEGF相比)，而且對(duì)KDR受體或FLT-1受體表現(xiàn)出選擇性結(jié)合親和力。
本發(fā)明提供了包括至少一個(gè)氨基酸突變(與天然VEGF的氨基酸序列相比)且對(duì)KDR受體具有選擇性結(jié)合親和力的VEGF變體?？扇芜x的是，至少一個(gè)氨基酸突變包括天然VEGF多肽中的一個(gè)氨基酸取代。
在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了在VEGF位置17至25處或之間包括至少一個(gè)氨基酸突變的VEGF變體。任選的是，所述VEGF變體在位置17至25處或之間包括一個(gè)氨基酸取代。具體的氨基酸取代包括F17I，M18E，Y21L，Y21F，Q22R，Q22K，Q22E，Y25S或Y25I。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述VEGF變體在VEGF的位置18和/或21處包括至少一個(gè)氨基酸取代，其中用谷氨酸取代18位的甲硫氨酸殘基和/或用亮氨酸取代21位的酪氨酸殘基。
在另一實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了在VEGF的第63至66位或之間含有至少一個(gè)氨基酸突變的VEGF變體。任選的是，所述VEGF變體包括在位置63至66處或之間的一個(gè)氨基酸取代。具體的氨基酸取代包括D63S，G65M，G65A，L66R或L66T。優(yōu)選的VEGF變體在VEGF位置63，65，和/或66處具有一個(gè)或多個(gè)氨基酸取代，其中用絲氨酸取代63位的天冬氨酸殘基，用甲硫氨酸取代第65位的甘氨酸殘基，和/或用精氨酸取代66位的亮氨酸殘基。
另一優(yōu)選的VEGF變體包括在VEGF的第63，65，和/或66位有多個(gè)(即，一個(gè)以上)氨基酸突變和/或在VEGF第17，18，21，22和/或25位的一處或多處有一個(gè)或多個(gè)氨基酸突變。更優(yōu)選的是，VEGF變體包含在VEGF的位置18和/或21處有一個(gè)或多個(gè)氨基酸取代(其中第18位用谷氨酸取代和/或第21位用亮氨酸取代)且在VEGF的位置63，65，和/或66處有一個(gè)或多個(gè)氨基酸取代(其中第63位用絲氨酸取代，第65位用甲硫氨酸取代，和/或第66位用精氨酸取代)。更優(yōu)選的是，VEGF變體可包括下列氨基酸取代組中之一M18E，Y21L，Q22R，Y25S；D63S，G65M，L66R；M18E，D63S，G65M，L66R；或Y21L，D63S，G65M，L66R。
在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，VEGF變體是含有包括本申請(qǐng)所述的一個(gè)或多個(gè)氨基酸取代的VEGF165氨基酸序列的多肽。
在表2中描述了其它的優(yōu)選VEGF變體，它們?cè)赩EGF序列的這些位置上含有多個(gè)氨基酸取代。
在另一實(shí)施方案中，本發(fā)明提供的VEGF變體對(duì)FLT-1受體具有選擇結(jié)合親和力，且優(yōu)選所述VEGF變體在43，46，79或83位的一處或多處包括一個(gè)或多個(gè)氨基酸突變。優(yōu)選的是，所述FLT-1選擇性VEGF變體在VEGF的第43，46，79和/或83位包括多個(gè)(即，一個(gè)以上)氨基酸突變。更優(yōu)選的是，所述FLT-1選擇性VEGF變體在VEGF的第43，46，79和/或83位包括一個(gè)或多個(gè)氨基酸取代成丙氨酸。最優(yōu)選的是，該FLT-1選擇性VEGF變體包含一組氨基酸取代I43A，I46A，Q79A，和I83A。
在另一方面，本發(fā)明提供了編碼本文所述的VEGF變體的分離的核酸。還提供了能表達(dá)本發(fā)明的VEGF變體的表達(dá)載體，含有所述載體的宿主細(xì)胞，及通過(guò)在產(chǎn)生VEGF變體的條件下培養(yǎng)所述宿主細(xì)胞來(lái)生產(chǎn)VEGF變體的方法。
在另一實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了含有VEGF變體和一種載體的組合物。任選的是，該載體可以是一種藥用上可接受的載體。
本發(fā)明還提供了治療需要血管發(fā)生或血管形成的病情的方法，例如，血管網(wǎng)絡(luò)的創(chuàng)傷，如手術(shù)切口，傷口，撕裂傷，穿刺血管和表面潰瘍。在這些方法中，可給具有所述病情的哺乳動(dòng)物施用有效量的VEGF變體。
本發(fā)明還提供了使用該VEGF變體的體外診斷方法。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述方法包括使用VEGF變體分析細(xì)胞或組織以檢測(cè)是否存在KDR和/或FLT-1受體。
最后，本發(fā)明提供了含有本文所公開的VEGF變體的試劑盒和產(chǎn)品。
附圖簡(jiǎn)述

圖1A和1B顯示了165個(gè)氨基酸的天然(“野生型”)VEGF的核苷酸序列和推斷的氨基酸序列。
圖2顯示了天然VEGF(8-109)的ELISA測(cè)定的滴定曲線。
圖3顯示了天然VEGF(8-109)的KIRA測(cè)定的滴定曲線。
圖4顯示了天然VEGF(8-109)的HUVEC增生試驗(yàn)測(cè)定的滴定曲線。
圖5顯示了通過(guò)使用各種濃度的天然VEGF(“WT VEGF)，LK-VRB-2s*(KDR選擇性變體)和Flt-1-sel(Flt-1選擇性變體)從表達(dá)KDR的NIH3T3細(xì)胞競(jìng)爭(zhēng)性取代125I-VEGF(1-165)所測(cè)量的配體對(duì)KDR的結(jié)合親和力。該測(cè)定法在實(shí)施例7中詳細(xì)描述。各點(diǎn)代表兩次測(cè)定的平均值，據(jù)估計(jì)誤差小于該值的15％。
圖6顯示了通過(guò)使用各種濃度的天然VEGF(“WT VEGF)，LK-VRB-2s*(KDR選擇性變體)和Flt-1-sel(Flt-1選擇性變體)從表達(dá)FLT-1的NIH3T3細(xì)胞競(jìng)爭(zhēng)性取代125I-VEGF(1-165)所測(cè)量的配體對(duì)Flt-1的結(jié)合親和力。該測(cè)定法在實(shí)施例7中詳細(xì)描述。各點(diǎn)代表兩次測(cè)定的平均值，估計(jì)誤差小于該值的15％。
圖7顯示了鑒定各種VEGF丙氨酸取代變體在結(jié)合中的倍數(shù)下降表。如實(shí)施例8所述，用各種丙氨酸變體進(jìn)行蛋白質(zhì)ELISA。對(duì)各殘基列出了變體的IC50與天然VEGF(1-109)的IC50的比率，代表與天然VEGF相比變體結(jié)合的倍數(shù)下降。天然VEGF(1-109)的IC50在括號(hào)中表示。以黑體字表示的殘基用于產(chǎn)生Flt-1選擇性變體。為了產(chǎn)生KDR選擇性變體，將突變區(qū)分成所示的5組，使用前4組構(gòu)建文庫(kù)用于隨后的噬菌體展示選擇。對(duì)星號(hào)(*)標(biāo)記的殘基軟隨機(jī)化(soft randomized)為針對(duì)野生型的50％偏差(bias)，對(duì)兩個(gè)星號(hào)標(biāo)記的殘基進(jìn)行硬性隨機(jī)化(hard randomized)。
圖8A顯示了放射免疫受體結(jié)合試驗(yàn)(RIA)的結(jié)果，其中顯示了Flt-1選擇性變體(“Flt-1-sel”)的KDR結(jié)合親和力下降了至少470倍。還顯示了天然VEGF(“WT VEGF)的結(jié)合親和力。各點(diǎn)代表兩次測(cè)定的平均值，估計(jì)誤差小于該值的15％。
圖8B顯示了放射免疫受體結(jié)合試驗(yàn)(RIA)的結(jié)果，其中顯示了Flt-1選擇性變體(“Flt-1-sel”)對(duì)FLT-1的結(jié)合親和力與天然VEGF(“WTVEGF)表現(xiàn)出的結(jié)合親和力相似。各點(diǎn)代表兩次測(cè)定的平均值，估計(jì)誤差小于該值的15％。
圖9顯示了測(cè)量天然VEGF(“WT VEGF”)和Flt-1選擇性變體(“Flt-1-sel”)誘導(dǎo)KDR磷酸化的能力的KIRA分析結(jié)果。
圖10顯示了測(cè)量天然VEGF(“WT VEGF”)和Flt-1選擇性變體(“Flt-1-sel”)誘導(dǎo)HUVEC細(xì)胞增生的能力的HUVEC增生試驗(yàn)結(jié)果。各數(shù)據(jù)點(diǎn)是三次實(shí)驗(yàn)的平均值，估計(jì)的誤差為10-20％。
圖11顯示了測(cè)定天然VEGF，LK-VRB-2s*(KDR選擇性變體)，F(xiàn)lt-sel(Flt-1選擇性變體)，和P1GF刺激人ASMC細(xì)胞的MMP-9分泌的能力的明膠酶譜分析結(jié)果。所示的酶譜是兩個(gè)獨(dú)立實(shí)驗(yàn)之一。倍數(shù)改變代表相對(duì)帶密度。
圖12A和12B顯示了為測(cè)定天然VEGF(“WT VEGF”)，F(xiàn)lt-sel(Flt-1選擇性變體)，和KDR選擇性變體(“KDR-sel”)對(duì)MAP激酶的激活所進(jìn)行的Westem印跡分析。該測(cè)定在實(shí)施例10中詳細(xì)描述。
圖13A和13B顯示了為測(cè)定天然VEGF(“wt”或“VEGF”)，KDR選擇性變體(“KDR-sel”)，和Flt-1選擇性變體(“Flt-sel”)和KDR在PLC-γ和PI3’-激酶磷酸化中的作用所進(jìn)行的Westerm印跡分析。該測(cè)定在實(shí)施例11中詳細(xì)描述。
圖14A和14B所示的柱狀圖顯示了在改良的Boyden室中進(jìn)行的HUVEC遷移試驗(yàn)的結(jié)果。圖14A顯示了以所示濃度的天然VEGF(“wt”)，F(xiàn)lt-選擇性變體(“Flt-sel”)，和KDR選擇性變體(“KDR-sel”)獲得的HUVEC遷移。圖14B顯示了在應(yīng)答天然VEGF(“VEGF”)時(shí)加入PI3’-激酶抑制劑(“LY”)對(duì)HUVEC遷移的不利影響的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。實(shí)驗(yàn)進(jìn)行一式三份，且誤差線段代表標(biāo)準(zhǔn)誤差。
圖15A和15B顯示了體內(nèi)角膜囊血管形成試驗(yàn)的結(jié)果。圖15A中的玻片顯示了應(yīng)答對(duì)照處理，天然VEGF(“VEGF”)，KDR-選擇性變體和Flt-選擇性變體時(shí)角膜血管形成程度的代表性例子。圖15B顯示了由對(duì)照處理，天然VEGF(“VEGF”)，KDR-選擇性變體(“KDR-sel”)，F(xiàn)lt-1選擇性變體(“Flt-sel”)，和P1GF引起的角膜血管形成的表面積定量分析。
本發(fā)明的詳細(xì)描述A.定義本文使用的術(shù)語(yǔ)“VEGF”和“天然VEGF”是指Leung等，科學(xué)，2461306(1989)和Houck等，分子內(nèi)分泌學(xué)，51806(1991)所述，(且已在圖1A和1B中提供)的165個(gè)氨基酸的血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子和相關(guān)的121-，189-和206個(gè)氨基酸的血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子，及其天然存在的等位基因形式和加工形式。術(shù)語(yǔ)“VEGF”和“天然VEGF”也用于指含有165個(gè)氨基酸的血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子的氨基酸8至109或1至109的截短形式。VEGF的任意這類形式在本申請(qǐng)中可用例如，“VEGF(8-109)”，“VEGF(1-109)”或“VEGF165或VEGF(1-165)”來(lái)表示?！敖囟痰摹碧烊籚EGF的氨基酸位置按天然VEGF序列中所示編號(hào)。例如，截短的天然VEGF中氨基酸位置17(甲硫氨酸)在天然VEGF中也是位置17(甲硫氨酸)。截短的天然VEGF優(yōu)選具有相當(dāng)于天然VEGF的對(duì)KDR和FLT-1受體的結(jié)合親和力。
本文使用的術(shù)語(yǔ)“VEGF變體”是指在天然VEGF序列中包括一個(gè)或多個(gè)氨基酸突變且對(duì)KDR受體或FLT-1受體具有選擇性結(jié)合親和力的VEGF多肽。在一個(gè)實(shí)施方案中，對(duì)KDR受體具有選擇性結(jié)合親和力的VEGF變體在天然VEGF序列的第17至25和/或63至66位中任一處有一個(gè)或多個(gè)氨基酸突變。任選的是，一個(gè)或多個(gè)氨基酸突變包括氨基酸取代。優(yōu)選的KDR選擇性VEGF變體包括一個(gè)或多個(gè)氨基酸突變并且對(duì)KDR受體表現(xiàn)出的結(jié)合親和力等于或大于(≥)天然VEGF對(duì)KDR受體的結(jié)合親和力，且更優(yōu)選的是，VEGF變體表現(xiàn)出對(duì)FLT-1受體的結(jié)合親和力小于(＜)天然VEGF對(duì)FLT-1表現(xiàn)出的結(jié)合親和力。當(dāng)該VEGF變體對(duì)KDR受體的結(jié)合親和力與天然VEGF相比大約相等(不變)或更大(增加)，且該VEGF變體對(duì)FLT-1受體的結(jié)合親和力與天然VEGF相比更小或幾乎消失時(shí)，本文中認(rèn)為該VEGF變體對(duì)KDR受體的結(jié)合親和力是“選擇性”的。本發(fā)明優(yōu)選的KDR選擇性VEGF變體對(duì)FLT-1受體的結(jié)合親和力至少低10倍(與天然VEGF相比)，更優(yōu)選的是，對(duì)FLT-1受體的結(jié)合親和力至少低100倍(與天然VEGF相比)。用本領(lǐng)域已知的且在下面實(shí)施例中將進(jìn)一步描述的ELISA，RIA，和/或BIAcore測(cè)定法可測(cè)定VEGF變體各自的結(jié)合親和力。本發(fā)明優(yōu)選的KDR選擇性VEGF變體在反映誘導(dǎo)KDR受體磷酸化的能力的KIRA測(cè)定法(如實(shí)施例中所述)中也表現(xiàn)出活性。本發(fā)明優(yōu)選的KDR選擇性VEGF變體另外或任選可誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞增生(可用本領(lǐng)域已知方法，如實(shí)施例中的HUVEC增生測(cè)定法測(cè)定)。目前相信內(nèi)皮細(xì)胞增生的誘導(dǎo)是經(jīng)過(guò)KDR受體進(jìn)行信號(hào)傳遞的結(jié)果。
在一個(gè)實(shí)施方案中，對(duì)FLT-1受體具有選擇性結(jié)合親和力的VEGF變體包括在天然VEGF序列的第43，46，79或83位中任一處有一個(gè)或多個(gè)氨基酸突變。任選的是，一個(gè)或多個(gè)氨基酸突變包括氨基酸取代，且優(yōu)選的是，氨基酸取代成丙氨酸。優(yōu)選的FLT-1選擇性VEGF變體包括一個(gè)或多個(gè)氨基酸突變并對(duì)FLT-1受體表現(xiàn)出的結(jié)合親和力等于或大于(≥)天然VEGF對(duì)FLT-1受體的結(jié)合親和力，且更優(yōu)選的是，該VEGF變體表現(xiàn)出對(duì)KDR受體的結(jié)合親和力小于(＜)天然VEGF對(duì)KDR表現(xiàn)出的結(jié)合親和力。當(dāng)該VEGF變體對(duì)FLT-1受體的結(jié)合親和力與天然VEGF相比大約相等(不變)或更大(增加)，且該VEGF變體對(duì)KDR受體的結(jié)合親和力與天然VEGF相比更小或幾乎消失時(shí)，本文中認(rèn)為該VEGF變體對(duì)FLT-1受體的結(jié)合親和力是“選擇性”的。本發(fā)明優(yōu)選的FLT-1選擇性VEGF變體對(duì)KDR受體的結(jié)合親和力至少低10倍(與天然VEGF相比)，更優(yōu)選的是，對(duì)KDR受體的結(jié)合親和力至少低100倍(與天然VEGF相比)。用本領(lǐng)域已知的且在下面實(shí)施例中將進(jìn)一步描述的ELISA，RIA，和/或BIAcore測(cè)定法可測(cè)定該VEGF變體各自的結(jié)合親和力。
為了速記本文所述的VEGF變體的名稱，應(yīng)注意數(shù)字是指沿推斷的天然VEGF氨基酸序列的氨基酸殘基的位置(參見Leung等，出處同上和Houck等，出處同上)。氨基酸標(biāo)識(shí)符使用氨基酸的單字母代碼，即Asp D 天冬氨酸Ile I異亮氨酸Thr T 蘇氨酸 Leu L亮氨酸Ser S 絲氨酸 Tyr Y酪氨酸Glu E 谷氨酸 Phe F苯丙氨酸Pro P 脯氨酸 His H組氨酸Gly G 甘氨酸 His K賴氨酸Ala A 丙氨酸 Arg R精氨酸Cys C 半胱氨酸Trp W色氨酸Val V 纈氨酸 Gln Q谷氨酰胺Met M 甲硫氨酸Asn N天冬酰胺“可操作連接”指并列后能執(zhí)行成份的正常功能。因此，編碼序列“可操作連接”到調(diào)控序列上是指這樣一種構(gòu)象，即其中在這些序列的調(diào)控下可表達(dá)該編碼序列且其中被連接的DNA序列是連續(xù)的，且對(duì)于分泌型先導(dǎo)序列，是連續(xù)的并在閱讀相中。例如，如果DNA以參與多肽分泌的前蛋白的形式進(jìn)行表達(dá)，那么前序列或分泌型先導(dǎo)序列的DNA與多肽的DNA可操作連接；如果啟動(dòng)子或增強(qiáng)子影響編碼序列的轉(zhuǎn)錄，則它們是與編碼序列可操作連接的；或如果核糖體結(jié)合位點(diǎn)的位置有助于翻譯，則它與編碼序列可操作連接。連接可在常規(guī)限制性位點(diǎn)進(jìn)行。如果不存在該位點(diǎn)，可按常規(guī)實(shí)踐使用合成寡核苷酸銜接子或接頭。
“調(diào)控序列”是指為了在具體宿主生物中表達(dá)可操作連接的編碼序列所必須的DNA序列。適用于原核生物的調(diào)控序列包括，例如，啟動(dòng)子，任選的操縱子序列和核糖體結(jié)合位點(diǎn)。已知真核生物利用啟動(dòng)子，多聚腺苷化信號(hào)，和增強(qiáng)子。
“表達(dá)系統(tǒng)”指含有可操作連接的目的編碼序列和對(duì)照序列的DNA序列，使得用這些序列轉(zhuǎn)化的宿主能產(chǎn)生所編碼的蛋白質(zhì)。為了實(shí)現(xiàn)轉(zhuǎn)化，表達(dá)系統(tǒng)可包含在一個(gè)載體中；然而，也可將有關(guān)DNA整合進(jìn)宿主染色體中。
本文所用的“細(xì)胞”，“細(xì)胞系”，和“細(xì)胞培養(yǎng)物”可互換所用且所有這些定義包括后代。因此，“轉(zhuǎn)化子”或“轉(zhuǎn)化細(xì)胞”包括原代試驗(yàn)細(xì)胞和由其產(chǎn)生的培養(yǎng)物而不考慮轉(zhuǎn)移的次數(shù)。還應(yīng)明白所有后代在DNA成份上可以并不精確相同，因?yàn)榭赡艹霈F(xiàn)故意的或無(wú)心的突變。應(yīng)包括在原始轉(zhuǎn)化細(xì)胞中篩選的具有相同功能的突變后代。如果意指不同的定義，從內(nèi)容上將是清楚的。
“質(zhì)?！币郧懊娴男懽帜浮皃”和/或隨后的大寫字母和/或數(shù)字表示。本文的起始質(zhì)粒是可買到的，在不受限制的基礎(chǔ)上可公開獲得的，或可用公開的方法從這類可獲得的質(zhì)粒構(gòu)建的。另外，其它的等價(jià)質(zhì)粒在本領(lǐng)域中是已知的且對(duì)普通技術(shù)人員而言是顯而易見的。
本文所用的術(shù)語(yǔ)“VEGF受體”是指VEGF的細(xì)胞受體，一般是在血管內(nèi)皮細(xì)胞上發(fā)現(xiàn)的細(xì)胞表面受體，及其保留結(jié)合VEGF之能力的片斷和變體(例如，受體細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域的片斷或截短形式)。VEGF受體的一個(gè)例子是fmz樣酪氨酸激酶(FLT或FLT-1)，酪氨酸激酶家族的跨膜受體。本申請(qǐng)中所用的術(shù)語(yǔ)“FLT-1受體”指諸如DeVries等，科學(xué)，255989(1992)；和Shibuya等，癌基因，5519(1990)所述的VEGF受體。全長(zhǎng)FLT-1受體包含胞外結(jié)構(gòu)域，跨膜區(qū)，和具有酪氨酸激酶活性的胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域。胞外結(jié)構(gòu)域涉及VEGF的結(jié)合，而胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域涉及信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)。VEGF受體的另一例子是KDR受體(也稱為FLK-1)。本申請(qǐng)所用的術(shù)語(yǔ)“KDR受體”指諸如Matthews等，美國(guó)國(guó)家科學(xué)院院報(bào)，889026(1991)；和Terman等，癌基因，61677(1991)；Terman等，生物化學(xué)和生物物理學(xué)研究通訊，1871579(1992)所述的VEGF受體。
“治療”是指治療性處理和預(yù)防性或防止性措施，其中目的是防止或延緩(緩解)靶向的病理學(xué)情況或疾病。需要治療的個(gè)體包括已具有該疾病的個(gè)體以及傾向于具有該疾病的個(gè)體或需要防止該疾病的個(gè)體。
“慢性”用藥指相對(duì)于急性方式以連續(xù)的方式施用藥劑，以便在更長(zhǎng)的時(shí)間段內(nèi)維持起始治療效果(活性)。間歇性用藥是指不中斷的不連續(xù)進(jìn)行且具有周期性特點(diǎn)的治療。
作為治療目標(biāo)的“哺乳動(dòng)物”是指分類為哺乳動(dòng)物的任何動(dòng)物，包括人類，家養(yǎng)和農(nóng)場(chǎng)動(dòng)物，和動(dòng)物園，運(yùn)動(dòng)場(chǎng)或?qū)櫸飫?dòng)物，例如狗，貓，奶牛，馬，綿羊或豬。優(yōu)選的是，哺乳動(dòng)物是人類。
與一種或多種其它治療劑“組合”用藥包括同時(shí)(并存)和以任意順序連續(xù)用藥。
B.方法和組合物1.VEGF變體的制備經(jīng)過(guò)在VEGF DNA中進(jìn)行突變可制備VEGF的氨基酸序列變體。例如，所述變體包括在Leung等，出處同上和Houck等，出處同上所示的氨基酸序列內(nèi)的殘基缺失，插入或取代?？蓪?duì)缺失，插入和取代作出任意組合以獲得具有所需活性的最終構(gòu)建體。顯然，在編碼變體的DNA中進(jìn)行的突變不必將該序列放在閱讀框外且優(yōu)選不構(gòu)建能產(chǎn)生二級(jí)mRNA結(jié)構(gòu)的互補(bǔ)區(qū)域[見EP75444A]。
任選的是，經(jīng)過(guò)在編碼天然VEGF的DNA中進(jìn)行核苷酸定點(diǎn)誘變或噬菌體展示技術(shù)，從而產(chǎn)生編碼變體的DNA并隨后在重組細(xì)胞培養(yǎng)物中表達(dá)該DNA可制備VEGF變體。
盡管導(dǎo)入氨基酸序列變異的位點(diǎn)是預(yù)定的，但突變本身不必預(yù)定。例如，為了最優(yōu)化給定位點(diǎn)的誘變效果，可在靶密碼子或靶區(qū)域進(jìn)行隨機(jī)誘變并對(duì)表達(dá)的VEGF變體篩選所需活性的最佳組合。在具有已知序列的DNA的預(yù)定位點(diǎn)作出取代突變的技術(shù)是熟知的，例如，定點(diǎn)誘變。
優(yōu)選經(jīng)過(guò)諸如實(shí)施例1所述的噬菌體展示技術(shù)實(shí)現(xiàn)本文所述的VEGF變體的制備。
選出所述克隆后，可取出突變的蛋白質(zhì)區(qū)域并放入用于蛋白質(zhì)生產(chǎn)的合適載體中，一般是可用于轉(zhuǎn)化合適宿主的表達(dá)載體類型。
氨基酸序列缺失的范圍一般從1至30個(gè)殘基，更優(yōu)選的是1至10個(gè)殘基，且一般是連續(xù)的。
氨基酸序列插入包括一個(gè)殘基到基本上不限長(zhǎng)度的多肽融合到氨基和/或羧基末端以及單個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基的序列內(nèi)插入。序列內(nèi)插入(即，天然VEGF序列內(nèi)插入)的范圍一般是從1到10個(gè)殘基，優(yōu)選1到5個(gè)殘基。末端插入的例子包括對(duì)宿主細(xì)胞而言為異源性的或者同源性的信號(hào)序列融合到N-末端以利于從重組宿主中分泌。
其它的VEGF變體是天然VEGF中至少一個(gè)氨基酸殘基被去掉且在其位置插入一個(gè)不同的殘基的變體。該取代可按照表1所示制備。
表 1原殘基 取代舉例Ala(A) gly；serArg(R) lysAsn(N) gln；hisAsp(D) gluCys(C) serGln(Q) asnGlu(E) aspGly(G) ala；proHis(H) asn；glnIle(I) leu；valLeu(L) ile；valLys(K) arg；gln；gluMet(M) leu；tyr；ilePhe(F) met；leu；tyrSer(S) thrThr(T) serTrp(W) tyrTyr(Y) trp；pheVal(V) ile；leu經(jīng)過(guò)選擇比表1中所示更不保守的取代可產(chǎn)生功能或免疫學(xué)同一性的改變，即，選擇在其對(duì)維持(a)取代區(qū)域多肽骨架的結(jié)構(gòu)，例如，折疊或螺旋構(gòu)象，(b)靶位點(diǎn)的分子電荷或疏水性，或(c)側(cè)鏈的大小的影響上區(qū)別更明顯的殘基。一般預(yù)期在VEGF變體特性中產(chǎn)生最大改變的取代是(a)甘氨酸和/或脯氨酸(P)被另一氨基酸取代或被缺失或插入；(b)親水殘基，例如，絲氨?；蛱K氨?；〈杷畾埢?，例如，亮氨酰基，異亮氨酰基，苯丙氨?；?，纈氨?；虮滨；虮黄淙〈?；(c)半胱氨酸殘基取代任意其它殘基或被其取代；(d)帶正電荷側(cè)鏈的殘基，例如，賴氨?；?，精氨?；蚪M氨?；〈鷰ж?fù)電荷的殘基，例如，谷氨酰基或天冬氨?；蛘弑黄淙〈?e)帶負(fù)電荷側(cè)鏈的殘基取代帶正電荷的殘基或者被其取代；或(f)具有大型側(cè)鏈的殘基，例如，苯丙氨酸被不具有這類側(cè)鏈的殘基，例如，甘氨酸取代或者被其取代。
本領(lǐng)域的技術(shù)人員使用常規(guī)篩選試驗(yàn)可容易地評(píng)估取代，缺失或插入的效果。例如，可在重組細(xì)胞培養(yǎng)物中表達(dá)，且任選從細(xì)胞培養(yǎng)物中純化噬菌體展示選擇的VEGF變體。然后可評(píng)估VEGF變體的KDR或FLT-1受體結(jié)合親和力和其它生物學(xué)活性，例如本申請(qǐng)中所公開的那些生物學(xué)活性。可在用于所需特征的合適篩選試驗(yàn)中篩選細(xì)胞裂解產(chǎn)物或純化的VEGF變體的結(jié)合特性或活性。例如，與天然VEGF相比，VEGF變體的免疫學(xué)特征，例如，對(duì)給定抗體的親和力的改變可能是所需要的。可用按照本領(lǐng)域的已知技術(shù)進(jìn)行的競(jìng)爭(zhēng)性免疫測(cè)定來(lái)測(cè)量該改變?？捎帽绢I(lǐng)域已知的且在下面實(shí)施例中進(jìn)一步描述的ELISA，RIA和/或BIAcore試驗(yàn)來(lái)測(cè)定VEGF變體各自的受體結(jié)合親和力。本發(fā)明優(yōu)選的VEGF變體在反映誘導(dǎo)KDR受體磷酸化能力的KIRA測(cè)定(例如實(shí)施例中所述)中也顯示出活性。本發(fā)明優(yōu)選的VEGF變體另外或者任選誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞增生(可用本領(lǐng)域已知方法，例如實(shí)施例中的HUVEC增生試驗(yàn)測(cè)定)。
用本領(lǐng)域已知的技術(shù)，例如重組方法可制備VEGF變體。這些方法中使用的分離的DNA在本文中理解為具有或不含3’和/或5’-側(cè)翼區(qū)的化學(xué)合成的DNA，cDNA，染色體或者染色體外DNA。優(yōu)選的是，經(jīng)過(guò)在重組細(xì)胞培養(yǎng)物中合成可制備本文的VEGF變體。
對(duì)于這類合成，首先必須獲得編碼VEGF或者VEGF變體的核酸。編碼VEGF分子的DNA可從牛垂體濾泡細(xì)胞獲得，方法是(a)從這些細(xì)胞制備cDNA文庫(kù)，(b)用編碼VEGF或其片斷的標(biāo)記DNA(長(zhǎng)度達(dá)到或者超過(guò)100個(gè)堿基對(duì))進(jìn)行雜交分析以檢測(cè)文庫(kù)中含有同源序列的克隆，和(c)以限制性酶分析和核酸測(cè)序來(lái)分析克隆以鑒定全長(zhǎng)克隆。如果在cDNA文庫(kù)中不存在全長(zhǎng)克隆，那么可使用本文首次公開的核酸序列信息從各種克隆回收合適的片斷并在這些克隆共有的限制性位點(diǎn)連接以裝配編碼VEGF的全長(zhǎng)克隆。另外，基因組文庫(kù)可提供所需的DNA。
一旦從文庫(kù)中鑒定并分離出該DNA，將它連接進(jìn)可復(fù)制載體中用于進(jìn)一步克隆或者用于表達(dá)。
在一個(gè)重組表達(dá)系統(tǒng)的例子中，在經(jīng)過(guò)用含有編碼VEGF的DNA的表達(dá)載體轉(zhuǎn)化的細(xì)胞系統(tǒng)中表達(dá)編碼VEGF的基因。優(yōu)選轉(zhuǎn)化能實(shí)現(xiàn)該方法的宿主細(xì)胞以便在培養(yǎng)基或宿主細(xì)胞周質(zhì)中獲得該VEGF，即獲得分泌分子。
“轉(zhuǎn)染”是指表達(dá)載體被宿主細(xì)胞吸收，而不論事實(shí)上是否表達(dá)任何編碼序列。許多轉(zhuǎn)染方法對(duì)于普通技術(shù)人員而言是已知的。例如，CaPO4和電穿孔。當(dāng)在宿主細(xì)胞內(nèi)出現(xiàn)該載體的任何作用跡象時(shí)一般認(rèn)為轉(zhuǎn)染成功。
“轉(zhuǎn)化”是指作為染色體外成份或者經(jīng)過(guò)染色體整合將DNA導(dǎo)入生物以便該DNA能夠復(fù)制。根據(jù)所用的宿主細(xì)胞，使用適合于該細(xì)胞的標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)進(jìn)行轉(zhuǎn)化。Cohen，美國(guó)國(guó)家科學(xué)院院報(bào)，692110(1972)和Mandel等，分子生物學(xué)雜志，53154(1970)所述的采用氯化鈣的鈣處理一般用于原核或其它含有大量細(xì)胞壁障礙的細(xì)胞。對(duì)于沒有該細(xì)胞壁的哺乳動(dòng)物細(xì)胞，優(yōu)選Graham和van der Eb，病毒學(xué)，52456-457(1978)的磷酸鈣沉淀法。Axel在1983年8月16日出版的美國(guó)專利號(hào)4399216中已經(jīng)描述了哺乳動(dòng)物細(xì)胞宿主系統(tǒng)轉(zhuǎn)化的一般情況。轉(zhuǎn)化進(jìn)酵母一般按照Van Solingen等，細(xì)菌雜志，130946(1977)和Hsiao等，美國(guó)國(guó)家科學(xué)院院報(bào)，763829(1979)的方法進(jìn)行。然而，也可使用諸如經(jīng)過(guò)核注射或經(jīng)過(guò)原生質(zhì)融合將DNA導(dǎo)入細(xì)胞的其它方法。
本文公開的載體和方法適合于在原核和真核生物大范圍內(nèi)的宿主細(xì)胞中使用。
當(dāng)然，一般來(lái)說(shuō)，優(yōu)選原核生物用于DNA序列的起始克隆和用于本發(fā)明的載體構(gòu)建。例如，大腸桿菌K12菌株MM294(ATCC 31,446)是特別有用的。可使用的其它微生物菌株包括大腸桿菌菌株，例如大腸桿菌B和大腸桿菌X1776(ATCC31537)。當(dāng)然，這些例子是用于說(shuō)明而不是限制。
原核生物也可用于表達(dá)?？墒褂蒙鲜鼍辏约按竽c桿菌菌株W3110(F-，λ-，原養(yǎng)型，ATCC 27,325)，K5772(ATCC 53635)，和SR101，諸如枯草芽孢桿菌等芽孢桿菌和諸如鼠傷寒沙門氏菌或粘質(zhì)沙雷氏菌等腸桿菌科其它細(xì)菌，和各種假單胞菌屬的種。
一般來(lái)說(shuō)，含有來(lái)自與宿主細(xì)胞相適合的種類的復(fù)制子和調(diào)控序列的質(zhì)粒載體與這些宿主結(jié)合使用。載體一般攜帶復(fù)制位點(diǎn)以及可在轉(zhuǎn)化細(xì)胞中提供表型選擇的標(biāo)記序列。例如，大腸桿菌一般使用pBR322，一種來(lái)自大腸桿菌種類的質(zhì)粒進(jìn)行轉(zhuǎn)化[參見，例如，Bolivar等，基因，295(1977)]。pBR322含有氨芐青霉素和四環(huán)素抗性基因且因此提供了鑒定轉(zhuǎn)化細(xì)胞的簡(jiǎn)便方法。pBR322質(zhì)粒，或其它微生物質(zhì)粒或噬菌體也必須含有，或被修飾成含有微生物用于其自身蛋白質(zhì)表達(dá)的啟動(dòng)子。
最常用于重組DNA構(gòu)建的啟動(dòng)子包括β-內(nèi)酰胺酶(青霉素酶)和乳糖啟動(dòng)子系統(tǒng)[Chang等，自然，375615(1978)；Itakura等，科學(xué)，1981056(1977)；Goeddel等，自然，281544(1979)]及色氨酸(trp)啟動(dòng)子系統(tǒng)[Goeddel等，核酸研究，84057(1980)；EPO申請(qǐng)公開號(hào)0036776]。盡管這些是最常用的，已發(fā)現(xiàn)并使用了其它的微生物啟動(dòng)子，并且已公開了其核苷酸序列的詳情，技術(shù)人員能夠?qū)⑺鼈兣c質(zhì)粒載體可操作連接[參見，例如，Siebenlist等，細(xì)胞，20269(1980)]。
除了原核生物外，也可使用真核微生物，例如酵母培養(yǎng)物。盡管許多其它菌株通常是可得到的，但釀酒酵母，或常見的面包酵母在真核微生物中是最常用的。為了在糖酵母屬中表達(dá)，常用質(zhì)粒YRp7[Stinchcomb等，自然，28239(1979)；Kingsman等，基因，7141(1979)；tschemper等，基因，10157(1980)]。該質(zhì)粒已含有trp1基因，該基因可以為在色氨酸中缺乏生長(zhǎng)能力的酵母突變菌株，例如，ATCC 44076或PEP4-1[Jones，遺傳學(xué)，8512(1977)]提供選擇標(biāo)記。trp1損傷的出現(xiàn)作為酵母宿主細(xì)胞基因組的一個(gè)特征提供了經(jīng)過(guò)在不含色氨酸下生長(zhǎng)來(lái)檢測(cè)轉(zhuǎn)化的有效環(huán)境。
酵母載體中合適的啟動(dòng)序列包括3-磷酸甘油酸激酶[Hitzeman等，生物學(xué)化學(xué)雜志，2552073(1980)]或其它糖酵解酶[Hess等，酶研究進(jìn)展雜志，7149(1968)；Holland等，生物化學(xué)，174900(1978)]，例如烯醇化酶，甘油醛-3-磷酸脫氫酶，己糖激酶，丙酮酸脫羧酶，磷酸果糖激酶，葡萄糖-6-磷酸異構(gòu)酶，3-磷酸甘油酸變位酶，丙酮酸激酶，丙糖磷酸異構(gòu)酶，磷酸葡萄糖異構(gòu)酶和葡萄糖激酶的啟動(dòng)子。在構(gòu)建合適的表達(dá)質(zhì)粒時(shí)，與這些基因相關(guān)的終止序列也連接進(jìn)表達(dá)載體中需要表達(dá)的序列的3’端以提供mRNA的多聚腺苷化和終止。具有受生長(zhǎng)條件控制的附加轉(zhuǎn)錄優(yōu)勢(shì)的其它啟動(dòng)子是乙醇脫氫酶2，同種細(xì)胞色素(isocytochrome)C，酸性磷酸酶，與氮代謝相關(guān)的降解酶和前述甘油醛-3-磷酸脫氫酶，及負(fù)責(zé)麥芽糖和半乳糖利用的酶的啟動(dòng)子區(qū)域。含有酵母適用性啟動(dòng)子，復(fù)制原點(diǎn)和終止序列的任意質(zhì)粒載體都是合適的。
除了微生物外，來(lái)自多細(xì)胞生物的細(xì)胞培養(yǎng)物也可用作宿主。原則上，任何這類細(xì)胞培養(yǎng)物都是可行的，無(wú)論來(lái)自脊椎動(dòng)物或是無(wú)脊椎動(dòng)物的培養(yǎng)物。然而，最感興趣的是脊椎動(dòng)物細(xì)胞且最近幾年在培養(yǎng)物(組織培養(yǎng)物)中脊椎動(dòng)物細(xì)胞的繁殖已成了常規(guī)方法[組織培養(yǎng)，學(xué)術(shù)出版社，Kruse和Patterson，編輯(1973)]。這類有用的宿主細(xì)胞系的例子是VERO和Hela細(xì)胞，中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢(CHO)細(xì)胞系，和W138，BHK，COS-7，293，和MDCK細(xì)胞系。這類細(xì)胞的表達(dá)載體通常包括(如果需要)復(fù)制原點(diǎn)，位于待表達(dá)的基因之前的啟動(dòng)子，以及任意必須的核糖體結(jié)合位點(diǎn)，RNA剪接位點(diǎn)，多聚腺苷化位點(diǎn)和轉(zhuǎn)錄終止子序列。
為用于哺乳動(dòng)物細(xì)胞，通常由病毒材料提供對(duì)表達(dá)載體的調(diào)控功能。例如，常用的啟動(dòng)子來(lái)自多瘤病毒，腺病毒2，最常見的來(lái)自猴病毒40(SV40)。特別有用的是SV40病毒的早期和晚期啟動(dòng)子，因?yàn)閮烧叨既菀讖牟《局凶鳛橐埠蠸V40病毒復(fù)制原點(diǎn)的片斷獲得[Fiers等，自然，273113(1978)]。也可使用更小或更大的SV40片斷，只要它包括從位于病毒復(fù)制原點(diǎn)上的HindIII位點(diǎn)到BglI位點(diǎn)的大約250-bp的序列。而且，還可以且通常需要使用正常情況下與目的基因序列相關(guān)的啟動(dòng)子或調(diào)控序列，前提是該調(diào)控序列與宿主細(xì)胞系統(tǒng)相容。
經(jīng)過(guò)構(gòu)建包括異源性原點(diǎn)，例如可來(lái)自SV40或其它病毒(例如，多瘤病毒，腺病毒，VSV，BPV)來(lái)源的原點(diǎn)的載體可提供復(fù)制原點(diǎn)，或者由宿主細(xì)胞染色體復(fù)制機(jī)制提供復(fù)制原點(diǎn)。如果載體整合進(jìn)宿主細(xì)胞染色體，后者通常就足夠。
細(xì)胞培養(yǎng)物可產(chǎn)生滿意量的蛋白質(zhì)，然而，使用第二編碼序列的設(shè)計(jì)可用于進(jìn)一步增強(qiáng)生產(chǎn)水平。第二編碼序列包括二氫葉酸還原酶(DHFR)，它受諸如氨甲蝶呤(MTX)的外部控制參數(shù)的影響，因此允許經(jīng)過(guò)控制氨甲蝶呤的濃度來(lái)控制表達(dá)。
為了用本發(fā)明的含有編碼VEGF和DHFR蛋白質(zhì)兩者的DNA序列的載體進(jìn)行轉(zhuǎn)染，在選擇優(yōu)選的宿主細(xì)胞時(shí)，合適的情況是根據(jù)所用的DHFR蛋白質(zhì)的類型來(lái)選擇宿主。如果使用野生型DHFR蛋白質(zhì)，優(yōu)選選擇DHFR缺陷型宿主細(xì)胞，從而允許使用DHFR編碼序列作為在缺乏次黃嘌呤，甘氨酸和胸苷的選擇培養(yǎng)基中成功轉(zhuǎn)染的標(biāo)記。在這種情況中合適的宿主細(xì)胞是按Urlaub和Chasin，美國(guó)國(guó)家科學(xué)院院報(bào)，774216(1980)所述制備和繁殖的DHFR活性缺陷型中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢(CHO)細(xì)胞系。
另一方面，如果對(duì)MTX具有低結(jié)合親和力的DHFR蛋白質(zhì)用作調(diào)控序列，則不必使用DHFR缺陷型細(xì)胞。由于突變型DHFR對(duì)氨甲蝶呤有抗性，可使用含有MTX的培養(yǎng)基作為選擇工具，前提是宿主細(xì)胞本身是氨甲蝶呤敏感性。能吸收MTX的大多數(shù)真核細(xì)胞表現(xiàn)出氨甲蝶呤敏感性。一個(gè)這類有用的細(xì)胞系是一種CHO細(xì)胞系，CHO-K1(ATCC CCL61)。
采用標(biāo)準(zhǔn)連接技術(shù)構(gòu)建含有所需編碼序列和調(diào)控序列的合適載體。裂解分離的質(zhì)?；駾NA片斷，剪切并以所需形式再連接以制備所需的質(zhì)粒。
如果需要平端，用10單位的聚合酶I(Klenow)在15℃下處理制劑15分鐘，酚-氯仿提取，并乙醇沉淀。
裂解片斷的大小分離可使用，例如，Goeddel等，核酸研究，84057(1980)所述的6％聚丙烯酰胺凝膠進(jìn)行。
為了證實(shí)在質(zhì)粒中構(gòu)建了正確的序列，一般使用連接混合物轉(zhuǎn)化大腸桿菌K12菌株294(ATCC 31446)或其它合適的大腸桿菌菌株，且如果合適，以氨芐青霉素或四環(huán)素抗性選擇成功的轉(zhuǎn)化子。按Messing等，核酸研究，9309(1981)的方法或Maxam等，酶學(xué)方法，65499(1980)的方法從轉(zhuǎn)化子制備質(zhì)粒并經(jīng)過(guò)限制性酶切圖譜和/或DNA測(cè)序進(jìn)行分析。
DNA導(dǎo)入哺乳動(dòng)物細(xì)胞宿主并在培養(yǎng)基中選擇穩(wěn)定轉(zhuǎn)染子后，經(jīng)過(guò)在大約20000-500000nM濃度的氨甲蝶呤(MTX，DHFR活性的競(jìng)爭(zhēng)性抑制劑)存在下培養(yǎng)宿主細(xì)胞培養(yǎng)物來(lái)實(shí)現(xiàn)DHFR-蛋白質(zhì)-編碼序列的擴(kuò)增。當(dāng)然，濃度的有效范圍高度依賴于DHFR基因的性質(zhì)和宿主的特征。顯而易見，不能確定一般定義的上限和下限。也可使用抑制DHFR的其它葉酸類似物或其它化合物的合適濃度。然而，MTX本身是方便，容易獲得和有效的。
2.VEGF變體的共價(jià)修飾本發(fā)明的VEGF也可包含進(jìn)一步的修飾。例子包括對(duì)一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基的共價(jià)修飾。例如，半胱氨酰殘基可與鹵代乙酸(和相應(yīng)的胺)，例如氯乙酸或氯乙酰胺反應(yīng)以產(chǎn)生羧甲基或羧基酰胺甲基衍生物。半胱氨酰殘基經(jīng)過(guò)與溴三氟丙酮；β-溴-(5-imidozoyl)丙酸；氯乙酰磷酸；N-烷基馬來(lái)酰亞胺；3-硝基-吡啶基二硫化物；甲基2-吡啶基二硫化物；對(duì)氯汞苯甲酸；2-氯汞-4-硝基苯酚；或氯-7-硝基苯并-2-噁-1，3-二唑反應(yīng)也可衍化。
另一例子包括使組氨酰殘基與焦碳酸二乙酯在pH5.5-7.0下反應(yīng)而衍生化。對(duì)-溴苯甲酰甲基溴化物，一種優(yōu)選在0.1M二甲胂酸鈉pH6.0下進(jìn)行的反應(yīng)也是有用的。
賴氨酰殘基和氨基末端殘基可與琥珀酸酐或其它羧酸酐反應(yīng)。用這些試劑衍化具有逆轉(zhuǎn)賴氨酰殘基的電荷的效果。適于衍化含β-氨基的殘基的其它試劑包括諸如甲基吡啶甲酰亞氨酸酯(picolinimidate)等亞氨酸酯；磷酸吡哆醛；吡哆醛；氯氫硼化物；三硝基苯磺酸；O-甲基異脲；2，4-戊二酮；和與乙醛酸的由轉(zhuǎn)氨酶催化的反應(yīng)。
精氨酰殘基經(jīng)過(guò)與選自苯甲酰甲醛，2，3-丁二酮，1，2-環(huán)己二酮，和茚三酮的一種或幾種常規(guī)試劑反應(yīng)可修飾。這些試劑也可用于修飾賴氨酸的ε-氨基。精氨酸殘基的衍生化應(yīng)在堿性條件下進(jìn)行，因?yàn)殡夜倌軋F(tuán)具有高pka。
酪氨酰殘基本身的特異性修飾已被廣泛研究，尤其對(duì)于經(jīng)過(guò)與芳香族重氮化合物或四硝基甲烷反應(yīng)將光譜標(biāo)記引入酪氨酰殘基特別感興趣。最常見的是，使用N-acetylimidizol和四硝基甲烷分別形成O-乙酰酪氨酰類和3-硝基衍生物。經(jīng)過(guò)，例如，使用下文所述的氯胺T方法，使用125I或131I可對(duì)酪氨酰殘基進(jìn)行碘標(biāo)記，從而制備標(biāo)記的蛋白質(zhì)用于放射免疫測(cè)定。
經(jīng)過(guò)與諸如1-環(huán)己基-3-(2-嗎啉基-(4-乙基))碳二亞胺或1-乙基-3-(4-氮鎓-4，4-二甲基戊基)碳二亞胺等碳二亞胺(R’-N-C-N-R’)反應(yīng)可選擇性地修飾羧基側(cè)基團(tuán)(天冬氨?；蚬劝滨；?。而且，經(jīng)過(guò)與銨離子反應(yīng)可將天冬氨?；凸劝滨埢D(zhuǎn)變成天冬酰胺?；凸弱０孵埢?br> 用雙功能試劑進(jìn)行的衍生化可將VEGF變體有效交聯(lián)到不溶于水的支持基質(zhì)或表面上。常用的交聯(lián)劑包括，例如，1，1-雙(重氮乙?；?-2-苯乙烷，戊二醛，N-羥基琥珀酰亞胺酯，例如，與4-疊氮水楊酸形成的酯，同型雙功能亞氨酸酯，包括雙琥珀酰亞胺基酯如3，3’-二硫代雙(琥珀酰亞胺基丙酸)，和雙功能馬來(lái)酰亞胺如雙-N-馬來(lái)酰亞胺基-1，8-辛烷。諸如甲基-3-[(p-疊氮苯基)二硫代]丙酰亞胺等衍生化試劑產(chǎn)生可光活化的中間體，其在有光的條件下能形成交聯(lián)。另外，諸如溴化氰激活型碳水化合物等反應(yīng)性不溶于水的基質(zhì)和在美國(guó)專利號(hào)3969287；3691016；4195128；4247642；4229537和4330440中所述的反應(yīng)性底物可用于蛋白質(zhì)固定化。
谷氨酰胺酰基和天冬酰胺?；ǔ１蝗ヵ０坊孕纬上鄳?yīng)的谷氨酰殘基和天冬氨酰殘基。另外，這些殘基可在中度酸性條件下去酰胺化。這些殘基的任一形式都落在本發(fā)明的范圍內(nèi)。
其它修飾包括脯氨酸和賴氨酸的羥基化，絲氨酰或蘇氨酰殘基的羥基的磷酸化，賴氨酸，精氨酸和組氨酸側(cè)鏈α-氨基的甲基化[Creighton，蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)和分子特征，79-86(WH.Freeman&Co.，San Francisco(1983))]，N-末端胺的乙酰化，和有時(shí)C-末端羧基的酰胺化。
其它修飾包括將VEGF或VEGF變體(或VEGF拮抗劑)連接或融合到諸如聚乙二醇等非蛋白類聚合物上。這種使PEG連接蛋白質(zhì)的方法在本領(lǐng)域是已知的。
VEGF變體氨基酸序列可含有至少一個(gè)具有通過(guò)N-連接被糖基化的潛力且在天然VEGF中通常不被糖基化的氨基酸序列。
在變體中導(dǎo)入N-連接的糖基化位點(diǎn)需要具有通式天冬酰胺-X-絲氨酸或天冬酰胺-X-蘇氨酸的三肽序列，其中天冬酰胺是受體且X是除了可阻止糖基化的脯氨酸外的20個(gè)遺傳編碼的氨基酸中的任何一個(gè)。[參見Struck和Lennarz，糖蛋白和蛋白聚糖的生物化學(xué)35(Lennarz編輯，Plenum出版社(1980))，Marshall，生物化學(xué)協(xié)會(huì)專題論文集，4017(1974)；和Winzler，激素蛋白和肽，1-15(Li編輯，紐約學(xué)術(shù)出版社(1973))]。本文的氨基酸序列變體可經(jīng)過(guò)用合適的氨基酸取代合適位點(diǎn)的氨基酸進(jìn)行修飾以實(shí)現(xiàn)糖基化。
如果采用O-連接的糖基化，O-糖苷鍵在動(dòng)物細(xì)胞中出現(xiàn)在N-乙酰半乳糖胺，半乳糖，或木糖與數(shù)種羥基氨基酸之一，最常見絲氨酸或蘇氨酸，但有時(shí)是位于該分子中合適區(qū)域的5-羥基脯氨酸或5-羥基賴氨酸殘基之間。
哺乳動(dòng)物產(chǎn)生的蛋白質(zhì)的糖基化形式在《血漿蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)，功能和遺傳控制》271-315(Putnam編輯，第二版，紐約學(xué)術(shù)出版社(1984))中詳細(xì)描述。在該章中，討論了天冬酰胺連接的寡糖，包括將它們?cè)俜殖芍辽偃M復(fù)合物高甘露糖，雜合結(jié)構(gòu)，以及O-糖苷連接的寡糖。
使用例如，Aplin和Wriston在CRC Crit.Rev.Biochem.259-306(1981)中所述的各種活化基團(tuán)可實(shí)現(xiàn)將糖苷經(jīng)化學(xué)和/或酶促偶聯(lián)到蛋白質(zhì)上?；瘜W(xué)偶聯(lián)技術(shù)的優(yōu)勢(shì)在于它們相對(duì)簡(jiǎn)單且不需天然O-和N-連接的糖基化所需的復(fù)雜的酶促機(jī)制。根據(jù)所用的偶聯(lián)方式，可將糖附著到(a)精氨酸或組氨酸，(b)游離羧基，例如谷氨酸或天冬氨酸的游離羧基，(c)游離巰基，例如半胱氨酸的游離巰基，(d)游離羥基，例如絲氨酸，蘇氨酸或羥脯氨酸的游離羥基，(e)芳香殘基，例如苯丙氨酸，酪氨酸或色氨酸的芳香殘基，或(f)谷氨酰胺的酰胺基上。這些方法在1987年9月11日公開的PCTWO87/05330中有更充分的描述。
酵母產(chǎn)生的蛋白質(zhì)的糖基化形式在Tanner和Lehle，生物化學(xué)和生物物理學(xué)學(xué)報(bào)，906(1)81-99(1987)和Kukuruzinska等，生物化學(xué)年鑒，56915-944(1987)中詳細(xì)描述。
盡管天然VEGF的糖基化對(duì)生物活性不是必須的[Walter等，實(shí)驗(yàn)室考察，74546(1996)]，但如果需要，可使用上述方法改變VEGF變體的糖基化。
3.治療和診斷方法本發(fā)明還提供了使用所公開的VEGF變體的方法。所述方法包括治療方法，例如誘導(dǎo)血管形成或血管發(fā)生的方法。所述方法還涉及對(duì)血管網(wǎng)的創(chuàng)傷的治療，因?yàn)閲@傷口的血管內(nèi)皮細(xì)胞會(huì)增生?？蛇@樣治療的這類創(chuàng)傷的例子包括，但不限于，手術(shù)切口，特別是涉及心臟的手術(shù)切口，傷口，包括撕裂傷，切口，和血管穿刺，涉及血管內(nèi)皮的表面潰瘍，例如糖尿病性，血友病性和腫脹性潰瘍。預(yù)期可采用對(duì)KDR受體具有選擇性結(jié)合親和力的優(yōu)選VEGF變體，其中需要實(shí)現(xiàn)KDR受體激活但避免伴隨FLT-1受體激活的潛在副作用。同樣，可采用對(duì)FLT-1受體具有選擇性結(jié)合親和力的優(yōu)選VEGF變體，其中需要實(shí)現(xiàn)FLT-1受體激活但避免伴隨KDR受體激活的潛在副作用。
可配制VEGF變體并按照良好的醫(yī)學(xué)實(shí)踐方式考慮所要治療的具體病癥，個(gè)體病人的狀況，VEGF變體的傳遞位點(diǎn)，用藥方法和開業(yè)醫(yī)生已知的其它因素后進(jìn)行用藥?！坝行Я俊钡腣EGF變體包括防止，減小其惡化，緩解或治愈所要治療的病癥或其癥狀的量。
經(jīng)過(guò)將具有所需純度的VEGF變體與生理學(xué)上可接受的載體，賦形劑或穩(wěn)定劑混合可配制VEGF變體用于貯存或用藥。例如，在Remington’s制藥科學(xué)，第16版，1980，Mack出版公司，Oslo等編輯，中描述了合適的載體及其包含其它人類蛋白質(zhì)，例如人血清白蛋白的配制品。一般來(lái)說(shuō)，在配制品中使用適量的制藥上可接受的鹽使配制品等滲。載體的例子包括諸如鹽水，Ringer’s溶液和葡萄糖溶液等緩沖液。溶液的pH優(yōu)選從大約5.0到大約8.0。例如，如果VEGF變體是水溶性的，可在諸如磷酸鹽或其它有機(jī)酸鹽等緩沖液中在大約7.0至8.0的pH下配制。如果VEGF變體僅部分可溶于水，經(jīng)過(guò)將它與諸如吐溫，Pluronics，或PEG等非離子表面活性劑，例如吐溫80以0.04-0.05％(w/v)的量進(jìn)行配制以增加其可溶性可將其制備成微乳狀液。
其它載體包括控釋制劑，它包括形成微囊顆粒和可植入物?？蒯屩苿┑睦影ǎ?，固體疏水性聚合物的半滲透性基質(zhì)，該基質(zhì)以成形物的形式存在，例如，膜，脂質(zhì)體或微粒。為了制備控釋VEGF變體組合物，優(yōu)選將VEGF變體摻入生物可降解的基質(zhì)或微囊中。用于該目的的合適材料是聚交酯，盡管也可使用聚-(β-羥基羧酸)，例如聚-D-(-)-3-羥基丁酸[EP133988A]的聚合物。其它的生物可降解的聚合物，例如，聚內(nèi)酯，聚縮醛，聚原酸酯，或聚原碳酸酯也是適用的。
對(duì)于控釋組合物的例子，可參見美國(guó)專利號(hào)3773919，EP58481A，美國(guó)專利號(hào)3887699，EP158277A，加拿大專利號(hào)1176565，Sidman等，生物多聚體，22547(1983)，和Langer等，化學(xué)技術(shù)，1298(1982)。
對(duì)于本領(lǐng)域的技術(shù)人員而言顯而易見的是，根據(jù)例如，用藥途徑和所施用的VEGF變體的濃度，某些載體可能是更優(yōu)選的。
可任選加入其它成份，例如抗氧化劑，如抗壞血酸；低分子量(不超過(guò)10個(gè)殘基)多肽，如聚精氨酸或三肽；蛋白質(zhì)，如血清白蛋白，明膠或免疫球蛋白；親水聚合物，如聚乙烯吡咯烷酮；氨基酸，如甘氨酸，谷氨酸，天冬氨酸，或精氨酸；單糖，二糖和其它碳水化合物，包括纖維素或其衍生物，葡萄糖，甘露糖或糊精；螯合劑，如EDTA；和糖醇，如甘露糖醇或山梨糖醇。賦形劑，載體，穩(wěn)定劑或其它添加劑的使用可導(dǎo)致形成VEGF變體的鹽。
當(dāng)選擇載體，賦形劑，穩(wěn)定劑或其它添加劑時(shí)，選擇的化合物和相應(yīng)的降解產(chǎn)物應(yīng)是無(wú)毒的且避免加重所治療的病癥和/或且癥狀。經(jīng)過(guò)在靶疾病的動(dòng)物模型中，或者如果不能得到該模型，可在正常動(dòng)物中進(jìn)行常規(guī)篩選可確定這點(diǎn)。
用于治療性用藥的VEGF變體應(yīng)是無(wú)菌的。通過(guò)除菌濾膜(例如，0.2微米膜)進(jìn)行過(guò)濾可實(shí)現(xiàn)無(wú)菌。VEGF變體一般以凍干形式或作為水溶液存貯。VEGF變體組合物的pH一般是大約5.0至8.0，盡管更高或更低的pH值在某些情況下也是合適的。
對(duì)哺乳動(dòng)物的用藥可經(jīng)過(guò)注射(例如，靜脈內(nèi)，腹膜內(nèi)，皮下，肌肉內(nèi))或經(jīng)過(guò)諸如確保以有效形式傳遞進(jìn)血流的吸入或輸注等其它方法完成。如果VEGF變體經(jīng)腸胃外途徑使用，含VEGF變體的治療性組合物一般放入具有無(wú)菌輸入口的容器中，例如，靜脈溶液袋或者具有可被皮下注射針頭穿刺的瓶塞的小瓶。
一般來(lái)說(shuō)，如果條件許可，可配制并施用定點(diǎn)傳遞的VEGF變體。這在有傷口和潰瘍的情況下較方便。
當(dāng)進(jìn)行局部用藥時(shí)，VEGF變體適合于與諸如載體，佐劑，穩(wěn)定劑或賦形劑的添加劑組合。如上所述，當(dāng)選擇添加劑用于與VEGF變體混合時(shí)，添加劑應(yīng)是藥用上可接受的且對(duì)于其目的用藥是有效的。而且，添加劑不應(yīng)影響VEGF變體的活性。合適的局部配制品的例子包括軟膏，乳劑，凝膠，或懸液，含有或不含純化的膠原蛋白。組合物也可浸滲進(jìn)皮膚膏藥，橡皮膏和繃帶中，優(yōu)選以液體或半液體的形式浸滲。
經(jīng)過(guò)將VEGF變體與諸如纖維素衍生物等水溶性多糖或諸如聚乙二醇等合成聚合物混合可制備具有所需粘度的凝膠配制品。用于多糖和聚乙二醇的術(shù)語(yǔ)“水溶性”是指包括膠體溶液和分散液。例如，一般來(lái)說(shuō)，纖維素衍生物的可溶性可用醚基團(tuán)的取代程度來(lái)測(cè)定，本文有用的穩(wěn)定衍生物應(yīng)在纖維素鏈的每個(gè)脫水葡萄糖單位具有足夠量的該醚基團(tuán)以使得該衍生物具有水溶性。一般每個(gè)脫水葡萄糖單位上至少0.35個(gè)醚基團(tuán)的醚取代程度就足夠。另外，纖維素衍生物可以是堿金屬鹽的形式，例如，Li，Na，K，或Cs鹽。
合適的多糖的例子包括，例如，纖維素衍生物，如醚化的纖維素衍生物，包括烷基纖維素，羥基烷基纖維素，和烷基羥基烷基纖維素，例如，甲基纖維素，羥乙基纖維素，羧甲基纖維素，羥丙基甲基纖維素和羥丙基纖維素；淀粉和分級(jí)淀粉；瓊脂；藻酸和藻酸鹽；阿拉伯膠；支鏈淀粉；瓊脂糖；角叉藻聚糖；葡聚糖；糊精；果聚糖；菊粉；甘露聚糖；木聚糖；阿拉伯聚糖；脫乙酰殼多糖；糖原；萄聚糖；和合成性生物多聚體；以及膠，例如黃原膠；瓜爾豆膠；槐豆莢膠；阿拉伯膠；西黃蓍膠；和刺梧桐樹膠；及其衍生物和混合物。本文優(yōu)選的膠化劑是對(duì)生物學(xué)系統(tǒng)為惰性的，無(wú)毒的，制備簡(jiǎn)單的，且不太流動(dòng)或粘滯的膠化劑，且不會(huì)使其中的VEGF變體去穩(wěn)定。
優(yōu)選的多糖是醚化的纖維素衍生物，更優(yōu)選的是充分鑒定，純化并在USP中列出的多糖，例如，甲基纖維素和羥烷基纖維素衍生物如羥丙基纖維素，羥乙基纖維素和羥丙基甲基纖維素。本文最優(yōu)選的是甲基纖維素。例如，含有甲基纖維素的凝膠配制品優(yōu)選包括大約2-5％的甲基纖維素和每毫升凝膠300-1000mg的VEGF變體。更優(yōu)選的是，凝膠配制品含有大約3％的甲基纖維素。
用于凝膠配制的聚乙二醇一般是低和高分子量聚乙二醇的混合物以獲得適當(dāng)?shù)恼扯?。例如，分子?00-600與分子量1500的聚乙二醇混合物當(dāng)以合適的比率混合而獲得藥膏時(shí)對(duì)該目的是有效的。
所用的劑量依賴于上述因素。作為一般建議，可配制VEGF變體并以能在組織中建立超過(guò)大約0.1ng/cc到有效但不過(guò)分有毒的最大量的VEGF變體水平的劑量傳遞給靶位點(diǎn)或組織。如果可能，應(yīng)經(jīng)過(guò)連續(xù)輸注，持續(xù)釋放，局部施用或以按經(jīng)驗(yàn)確定的頻率進(jìn)行注射來(lái)維持組織內(nèi)濃度。
組合VEGF變體療法與其它新的或常規(guī)療法(例如，本領(lǐng)域已知的生長(zhǎng)因子，如aFGF，bFGF，HGF，PDGF，IGF，NGF，合成類固醇，EGF或TGF-β)以增強(qiáng)包括天然VEGF在內(nèi)的任意生長(zhǎng)因子在促進(jìn)細(xì)胞增生和修復(fù)中的活性均在其范圍內(nèi)。這種共同治療的藥品本身不必包含在本發(fā)明的組合物中，盡管如果該藥品是蛋白類時(shí)這樣會(huì)很方便。該混合物與單獨(dú)使用的VEGF變體以相同的方式且用于例如，相同的目的進(jìn)行適當(dāng)?shù)挠盟帯?br> 有效劑量和用藥程序可憑經(jīng)驗(yàn)確定，且作出該決定在本領(lǐng)域的技術(shù)人員能力范圍內(nèi)。
本發(fā)明的VEGF變體在診斷方法和檢測(cè)中也具有實(shí)用性。例如，VEGF變體可用于診斷試驗(yàn)以檢測(cè)細(xì)胞和組織中KRD受體的表達(dá)或存在?？墒褂帽绢I(lǐng)域已知的各種診斷試驗(yàn)技術(shù)，例如體內(nèi)成像試驗(yàn)，體外競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合試驗(yàn)，直接或間接夾心試驗(yàn)和在多相或均相中進(jìn)行的免疫沉淀試驗(yàn)。用于所述試驗(yàn)的VEGF變體可用可檢測(cè)組分進(jìn)行標(biāo)記?？蓹z測(cè)組分應(yīng)能夠產(chǎn)生可直接或間接檢測(cè)的信號(hào)。例如，可檢測(cè)組分可以是放射性同位素，如，3H，14C，32P，35S或125I，熒光或化學(xué)發(fā)光的化合物，如異硫氰酸熒光素，羅丹明或螢光素，或酶，如堿性磷酸酶，β-半乳糖苷酶，或辣根過(guò)氧化物酶?？刹捎帽绢I(lǐng)域已知的任何方法將VEGF變體與可檢測(cè)組分偶聯(lián)。
VEGF變體也可用于從重組細(xì)胞培養(yǎng)物或天然來(lái)源親和純化KDR受體或Flt-1受體。使用本領(lǐng)域已知的方法可將VEGF變體固定在合適的支持物，如樹脂或?yàn)V紙上。然后可將固定的VEGF變體與含KDR受體或Flt-1受體的樣品接觸，隨后用合適的溶劑洗滌支持物，除了與VEGF變體結(jié)合的KDR受體或Flt-1受體外，該溶劑基本上去掉樣品中所有的物質(zhì)。如果需要，可用另一合適的溶劑洗滌支持物，這種溶劑可從VEGF變體上釋放出KDR受體或Flt-1受體。
4.制造的商品本申請(qǐng)還提供了制造的商品和試劑盒。制造的商品，例如用于診斷試驗(yàn)或本文所述病癥治療的含有VEGF變體的試劑盒包括至少一個(gè)容器和一個(gè)標(biāo)記。合適的容器包括，例如，瓶子，小瓶，注射器和試管。容器可用諸如玻璃或塑料等各種材料制成。該容器容納用于診斷或治療病癥的組合物且具有無(wú)菌輸出口(例如，容器可以是靜脈溶液袋或具有可被皮下注射針頭刺穿的瓶塞的小瓶)。組合物中的活性試劑是VEGF變體。容器上的或與之相聯(lián)的標(biāo)記表明該組合物用于診斷目的或治療選定的病癥。制造的商品還可包括容納了藥用上可接受的緩沖液，例如，磷酸鹽緩沖液，Ringer’s溶液和葡萄糖溶液的第二容器。它還可包括從商業(yè)和用戶的角度所需的其它物質(zhì)，包括其它緩沖液，稀釋劑，濾紙，針頭，注射器和帶有使用說(shuō)明的包裝插頁(yè)。制造的商品也可包括含有上述另一活性試劑的第二或第三容器。
提供下面的實(shí)施例僅用作說(shuō)明性的目的而不打算以任何方式限制本發(fā)明的范圍。
本說(shuō)明書中引證的所有專利和參考文獻(xiàn)以其全文引入本文以供參考。
實(shí)施例實(shí)施例中涉及的商業(yè)上可獲得的試劑按照廠商的說(shuō)明書使用，除非另有說(shuō)明。下面實(shí)施例，和整個(gè)說(shuō)明書中以ATCC保藏號(hào)限定的細(xì)胞的來(lái)源是美國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心，Manassas，Virginia。
實(shí)施例 1KDR-特異性VEGF變體的篩選為了產(chǎn)生KDR-特異性變體，構(gòu)建了兩個(gè)噬菌體文庫(kù)，其中隨機(jī)突變了對(duì)Flt-1結(jié)合很重要但對(duì)KDR結(jié)合不重要的VEGF(1-109)殘基。
噬菌粒的構(gòu)建為了構(gòu)建噬菌體文庫(kù)，首先產(chǎn)生具有編碼VEGF殘基1-109的cDNA的噬菌粒載體。使用允許隨后將Nsi/Xba I限制性片斷連接進(jìn)噬菌粒載體phGHam-g3(Genentech，Inc.)的引物，經(jīng)過(guò)對(duì)編碼VEGF殘基1-109的cDNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增產(chǎn)生噬菌粒載體pB2105(Genentech，Inc.)。這使得在緊靠殘基109之后導(dǎo)入一個(gè)琥珀密碼子并將VEGF1-109cDNA融合到含有殘基249到406的gIII位點(diǎn)的C末端一半上。
在一個(gè)文庫(kù)中，VEGF1-109的位置18，21，22和25允許所有可能的殘基組合(其需借助將靶密碼子改變成NNS序列的寡核苷酸，其中N＝G，A，T，或C，S＝C或G)，位置17允許有40％的概率發(fā)生改變(對(duì)靶密碼子中每個(gè)堿基而言有70％的概率為野生型，其它三個(gè)堿基類型各10％的概率)。
使用下面的寡核苷酸將靶密碼子改變成NNS序列L-528CAC GAA GTG GTG AAG TTC NNS GAT GTC NNS NNSCGC AGC NNS TGC CAT CCA ATC GAG(SEQ ID NO1)L-530GGG GGC TGC TGC AAT NNS GAG NNS NNS GAG TGT GTGCCC ACT(SEQ ID NO2)在第二個(gè)文庫(kù)中，VEGF 1-109在位置63，65和66允許所有可能的殘基組合，在位置64允許有40％的概率發(fā)生改變。
在第三個(gè)文庫(kù)中，VEGF(1-109)在位置47和48允許所有可能的殘基組合，在位置43和46允許有50％的概率發(fā)生改變。在第四個(gè)文庫(kù)中，VEGF(1-109)在位置63，65和66允許所有可能的殘基組合，在位置64允許有50％的概率發(fā)生改變。
為了產(chǎn)生KDR-選擇性變體，可將突變區(qū)分成所示的5組，使用前四組構(gòu)建文庫(kù)，該文庫(kù)用于隨后的噬菌體展示篩選。用星號(hào)(*)標(biāo)記的殘基經(jīng)“軟隨機(jī)化”為50％偏向野生型，用兩個(gè)星號(hào)標(biāo)記的殘基經(jīng)“硬隨機(jī)化”(見下文圖7)。
異源雙鏈DNA的合成根據(jù)從Kunkel等，酶學(xué)方法，204125-139(1991)修改的方法合成異源雙鏈DNA。通過(guò)該方法，將誘變的寡核苷酸插入具有生物學(xué)活性的共價(jià)閉環(huán)DNA(CCC-DNA)分子中。按下述步驟實(shí)現(xiàn)該方法。
首先，將上述寡核苷酸5’磷酸化。這可通過(guò)在eppendof管中將2μg寡核苷酸，2μl10xTM緩沖液(500mM Tris-HCl，100mM MgCl2，pH7.5)，2μl10mM ATP和1μl100mM DTT混合，然后加水至20μl的總體積而實(shí)現(xiàn)。向該混合物中加入20單位的T4多核苷酸激酶(Weiss單位)并在37℃下溫育1小時(shí)。
接著，使每種5’磷酸化的寡核苷酸與噬菌粒模板(從dut/ung-大腸桿菌菌株CJ-236純化的單鏈DNA)退火。這可通過(guò)首先混合1μg單鏈DNA模板，0.12μg磷酸化的寡核苷酸和2.5μl10xTM緩沖液(500mM Tris-HCl，100mM MgCl2，pH7.5)，然后加水至總體積25μl而實(shí)現(xiàn)。DNA的量使得寡核苷酸與模板的摩爾比率為3∶1，其中假定寡核苷酸與模板長(zhǎng)度的比率是1∶100?；旌衔镌?0℃溫育2分鐘，然后在50℃溫育3分鐘，然后在20℃溫育5分鐘。
然后向已退火的混合物中加入下列試劑1μl10mMATP，1μl25mMdNTPs，1.5μl100 mMDTT，3單位的T4 DNA連接酶，和3單位的T7DNA聚合酶，使每種5’磷酸化的寡核苷酸酶促延伸并連接以形成CCC-DNA分子。然后將混合物在20℃下溫育至少3小時(shí)。
經(jīng)過(guò)乙醇沉淀純化DNA并重懸于15μl水中。
大腸桿菌電穿孔在稱為大腸桿菌XL1-blue(Stratagene，LaJolla，CA)的大腸桿菌抑制型菌株中經(jīng)過(guò)大腸桿菌電穿孔產(chǎn)生文庫(kù)噬菌體。為進(jìn)行電穿孔，首先將純化的異源雙鏈DNA在0.2-cm缺口的電穿孔杯中在冰上冷凍，將100μl等分試樣的電感受態(tài)大腸桿菌XL1-blue在冰上解凍。將大腸桿菌細(xì)胞加入所述DNA中并吸取幾次以混合。
將混合物轉(zhuǎn)移到杯中并使用基因脈沖儀(Bio-rad，Hercules，CA)在如下條件2.5kv電場(chǎng)強(qiáng)度，200歐姆電阻和25mF電容下進(jìn)行電穿孔。隨后立即加入1mlSOC培養(yǎng)基(5g細(xì)菌用酵母提取物，20g細(xì)菌用胰蛋白胨，0.5gNaCl，0.2g KCI；加水至1升并用NaOH調(diào)至pH7.0；高壓滅菌；然后加入5mL已高壓滅菌的2M MgCl2和20mL濾膜除菌的1M葡萄糖)并將混合物轉(zhuǎn)移到無(wú)菌培養(yǎng)管中37℃下振蕩培養(yǎng)30分鐘。
為了測(cè)定文庫(kù)的多樣性，將系列稀釋液涂布在2YT(10g細(xì)菌用酵母抽提物，16g細(xì)菌用胰蛋白胨，5gNaCl；加水至1升并用NaOH調(diào)pH至7.0；高壓滅菌)平板上(補(bǔ)充了50μg/ml氨芐青霉素)。另外，將培養(yǎng)物轉(zhuǎn)移到含有25ml 2YT，25mg/ml氨芐青霉素，M13-VCS(1010pfu/mL)(Stratagene，LaJolla，CA)的250ml帶檔板的搖瓶中并在37℃下振蕩培養(yǎng)過(guò)夜。
然后將培養(yǎng)物在Sorvall GSA離心機(jī)(16000g)中以10krpm，2℃離心10分鐘。將上清轉(zhuǎn)移到新試管中并加入1/5體積的PEG-NaCl溶液(200g/lPEG-8000，146g/lNaCl；高壓滅菌)以沉淀噬菌體。上清/PEG-NaCl溶液在室溫下培養(yǎng)5分鐘并再次離心以獲得噬菌體沉淀。
傾析并棄去上清。再次簡(jiǎn)短離心噬菌體沉淀并去掉殘留的上清。噬菌體沉淀重懸于1/20體積的PBT緩沖液(PBS，0.2％BSA，0.1％吐溫20)中，經(jīng)過(guò)在SS-34離心機(jī)中以15krpm(27000g)，2℃離心重懸的沉淀5分鐘棄去不溶物。所得的上清含有噬菌體。
保存上清用于以其結(jié)合親和力分選VEGF變體。經(jīng)過(guò)在大腸桿菌抑制型菌株中產(chǎn)生噬菌體，可表達(dá)VEGF(1-109)變體-gIII融合蛋白并在噬菌體表面展示，使得噬菌體與KDR和/或Flt-1受體結(jié)合。
文庫(kù)的親和力分選使用相似于H.Jin，臨床研究雜志，98969(1996)所述方法的競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合技術(shù)分選各文庫(kù)對(duì)KDR(1-3)單體的結(jié)合，顯示所述文庫(kù)對(duì)于產(chǎn)生受體選擇性變體有用。
為了進(jìn)行競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合技術(shù)，在溶液中存在高濃度(100nM)的競(jìng)爭(zhēng)性Flt-1(1-3)單體(Genentech，Inc.)的條件下分選各文庫(kù)對(duì)固相KDR(1-3)單體(Genentech，South San Francisco，Califomia)的結(jié)合。即，首先用包被緩沖液(pH9.6的50mM碳酸鈉)中的2-5μg/ml KDR(1-3)單體以80μl/孔包被Maxisorp免疫平板孔(Nalge Nunc Intemational，Rochester，紐約)并在4℃溫育過(guò)夜。所需孔的數(shù)目依賴于文庫(kù)的多樣性。去掉包被液并用200μl0.2％BSA的PBS溶液封閉1小時(shí)。同時(shí)，封閉相等數(shù)目的未包被孔作為陰性對(duì)照。
各孔用PT緩沖液(PBS，0.05％吐溫20)洗滌8次以去掉封閉緩沖液。然后向包被或未包被的各孔中加入在PBT緩沖液(PBS，0.2％BSA，0.1％吐溫20)中的文庫(kù)噬菌體溶液(1012個(gè)噬菌體/ml)100μl。向該噬菌體溶液中加入Flt-1(1-3)單體。所有孔在室溫下輕輕搖動(dòng)培養(yǎng)2小時(shí)。
然后各孔用PT緩沖液(PBS，0.05％吐溫20)洗滌10次以去掉噬菌體溶液和Flt-1-結(jié)合的任何噬菌體。用100μl 0.2mM的甘氨酸在pH2室溫下培養(yǎng)各孔5分鐘，而從孔中洗脫KDR結(jié)合的噬菌體。為了收集KDR結(jié)合的噬菌體，將甘氨酸溶液轉(zhuǎn)移到eppendorf管中并用1.0MTris-HCl，pH8.0中和。
將洗脫的噬菌體溶液取一半加入10倍體積的活躍生長(zhǎng)的大腸桿菌XL1-blue(OD600＜10)中并在37℃下?lián)u動(dòng)培養(yǎng)30分鐘，從而再繁殖KDR結(jié)合的噬菌體。然后將該培養(yǎng)物的系列稀釋液涂布在2YT/amp平板(補(bǔ)充了50mg/ml氨芐青霉素的2YT)上以測(cè)定洗脫的噬菌體數(shù)。對(duì)用KDR(1-3)單體包被的孔和未包被的孔都進(jìn)行測(cè)定。
將來(lái)自平板的培養(yǎng)物轉(zhuǎn)移到10倍體積的2YT/amp/VCS(補(bǔ)充了50mg/ml氨芐青霉素和1010puf/mlM13-VCS的2YT)中并在37℃下?lián)u動(dòng)培養(yǎng)過(guò)夜。然后分離噬菌體。
在高濃度(100nM)的競(jìng)爭(zhēng)性Flt-1(1-3)單體存在的條件下再分選再繁殖后的噬菌體對(duì)固相KDR(1-3)單體的結(jié)合，隨后洗去Flt-1結(jié)合的噬菌體并再繁殖KDR結(jié)合的噬菌體。通過(guò)計(jì)算富集比率來(lái)監(jiān)測(cè)親和力分選過(guò)程并重復(fù)直至富集比率達(dá)到最大值(大約5到6個(gè)分選循環(huán))。
富集比率是KDR(1-3)單體包被孔洗脫的噬菌體數(shù)除以與未包被的對(duì)照孔結(jié)合的噬菌體數(shù)。比率大于1通常表明噬菌體與KDR(1-3)蛋白質(zhì)特異性結(jié)合，從而表明對(duì)于與所加的Flt-1(1-3)單體的結(jié)合有抗性。當(dāng)富集比率達(dá)到最大值時(shí)，分析單個(gè)克隆的特異性結(jié)合。
噬菌體ELISA按照Muller等，PNAS，947192(1997)所述使用噬菌體ELISA測(cè)量在其表面具有VEGF 1-109變體-gIII蛋白質(zhì)的噬菌體與KDR(1-3)單體的特異性結(jié)合。為進(jìn)行噬菌體ELISA，用在50mM碳酸鈉，pH9.6中的純化的KDR(1-3)單體或Flt-1(1-3)單體(5ug/ml)包被微量滴定平板(Maxisorp，Nunc-Immunoplate，Nalge Nunc International，Rochester，紐約)并在4℃下溫育過(guò)夜。用0.5％的BSA封閉平板。接著，向孔中加入在100ul結(jié)合緩沖液(PBS，0.5％吐溫20，0.5％BSA)中的VEGF1-109變體的系列稀釋液以及亞飽和濃度的競(jìng)爭(zhēng)性受體(KDR(1-3)單體或Flt-1(1-3)單體)。平衡后，洗滌平板，按廠商說(shuō)明書用辣根過(guò)氧化物酶偶聯(lián)的抗-M13抗體(PharmaciaBiotech，Piscataway，NJ)染色結(jié)合的噬菌粒。親和力(EC50)計(jì)算為產(chǎn)生最大噬菌粒結(jié)合的一半的競(jìng)爭(zhēng)性受體濃度。
從噬菌粒cDNA的序列測(cè)定從親和力分選獲得的且顯示出對(duì)Flt-1(1-3)單體有抗性的VEGF 1-109變體的序列。
VEGF1-109變體的純化從大腸桿菌(27c7)搖瓶培養(yǎng)物分離可回收體形式的VEGF1-109變體蛋白質(zhì)。按yihai等，生物化學(xué)雜志，2713154-3162(1996)所述進(jìn)行突變蛋白質(zhì)的重折疊?；旌献凅w并用6M鹽酸胍加1mM氧化型谷胱甘肽在pH6下解折疊，用10倍體積的2mM還原型谷胱甘肽和0.5mM氧化型谷胱甘肽和2M尿素的20mMTis-HClpH8溶液中透析10小時(shí)。用20倍體積的20mMTris-HCl(pH8)在4℃下緩慢透析過(guò)夜以去掉尿素。經(jīng)過(guò)陰離子交換(PharmaciaHiTrap Q，1ml)(Pharmacia Biotech，Piscataway，NJ)進(jìn)一步純化各變體以去掉微量的錯(cuò)誤折疊的單體。以SDS-PAGE和質(zhì)譜法證實(shí)所得的純變體的均一性。
表2顯示了VEGF變體的標(biāo)識(shí)符名稱，導(dǎo)入的氨基酸取代，和編碼被取代的氨基酸的相應(yīng)密碼子。某個(gè)變體標(biāo)識(shí)符(例如LK-VRB-ls)之后的星號(hào)(*)表示被證實(shí)具有特別優(yōu)選的結(jié)合親和力和/或生物學(xué)活性的各種VEGF變體。含有“s”的變體標(biāo)識(shí)符(例如LK-VRB-1s)表示由VEGF的1-109截短形式組成且含有表中所引的突變的VEGF變體多肽。含有“f”的變體標(biāo)識(shí)符(例如LK-VRB-1f)表示由VEGF的全長(zhǎng)1-165形式組成且含有表中所列舉的突變的VEGF變體多肽。變體序列中突變的命名和鑒定按常規(guī)命名。例如，對(duì)于表2中的最開始處，突變稱為“M18E”。這意味著天然VEGF序列的第18位(使用Leung等，出處同上和Houck等，出處同上報(bào)道的天然人VEGF的氨基酸序列中的編號(hào))發(fā)生突變使得在該位置的天然甲硫氨酸(M)被谷氨酸(E)殘基取代以制備VEGF變體。表2中稱為“核苷酸序列”的一欄提供了各氨基酸突變的各自密碼子(5’→3’)。例如，對(duì)于表2中的最開始處，M18E突變由密碼子“GAG”編碼。
表2VEGF變體和相應(yīng)的突變
實(shí)施例2VEGF變體與KDR受體的結(jié)合經(jīng)過(guò)測(cè)量VEGF(1-109)變體和VEGF165變體(實(shí)施例1所述)抑制生物素標(biāo)記的天然VEGF(8-109)結(jié)合KDR受體的能力可評(píng)價(jià)所述變體與KDR受體的結(jié)合。所評(píng)價(jià)的VEGF變體含有表2所示的突變。
在96孔免疫平板(Maxisorp，Nunc-Immunoplate，Nalge NuncInternational，Rochester，紐約)中進(jìn)行受體結(jié)合試驗(yàn)。每孔用100μl在pH9.6的50mM碳酸鹽緩沖液中含8μg/ml稱為MAKD5(Genentech，South SanFrancisco，Caliromia)的抗KDR單克隆抗體的溶液包被并在4℃下溫育過(guò)夜。棄去上清，各孔在洗滌緩沖液(PBS含0.05％吐溫20)中洗滌三遍，用封閉緩沖液(PBS含0.5％BSA，0.01％硫柳汞)在室溫下封閉平板(每孔150μl)1小時(shí)。棄去上清并洗滌孔。
將系列稀釋的天然VEGF(8-109)，天然VEGF(1-165)，天然VEGF(1-109)變體，或VEGF165變體(0.16-168nM的單體)與生物素標(biāo)記的天然VEGF(8-109)(84nM)和KDR(1-3)(1μg/ml)在試驗(yàn)緩沖液(在PBS中含0.5％BSA，0.05％吐溫20)中室溫下培養(yǎng)2小時(shí)。將等分試樣的該混合物(100μl)加入預(yù)包被的微量滴定孔中且在室溫下培養(yǎng)該平板1小時(shí)。經(jīng)過(guò)用過(guò)氧化物酶標(biāo)記的鏈霉抗生物素蛋白(0.2mg/ml，Sigma，St.Louis，Missouri)在室溫下溫育各孔30分鐘來(lái)檢測(cè)與微量滴定平板結(jié)合的KDR(1-3)與生物素標(biāo)記型天然VEGF的復(fù)合物。然后用3，3’，5，5’-四甲基聯(lián)苯胺(0.2克/升；Kirkegaard&Perry實(shí)驗(yàn)室，Gaithersburg，Maryland)在室溫下與各孔一起溫育約10分鐘。在Vmax讀板儀(Molecular Devices，Menlo Park，Califomia)上于450nm處閱讀吸光度。
用四參數(shù)非線型回歸曲線吻合程序(Kaleida Graph，Synergy Software，Reading，Pennsylvania)來(lái)調(diào)整滴定曲線。計(jì)算相應(yīng)于天然VEGF(8-109)滴定曲線的中點(diǎn)吸光度處的VEGF變體濃度，然后除以相應(yīng)于天然VEGF滴定曲線的中點(diǎn)吸光度處的天然VEGF濃度(見圖2)。
VEGF(1-109)變體和VEGF165變體的測(cè)定的結(jié)合親和力在表3中顯示。多種VEGF變體表現(xiàn)出與KDR受體的結(jié)合在天然VEGF(8-109)結(jié)合的大約2倍范圍內(nèi)。
實(shí)施例3VEGF變體與Flt-1受體的結(jié)合經(jīng)過(guò)測(cè)量VEGF(1-109)變體和VEGF165變體(實(shí)施例1所述)抑制生物素標(biāo)記的天然VEGF(8-109)與Flt-1受體結(jié)合的能力可評(píng)價(jià)所述與Flt-1受體的結(jié)合。所評(píng)價(jià)的VEGF變體含有表2所示的突變。
在96孔免疫平板(Maxisorp，Nunc-Immunoplate，Nalge NuncInternational，Rochester，紐約)中進(jìn)行受體結(jié)合試驗(yàn)。每孔用100μl在pH9.6的50mM碳酸鹽緩沖液中含2μg/ml抗人IgG Fc的兔F(ab’)2(JacksonImmuno Research，West Grove，Pennsylvania)的溶液包被并在4℃下溫育過(guò)夜。然后棄去上清，各孔在洗滌緩沖液(PBS含0.05％吐溫20)中洗滌三遍，用封閉緩沖液(PBS含0.5％BSA，0.01％硫柳汞)在室溫下封閉平板(每孔150μl)1小時(shí)。棄去上清并洗滌各孔。
每孔用100μl在試驗(yàn)緩沖液(PBS含0.5％BSA，0.05％吐溫20)中含50ng/mlFlt-IgG(嵌合Flt-人Fc分子)的溶液包被。孔在室溫下溫育1小時(shí)并然后在洗滌緩沖液(PBS含0.05％吐溫20)中洗滌三次。
將系列稀釋的天然VEGF(8-109)，天然VEGF165，VEGF(1-109)變體，或VEGF165變體(0.03-33nM的單體)與生物素標(biāo)記的天然VEGF(8-109)(0.21nM)或生物素標(biāo)記的天然VEGF165(0.66nM)混合。向預(yù)包被的微滴定孔中加入等分試樣的該混合物(100μl)并將平板在室溫下溫育2小時(shí)。經(jīng)過(guò)用過(guò)氧化物酶標(biāo)記的鏈霉抗生物素蛋白(0.2mg/ml，Sigma，St.Louis，Missouri)在室溫下溫育各孔30分鐘來(lái)檢測(cè)與微量滴定平板結(jié)合的Flt-IgG與生物素標(biāo)記型天然VEGF的復(fù)合物。然后各孔與3，3’，5，5’-四甲基聯(lián)苯胺(0.2克/升；Kirkegaard & Perry實(shí)驗(yàn)室，Gaithersburg，Maryland)在室溫下溫育約10分鐘。在Vmax讀板儀(Molecular Devices，Menlo Park，Califomia)上閱讀450nm處吸光度。
用四參數(shù)非線型回歸曲線吻合程序(KaleidaGraph，Synergy Software，Reading，Pennsylvania)來(lái)調(diào)整滴定曲線。計(jì)算相應(yīng)于天然VEGF(8-109)滴定曲線的中點(diǎn)吸光度處的VEGF變體濃度，然后除以相應(yīng)于天然VEGF滴定曲線的中點(diǎn)吸光度處的天然VEGF濃度。
VEGF(1-109)變體和VEGF165變體的測(cè)定的結(jié)合親和力在表3中顯示。多種VEGF變體顯示出對(duì)Flt-1受體的結(jié)合比天然VEGF(8-109)的結(jié)合低2000倍以上。表3中報(bào)道的某些VEGF變體(例如，LK-VRB-7s*和LK-VRB-8s*)對(duì)FLT-1受體的相對(duì)結(jié)合親和力沒有以nM值報(bào)道，因?yàn)榭蓹z測(cè)的結(jié)合量超出了ELISA試驗(yàn)的靈敏度。
表3VEGF變體對(duì)KDR受體和FLT-1受體的結(jié)合
實(shí)施例4VEGF(1-109)變體誘導(dǎo)KDR受體磷酸化為了測(cè)定VEGF變體的活性，在KIRA試驗(yàn)中測(cè)量變體誘導(dǎo)KDR受體磷酸化的能力。所評(píng)價(jià)的VEGF變體含有表2中的突變。具體地說(shuō)，研究了下列VEGF(1-109)變體LK-VRB-1s*；LK-VRB-2s*；LK-VRB-3s；LK-VRB-4s；LK-VRB-5s和LK-VRB-6s。
向表達(dá)N末端具有g(shù)D標(biāo)記的KDR受體的CHO細(xì)胞(Genentech，SouthSan Francisco，California)中加入系列稀釋的VEGF(1-109)變體(0.01-10nM)。用0.5％Titon-X100，150mM NaCl，50mM Hepes在pH7.2下裂解細(xì)胞，經(jīng)ELISA定量裂解產(chǎn)物中磷酸化的gD-KDR受體。
為進(jìn)行ELISA，使用96孔免疫平板(Maxisorp，Nunc-Immunoplate，Nalge Nunc International，Rochester，紐約)。每孔用100μl在pH9.6的50mM碳酸鹽緩沖液中含1μg/ml稱為3C8(Genentech，South San Francisco，Califomiia)的抗gD小鼠單克隆抗體的溶液包被并在4℃下溫育過(guò)夜。棄去上清，在洗滌緩沖液(PBS含0.05％吐溫20)中洗滌各孔三遍，用封閉緩沖液(PBS含0.5％BSA，0.01％硫柳汞)在室溫下封閉平板(每孔150μl)1小時(shí)。然后棄去上清并洗滌各孔。
向預(yù)包被的孔中加入等分試樣的裂解產(chǎn)物(100μl)并在室溫下溫育2小時(shí)。每孔用生物素標(biāo)記的稱為4G10(0.05mg/ml)(Upstate Biotechnology，LakePlacid，紐約)的抗磷酸酪氨酸單克隆抗體在室溫下溫育2小時(shí)，接著用過(guò)氧化物酶標(biāo)記的鏈霉抗生物素蛋白(0.2mg/ml，Sigma，St.Louis，Missouri)在室溫下溫育孔1小時(shí)來(lái)檢測(cè)磷酸化gD-KDR受體。然后每孔與3，3’，5，5’-四甲基聯(lián)苯胺(0.2克/升；Kirkegaard & Perry實(shí)驗(yàn)室，Gaithersburg，Maryland)在室溫下溫育約15-20分鐘。在Vmax讀板儀(Molecular Devices，MenloPark，Califomia)上閱讀450nm處吸光度。
用四參數(shù)非線型回歸曲線吻合程序(KaleidaGraph，Synergy Software，Reading，Pennsylvania)來(lái)調(diào)整滴定曲線。計(jì)算相應(yīng)于天然VEGF(8-109)滴定曲線的中點(diǎn)吸光度處的VEGF變體濃度，然后除以相應(yīng)于天然VEGF滴定曲線的中點(diǎn)吸光度處的天然VEGF濃度(圖3)。
表4中提供了VEGF變體誘導(dǎo)磷酸化的活性。VEGF變體一般表現(xiàn)出的誘導(dǎo)磷酸化的活性在天然VEGF(8-109)活性的2倍范圍內(nèi)。
表4VEGF(1-109)變體對(duì)KDR受體磷酸化的誘導(dǎo)
實(shí)施例 5內(nèi)皮細(xì)胞增生試驗(yàn)使用人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(HUVEC)(細(xì)胞系統(tǒng)，Kirkland，華盛頓)作靶細(xì)胞測(cè)定VEGF(1-109)或VEGF165變體(以及一個(gè)VEGF165變體，LK-VRB-2f)的促有絲分裂活性。所評(píng)價(jià)的VEGF變體含有表2中的突變。具體地說(shuō)，研究了下列VEGF(1-109)變體LK-VRB-1s*；LK-VRB-2s*；LK-VRB-7s*；和LK-VRB-8s*。
HUVEC是在CS-C完全生長(zhǎng)培養(yǎng)基(細(xì)胞系統(tǒng)，Kirkland，華盛頓)中用諸如酸性FGF等生長(zhǎng)因子維持和生長(zhǎng)的原代細(xì)胞系。為了制備用于該試驗(yàn)，洗滌所述細(xì)胞的早期傳代培養(yǎng)物(不超過(guò)5代)并接種在96孔平板(每孔100μl含3000個(gè)細(xì)胞)中且在不含任何生長(zhǎng)因子但補(bǔ)充了2％已滲濾的胎牛血清(GibcoBRL，Gaithersburg，MD)的CS-C培養(yǎng)基中于37℃的5％CO2培養(yǎng)箱內(nèi)絕食(fast)24小時(shí)，之后用新鮮的絕食培養(yǎng)基替換。向孔中加入在相同絕食培養(yǎng)基中稀釋的幾個(gè)濃度的VEGF變體(約10nM-0.01nM)使體積達(dá)到每孔150μl并溫育18個(gè)小時(shí)。
為了測(cè)量VEGF變體誘導(dǎo)的DNA合成，以每孔0.5μCi向各孔中加入3H-胸苷(Amersham Life Science，Arlington Heights，IL)并再培養(yǎng)24小時(shí)以便細(xì)胞吸收放射活性。然后將細(xì)胞收獲到另一96孔過(guò)濾平板上并且在將平板上樣到Topcount(Packard，Meriden，Connecticut)之前洗去過(guò)量的標(biāo)記。
用Topcount計(jì)數(shù)細(xì)胞。每分鐘測(cè)量的讀數(shù)(CPM)對(duì)各變體濃度繪圖以比較其活性。(圖4)表5中顯示了VEGF變體的細(xì)胞增生能力。VEGF變體一般表現(xiàn)出的細(xì)胞增生能力在天然VEGF(8-109)能力的2倍范圍內(nèi)。
表 5VEGF(1-109)變體的促有絲分裂活性
實(shí)施例 6測(cè)定VEGF變體與KDR和FLT-1受體結(jié)合的RIA試驗(yàn)基本上按照Muller等，PNAS，947192-7197(1997)所述進(jìn)行RIA試驗(yàn)以檢查與天然VEGF165或天然VEGF(8-109)相比，幾個(gè)VEGF變體(表2中所述)與KDR受體和FLT-1受體的相對(duì)結(jié)合親和力。結(jié)果在下面表6中顯示。
表6
實(shí)施例 7VEGF變體與KDR-或FLT-1-轉(zhuǎn)染的細(xì)胞的結(jié)合在受體轉(zhuǎn)染的細(xì)胞結(jié)合試驗(yàn)中進(jìn)一步檢查了LK-VRB-2s*(見實(shí)施例1，表2)的結(jié)合特性。按Fuh等，生物化學(xué)雜志，27311187-11204(1998)所述制備KDR或Flt-1轉(zhuǎn)染的NIH3T3細(xì)胞。轉(zhuǎn)染的細(xì)胞在補(bǔ)充了10％FBS和400ug/ml G418(GibcoBRL)的F12培養(yǎng)基中維持。為進(jìn)行結(jié)合試驗(yàn)，將細(xì)胞以1X106/孔涂布在12孔平板中以便在第二天達(dá)到鋪滿。然后洗滌細(xì)胞并在含1％BSA的Hank’s緩沖鹽水(HBS)中封閉1小時(shí)，之后加入125I-VEGF(1-109)(以標(biāo)準(zhǔn)氯胺-T方法制備)和濃度遞增的未標(biāo)記型VEGF變體。50pM和10pM標(biāo)記型VEGF(1-109)分別用于KDR和Flt-1細(xì)胞結(jié)合。平板在4℃下溫育3小時(shí)，然后用含0.5％BSA的HBS洗滌兩次。用1N NaOH溶解已洗滌的細(xì)胞來(lái)收集結(jié)合的標(biāo)記型VEGF，然后在γ-計(jì)數(shù)器(Isodata，ICN)中計(jì)數(shù)。
如圖5所示，LK-VRB-2s*表現(xiàn)出與表達(dá)KDR的轉(zhuǎn)染細(xì)胞的結(jié)合相似于天然VEGF結(jié)合。然而，LK-VRB-2s*表現(xiàn)出與Flt-1轉(zhuǎn)染的細(xì)胞的結(jié)合減少了大約200倍(見圖6)。
實(shí)施例 8Flt-1特異性VEGF變體的產(chǎn)生和篩選使用丙氨酸掃描(Wells，酶學(xué)方法，202309-411(1991))限定單個(gè)VEGF殘基對(duì)KDR與Flt-1結(jié)合的相對(duì)重要性。選擇用于誘變的殘基包括在VEGF的受體結(jié)合結(jié)構(gòu)域和Flt-1結(jié)構(gòu)域2之間的復(fù)合物晶體結(jié)構(gòu)中觀察到的22個(gè)接觸殘基(Wiesmann等，細(xì)胞，91695-704(1997))，以及以前作為KDR結(jié)合決定簇鑒定的Phe47和Glu64(Muller等，美國(guó)國(guó)家科學(xué)院院報(bào)，947192-7197(1997))。使用Kunkel等，酶學(xué)方法，204125-139(1991)的方法在VEGF的受體結(jié)合結(jié)構(gòu)域(殘基1-109)骨架中進(jìn)行定點(diǎn)誘變。經(jīng)過(guò)DNA測(cè)序證實(shí)所有突變。將下列VEGF殘基分別突變成丙氨酸Lys16，Phe17，Met18，Tyr21，Gln22，Tyr25，Ile43，Ile46，Phe47，Lys48，Asp63，Glu64，Gly65，Leu66，Gln79，Met81，Ile83，His86，Gln89，Ile91，Lys101，Glu103，Arg105，Pro106。在VEGF的受體結(jié)合結(jié)構(gòu)域背景(殘基1-109Keyt等，生物化學(xué)雜志，2717788-7795(1996)；Muller等，美國(guó)國(guó)家科學(xué)院院報(bào)，947192-7197(1997))中將這些殘基分別誘變成丙氨酸。
生產(chǎn)每種突變蛋白并純化成均一物質(zhì)，使用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)測(cè)定對(duì)KDR和Flt-1的結(jié)構(gòu)域1至3的結(jié)合親和力(這三個(gè)結(jié)構(gòu)域含有完整的VEGF-結(jié)合位點(diǎn)；Wiesmann等，細(xì)胞，91695-704(1997)；Fuh等，生物學(xué)化學(xué)雜志，27311197-11204(1998))。為進(jìn)行ELISA，用在50mM碳酸鈉(pH9.6)中的純化VEGF(8-109)(5μg/ml)4℃下包被微量滴定平板過(guò)夜。用0.5％BSA封閉平板，并向孔中加入在100μl結(jié)合緩沖液(PBS含0.5％吐溫20，0.5％BSA)中的競(jìng)爭(zhēng)性VEGF丙氨酸變體的系列稀釋液和亞飽和濃度(100pM)的生物素標(biāo)記型受體(KDR(1-3)或Flt1(1-3))。1小時(shí)后，洗滌平板，用鏈霉抗生物素蛋白辣根過(guò)氧化物酶偶聯(lián)物(Pharmacia)染色結(jié)合蛋白并測(cè)定。親和力按IC50值評(píng)估即抑制50％蛋白結(jié)合的KDR(1-3)或Flt(1-3)的濃度。
該分析的結(jié)果在圖7中顯示。針對(duì)各殘基列出突變體IC50與野生型VEGF(8-109)IC50的比率，其代表了與野生型蛋白相比突變體結(jié)合的倍數(shù)下降。野生型VEGF(8-109)的IC50在括號(hào)中表示。黑體字顯示的殘基用于產(chǎn)生Flt-1-選擇性變體。
同時(shí)分析VEGF突變體的Flt-1結(jié)合顯示出相似并重疊的受體結(jié)合區(qū)，主要是位于20s螺旋和60s環(huán)上，最重要的Flt-1-結(jié)合決定簇是Phe17，Tyr21，Gln22和Leu66(圖7)。相反，關(guān)鍵的Flt-1-結(jié)合決定簇的突變也傾向于明顯降低對(duì)KDR的親和力(圖7)。
通過(guò)將極大地影響KDR結(jié)合但不影響Flt-1結(jié)合的四個(gè)突變組合可產(chǎn)生對(duì)Flt-1受體具有高選擇性的VEGF變體。Ile43，Ile46，Gln79或Ile83向丙氨酸的突變表明這些殘基的側(cè)鏈對(duì)于牢固結(jié)合KDR是關(guān)鍵的，但對(duì)Flt-1-結(jié)合不重要。使用定點(diǎn)誘變方法(Kunkel等，酶學(xué)方法，204125-139(1991))在Ile43，Ile46，Gln79和Ile83位置用丙氨酸取代可構(gòu)建變體(本文稱為“Flt-sel”)。按照上面實(shí)施例1所述(和表2所示)的命名法也可用標(biāo)識(shí)符I43A/I46A/Q79A/I83A表示該具體Flt-sel變體。在位置43，46，79和83的這四個(gè)丙氨酸取代的相應(yīng)密碼子分別是GCC/GCC/GCG/GCC(按照上面實(shí)施例1所述和表2所示的命名法)。
進(jìn)行各種試驗(yàn)以檢查I43A/I46A/Q79A/I83A Flt-sel變體的特征和生物學(xué)活性。例如，使用上面實(shí)施例6所述的可溶性放射免疫受體結(jié)合試驗(yàn)(RIA)進(jìn)行定量結(jié)合測(cè)量。在該試驗(yàn)中，天然VEGF(8-109)對(duì)KDR和Flt-1的親和力分別是0.5nM和0.4nM(圖8A和8B)。發(fā)現(xiàn)Flt-sel在該試驗(yàn)中的KDR結(jié)合親和力降低至少470倍(圖8A)。有點(diǎn)令人驚奇的是，由于在ELISA(上述)中從單個(gè)點(diǎn)突變已觀察到Flt-1結(jié)合少量下降，F(xiàn)lt-sel變體對(duì)Flt-1的親和力基本上相同于天然蛋白質(zhì)(圖8B)。
在實(shí)施例7所述的3T3轉(zhuǎn)染細(xì)胞-結(jié)合試驗(yàn)中也檢驗(yàn)了Flt-sel變體的活性。與RIA數(shù)據(jù)一致，F(xiàn)lt-sel未顯示出可檢測(cè)到的對(duì)KDR轉(zhuǎn)染的3T3細(xì)胞的結(jié)合且略為提高了對(duì)Flt-1-轉(zhuǎn)染的細(xì)胞的結(jié)合(圖5和6)。
在實(shí)施例4所述的KIRA試驗(yàn)中也檢驗(yàn)了Flt-sel變體的活性。結(jié)果在圖9中顯示。
在實(shí)施例5所述的HUVEC增生試驗(yàn)中進(jìn)一步檢驗(yàn)了Flt-sel變體的活性。結(jié)果在圖10中顯示。
實(shí)施例 9基質(zhì)金屬蛋白酶9試驗(yàn)可進(jìn)行試驗(yàn)測(cè)量激活人主動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞中表達(dá)的Flt-1后基質(zhì)金屬蛋白酶9的分泌(Wang和Keiser，循環(huán)研究，83832-840(1998))。人主動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞(ASMC)(Clonetics)在6孔聚苯乙烯平板(Becton-Dickinson)中在10％胎牛血清存在的條件下在5％CO2和95％環(huán)境空氣中37℃下在SM2培養(yǎng)基(Clonetics)中維持。當(dāng)細(xì)胞達(dá)到90％鋪滿時(shí)，在含有0.2％牛血清白蛋白(BSA)的無(wú)血清培養(yǎng)基中限制(arrested)生長(zhǎng)24小時(shí)。以40ng/ml的終濃度加入VEGF(1-109)，P1GF(R&D系統(tǒng)，Minneapolis，MN)或VEGF(1-109)變體(LK-VRB-2s*)和Flt-sel(上述)并在含有0.2％BSA的無(wú)血清培養(yǎng)基中再培養(yǎng)細(xì)胞24小時(shí)。經(jīng)過(guò)酶譜法分析該條件培養(yǎng)基中的明膠酶。收集并濃縮培養(yǎng)基，將25μl等分試樣與無(wú)還原劑或未加熱的2X樣品緩沖液混合。將樣品上樣到含有0.1％明膠(Novex，San Diego，CA)的10％聚丙烯酰胺凝膠中用于電泳。除了使用標(biāo)準(zhǔn)分子量標(biāo)記外，用MMP-2和-9酶譜標(biāo)準(zhǔn)(Chemicon，Temecula，CA)作明膠酶的標(biāo)準(zhǔn)。電泳后，凝膠在復(fù)性緩沖液中室溫下溫育30分鐘使蛋白質(zhì)復(fù)性并在顯色緩沖液(Novex)中37℃下過(guò)夜。凝膠用0.25％考馬斯亮蘭(Sigma)染色。明膠酶活性鑒定為脫色后明亮(lightly)染色或清楚的帶。
結(jié)果在圖11中顯示。顯示的是兩個(gè)獨(dú)立實(shí)驗(yàn)中的一個(gè)代表性酶譜。倍數(shù)改變代表VEGF(1-109)-，VEGF(1-109)變體-或P1GF-處理組與載體處理(PBS)對(duì)照組的相對(duì)帶密度。與LK-VRB-2s*相反，當(dāng)與天然VEGF(1-109)或P1GF的活性相比時(shí)，該試驗(yàn)中的Flt-sel具有完全活性(圖11)。
實(shí)施例10MAP激酶的激活進(jìn)行試驗(yàn)以確定天然VEGF，KDR-選擇性VEGF變體，或Flt-選擇性VEGF變體是否能介導(dǎo)促有絲分裂信號(hào)傳導(dǎo)。
第4-7代HUVEC細(xì)胞(Cell Systems，Kirkland，WA)在明膠包被板上含10％胎牛血清和生長(zhǎng)因子的Cell Systems完全培養(yǎng)基(AZ0-500)中生長(zhǎng)并在0.2％血清中饑餓培養(yǎng)14小時(shí)使其休眠。休眠的HUVEC細(xì)胞保持未處理或用天然VEGF(1-165)或VEGF變體(含有全長(zhǎng)165序列并含有上面實(shí)施例8中對(duì)“短形式”(1-109)Flt-sel所述的丙氨酸取代I43A/I46A/Q79A/I83A的Flt-1選擇性變體；或稱為L(zhǎng)K-VRB-2f(見實(shí)施例1；表2)的KDR-選擇性變體(也含有全長(zhǎng)165序列))(以50ng/ml或10ng/ml的濃度)刺激5分鐘。天然VEGF(1-165)和VEGF變體均在大腸桿菌中表達(dá)并按Keyt等，生物學(xué)化學(xué)雜志，2715638-5646(1996)所述純化。然后在含有0.1mM正釩酸鈉，5mM對(duì)硝基苯磷酸，10mM氟化鈉，0.5微摩爾岡田酸和蛋白酶抑制劑混合物(Roche MB1836145)的0.5-1ml則PA緩沖液中裂解HUVEC細(xì)胞。然后進(jìn)行Western印跡分析，使用抗磷酸ERK抗血清(Promega)探測(cè)磷酸化ERK1或ERK2。
KDR選擇性VEGF變體，LK-VRB-2f引起的激活觸發(fā)了HUVEC細(xì)胞中ERK1和ERK2的磷酸化(圖12A)。磷酸化程度與使用天然VEGF(1-165)獲得的結(jié)果不易區(qū)別。Flt-1選擇性VEGF變體(以最高濃度使用)導(dǎo)致幾乎檢測(cè)不到ERK2的磷酸化。在該研究中使用的同型二聚體VEGF變體預(yù)期不能促進(jìn)受體異二聚體的形成。因此Flt-1不會(huì)導(dǎo)致MAP激酶的激活。
以前已報(bào)道了VEGF可刺激應(yīng)激激活的p38 MAP激酶[Rousseau等，癌基因，152169-2177(1997)；Yu等，細(xì)胞生理學(xué)雜志，178235-246(1999)]。為了分析所涉及的VEGF受體，用天然VEGF(1-165)，F(xiàn)lt-1選擇性變體，或LK-VRB-2f(上述)刺激后檢測(cè)p38的磷酸化狀態(tài)。
第4-7代HUVEC細(xì)胞(Cell Systems，Kirkland，WA)在明膠包被板上含10％胎牛血清和生長(zhǎng)因子的Cell Systems完全培養(yǎng)基(AZ0-500)中生長(zhǎng)并在0.2％血清中饑餓培養(yǎng)14小時(shí)使其休眠。休眠的HUVEC細(xì)胞保持未處理或用天然VEGF(1-165)或VEGF變體(Flt-sel(全長(zhǎng)165形式)或LK-VRB-2f；兩者在上文中用于ERK1和ERK2試驗(yàn))(以50ng/ml或10ng/ml的濃度)刺激5分鐘。然后在含有0.1mM正釩酸鈉，5mM對(duì)硝基苯磷酸，10mM氟化鈉，0.5微摩爾岡田酸和蛋白酶抑制劑混合物(Roche MB1836145)的0.5-1mlRIPA緩沖液中裂解細(xì)胞。使用抗磷酸p38特異性抗血清(NEB)評(píng)估p38應(yīng)激激活的MAP激酶的磷酸化狀態(tài)。
圖12B表明KDR選擇性VEGF變體能刺激p38磷酸化。
實(shí)施例 11KDR刺激PI 3’-激酶和PLC-γ磷酸化以前在VEGF信號(hào)傳導(dǎo)中涉及PLC-γ磷酸化和激活。已報(bào)道PLC-γ與兩種KDR均結(jié)合[Dougher等，癌基因，181619-1627(1999)；Cunningham等，生物化學(xué)和生物物理學(xué)研究通訊，240635-639(1997)]和Flt-1[Seetharam等，癌基因，10135-147(1995)；Sawano等，生物化學(xué)和生物物理學(xué)研究通訊，238487-491(1997)；Ito等，生物學(xué)化學(xué)雜志，27323410-23418(1998)]。
為了確定哪種(些)VEGF受體與原代內(nèi)皮細(xì)胞中的PLC-γ激活相關(guān)，用天然VEGF或VEGF受體-選擇性變體處理HUVEC細(xì)胞并在免疫沉淀后評(píng)估PLC-γ的磷酸化。
第4-7代HUVEC細(xì)胞(Cell Systems，Kirkland，WA)在明膠包被板上含10％胎牛血清和生長(zhǎng)因子的Cell Systems完全培養(yǎng)基(AZ0-500)中生長(zhǎng)并在0.2％血清中饑餓培養(yǎng)14小時(shí)使其休眠。休眠的HUVEC細(xì)胞保持未處理或用天然VEGF(1-165)或VEGF變體(Flt-sel(全長(zhǎng)165形式)或LK-VRB-2f；上面實(shí)施例10中所述)(以20ng/ml的濃度)刺激5分鐘。然后在0.5-1ml含有0.1mM正釩酸鈉，5mM對(duì)硝基苯磷酸，10mM氟化鈉，0.5微摩爾岡田酸和蛋白酶抑制劑混合物(Roche MB1836145)的RIPA緩沖液中裂解細(xì)胞。然后使用單克隆抗體(Upstate Biotechnology)從全細(xì)胞裂解產(chǎn)物中免疫沉淀PLC-γ并分析酪氨酸磷酸化作用(圖13A)或用抗p85 PI3’-激酶的單克隆抗體(購(gòu)自轉(zhuǎn)導(dǎo)實(shí)驗(yàn)室(P13020)和新標(biāo)記(MS424-P))免疫沉淀裂解產(chǎn)物并使用磷酸酪氨酸抗體PY20或E120H(轉(zhuǎn)導(dǎo)實(shí)驗(yàn)室)檢驗(yàn)磷酸酪氨酸(圖13B)。按下述進(jìn)行免疫沉淀。在50mMHEPESpH7.2，0.1％TX-100，150mMNaCl和1mg/ml卵清蛋白中封閉蛋白質(zhì)A/G珠(Pierce)的非特異性蛋白質(zhì)結(jié)合30分鐘。在相同緩沖液中4℃下顛倒旋轉(zhuǎn)使抗體預(yù)偶聯(lián)并在裂解緩沖液中洗滌珠3次。將珠加入裂解物中并旋轉(zhuǎn)過(guò)夜。依次在50mM Tis pH7.6，150mM NaCl，1％TX-100，1mM CaCl2；50mM Tris pH7.6，500mM NaCl，0.1％TX-100，1mM CaCl2和50mM Tris pH7.6，150mM NaCl，0.05％TX-100，1mM CaCl2中洗滌珠子。然后將珠子重懸于2X樣品緩沖液中并煮沸。將上清直接上樣到4-12％Tris-甘氨酸梯度凝膠(Novex)上。
如圖13A所示，天然VEGF和KDR選擇性VEGF變體能刺激PLC-γ磷酸化到相似程度。Flt-1選擇性VEGF變體相對(duì)于背景水平不能增加PLC-γ的磷酸化，這不支持Flt-1在HUVEC細(xì)胞的PLC-γ激活中起作用的論點(diǎn)。
已證實(shí)在一些細(xì)胞類型中PI3’-激酶通過(guò)激活A(yù)kt來(lái)傳遞存活信號(hào)[Marte等，生物化學(xué)科學(xué)動(dòng)態(tài)，22355-358(1997)]。VEGF也起內(nèi)皮細(xì)胞存活因子的作用且該信號(hào)需要PI3’-激酶和Akt激酶活性[Gerber等，生物學(xué)化學(xué)雜志，27330366-30343(1998)]。在各種細(xì)胞類型中，已證實(shí)PI3’-激酶活性與生長(zhǎng)因子刺激后細(xì)胞骨架的改變及細(xì)胞遷移有關(guān)[Wennstrom等，當(dāng)今生物學(xué)，4385-393(1994)]。因此，免疫沉淀后評(píng)價(jià)VEGF蛋白質(zhì)引起PI3’-激酶的p85調(diào)節(jié)亞基磷酸化的能力。僅天然VEGF和KDR-選擇性VEGF變體能引起PI-3’激酶調(diào)節(jié)亞基的磷酸化，如圖13B所示。
實(shí)施例 12對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞遷移的影響VEGF對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞的作用的一個(gè)核心方面是其用作化學(xué)引誘物并刺激內(nèi)皮細(xì)胞遷移的能力。在如下改良的Boyden室試驗(yàn)中分析HUVEC細(xì)胞遷移。
用1型膠原(VITROGEN，COHESION)包被Falcon 8.0微米濾膜插條(Falcon3097)。HUVEC(從Cell Systems公司獲得，小于8代)在含10％FCS的Cell Systems完全培養(yǎng)基(4ZO-500)中生長(zhǎng)。細(xì)胞用胰酶消化并轉(zhuǎn)移到含0.1％BSA的EBM(內(nèi)皮細(xì)胞基礎(chǔ)培養(yǎng)基，Clonetics)中用于試驗(yàn)。以每上層室中5×104個(gè)細(xì)胞進(jìn)行鋪板。生長(zhǎng)因子(VEGF(1-165)；F1t-1選擇性變體；LK-VRB-2f；上面實(shí)施例10所述)放在下層室中(以圖14A和14B所示的濃度)，抑制劑放在上層室中。試驗(yàn)按常規(guī)在37℃下進(jìn)行18小時(shí)。對(duì)于LY294002抑制劑實(shí)驗(yàn)，在加入抑制劑之前使細(xì)胞附著30分鐘。加入抑制劑20分鐘后，向底孔中加入VEGF且使試驗(yàn)僅進(jìn)行4小時(shí)以避免出現(xiàn)與用LY294002(購(gòu)自Biomol)處理這些原代細(xì)胞相關(guān)的細(xì)胞凋亡。
經(jīng)過(guò)用聚氨基甲酸酯拭子從膜的上側(cè)刮取細(xì)胞，然后將膜的底側(cè)上剩下的細(xì)胞用甲醇固定。用Yo-Pro碘化物核染料(分子探針)染色細(xì)胞并使用Image-Pro細(xì)胞識(shí)別程序在低能熒光下計(jì)數(shù)。
圖14A顯示了在改良的Boyden室試驗(yàn)中受體選擇性VEGF變體對(duì)HUVEC細(xì)胞(在所示濃度)的影響(實(shí)驗(yàn)進(jìn)行3份；誤差線段代表標(biāo)準(zhǔn)誤差)。在幾個(gè)獨(dú)立的實(shí)驗(yàn)中，天然VEGF引起HUVEC細(xì)胞遷移增加4-5倍。在HUVEC細(xì)胞遷移的促進(jìn)方面KDR-選擇性VEGF變體與天然VEGF一樣有效。Flt-1選擇性VEGF變體相對(duì)于背景水平不能增加細(xì)胞遷移。
為了確定PI 3-激酶對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞遷移的貢獻(xiàn)，在使細(xì)胞附著到膜上后向試驗(yàn)液中加入不同濃度的抑制劑LY 294002。由于PI3’-激酶抑制對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞存活的有害影響，只進(jìn)行短期試驗(yàn)(如上所述)。圖14B顯示了在其最高濃度下，LY294002導(dǎo)致對(duì)HUVEC細(xì)胞遷移的56％抑制。因此，PI3’-激酶活性明顯影響內(nèi)皮細(xì)胞遷移。
實(shí)施例 13角膜囊血管形成試驗(yàn)按Polverini等，酶學(xué)方法，198440-450(1991)所述經(jīng)過(guò)下述改良后進(jìn)行試驗(yàn)。使用氣體(異氟醚)/可注射的氯胺酮(80mg/kg)/甲苯噻嗪(15mg/kg)組合麻醉Sprague-Dawley大鼠。輕輕凸出眼睛并使用無(wú)損傷鑷子固定。用#15刀片在角膜中央略下面作出一個(gè)1.5mm的切口。使用微型藥勺(ST80017，ASSI)從眼睛基質(zhì)到外眼角對(duì)切口進(jìn)行仔細(xì)鈍解剖。將含有生長(zhǎng)因子(200ng)hydron包裹的片劑(2mm×2mm)(VEGF(1-165)；Flt-1選擇性變體；LK-VRB-2f；(上面實(shí)施例10所述)或P1GF(R&D系統(tǒng)))，或者甲基纖維素和硫糖鋁(100ug)(對(duì)照)的插入囊的基部。手術(shù)后，用慶大霉素軟膏覆蓋眼睛。6天后，用高分子量的FITC-葡聚糖注射動(dòng)物并使其安樂死以允許觀察其脈管系統(tǒng)。從摘出的眼球制備角膜整體封片并使用計(jì)算機(jī)輔助成像分析(Image-ProPlus)完成新血管區(qū)的測(cè)量。
如圖15A所示，KDR選擇性VEGF變體與天然VEGF在誘導(dǎo)角膜血管形成中一樣有效。盡管Flt-1選擇性VEGF變體偶爾誘導(dǎo)邊緣血管形成(圖15A)，對(duì)一些動(dòng)物中血管形成表面區(qū)域的分析顯示Flt-1選擇性VEGF變體相對(duì)于對(duì)照水平不能刺激血管形成。P1GF僅產(chǎn)生邊緣反應(yīng)(圖15B)。因此，目前相信KDR而不是Flt-1能促進(jìn)體內(nèi)血管形成。
上面所寫的說(shuō)明書認(rèn)為足以使得本領(lǐng)域的技術(shù)人員能夠?qū)崿F(xiàn)本發(fā)明。除了本文所示和所述外，對(duì)本發(fā)明的各種修改對(duì)于本領(lǐng)域的技術(shù)人員而言，根據(jù)上面說(shuō)明書是顯而易見的且落在所附權(quán)利要求書的范圍內(nèi)。
權(quán)利要求
1.一種VEGF變體多肽，它在天然VEGF的氨基酸序列中含有一個(gè)或多個(gè)氨基酸突變且對(duì)KDR受體具有選擇性結(jié)合親和力。
2.權(quán)利要求1的VEGF變體，其中所述的一個(gè)或多個(gè)氨基酸突變包括在天然VEGF序列的第17至25處或之間的一個(gè)或多個(gè)氨基酸取代。
3.權(quán)利要求1的VEGF變體，其中所述的一個(gè)或多個(gè)氨基酸突變包括在天然VEGF序列的第63至66處或之間的一個(gè)或多個(gè)氨基酸取代。
4.權(quán)利要求1的VEGF變體，其中所述的多肽包括至少4個(gè)不同的氨基酸突變且4個(gè)所述的氨基酸突變是下列氨基酸取代M18E，Y21L，Q22R，Y25S。
5.權(quán)利要求1的VEGF變體，其中所述的多肽包括至少3個(gè)不同的氨基酸突變且3個(gè)所述的氨基酸突變是下列氨基酸取代D63S，G65M，L66R。
6.權(quán)利要求1的VEGF變體，其中所述的多肽包括至少4個(gè)不同的氨基酸突變且4個(gè)所述的氨基酸突變是下列氨基酸取代M18E，D63S，G65M，L66R。
7.權(quán)利要求1的VEGF變體，其中所述的多肽包括至少4個(gè)不同的氨基酸突變且4個(gè)所述的氨基酸突變是下列氨基酸取代Y21L，D63S，G65M，L66R。
8.一種分離的核酸，其含有編碼權(quán)利要求1的VEGF變體的DNA序列。
9.權(quán)利要求8的分離的核酸，其中所述的DNA序列編碼權(quán)利要求4的VEGF變體。
10.權(quán)利要求8的分離的核酸，其中所述的DNA序列編碼權(quán)利要求5的VEGF變體。
11.權(quán)利要求8的分離的核酸，其中所述的DNA序列編碼權(quán)利要求6的VEGF變體。
12.權(quán)利要求8的分離的核酸，其中所述的DNA序列編碼權(quán)利要求7的VEGF變體。
13.含有權(quán)利要求8的核酸的載體。
14.含有權(quán)利要求13的載體的宿主細(xì)胞。
15.一種組合物，它含有權(quán)利要求1的VEGF變體和一種載體。
16.權(quán)利要求15的組合物，其中所述的載體是一種藥用上可接受的載體。
17.一種檢測(cè)KDR受體的測(cè)定法，包括將細(xì)胞或組織與權(quán)利要求1的VEGF變體接觸并檢測(cè)所述VEGF變體與可能存在于所述細(xì)胞或組織中或其上的KDR受體的結(jié)合。
18.一種刺激血管發(fā)生或血管形成的方法，包括將表達(dá)KDR受體的哺乳動(dòng)物細(xì)胞與有效量的權(quán)利要求1的VEGF變體接觸。
19.一種制造的商品，包括裝有權(quán)利要求15的組合物的一種容器和在所述容器上的提供體外或體內(nèi)使用所述組合物的說(shuō)明的標(biāo)簽。
全文摘要
本發(fā)明提供了在天然VEGF序列上具有至少單個(gè)氨基酸突變且對(duì)KDR受體或FLT－1受體具有選擇性結(jié)合親和力的VEGF變體。還提供了制備VEGF變體的方法和使用VEGF變體的方法。
文檔編號(hào)A61P9/00GK1352684SQ00808101
公開日2002年6月5日 申請(qǐng)日期2000年4月10日 優(yōu)先權(quán)日1999年4月16日
發(fā)明者布賴恩·坎寧安, 亞伯拉罕·德沃斯, 李冰 申請(qǐng)人:杰南技術(shù)公司