專利名稱：應(yīng)用母牛分枝桿菌治療免疫介導(dǎo)疾病的方法和組合物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明關(guān)于免疫介導(dǎo)失調(diào)的治療方法。在特定實(shí)施方案中，本發(fā)明關(guān)于應(yīng)用含制于母牛分枝桿菌(Mycobacterium vaccae)、結(jié)核分枝桿菌(Mycobacterium tuberculosis)和恥垢分枝桿菌(Mycobacteriumsmegmatis)成分的組合物，來治療呼吸系統(tǒng)的免疫介導(dǎo)失調(diào)，如肉樣瘤病、氣喘和肺癌，來治療過敏性失調(diào)，如特異反應(yīng)性皮炎和濕疹，來治療得益于嗜曙紅細(xì)胞增多減緩的失調(diào)，來治療和預(yù)防傳染病，如結(jié)核分枝桿菌或貪食分枝桿菌(Mycobacterium avium)感染，并來治療[動(dòng)脈]粥樣硬化、高膽固醇血癥和其他可由調(diào)節(jié)IL-10產(chǎn)生改善的失調(diào)。
背景技術(shù)：
結(jié)核病是由結(jié)核分枝桿菌感染引起的慢性傳染病。它在發(fā)展中國家是一種主要疾病，在發(fā)達(dá)地區(qū)問題也愈益嚴(yán)重，每年約八百萬人感染，三百萬人死亡。盡管感染可在相當(dāng)長時(shí)期內(nèi)無癥狀，該病常表征為肺慢性炎癥，導(dǎo)致發(fā)燒和呼吸系統(tǒng)癥狀。若不救治，可致顯著發(fā)病和死亡。
盡管一般可用大量抗生素治療控制結(jié)核病，該治療尚不足以防止疾病傳播。受感染的個(gè)體可在一段時(shí)期內(nèi)無癥狀但具傳染性。此外，盡管服從療程很關(guān)鍵，卻難以監(jiān)控病人行為。一些病人不完成療程，可導(dǎo)致無效治療和抗藥分枝桿菌的發(fā)展。
抑制結(jié)核病傳播需要有效的疫苗接種和準(zhǔn)確的早期診斷。目前，接種活菌是誘導(dǎo)保護(hù)性免疫的最有效方法。最常用的分枝桿菌是卡介苗(BCG)為牛分枝桿菌(Mycobacterium bovis)的無毒株。然而，BCG的安全性和功效性是有爭議的，有些國家，如美國，不向公眾接種。結(jié)核分枝桿菌診斷常用皮試，這包括結(jié)核菌素PPD(蛋白純化衍生物)的皮內(nèi)注射?？乖禺惖腡細(xì)胞反應(yīng)導(dǎo)致注射處于注射后48-72小時(shí)可測量的硬結(jié)，從而指示分枝桿菌抗原。然而，該測試的靈敏性和特異性卻是問題，且接種BCG的個(gè)體能不能區(qū)別于受感染的個(gè)體。
用于結(jié)核病，還有麻風(fēng)免疫治療的較不為所知的分枝桿菌是母牛分枝桿菌，它對人無致病性。然而，與BCG相比，關(guān)于母牛分枝桿菌功效的信息較少，且它未廣泛用于公眾接種。據(jù)信，牛分枝桿菌BCG和母牛分枝桿菌含可由結(jié)核分枝桿菌感染個(gè)體的免疫系統(tǒng)所識別的抗原組合物。
若干專利和其他出版物公開了由服用分枝桿菌，包括母牛分枝桿菌或特定的分枝桿菌片段對各種情況的治療。美國專利4716038公開了由服用包括母牛分枝桿菌的分枝桿菌來診斷、接種和治療包括關(guān)節(jié)炎病的各類型自身免疫疾病。美國專利4724144公開了含來自母牛分枝桿菌的抗原物質(zhì)的免疫治療劑來治療分枝桿菌病，尤其是結(jié)核病和麻風(fēng)，并作為化療佐劑。國際專利出版WO 91/01751公開了用來自母牛分枝桿菌的抗原和/或免疫調(diào)節(jié)物質(zhì)作為免疫預(yù)防劑來延遲或/和防止AIDS發(fā)病。國際專利出版WO94/06466公開了來自母牛分枝桿菌的抗原和/或免疫調(diào)節(jié)物質(zhì)用于治療HIV感染，伴或不伴AIDS，伴或不伴結(jié)核病。
美國專利5599545公開了應(yīng)用分枝桿菌，特別是整個(gè)、失活的母牛分枝桿菌作為與非內(nèi)源于母牛分枝桿菌的抗原服用的佐劑。該專利推理佐劑的利效可以是由于熱體克蛋白65(hsp65)。國際專利公開WO 92/08484披露了來自母牛分枝桿菌的抗原和/或免疫調(diào)節(jié)物質(zhì)用于治療眼色素層炎。國際專利公開WO 93/16727披露了來自母牛分枝桿菌的抗原和/或免疫調(diào)節(jié)物質(zhì)用于治療與由感染引發(fā)的自身免疫反應(yīng)關(guān)聯(lián)的精神疾病。國際專利公開WO 95/26742披露了來自母牛分枝桿菌的抗原和/或免疫調(diào)節(jié)物質(zhì)用于延遲或預(yù)防腫瘤生長或擴(kuò)散。國際專利出版WO 91/02542公開了滅活的母牛分枝桿菌用于治療慢性炎癥失調(diào)，其中病人顯示出IL-6和/或TNF的異常高水平釋放或病人IgG顯示出異常高比例的agalactosyl IgG。該出版物中提及的失調(diào)有牛皮癬、類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎。分枝桿菌病、Crohn’s病、原發(fā)膽硬變、肉樣瘤病、潰瘍性結(jié)腸炎、系統(tǒng)性紅斑狼瘡、多發(fā)性硬化、Guillain-Barre癥、原發(fā)糖尿病及移植排斥的某些方面。
母牛分枝桿菌是已知分枝桿菌中惟一熱制備物保持疫苗和免疫治療特性的。如，牛分枝桿菌BCG疫苗，用于抗結(jié)核病接種，采用活件。熱殺傷的牛分枝桿菌BCG和結(jié)核分枝桿菌當(dāng)用于疫苗時(shí)不具保護(hù)性質(zhì)。已從一些分枝桿菌中分離出一些具佐劑性質(zhì)的組合物。這些佐劑的效果基本上是刺激特定免疫反應(yīng)機(jī)制抗他物種抗原。
已從分枝桿菌中分離出兩大類具佐劑性質(zhì)的組合物。第一類是水溶蠟D餾分(White等，Immunology 154，1958；美國專利4036953)。第二類是述于美國專利3956481和4036953的胞壁酰二肽基質(zhì)(約等摩爾量的N-乙酰葡糖胺和N-乙二醇胞壁酸)。這些組合物在其組分的以下方面不同于本發(fā)明的去脂去糖脂母牛分枝桿菌(DD-母牛分枝桿菌)1.它們是水溶劑，而DD-母牛分枝桿菌不溶于水溶液。
2.它們含一些分枝桿菌細(xì)胞壁單元的小寡聚物，或由各種溶劑提取自細(xì)菌，或由酶消化自細(xì)胞壁。對比地，DD-母牛分枝桿菌含經(jīng)加工的分枝桿菌細(xì)胞。
3.以蛋白水解酶消化去除其制備物中的全部蛋白。其制備物的惟一要素是細(xì)胞壁肽聚糖結(jié)構(gòu)成分，具體為丙氨酸、谷氨酸、二氨基庚二酸、N-乙酰葡糖胺和N-乙二醇胞壁酸。對比地，DD-母牛分枝桿菌含50％(質(zhì)量比)蛋白，包括一些不同的蛋白種類。
肉樣瘤病病因未知，表征為影響身體許多器官尤其是肺、淋巴結(jié)和肝的肉芽腫炎癥。肉樣肉芽瘤含單核吞噬細(xì)胞，上皮樣細(xì)胞和巨大細(xì)胞居中，及T淋巴細(xì)胞。CD4T淋巴細(xì)胞與上皮樣細(xì)胞緊密聯(lián)結(jié)，而CD4和CD8T淋巴細(xì)胞集于周邊。肉樣瘤病的特征免疫異常包括外周血和支氣管肺泡灌洗高球蛋白血及皮膚對結(jié)核菌素和其他類似抗原，如念珠菌屬和流行性腮腺炎，“遲滯型”過敏反應(yīng)的抑制。外周血淋巴細(xì)胞數(shù)目減少，外周血CD4∶CD8比例壓至約1-1.5∶1.這些并非意味著一般免疫缺陷，都是“局部于”疾病活動(dòng)場所的免疫活性升高的結(jié)果。在肺肉樣瘤病病人，支氣管肺泡灌洗恢復(fù)的細(xì)胞總數(shù)增加五至十倍，且淋巴細(xì)胞比例由正常小于10％-14％增至15％-50％。90％多恢復(fù)的淋巴細(xì)胞是T淋巴細(xì)胞，且報(bào)道CD4∶CD8比例由正常對照值1.8∶1增至10.5∶1。T淋巴細(xì)胞主要為Th1類，產(chǎn)生IFN-γ和IL-2細(xì)胞因子，而非Th2類。治療后，肉樣肺中Th1淋巴細(xì)胞增長得到矯正。
肉樣瘤病在幾乎所有病例中都牽涉肺。甚至當(dāng)病變主要見于其他器官時(shí)，常有亞臨床的肺感染。盡管一些肉樣瘤病自動(dòng)消退，約50％病人留下至少輕度的永久性器官功能異常。嚴(yán)重時(shí)，肺纖維化發(fā)展并進(jìn)為肺衰竭而需植肺。治療肉樣瘤病的主成分是皮質(zhì)類固醇。初始對皮質(zhì)類固醇有反應(yīng)的病人常復(fù)發(fā)，并需其他免疫抑制藥物治療，如氨甲蝶呤或環(huán)孢菌素。
氣喘是常見病，高發(fā)于發(fā)達(dá)地區(qū)。氣喘表征為氣管支氣管樹對各種刺激反應(yīng)性增強(qiáng)，原發(fā)生理干擾為可逆性氣流受限，可為自發(fā)的或藥物相關(guān)的，病理hallmark為氣道炎癥。臨床上，氣喘可分為外源型和內(nèi)源型。
外源氣喘具可鑒別的沉淀物，可認(rèn)為是特異反應(yīng)性的，職業(yè)性的和藥物誘發(fā)的。特異反應(yīng)性氣喘與產(chǎn)生特異免疫球蛋白E(IgE)的Th2型免疫反應(yīng)增強(qiáng)有關(guān)，對常見空氣過每原和/或特異反應(yīng)性癥狀皮試陽性。據(jù)癥狀的發(fā)病時(shí)季，可進(jìn)一步分為季節(jié)性和多年性。外源氣喘氣流梗阻是由于氣道炎癥引發(fā)的非特異性支氣管過反應(yīng)性。炎癥由包括肥大細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞和淋巴細(xì)胞的各種炎癥細(xì)胞釋放的化學(xué)物質(zhì)所介導(dǎo)。這些介導(dǎo)物的行為導(dǎo)致血管通透，粘液分泌和支氣管平滑肌縊縮。在特異反應(yīng)性氣喘，產(chǎn)生氣道炎癥的免疫反應(yīng)是由分泌IL-4、IL-5和IL-10的Th2類T細(xì)胞引起的。已證實(shí)特異反應(yīng)性氣喘肺的淋巴細(xì)胞激活時(shí)產(chǎn)生IL-4和IL-5。IL-4和IL-5都是Th2類的細(xì)胞因子，并為氣喘中IgE產(chǎn)生和嗜酸性粒細(xì)胞加入所需。職業(yè)性氣喘可與IgE對蛋白半抗原的發(fā)展有關(guān)，如在塑料工人為酸酐，和西部紅松誘發(fā)氣喘的大側(cè)柏酸，或與非IgE相關(guān)的機(jī)制，如見于甲苯二異氰酸誘發(fā)氣喘的。藥物誘發(fā)氣喘可見于服用阿斯匹林或其他非類固醇抗炎藥后；常見于有其他特征如鼻polyposis和鼻竇炎的特定病人群。報(bào)道內(nèi)源或原因不明的氣喘于上呼吸道感染后發(fā)展，但在中年或老年人中可從新發(fā)生，在此人群中治療比外源氣喘更難。
理想地，氣喘可由回避誘因過敏原來預(yù)防，但這并非總是可能的，誘因過敏原也非總易于鑒別。醫(yī)療氣喘基于應(yīng)用皮質(zhì)類固醇和支氣管舒張藥來緩減炎癥并回復(fù)氣路梗阻。對慢性氣喘，以皮質(zhì)類固醇治療導(dǎo)致不可接受的不利副反應(yīng)。
與氣喘免疫異常類似的另一失調(diào)為過敏性鼻炎。過敏性鼻炎是常見病，估計(jì)影響至少10％人群。過敏性鼻炎可以是對花粉的變態(tài)反應(yīng)引發(fā)的季節(jié)性的(花粉氣喘)。非季節(jié)性或多年鼻炎由對如家居塵螨或動(dòng)物皮屑的抗原的變態(tài)反應(yīng)引發(fā)。
過敏性鼻炎的異常免疫反應(yīng)表征為特異于過敏原的IgE抗體的過量生產(chǎn)。炎癥反應(yīng)發(fā)生于鼻粘膜，而非如氣喘在更下的氣道。如氣喘，病變組織的局部嗜酸性粒細(xì)胞是過敏性鼻炎的主要特征。炎癥的結(jié)果，病人發(fā)展噴嚏，流涕和充血。更嚴(yán)重時(shí)，炎癥延及眼(結(jié)膜炎)，喉和外耳。盡管不威脅生命，過敏性鼻炎可非常失能，阻礙正?；顒?dòng)，干擾工作能力。目前治療用抗組胺劑，鼻疏血?jiǎng)┖?，如治氣喘的sodium cromoglycate和皮質(zhì)類固醇。
特異反應(yīng)性皮炎，又稱特異反應(yīng)性濕疹，是慢性復(fù)發(fā)的瘙癢炎癥皮膚病，常發(fā)于有各種過敏失調(diào)遺傳史的家庭，如過敏性鼻炎和氣喘。特異反應(yīng)性皮炎正逐漸流行，至約15％人群在童年期患過特異反應(yīng)性皮炎。主要癥狀為皮膚干燥和主要位于面、頸、屈肌側(cè)和四肢彎曲處的皮炎(濕疹)，伴有嚴(yán)重瘙癢。典型發(fā)作于一生中的頭五年。在許多病人，該皮膚病于童年期消失，但癥狀卻可持續(xù)至成年。進(jìn)一步，50％的病人發(fā)展氣喘，約75％的病人發(fā)展過敏性鼻炎。這是世界范圍內(nèi)最常見的皮炎之一。
過敏原在特異反應(yīng)性皮炎中作用重要。約80％的病人具對各種食物和吸入過敏源的IgE抗體，大部分嚴(yán)重特異反應(yīng)性皮炎病人血清IgE水平升高，特別是如果他們還患其他特異反應(yīng)性病。此外，血中嗜酸性粒細(xì)胞循環(huán)水平通常升高。在特異反應(yīng)性皮炎，病變皮膚的真皮滲潤巨噬細(xì)胞、T細(xì)胞和嗜酸性粒細(xì)胞，在慢性病變胞大細(xì)胞數(shù)目增多。急性病變有顯著多的細(xì)胞表達(dá)細(xì)胞因子IL-4和IL-5和IL-13，意味Th2類T細(xì)胞的優(yōu)先累積。此外，特異反應(yīng)性皮炎患者的循環(huán)T細(xì)胞比正常人產(chǎn)生更多的IL-4和IL-5。Th2細(xì)胞因子在啟動(dòng)過敏反應(yīng)中起重要作用。IL-4作用是將抗體生產(chǎn)調(diào)至IgE同型，發(fā)展Th2細(xì)胞和誘導(dǎo)募集嗜酸性粒細(xì)胞的內(nèi)皮細(xì)胞上的粘著分子。IL-5對于嗜酸性粒細(xì)胞的發(fā)育和分化很重要。
與Th2細(xì)胞不同，Th1細(xì)胞產(chǎn)生IFNγ和IL-2。慢性特異反應(yīng)性皮膚病變中的Th1細(xì)胞已經(jīng)鑒定。因?yàn)镮L-2對T細(xì)胞生長很重要并有致異常皮層加厚之效應(yīng)，Th1細(xì)胞也可參與特異反應(yīng)性皮炎的病理。以卵清蛋白重復(fù)上表皮(epicutaneous)致敏可致小鼠特異反應(yīng)性皮炎似病變。這些小鼠的引流淋巴結(jié)T細(xì)胞受體外卵清蛋白刺激時(shí)分泌IL-4而不是IFN-γ。
過敏性接觸皮炎是常見的皮膚非傳染性炎癥失調(diào)。在接觸皮炎，身體對特殊抗原敏感化時(shí)才發(fā)展出免疫反應(yīng)。皮膚隨后暴露于抗原和T細(xì)胞識別這些抗原，導(dǎo)致釋放各種細(xì)胞因子，T細(xì)胞增殖和聚集，并終致皮炎(濕疹)。
過敏性接觸皮炎病變中只有一小部分T細(xì)胞特異于相關(guān)抗原。激活的T細(xì)胞可能移至炎癥區(qū)而與抗原特異性無關(guān)。遲滯型過敏性只能由共享MHC類II抗原的T細(xì)胞(CD4+細(xì)胞)轉(zhuǎn)移。對接觸過敏原的“反應(yīng)”可由共享MHC類I(CD8+細(xì)胞)或類II(CD4+細(xì)胞)分子的T細(xì)胞轉(zhuǎn)移(Sunday等，J.Immunol.1251601-1605，1980)。角質(zhì)形成細(xì)胞可產(chǎn)生能助抗原呈T細(xì)胞的白細(xì)胞介素-1。表面抗原細(xì)胞間粘著分子-1(ICAM-1)表達(dá)可在角質(zhì)形成細(xì)胞和內(nèi)皮上由細(xì)胞因子腫瘤壞死因子(INF)和干擾素-γ(IFN-γ)誘導(dǎo)。
若能鑒別病因，單獨(dú)移除即將治愈過敏性接觸皮炎。外用皮質(zhì)類固醇對炎癥有用。已在遲滯型超敏性觀察到環(huán)孢菌素對體外引發(fā)T細(xì)胞促炎功能的抑制效果(Shidani等，Eur.J.Immunol.14314-318，1984)。還報(bào)道了環(huán)孢菌素對小鼠T細(xì)胞早期活化的抑制效果(Milon等，Ann.Immunol.(Inst.Pasteur)135d237-245，1984)。
肺癌是首要的癌癥致死因。肺癌發(fā)病率持續(xù)上升，世界衛(wèi)生組織估計(jì)至公元2000年每年將有二百萬新病例。肺癌廣義分為兩類小細(xì)胞肺癌(SCLC)占所有肺癌的20％-25％，和非小細(xì)胞肺癌(NSCLC)占其余75％。SCLC傾向于早期擴(kuò)散，90％患者診斷時(shí)波及(involvement)胸部呈縱隔淋巴節(jié)。SCLC以化療或化療結(jié)合放療治療。完全反應(yīng)率變化自10％至50％。對無波及(involvement)淋巴節(jié)的罕見病人，手術(shù)繼以化療可致超過60％的治愈率。NSCLC預(yù)后較悲觀，因?yàn)槎鄶?shù)病人在診斷時(shí)病情已惡化。手術(shù)移除腫瘤對極少數(shù)病人是可能的，NSCLC的五年存活率僅5％-10％。
導(dǎo)致肺癌發(fā)展的因素復(fù)雜多樣。環(huán)境和遺傳因素相互作用，致序列和增進(jìn)異常性，而導(dǎo)致不可控的細(xì)胞增殖，臨近組織入侵和向遠(yuǎn)處擴(kuò)散。肺癌患者顯示細(xì)胞介導(dǎo)的和體液免疫均受損害。放療和化療進(jìn)一步損傷病人免疫功能。已嘗試以未活化的腫瘤細(xì)胞或腫瘤抗原免疫病人來增強(qiáng)機(jī)體抗腫瘤反應(yīng)。肺癌手術(shù)后向胸腔注入卡介苗(BCG)來增強(qiáng)非特異性免疫。已嘗試由向病人提供以來自體內(nèi)的白介素-2(IL-2)處理的淋巴細(xì)胞來增強(qiáng)抗腫瘤免疫性。這些淋巴因子激活的淋巴細(xì)胞獲得殺傷腫瘤細(xì)胞的能力。目前肺癌的免疫療法仍在發(fā)展階段，其肺癌標(biāo)準(zhǔn)治療功效尚待建立。
動(dòng)脈粥樣硬化是一種動(dòng)脈壁慢性炎癥疾病，表征為脂類、巨噬細(xì)胞、T淋巴細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞和細(xì)胞外基質(zhì)累積?？寡准?xì)胞因子產(chǎn)生于炎癥反應(yīng)，并據(jù)信可調(diào)節(jié)炎癥過程。白介素-10(IL-10)由Th2淋巴細(xì)胞和巨噬細(xì)胞分泌，已知具抗炎性。Mallat等近來報(bào)道的研究顯示IL-10對小鼠粥樣硬化病變的形成和穩(wěn)定性具保護(hù)效果(Circ.Res.85e17-24，1999)。這些研究暗示可采用增加IL-10產(chǎn)生的因素來調(diào)節(jié)動(dòng)脈粥樣硬化的程度和/或輕重。
顯示服用IL-10有利的其他失調(diào)包括高膽固醇血癥(見美國專利5945097)；細(xì)菌感染，包括革蘭氏陰性和/或革蘭氏陽性菌感染(見美國專利5837293和5837232)；和胰島素依賴性糖尿病(見美國專利5827513)。此外，美國專利5871725公布了由向病人施用IL-10激活的外周血單核細(xì)胞(PBMC)來治療癌癥的一種方法。
發(fā)明概述簡要地，本發(fā)明提供組合物和方法來預(yù)防和治療免疫介導(dǎo)失調(diào)，包括呼吸系統(tǒng)失調(diào)(如結(jié)核分枝桿菌或貪食分枝桿菌等的分枝桿菌感染，肉樣瘤病，氣喘，過敏性鼻炎和肺癌)，過敏性失調(diào)如特異反應(yīng)性皮炎和濕疹，得益于嗜酸性粒細(xì)胞減少的疾病，和由調(diào)節(jié)IL-10產(chǎn)生可改善的失調(diào)(如動(dòng)脈粥樣硬化，高膽固醇血癥，癌癥，細(xì)菌感染和胰島素依賴性糖尿病)。
首先，提供的組合物包括去脂去糖脂的分枝桿菌細(xì)胞。在特定實(shí)施方案中，去脂去糖脂的細(xì)胞制備于母牛分枝桿菌，結(jié)核分枝桿菌和/或恥垢分枝桿菌。
其次，本發(fā)明提供的組合物包括去脂去糖脂分枝桿菌細(xì)胞的衍生物，它選自下組經(jīng)堿水解處理的去脂去糖脂分枝桿菌細(xì)胞；經(jīng)酸水解處理的去脂去糖脂分枝桿菌細(xì)胞；經(jīng)高碘酸處理的去脂去糖脂分枝桿菌細(xì)胞；經(jīng)蛋白酶K處理的去脂去糖脂分枝桿菌細(xì)胞；經(jīng)無水氫氟酸水解處理的去脂去糖脂分枝桿菌細(xì)胞。去脂去糖脂的母牛分枝桿菌衍生物優(yōu)選地含半乳糖量小于總碳水化合物的9.7％，更優(yōu)選地小于總碳水化合物的5％，最優(yōu)選地小于總碳水化合物的3.5％。在特定實(shí)施方案中，去脂去糖脂母牛分枝桿菌衍生物葡糖胺含量高于總碳水化合物的3.7％，優(yōu)選高于總碳水化合物的5％，更優(yōu)選地高于總碳水化合物的7.5％。
又次，本發(fā)明提供方法來治療病人失調(diào)，包括呼吸系統(tǒng)失調(diào)，這些方法包括向病人施用本發(fā)明的一種組合物。在特定實(shí)施方案中，失調(diào)選自分枝桿菌感染，氣喘，肉樣瘤病，過敏性鼻炎，特異反應(yīng)性皮炎和肺癌。在一個(gè)實(shí)施方案中，這些組合物施用于導(dǎo)向或位于肺內(nèi)的氣道，優(yōu)選地經(jīng)鼻或口吸入，優(yōu)選地以氣霧劑形式施用?；蛘?，這些組合物還可由皮內(nèi)、經(jīng)皮或皮下施用。
又次，本發(fā)明提供方法，通過服用本發(fā)明的組合物來治療病人呼吸系統(tǒng)失調(diào)，其中該失調(diào)表征為呼吸系統(tǒng)組織中存在嗜酸性粒細(xì)胞。這些病的例子包括氣喘和過敏性鼻炎。相關(guān)地，本發(fā)明提供減少病人嗜酸性粒細(xì)胞的方法，這包括服用此處公開的至少一種組合物。典型地，嗜酸性粒細(xì)胞減少將變化于20％至80％。肺嗜酸性粒細(xì)胞減少百分比可于下述治療前后由測量氣管支氣管灌洗液嗜酸性粒細(xì)胞數(shù)目來確定。
又次，提供了增強(qiáng)IL-10產(chǎn)生的方法，包括服用本發(fā)明的一種組合物。如上討論，近來顯示IL-10在粥樣硬化病變形成和穩(wěn)定性中起保護(hù)作用。還顯示IL-10對治療高膽固醇血癥，癌癥，細(xì)菌感染和胰島素依賴性糖尿病有效。發(fā)明的組合物于是可用于治療這些失調(diào)。
本發(fā)明進(jìn)而提供激活αδT細(xì)胞，γδT細(xì)胞或NK細(xì)胞的方法，并由此修復(fù)病人內(nèi)皮，這些方法包括向病人施用本發(fā)明的一種組合物。
參考以下詳述和附圖，本發(fā)明的這些和其他方面將很清楚。所有公開于此的參考文獻(xiàn)因而全文引用，如同各自單獨(dú)引用。
附圖簡述

圖1示高壓滅菌母牛分枝桿菌，凍干母牛分枝桿菌，去脂去糖脂母牛分枝桿菌和母牛分枝桿菌糖脂誘導(dǎo)IL-12。
圖2比較由不同濃度熱滅活(高壓滅菌)母牛分枝桿菌，去脂去糖脂母牛分枝桿菌和母牛分枝桿菌糖脂體外刺激重度聯(lián)合免疫缺隕(SCID)小鼠脾細(xì)胞產(chǎn)生干擾素-γ。
圖3示DD-母牛分枝桿菌(Q1)和DD-母牛分枝桿菌衍生物Q2(DD-母牛分枝桿菌-KOH)，Q3(DD-母牛分枝桿菌-酸)，Q4(DD-母牛分枝桿菌-高碘酸鹽(periodate))，Q6(DD-母牛分枝桿菌-KOH-高碘酸鹽)，P5(DD-母牛分枝桿菌-KOH-酸)和P6(DD-母牛分枝桿菌-KOH-高碘酸鹽)對鼻內(nèi)接種這些組合物的小鼠中卵清蛋白誘導(dǎo)氣道嗜酸性粒細(xì)胞的抑制。對照小鼠接種PBS。
圖4示DD-母牛分枝桿菌衍生物刺激THP-1細(xì)胞產(chǎn)生IL-10。
圖5示結(jié)核分枝桿菌感染前，以熱滅活母牛分枝桿菌或去脂去糖脂母牛分枝桿菌(DD-母牛分枝桿菌)免疫小鼠的效果。
圖6示DD-母牛分枝桿菌和DD-母牛分枝桿菌-KOH的重懸浮。
圖7DD-母牛分枝桿菌(R1)和DD-母牛分枝桿菌衍生物DD-母牛分枝桿菌-KOH(R2)，DD-母牛分枝桿菌-酸(R3)，DD-母牛分枝桿菌-高碘酸鹽(R4)，DD-母牛分枝桿菌-KOH-酸(R5)和DD-母牛分枝桿菌-KOH-高碘酸鹽(R6)刺激巨噬細(xì)胞產(chǎn)生IL-12。
圖8示DD-母牛分枝桿菌-酸衍生物以劑量依賴方式抑制氣道嗜酸性粒細(xì)胞。
圖9比較以DD-母牛分枝桿菌-酸鼻內(nèi)或皮內(nèi)免疫對肺嗜酸性粒細(xì)胞的抑制效果。
圖10示以DD-母牛分枝桿菌，DD-結(jié)核分枝桿菌和DD-恥垢分枝桿菌免疫對氣道嗜酸性粒細(xì)胞的效果。
圖11示以DD-母牛分枝桿菌刺激人PBMC和非粘附細(xì)胞產(chǎn)生TNF-α。
圖12A和12B分別示以DD-母牛分枝桿菌刺激人PBMC和非粘附細(xì)胞產(chǎn)生IL-10和IFN-γ。
圖13示DD-母牛分枝桿菌和DD-母牛分枝桿菌衍生物DD-母牛分枝桿菌-酸，Hvac和Evac抑制過敏原誘發(fā)的氣道嗜酸性粒細(xì)胞。
圖14示以O(shè)VA攻擊三天之后，施用DD-母牛分枝桿菌-酸，DD-母牛分枝桿菌-酸對嚴(yán)重過敏原誘發(fā)的小鼠氣道嗜酸性粒細(xì)胞的療效。
圖15示施用DD-母牛分枝桿菌-酸后立即繼以O(shè)VA攻擊一次或兩次，DD-母牛分枝桿菌-酸對過敏原誘發(fā)的氣道嗜酸性粒細(xì)胞的抑制效果。
圖16示在兩次OVA攻擊之間施用DD。-母牛分枝桿菌-酸一或二次，DD-母牛分枝桿菌-酸抑制過敏原誘發(fā)的小鼠氣道嗜酸性粒細(xì)胞的效果。
發(fā)明詳述如上述，本發(fā)明的一般目的是治療免疫誘導(dǎo)失調(diào)的組合物和方法。在特定實(shí)施方案中，這些失調(diào)選自呼吸系統(tǒng)失調(diào)，過敏性失調(diào)，和服用IL-10和/或刺激IL-10產(chǎn)生對病情有利的失調(diào)。呼吸系統(tǒng)失調(diào)的例子有分枝桿菌感染，氣喘，肉樣瘤病，過敏性鼻炎和肺癌。服用或增加產(chǎn)生IL-10被認(rèn)為利好的失調(diào)例子有動(dòng)脈粥樣硬化，高膽固醇血癥，癌癥，細(xì)菌感染和胰島素依賴性糖尿病。過敏性皮膚病的例子有特異反應(yīng)性皮炎和濕疹。
特定的病原如結(jié)核分枝桿菌，和特定的癌癥，被CD4+T細(xì)胞指導(dǎo)的免疫攻擊，稱為細(xì)胞介導(dǎo)的免疫有效遏制。其他病原如脊髓灰質(zhì)炎病毒，還需B細(xì)胞產(chǎn)生的抗體遏制。這些不同類的免疫攻擊(T細(xì)胞或B細(xì)胞)受控于CD4+T細(xì)胞的不同亞群，通稱為Th1和Th2細(xì)胞。
這兩類Th細(xì)胞已很好地表征于小鼠模型，并由其激活時(shí)釋放的細(xì)胞因子定義。Th1亞類分泌IL-2，IFN-γ和腫瘤壞死因子。并介導(dǎo)巨噬細(xì)胞活化和遲滯型超敏反應(yīng)。Th2亞類釋放IL-4，IL-5，IL-6和IL-10，來刺激B細(xì)胞活化。Th1和Th2亞類相互抑制，以致IL-4抑制Th1型反應(yīng)，IFN-γ抑制Th-2型反應(yīng)。類似的Th1和Th2亞類已發(fā)現(xiàn)于人，并釋放與小鼠模型中觀察到的相同的細(xì)胞因子。Th-1型免疫反應(yīng)擴(kuò)增是許多失調(diào)病情逆轉(zhuǎn)的核心，包括呼吸系統(tǒng)失調(diào)如結(jié)核病、肉樣瘤病、氣喘、過敏鼻炎和肺癌。已顯示IL-12上調(diào)Th1反應(yīng)，而IL-10下調(diào)Th2反應(yīng)。Zuany-Amorim等示IL-10調(diào)節(jié)淋巴細(xì)胞浸潤抗原攻擊小鼠的氣道，表明IL-10在調(diào)節(jié)肺過敏性炎癥過程中起重要作用(J.Clin.Invest.952644-2651，1995)。Borish等的研究發(fā)現(xiàn)氣喘病人比正常人氣管支氣管液IL-10水平降低(J.Allergy.Clin.Immunol.971288-96，1996)。
一方面，提供治療呼吸和/或肺失調(diào)的方法，包括施用去脂去糖脂的分枝桿菌細(xì)胞，優(yōu)選去脂去糖脂的結(jié)核分枝桿菌細(xì)胞和/或去脂去糖脂的恥垢分枝桿菌細(xì)胞。相關(guān)地，本發(fā)明提供方法，由施用含至少一種去脂去糖脂分枝桿菌細(xì)胞衍生物的組合物來免疫治療病人呼吸和/或肺失調(diào)，包括結(jié)核病、肉樣瘤病、氣喘、過敏性鼻炎和肺癌。在特定實(shí)施方案中，這些方法包括施用至少一種DD-母牛分枝桿菌衍生物。如下詳述，發(fā)明者已用小鼠模型證實(shí)了這些組合物治療氣喘的功效。這些組合物被認(rèn)為治療如氣喘的疾病有效，是因?yàn)樗鼈兡芤种茪獯T發(fā)的Th2免疫反應(yīng)。在一實(shí)施方案中，這些組合物直接投放于導(dǎo)向和/或肺內(nèi)氣道的粘膜表面。然而，這些組合物或者還可由皮內(nèi)或皮下施用。
用于此的術(shù)語“呼吸系統(tǒng)”指肺、鼻通道、氣管和支氣管通道。
用于此的術(shù)語“導(dǎo)向或位于肺的氣道”包括鼻通道、口、扁桃體組織、氣管和支氣管通道。
此處用的“患者”指任何溫血?jiǎng)游?，?yōu)選人。該患者可害病也可未患可檢測到的疾病。換言之，發(fā)明的方法可用于誘導(dǎo)保護(hù)性免疫半預(yù)防或治療疾病。
此處用的術(shù)語“失活母牛分枝桿菌”指例1中熱滅活的，或經(jīng)2.5兆拉德劑量60鈷照射致死的母牛分枝桿菌細(xì)胞。此處用的術(shù)語“修飾母牛分枝桿菌”包括去脂母牛分枝桿菌細(xì)胞，去糖脂母牛分枝桿菌細(xì)胞，去脂去糖脂母牛分枝桿菌(DD-母牛分枝桿菌)細(xì)胞及其衍生物。DD-母牛分枝桿菌可按下述例1制備，DD-母牛分枝桿菌衍生物制備下述于例2。去脂去糖脂結(jié)核分枝桿菌(DD-結(jié)核分枝桿菌)和恥垢分枝桿菌(DD-恥垢分枝桿菌)下述于例10?？砂垂_于此的DD-母牛分枝桿菌衍生物的制備過程來制備DD-結(jié)核分枝桿菌和DD-恥垢分枝桿菌衍生物，如酸處理、堿處理、過碘酸鹽處理、蛋白酶K處理和/或氫氟酸處理的衍生物。
DD-母牛分枝桿菌衍生物的半乳糖含量優(yōu)選地小于總碳水化合物的9.7％，更優(yōu)選地小于總碳水化合物的5％，最優(yōu)選地小于總碳水化合物的3.5％。在特定實(shí)施方案中，DD-母牛分枝桿菌衍生物含葡糖胺量優(yōu)選地大于總碳水化合物的3.7％，更優(yōu)選地大于總碳水化合物的5％，最優(yōu)選地大于總碳水化合物的7.5％。堿處理的DD-母牛分枝桿菌如DD-母牛分枝桿菌-KOH(也作Kvac)的衍生物比DD-母牛分枝桿菌細(xì)胞壁連接分枝菌酸和阿拉伯半乳聚糖的酯鍵數(shù)目減少，因而貧化分枝菌酸。以酸如DD-母牛分枝桿菌-酸(也作Avac)處理制備的衍生物中連接阿拉伯半乳聚糖側(cè)鏈和細(xì)胞壁肽聚糖的磷酸二酯鍵數(shù)目減少，因而貧化阿拉伯半乳聚糖。此外，這些衍生物貧化DNA。以高碘酸鹽DD-母牛分枝桿菌如DD-母牛分枝桿菌-高碘酸鹽(也作Ivac)處理制備的衍生物比DD-母牛分枝桿菌的順式二醇蔗糖殘基數(shù)目減少，而貧化阿拉伯半乳聚糖。以蛋白酶K處理DD-母牛分枝桿菌(如指作Evac的衍生物)制備的衍生物貧化蛋白和肽。以氫氟酸，如以氫氟酸處理的DD-母牛分枝桿菌-KOH(作Hvac)，處理制備的衍生物貧化糖苷鍵。
通常，本發(fā)明的組合物可由注射(如皮內(nèi)，肌內(nèi)，靜脈內(nèi)或皮下)，鼻內(nèi)(如吸入)，口內(nèi)或上表皮(皮膚外用)施用。在一實(shí)施方案中，本發(fā)明的組合物制式適于投放至導(dǎo)向或肺內(nèi)氣道的粘膜表面。例如，組合物可懸溶于液體，以氣溶劑或類似于目前用于治療氣喘的噴霧器來向患者投送。
為用于治療方法，本發(fā)明的組合物可另含生理可接受的載體和/或免疫刺激劑來引發(fā)和/或刺激免疫反應(yīng)，如將多肽摻入佐劑或脂質(zhì)體。本技術(shù)領(lǐng)域已知的任何適合載體都可用于本發(fā)明的藥物組合物，載體類型依施用方式而變。對腸胃外施用，如皮下注射，載體優(yōu)選地含水、鹽、酒精、脂肪、蠟或緩沖液。對口服、可采用上述載體或固體載體，如甘露醇、乳糖、淀粉、硬脂酸鎂、糖精鈉、滑石、纖維素、果糖、蔗糖和碳酸鎂?？缮锝到獾奈⑶蝮w(如polylactic galactide)也可用作本發(fā)明藥物組合物的載體。適合的生物可降解微球體公開于，如美國專利號4897268和5075109。
本發(fā)明組合物中可采用各種佐劑來增強(qiáng)免疫反應(yīng)。許多佐劑含設(shè)計(jì)用來保護(hù)抗原以免被迅速代謝的物質(zhì)，如氫氧化鋁或礦物油，和免疫反應(yīng)的非特異刺激劑，如脂類A，百日咳博德特氏菌，結(jié)核分枝桿菌或如下討論的母牛分枝桿菌。適合的商業(yè)佐劑如Freund’s不完全佐劑和Freund’s完全佐劑(Difco實(shí)驗(yàn)室，底特律，MI)和Merck佐劑65(Merck and Company公司，Rahway，NJ)。其他合適的佐劑包括明礬，生物可降解微球體，單磷酸脂A和Quil A。
優(yōu)選施用頻率和有效劑量依個(gè)體而變。對DD-母牛分枝桿菌和DD-母牛分枝桿菌衍生物，一劑量優(yōu)選地自約10μg至約1000μg，更優(yōu)選地自約10μg至約100μg。施用劑量次數(shù)在最多可達(dá)12月內(nèi)自1至約10次。
措辭“約”用于此申請指劑量中活性成分含量有指定量的多至5％偏差。措辭“約”用于嗜酸性粒細(xì)胞減少百分?jǐn)?shù)時(shí)，有指定百分?jǐn)?shù)的多至10％偏差。
以下例說明，但不限于這些例子。例1 制備去脂去糖脂母牛分枝桿菌細(xì)胞(DD-母牛分枝桿菌)此例說明母牛分枝桿菌不同組合物的加工及其免疫調(diào)節(jié)性質(zhì)。熱滅活母牛分枝桿菌及母牛分枝桿菌濾過物母牛分枝桿菌(ATCC Number 15483)37℃培養(yǎng)于無菌培養(yǎng)基90(酵母提取物2.5g/L，胰胨5g/L，葡萄糖1g/L)。離心收獲細(xì)胞，轉(zhuǎn)至含葡萄糖的無菌Middle brook 7H9培養(yǎng)基(Difco實(shí)驗(yàn)室，底特律，MI)，37℃一天。然后離心沉淀細(xì)菌，移除培養(yǎng)濾過物。細(xì)菌沉淀重懸于磷酸緩沖鹽水至10mg/ml濃度，相當(dāng)于每毫升1010母牛分枝桿菌。細(xì)胞懸液再于120℃滅菌15分鐘。培養(yǎng)濾過物通過0.45μm濾器至無菌瓶中。制備去脂去糖脂母牛分枝桿菌(DD-母牛分枝桿菌)及組成分析為制備去脂母牛分枝桿菌，離心沉淀失活母牛分枝桿菌，水洗沉淀，再離心收集，并凍干。一份凍干的母牛分枝桿菌被保存并稱作凍干母牛分枝桿菌。當(dāng)用于實(shí)驗(yàn)中時(shí)，重懸于PBS至所需濃度。凍干母牛分枝桿菌以氯仿/甲醇(2∶1)室溫處理60分鐘來抽提脂類，抽提重復(fù)一次。氯仿/甲醇抽提的去脂殘余進(jìn)一步以50％乙醇回流二小時(shí)來移除糖脂。50％乙醇抽提重復(fù)二次。收集的50％乙醇抽提物用作母牛分枝桿菌糖脂源(見下)。50％乙醇抽提的殘余凍干并稱重。去脂去糖脂母牛分枝桿菌的制備量相當(dāng)于所用母牛分枝桿菌初濕重的11.1％。為生物測試，去脂去糖脂母牛分枝桿菌(DD-母牛分枝桿菌)以超聲重懸于磷酸緩沖鹽水，并高壓滅菌。
熱滅活母牛分枝桿菌和去脂去糖脂母牛分枝桿菌的組成分析見表1。與熱滅活母牛分枝桿菌的不溶部分相比，去脂去糖脂母牛分枝桿菌的主要變化在于脂肪酸組合物和氨基酸組合物。表1數(shù)據(jù)顯示熱滅活母牛分枝桿菌的不溶部分含10％w/w脂，總氨基酸含量為2750nmole/mg，或約33％w/w。去脂去糖脂母牛分枝桿菌含1.3％w/w脂和4250 nmole/mg氨基酸，約51％v/v。
表1熱滅活母牛分枝桿菌和去脂去糖脂母牛分枝桿菌的組成分析單糖組合物
脂肪酸組合物
熱滅活母牛分枝桿菌的不溶部分含10％w/w脂，而去脂去糖脂母牛分枝桿菌含1.3％w/w脂。氨基酸組合物
熱滅活母牛分枝桿菌不溶部分氨基酸總量為2750nmole/mg，約33％w/w。去脂去糖脂母牛分枝桿菌氨基酸總量為4250nmole/mg，約51％w/w。母牛分枝桿菌糖脂上述收集的50％乙醇抽提物經(jīng)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)干燥，再溶于水，并凍干?；厥仗侵考s所用母牛分枝桿菌初濕重的1.2％。為生物測試，糖脂溶于磷酸緩沖鹽水。巨噬細(xì)胞白細(xì)胞介素-12的生產(chǎn)完整熱滅活母牛分枝桿菌和去脂去糖脂母牛分枝桿菌顯示具有不同的細(xì)胞因子刺激性質(zhì)。
Th1免疫反應(yīng)刺激受巨噬細(xì)胞白細(xì)胞介素-12(IL-12)生產(chǎn)增強(qiáng)。不同母牛分枝桿菌制備物刺激IL-12生產(chǎn)的能力示于下。
以DIFCO巰基甘醇酸酯腹膜內(nèi)注射于一組C57 BL/6J小鼠。三天后收集腹膜巨噬細(xì)胞，并置于含干擾素-γ的細(xì)胞培養(yǎng)物三小時(shí)。更換培養(yǎng)基，加入各種濃度的完整熱滅活高壓滅菌母牛分枝桿菌，凍干母牛分枝桿菌，去脂去糖脂母牛分枝桿菌(指圖1去脂去糖脂母牛分枝桿菌)。37℃又三天后，測試培養(yǎng)上清中巨噬細(xì)胞產(chǎn)生的IL-12。如圖1示，母牛分枝桿菌制備物刺激巨噬細(xì)胞產(chǎn)生IL-12。
形成對照地，檢測同樣母牛分枝桿菌制備物刺激天然殺傷(NK)細(xì)胞產(chǎn)生干擾素-γ(IFN-γ)的能力。制備重度聯(lián)合免疫缺損(SCID)小鼠脾細(xì)胞。該群體含75％-80％NK細(xì)胞。脾細(xì)胞37℃孵育于含不同濃度熱滅活母牛分枝桿菌，去脂去糖脂母牛分枝桿菌或母牛分枝桿菌糖脂的培養(yǎng)物中。圖2數(shù)據(jù)顯示，熱滅活母牛分枝桿菌和母牛分枝桿菌糖脂刺激干擾素-γ產(chǎn)生，去脂去糖脂母牛分枝桿菌刺激相對較少干擾素-γ。圖1和2數(shù)據(jù)合并顯示，與完整熱滅活母牛分枝桿菌相比，去脂去糖脂母牛分枝桿菌是IL-12較好的刺激劑，而對干擾素-γ較差。例2母牛分枝桿菌其他衍生物的制備和定性去脂去糖脂母牛分枝桿菌的堿水解此過程意在裂解對堿水解不穩(wěn)定的連接，如連接分枝菌酸與分枝桿菌細(xì)胞壁阿拉伯半乳聚糖的酯鍵。
按例1所述制備一克去脂去糖脂母牛分枝桿菌，懸于20mL 0.5％KOH乙醇溶液。本技術(shù)領(lǐng)域已知的其他堿性劑和溶劑可用于置換KOH和乙醇?；旌衔镉?7℃間歇攪拌孵育48小時(shí)。離心收集固體殘余，乙醇洗兩次，二乙醚洗一次。產(chǎn)物空氣干燥過夜。產(chǎn)量為1.01g(101％)KOH處理的去脂去糖脂母牛分枝桿菌，后作DD-母牛分枝桿菌-KOH(還作Kvac)。發(fā)現(xiàn)該衍生物比公開于此的去脂去糖脂母牛分枝桿菌的其他衍生物更易溶。去脂去糖脂母牛分枝桿菌的酸水解此過程意在裂解酸不穩(wěn)定的連接，如連接阿拉伯半乳聚糖側(cè)鏈與分枝桿菌細(xì)胞壁肽聚糖的磷酸二酯鍵。
DD-母牛分枝桿菌和DD-母牛分枝桿菌-KOH(100mg)在1mL 50mM H2SO4中洗兩次，然后重懸并離心。本技術(shù)領(lǐng)域已知的其他酸可用于置換硫酸。在酸水解步驟，固體殘余重懸于1mL 50mM H2SO4，60℃孵育72小時(shí)。離心回收固體殘余后，以水洗殘余五次來除去酸。凍干固體殘余得58.2mg酸處理的DD-母牛分枝桿菌(DD-母牛分枝桿菌-酸，也作Avac)或36.7mg酸處理的DD-母牛分枝桿菌-KOH(DD-母牛分枝桿菌-KOH-酸)。高碘酸裂解去脂去糖脂母牛分枝桿菌此過程意在裂解去脂去糖脂母牛分枝桿菌含順二醇的蔗糖殘基，如肽聚糖主鏈上阿拉伯半乳聚糖附著位點(diǎn)附近的鼠李糖殘基。
DD-母牛分枝桿菌或DD-母牛分枝桿菌-KOH(100mg)懸于1mL1％高碘酸于3％乙酸溶液，室溫孵育1小時(shí)，離心回收固體殘余。高碘酸處理重復(fù)三次。離心回收固體殘余，以5mL 0.1M氫硼化鈉室溫孵育一小時(shí)。離心回收產(chǎn)物固體殘余，并重復(fù)氫硼化鈉處理。離心后，以水洗固體殘余四次并凍干，得62.8mg DD-母牛分枝桿菌-高碘酸鹽(也作Ivac)或61.0mg DD-母牛分枝桿菌-KOH-高碘酸鹽。重懸DD-母牛分枝桿菌和DD-母牛分枝桿菌-KOHDD-母牛分枝桿菌和DD-母牛分枝桿菌-KOH(各11mg)懸于磷酸緩沖鹽水(5.5mL)。室溫以Virtis探針超聲器超聲樣品不同時(shí)間(微小探針，15％輸出)。樣品渦旋振蕩六十秒并靜置五分鐘以使大顆粒沉降。600nm測定其余懸液的光吸收。如圖6示，DD-母牛分枝桿菌-KOH(圖6作DDMV-KOH)于一分鐘超聲后全部重懸，進(jìn)一步超聲并不增強(qiáng)光吸收。五分鐘超聲后，如重懸光吸收估計(jì)，DD-母牛分枝桿菌重懸(圖6作DDMV)仍不完全。這些結(jié)果表明DD-母牛分枝桿菌-KOH比DD-母牛分枝桿菌相當(dāng)?shù)馗兹?。去脂去糖脂母牛分枝桿菌的蛋白酶K水解此過程意在消化蛋白和多肽，同時(shí)保留多數(shù)其他物質(zhì)完整。
按例1所述制備一百毫克DD-母牛分枝桿菌，以超聲懸于9mL水中。加入十二烷硫酸鈉(SDS)至終濃度1％w/v，蛋白酶K終濃度為100μg/mL w/v。反應(yīng)混合物50℃孵育16小時(shí)。離心回收產(chǎn)物，以水和磷酸緩沖鹽水洗，凍干。得59mg(59％)蛋白酶K處理的DD-母牛分枝桿菌，后作EVac。氫氟酸水解KOH處理的去脂去糖脂母牛分枝桿菌此過程意在裂解對無水氫氟酸水解不穩(wěn)定的連接，如糖苷鍵，而保留多數(shù)蛋白完整。
按上述制備一克DD-母牛分枝桿菌-KOH，懸于含苯甲醚為自由基清除劑的15mL液態(tài)氟化氫。混合物于0℃攪拌孵育一小時(shí)。蒸餾除去氟化氫(HF)，以二乙醚洗固體殘余來除去苯甲醚。以水抽提產(chǎn)物來得到水溶和水不溶部分。得250mg(25％)水溶物質(zhì)，和550mg(55％)水不溶HF水解的KOH處理DD-母牛分枝桿菌，后作HVac。例3去脂去糖脂母牛分枝桿菌及其衍生物對小鼠氣喘的免疫效果在氣喘樣過敏原特異肺病小鼠模型中檢測DD-母牛分枝桿菌及其衍生物抑制過敏性免疫反應(yīng)發(fā)展的能力。該過敏性疾病的嚴(yán)重性反映為氣道中累積巨多嗜酸性粒細(xì)胞。
在0至14日經(jīng)腹膜內(nèi)給BALB/cByJ小鼠2μg卵清蛋白于2mg明礬佐劑，然后在第28日經(jīng)鼻內(nèi)給100μg卵清蛋白于50μL磷酸緩沖鹽水(PBS)。通過鹽水沖洗麻醉鼠氣道，收集洗出物(支氣管灌洗或BAL)，并計(jì)數(shù)嗜酸性粒細(xì)胞數(shù)目，檢測出小鼠在氣道累積嗜酸性粒細(xì)胞。
按上述制備DD-母牛分枝桿菌衍生物。10只小鼠一組，鼻內(nèi)施用200μg PBS，DD-母牛分枝桿菌或DD-母牛分枝桿菌衍生物之一(Q1DD-母牛分枝桿菌；Q2DD-母牛分枝桿菌-KOH；Q3DD-母牛分枝桿菌-酸；Q4DD-母牛分枝桿菌-高碘酸鹽；Q6和P6DD-母牛分枝桿菌-KOH-高碘酸鹽；P5DD-母牛分枝桿菌-KOH-酸)，一周后繼以鼻內(nèi)施用卵清蛋白。如圖3示，與對照小鼠相比，施用卵清蛋白六天后收集的BAL細(xì)胞嗜酸性粒細(xì)胞百分?jǐn)?shù)統(tǒng)計(jì)上顯著降低。而且，數(shù)據(jù)顯示以DD-母牛分枝桿菌-酸和DD-母牛分枝桿菌-KOH-高碘酸鹽(Q3，Q6和P6)抑制氣道嗜酸性粒細(xì)胞高于DD-母牛分枝桿菌(Q1)。對照小鼠給鼻內(nèi)PBS。圖3數(shù)據(jù)示每組小鼠平均值和SEM。
嗜酸性粒細(xì)胞是過敏性氣喘氣道中最顯著的血細(xì)胞。嗜酸性粒細(xì)胞的分泌產(chǎn)物使過敏性氣喘氣道粘膜內(nèi)層(lining)腫脹并發(fā)炎。圖3數(shù)據(jù)表明DD-母牛分枝桿菌或其衍生物減緩肺嗜酸性粒細(xì)胞累積，并可用于減緩氣道，鼻粘膜和上呼吸道中與嗜酸性粒細(xì)胞相關(guān)的炎癥。因此施用DD-母牛分枝桿菌或其衍生物可減緩氣喘和有類似免疫異常疾病如過敏性鼻炎、特異反應(yīng)性皮炎和濕疹的嚴(yán)重性。
此外，采集以熱滅活母牛分枝桿菌或DD-母牛分枝桿菌免疫的小鼠血清樣品，并以標(biāo)準(zhǔn)酶聯(lián)免疫測試(EIA)測定對卵清蛋白的抗體水平。如表2示，感染BCG的小鼠血清比PBS對照血清，卵清蛋白特異的IgG1水平較高。對照地，以熱滅活母牛分枝桿菌或DD-母牛分枝桿菌免疫的小鼠有相似或較低水平的卵清蛋白特異IgG1。因IgG1抗體是Th2免疫反應(yīng)的特征，這些結(jié)果與DD-母牛分枝桿菌對氣喘誘發(fā)Th2免疫反應(yīng)的抑制效果是一致的。
表2以熱滅活母牛分枝桿菌或去脂去糖脂母牛分枝桿菌免疫小鼠的抗原特異IgG1血清低水平
例4去脂去糖脂母牛分枝桿菌衍生物對THP-1細(xì)胞生產(chǎn)IL-10的影響已顯示IL-10抑制Th1細(xì)胞生產(chǎn)細(xì)胞因子，并在抑制實(shí)驗(yàn)誘發(fā)的皮膚炎癥反應(yīng)中起關(guān)鍵作用(Berg等，J.Exp.Med.18299-108，1995)。更近些時(shí)候，IL-10已成功用于兩例臨床實(shí)驗(yàn)來治療牛皮癬患者(Reich等，J.Invest.Dermatol，1111235-1236，1998；和Asadullah等，J.Clin.Invest.101783-794，1998)。以下評估在DD-母牛分枝桿菌衍生物存在時(shí)培養(yǎng)的人單核細(xì)胞系(THP-1)生產(chǎn)IL-10的水平。
THP-1細(xì)胞(ATCC Number TIB-202)培養(yǎng)于0.5mg/L鏈霉素，500 U/L青霉素，2 mg/L L-谷氨酰胺，5×10-5M β-巰基乙醇和5％胎牛血清(FBS)補(bǔ)充的RPMI培養(yǎng)基(Gibco BRL Life Technologies)。測試前一天，細(xì)胞以5×105細(xì)胞/mL分轉(zhuǎn)培養(yǎng)于新鮮培養(yǎng)基。細(xì)胞于含5％CO2的濕潤空氣中37℃孵育24小時(shí)，然后抽吸并以50mL培養(yǎng)基離心洗滌。細(xì)胞重懸于5mL培養(yǎng)基，以錐蟲藍(lán)(Sigma，St LouisMI)染色和血細(xì)胞計(jì)數(shù)器分析測定細(xì)胞濃度和活力。DD-母牛分枝桿菌衍生物(按上述制備)于50μL PBS和對照刺激劑以三次重復(fù)加入含100μL培養(yǎng)基的96孔板，并制備相應(yīng)稀釋。脂多糖(LPS)(300μg/mL；Sigma)和PBS用作對照。每孔加入100μL濃度為2×106細(xì)胞/ml的細(xì)胞，板于含5％CO2的濕潤空氣中37℃孵育24小時(shí)。據(jù)廠商說明，用人IL-10 ELISA試劑(Phar Mingen，San Diego CA)測定每孔中IL-10的水平。如圖4示，發(fā)現(xiàn)DD-母牛分枝桿菌的酸和高碘酸鹽衍生物刺激顯著水平的IL-10生產(chǎn)。PBS對照，DD-母牛分枝桿菌-KOH，DD-母牛分枝桿菌-KOH-高碘酸鹽和DD-母牛分枝桿菌-KOH-酸衍生物不刺激THP-1細(xì)胞生產(chǎn)IL-10。例5 母牛分枝桿菌和去脂去糖脂母牛分枝桿菌免疫小鼠對結(jié)核病的影響此例說明以結(jié)核分枝桿菌挑戰(zhàn)前，以熱滅活母牛分枝桿菌或DD-母牛分枝桿菌免疫的效果此距三周分兩次向小鼠腹膜內(nèi)注射下列制備物之一a) 磷酸緩沖鹽水(PBS，對照)；b) 熱滅活母牛分枝桿菌(500μg)；和c) DD-母牛分枝桿菌(50μg)。
最后一次腹膜內(nèi)免疫后三周，以5×105活H37Rv結(jié)核分枝桿菌感染小鼠。又三周后，殺死小鼠，勻漿其脾臟，并測試結(jié)核分枝桿菌菌落形成單位(CFU)作為感染程度的指標(biāo)。
圖5數(shù)據(jù)中，每點(diǎn)代表一只小鼠。以PBS單獨(dú)免疫對照小鼠回收的CFU數(shù)作為基線。實(shí)驗(yàn)小鼠的所有數(shù)據(jù)表達(dá)為對照小鼠基線下CFU的對數(shù)(或?qū)?shù)保護(hù))。如圖5示，以熱滅活母牛分枝桿菌或DD-母牛分枝桿菌免疫的小鼠分別顯示＞1或0.5 logs CFU的平均降低。數(shù)據(jù)證實(shí)以母牛分枝桿菌或DD-母牛分枝桿菌免疫的有效性，并表明DD-母牛分枝桿菌可發(fā)展為抗結(jié)核病的疫苗。例6 去脂去糖脂母牛分枝桿菌和去脂去糖脂母牛分枝桿菌衍生物的組成分析DD-母牛分枝桿菌和DD-母牛分枝桿菌衍生物的碳水組成分析DD-母牛分枝桿菌和DD-母牛分枝桿菌衍生物的碳水化合物以標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)測定。結(jié)果示于表3，其中DDMV代表DD-母牛分枝桿菌；DDMV-KOH代表DD-母牛分枝桿菌-KOH；DDMV-A代表DD-母牛分枝桿菌-酸；DDMV-I代表DD-母牛分枝桿菌高碘酸鹽；DDMV-KOH-A代表DD-母牛分枝桿菌-KOH-酸；DDMV-KOH-I代表DD-母牛分枝桿菌-KOH-高碘酸鹽。
表3DD-母牛分枝桿菌和DD-母牛分枝桿菌衍生物的碳水化合物分析
*所有值為總碳水化合物的百分?jǐn)?shù)結(jié)果證明每種DD-母牛分枝桿菌衍生物碳水組成含量不同，如從酸、高碘酸鹽或堿處理細(xì)胞的不同效果所預(yù)期。此外，與DD-母牛分枝桿菌衍生物相比，DD-母牛分枝桿菌的碳水化合物顯然不同。如所期，DD-母牛分枝桿菌-酸和DD-母牛分枝桿菌-高碘酸鹽衍生物中半乳糖含量低于DD-母牛分枝桿菌和DD-母牛分枝桿菌-KOH。這些值反映了酸和高碘酸鹽在制備衍生物中的作用，即從肽聚糖主鏈裂解掉阿拉伯半乳聚糖側(cè)鏈。DD-母牛分枝桿菌和DD-母牛分枝桿菌衍生物的核酸分析蛋白酶K處理后，以凝膠電泳分析DD-母牛分枝桿菌和DD-母牛分枝桿菌衍生物的核酸含量，顯示DD-母牛分枝桿菌，DD-母牛分枝桿菌-高碘酸鹽和DD-母牛分枝桿菌-KOH含少量DNA，而DD-母牛分枝桿菌-酸中未檢測出核酸。例7 去脂去糖脂母牛分枝桿菌衍生物對巨噬細(xì)胞生產(chǎn)IL-12的影響巨噬細(xì)胞生產(chǎn)的白細(xì)胞介素-12(IL-12)增強(qiáng)刺激Th1免疫反應(yīng)。下面證明不同母牛分枝桿菌制備物刺激IL-12生產(chǎn)的能力。
一組BALB/cByJ小鼠腹膜內(nèi)注射巰基甘醇酸酯(Difco.實(shí)驗(yàn)室，底特律，MI)。三天后采集腹膜巨噬細(xì)胞，并置于含IFN-γ(2U/mL)的細(xì)胞培養(yǎng)物中四小時(shí)。以補(bǔ)充有110mg/L丙酮酸，116mg/L精氨酸，36mg/L L-天冬酰胺，6mg/L葉酸，0.5mg/L鏈霉素，500U/L青霉素，2mg/L L-谷氨酸，5×10-5M 2-巰基乙醇和5％胎牛血清(FBS)的50mL冷DMEM培養(yǎng)基(Gibco Life Techrologies，Gaithersburg MD)洗滌細(xì)胞三次，并調(diào)濃度至2×106細(xì)胞/mL。加入各種濃度的DD-母牛分枝桿菌(圖7作R1)和DD-母牛分枝桿菌-KOH(圖7作R2)，DD-母牛分枝桿菌-酸(圖7作R3)，DD-母牛分枝桿菌-高碘酸鹽(圖7作R4)，DD-母牛分枝桿菌-KOH-酸(圖7作R5)和DD-母牛分枝桿菌-KOH-高碘酸鹽(圖7作P6)。每孔加入0.1mL濃度為2×106細(xì)胞/mL的IFN-γ處理過的巨噬細(xì)胞。37℃又孵育24小時(shí)后，收集培養(yǎng)上清，并測試巨噬細(xì)胞產(chǎn)生的IL-12。以DD-母牛分枝桿菌衍生物刺激的巨噬細(xì)胞生產(chǎn)IL-12水平示于圖7。數(shù)據(jù)表明DD-母牛分枝桿菌衍生物刺激巨噬細(xì)胞生產(chǎn)IL-12約與DD-母牛分枝桿菌水平相同，除DD-母牛分枝桿菌-KOH-酸誘導(dǎo)較少IL-12產(chǎn)生外。例8 以去脂去糖脂母牛分枝桿菌衍生物的不同劑量免疫小鼠的效果此例說明DD-母牛分枝桿菌衍生物的不同劑量對肺過敏性免疫反應(yīng)發(fā)展的免疫效果。這在氣喘樣過敏原特異性肺病的小鼠模型中得到證實(shí)。這種過敏性疾病的嚴(yán)重性反映于累積在氣道的巨大數(shù)目嗜酸性粒細(xì)胞。
在0和7天腹膜內(nèi)注射200μL含10μg卵清蛋白(OVA)和1mg明礬佐劑的乳劑，使BALB/cBYJ雌小鼠對OVA致敏化。在14和21天，麻醉小鼠，鼻內(nèi)或皮內(nèi)接種200μg DD-母牛分枝桿菌-酸或PBS。在28和32天，麻醉小鼠，鼻內(nèi)施以100μg OVA。在35天，殺死小鼠，用PBS操作支氣管肺泡灌洗(BAL)。以流式細(xì)胞計(jì)分析BAL細(xì)胞樣品來測定嗜酸性粒細(xì)胞含量(％嗜酸性粒細(xì)胞)。以嗜酸性粒細(xì)胞百分?jǐn)?shù)值乘所得淋巴細(xì)胞總數(shù)即得總BAL嗜酸性粒細(xì)胞數(shù)，淋巴細(xì)胞總數(shù)用血細(xì)胞計(jì)數(shù)器測定。
圖8示，DD-母牛分枝桿菌-酸引致氣道嗜酸性粒細(xì)胞(％嗜酸性粒細(xì)胞)的顯著的劑量依賴抑制，增加DD-母牛分枝桿菌-酸的劑量，則觀察到抑制水平升高。例9 以去脂去糖脂母牛分枝桿菌免疫小鼠的途徑的效果此例說明DD-母牛分枝桿菌衍生物免疫的不同途徑抑制氣喘樣過敏原特異性肺病小鼠模型中氣道嗜酸性粒細(xì)胞的效果。
在0和7日，以腹膜內(nèi)注射200μL含10μgOVA和1mg明礬佐劑的乳劑使BALB/cByJ雌小鼠對OVA致敏化。在14和21日，麻醉小鼠，鼻內(nèi)或皮內(nèi)接種200μg DD-母牛分枝桿菌-酸或PBS。在28和32日，麻醉小鼠，鼻內(nèi)施以100μg OVA。在35日，殺死小鼠，并用PBS作支氣管肺泡灌洗(BAL)。以流式細(xì)胞計(jì)分析BAL細(xì)胞樣品來測定嗜酸性粒細(xì)胞含量(％嗜酸性粒細(xì)胞)。嗜酸性粒細(xì)胞百分?jǐn)?shù)乘所得淋巴細(xì)胞總數(shù)即得總BAL嗜酸性粒細(xì)胞數(shù)，淋巴細(xì)胞數(shù)用血細(xì)胞計(jì)數(shù)器測定。
如圖9示，與對照小鼠相比，觀察到以DD-母牛分枝桿菌-酸鼻內(nèi)免疫小鼠繼以卵清蛋白攻擊六天后采集的BAL細(xì)胞嗜酸性粒細(xì)胞百分?jǐn)?shù)顯著降低。更進(jìn)一步，數(shù)據(jù)顯示以DD-母牛分枝桿菌-酸鼻內(nèi)施用對氣道嗜酸性粒細(xì)胞的抑制強(qiáng)于皮內(nèi)免疫。對照小鼠給以鼻內(nèi)PBS。圖9數(shù)據(jù)示每組小鼠的平均值和平均標(biāo)準(zhǔn)誤差。例10 去脂去糖脂結(jié)核分枝桿菌(DD-結(jié)核分枝桿菌)和恥垢分枝桿菌(DD-M.smegmatis)的制備和組成分析結(jié)核分枝桿菌和恥垢分枝桿菌的培養(yǎng)濾過物按例1述母牛分枝桿菌的方法，培養(yǎng)恥垢分枝桿菌(恥垢分枝桿菌ATCC Number 27199)于加1％葡萄糖的培養(yǎng)基90。37℃孵育5天后，離心收集細(xì)胞，并移除培養(yǎng)濾過物。細(xì)菌沉淀重懸于磷酸緩沖鹽水至10mg/mL濃度，相當(dāng)于每毫升1010恥垢分枝桿菌。細(xì)胞懸液120℃滅菌15分鐘。培養(yǎng)濾過物通過0.45μm濾器至無菌瓶中。
結(jié)核分枝桿菌H37Rv株(ATCC Number 27294)培養(yǎng)物在GAS培養(yǎng)基(0.3g細(xì)菌酪胨(Difco Laboratories，底特律MI)，0.05g檸檬酸銨鐵，4g K2HPO4，2g檸檬酸，1g L-丙氨酸，1.2g MgCl2·6H2O，0.6g K2SO4，2g NH4Cl，1.8mL NaOH(10N)，5mL甘油，pH 7.0)37℃生長五天。細(xì)胞收集和進(jìn)一步處理如上述對恥垢分枝桿菌細(xì)胞。
制備去脂去糖脂結(jié)核分枝桿菌(DD-結(jié)核分枝桿菌)和去脂去糖脂恥垢分枝桿菌(DD-恥垢分枝桿菌)及組成分析。
為制備去糖去糖脂結(jié)核分枝桿菌(DD-結(jié)核分枝桿菌)和恥垢分枝桿菌(DD-恥垢分枝桿菌)，離心沉淀失活結(jié)核分枝桿菌和恥垢分枝桿菌，水洗沉淀并再離心收集，凍干。分別保留一份凍干結(jié)核分枝桿菌和恥垢分枝桿菌，稱作凍干結(jié)核分枝桿菌和恥垢分枝桿菌。當(dāng)用于實(shí)驗(yàn)時(shí)，凍干物質(zhì)重懸于PBS至理想濃度。
按例1述DD-母牛分枝桿菌的制備，來制備去脂去糖脂結(jié)核分枝桿菌和恥垢分枝桿菌。為生物測試凍干DD-結(jié)核分枝桿菌和DD-恥垢分枝桿菌以超聲重懸于磷酸緩沖鹽水(PBS)并滅菌。
DD-結(jié)核分枝桿菌和DD-恥垢分枝桿菌的組成分析見表4和表5。DD-結(jié)核分枝桿菌和DD-恥垢分枝桿菌與DD-母牛分枝桿菌在單糖組合物上的主要不同在于某些單糖成分。表4數(shù)據(jù)示DD-結(jié)核分枝桿菌和DD-恥垢分枝桿菌分別含1.3％和0.0mol％葡萄糖，而DD-母牛分枝桿菌含28.1mol％。
DD-結(jié)核分枝桿菌和DD-恥垢分枝桿菌的氨基酸組合物見表5。DD-結(jié)核分枝桿菌含6537.9n moles/mg氨基酸，或約78.5％w/w，DD-恥垢分枝桿菌含6007.7 nmoles/mg氨基酸，約72.1％w/w蛋白質(zhì)。與表1DD-母牛分枝桿菌的氨基酸分析相比，DD-結(jié)核分枝桿菌和DD-恥垢分枝桿菌比DD-母牛分枝桿菌含更多總％蛋白(55.1％)。
表4去脂去糖脂結(jié)核分枝桿菌和去脂去糖脂恥垢分枝桿菌的單糖化合物
*未做表5去脂去糖脂結(jié)核分枝桿菌和去脂去糖脂恥垢分枝桿菌的氨基酸組成
例11 以去脂去糖脂結(jié)核分枝桿菌和去脂去糖脂恥垢分枝桿菌免疫對小鼠氣喘的影響按上述于例8，在氣喘樣過敏原特異性肺病小鼠模型中檢測DD-結(jié)核分枝桿菌和DD-恥垢分枝桿菌抑制過敏性免疫反應(yīng)發(fā)展的能力。結(jié)果說明DD-結(jié)核分枝桿菌和DD-恥垢分枝桿菌免疫對抑制氣道嗜酸性粒細(xì)胞的效果，說明其免疫調(diào)節(jié)性。
在0和7日，腹膜內(nèi)注射200μL含10μg OVA和1mg明礬佐劑的乳劑使BALB/cByJ雌小鼠對OVA致敏化。在14和21日，麻醉小鼠，鼻內(nèi)或皮內(nèi)接種200μg DD-母牛分枝桿菌，DD-結(jié)核分枝桿菌，DD-恥垢分枝桿菌或PBS。在28和32日，麻醉小鼠，鼻內(nèi)施以100μg OVA。在35日，殺死小鼠，并用PBS作支氣管肺泡灌洗(BAL)。以流式細(xì)胞計(jì)分析BAL細(xì)胞樣品來測定嗜酸性粒細(xì)胞含量(％嗜酸性粒細(xì)胞)。嗜酸性粒細(xì)胞百分?jǐn)?shù)乘所得淋巴細(xì)胞總數(shù)得總BAL嗜酸性粒細(xì)胞數(shù)，淋巴細(xì)胞總數(shù)用血細(xì)胞計(jì)數(shù)器測定。
圖10數(shù)據(jù)表明，以DD-結(jié)核分枝桿菌和DD-恥垢分枝桿菌治療減緩肺嗜酸性粒細(xì)胞累積，這與以DD-母牛分枝桿菌免疫后的減緩類似；DD-結(jié)核分枝桿菌和DD-恥垢分枝桿菌可用于減緩與氣道、鼻粘膜和上呼吸道嗜酸性粒細(xì)胞相關(guān)的炎癥。因此施用DD-結(jié)核分枝桿菌和DD-恥垢分枝桿菌可減緩氣喘和類似免疫異常性疾病如過敏性鼻炎的嚴(yán)重性。例12去脂去糖脂母牛分枝桿菌對人外周血單核細(xì)胞產(chǎn)生IL-10，TNF-α和IFN-γ的影響此例記述DD-母牛分枝桿菌刺激人外周血單核細(xì)胞(PBMC)產(chǎn)生細(xì)胞因子的能力研究。
人血分離為PBMC和非粘著細(xì)胞，如下以DD-母牛分枝桿菌刺激后測定各部分的細(xì)胞因子生產(chǎn)。血以等體積鹽水稀釋，15-20mL鋪層于10mL水溶性聚蔗糖(Ficoll)(Gibco BRL Life Technologies，Gaithersburg，MD)。1800 rpm離心20 min后移除淋巴細(xì)胞層，以RPMI培養(yǎng)基(GibcoBRL)洗三次，并用錐蟲藍(lán)計(jì)數(shù)。細(xì)胞重懸于含5％熱失活的自身血清的RPMI培養(yǎng)基至濃度為2×106/mL。細(xì)胞樣品分裝以制備非粘著細(xì)胞。
在含5％CO2的濕潤空氣中，于補(bǔ)充血清(如上)的RPMI孵育20mL淋巴細(xì)胞一小時(shí)來制備非粘著細(xì)胞。非粘著細(xì)胞轉(zhuǎn)至干凈瓶，孵育重復(fù)一次。非粘著細(xì)胞移出，計(jì)數(shù)，并重懸于補(bǔ)充RPMI培養(yǎng)基至濃度為2-106/mL。制備DD-母牛分枝桿菌的系列稀釋，始于200μg/mL，并加入96孔板的100μL培養(yǎng)基(補(bǔ)充RPMI)中。PBMC和非粘著細(xì)胞加入孔內(nèi)(100μL)，板在含5％CO2的濕潤空氣中37℃孵育48小時(shí)。每孔移出150μL來測定以DD-母牛分枝桿菌刺激后，不同細(xì)胞產(chǎn)生的細(xì)胞因子的量。
DD-母牛分枝桿菌刺激PBMC分泌TNT-α和IL-10(圖11和12A，分別)，但刺激非粘著細(xì)胞產(chǎn)生IFN-γ(圖12B)。這些數(shù)據(jù)暗示DD-母牛分枝桿菌刺激的PBMC中IFN-γ生產(chǎn)受IL-10自身分泌抑制。例13熱滅活母牛分枝桿菌和去脂去糖脂母牛分枝桿菌活化T細(xì)胞下面檢測熱滅活母牛分枝桿菌和去脂去糖脂母牛分枝桿菌活化人T細(xì)胞和天然殺傷(NK)細(xì)胞的能力。
濃度為5×106細(xì)胞/mL的人外周血單核細(xì)胞(PBMC)與20μg/mL熱滅活母牛分枝桿菌或DD-母牛分枝桿菌培養(yǎng)24小時(shí)。對照細(xì)胞只與培養(yǎng)基培養(yǎng)。然后以抗CD 56(NK細(xì)胞的一種標(biāo)記)、αβT細(xì)胞或γδT細(xì)胞的單克隆抗體-S抗CD 69單克隆抗體聯(lián)用，染色培養(yǎng)細(xì)胞，其中CD 69是活化細(xì)胞表達(dá)的一種分子。細(xì)胞再以流式細(xì)胞計(jì)分析。表達(dá)CD 69的細(xì)胞百分?jǐn)?shù)見表6。
表6熱滅活母牛分枝桿菌和去脂去糖脂母牛分枝桿菌活化人T細(xì)胞和天然殺傷細(xì)胞
這些結(jié)果表明熱滅活母牛分枝桿菌和DD-母牛分枝桿菌活化αβ和γδT細(xì)胞及NK細(xì)胞。
Holt和Sly的新近研究(Nature Medicine 51127-1128，1999)表明，對氣喘，γδT細(xì)胞在保持正常氣道反應(yīng)性和下調(diào)氣道對抗原入侵的反應(yīng)性中是重要的，可能通過控制氣道內(nèi)皮細(xì)胞對γδT細(xì)胞細(xì)胞介導(dǎo)損傷的“修復(fù)”反應(yīng)。由于母牛分枝桿菌和DD-母牛分枝桿菌能活化γδT細(xì)胞，它們可能有效恢復(fù)機(jī)體存在γδT細(xì)胞的病變區(qū)如氣道、肺、皮膚和腸的正常內(nèi)皮。例14 以DD-母牛分枝桿菌-酸，DD-母牛分枝桿菌，HVac和EVac免疫對小鼠氣喘的影響此例說明以DD-母牛分枝桿菌和DD-母牛分枝桿菌衍生物DD-母牛分枝桿菌-酸，Hvac和EVac免疫對肺過敏性免疫反應(yīng)發(fā)展的影響。這在氣喘樣過敏原特異性肺病的小鼠模型中得到證實(shí)。此過敏性疾病的嚴(yán)重性反映于累積在氣道的巨大數(shù)目嗜酸性粒細(xì)胞。
在0和7日，腹膜內(nèi)注射200μL含10μg OVA和1mg明礬佐劑的乳劑使BALB/cByJ雌小鼠對OVA致敏化。在14和21日，麻醉小鼠，鼻內(nèi)或皮內(nèi)接種200μg DD-母牛分枝桿菌，DD-母牛分枝桿菌-酸，Hvac，Evac或PBS。在28和32日，麻醉小鼠，鼻內(nèi)施用100μg OVA于50μLPBS。在35日，殺死小鼠，并用PBS作支氣管肺泡灌洗(BAL)。BAL細(xì)胞以流式細(xì)胞計(jì)分析來測定嗜酸性粒細(xì)胞含量(％嗜酸性粒細(xì)胞)。嗜酸性粒細(xì)胞百分?jǐn)?shù)乘所得淋巴細(xì)胞總數(shù)即得總BAL嗜酸性粒細(xì)胞數(shù)，淋巴細(xì)胞總數(shù)由血細(xì)胞計(jì)數(shù)器測定。
如圖13示，DD-母牛分枝桿菌，Hvac和Evac致氣道嗜酸性粒細(xì)胞顯著抑制(示為％嗜酸性粒細(xì)胞)。例15 以O(shè)VA攻擊后施用DD-母牛分枝桿菌-酸對氣道嗜酸性粒細(xì)胞的抑制此例說明DD-母牛分枝桿菌-酸對肺過敏性免疫反應(yīng)發(fā)展的影響，如示于氣喘樣過敏原特異性肺病的小鼠模型。以O(shè)VA進(jìn)攻后三天施用DD-母牛分枝桿菌-酸來誘發(fā)嚴(yán)重的氣道嗜曙紅細(xì)胞增多。
在0和7日，腹膜內(nèi)注射200μL含10μg OVA和1mg明礬佐劑的乳劑使BALB/cByJ雌小鼠(每組十只)對OVA致敏化。在14和18日，麻醉小鼠，鼻內(nèi)進(jìn)攻100μg OVA于50μL PBS。在21日，再麻醉小鼠，并鼻內(nèi)施用200μg DD-母牛分枝桿菌-酸。在25日，殺死小鼠，并用PBS作BAL。對照小鼠接受PBS而非DD-母牛分枝桿菌-酸施用，其余處理同實(shí)驗(yàn)小鼠。BAL細(xì)胞以流式細(xì)胞計(jì)分析來測定嗜酸性粒細(xì)胞含量(％嗜酸性粒細(xì)胞)?？侭AL嗜酸性粒細(xì)胞數(shù)由嗜酸性粒細(xì)胞百分?jǐn)?shù)乘所得淋巴細(xì)胞總數(shù)而得到，淋巴細(xì)胞總數(shù)由血細(xì)胞計(jì)數(shù)器測定。
如圖14示，觀察到氣道嗜酸性粒細(xì)胞的顯著抑制(示為％嗜酸性粒細(xì)胞)，說明DD-母牛分枝桿菌-酸的療效。在PBS和DD-母牛分枝桿菌-酸處理的小鼠，氣道嗜曙紅細(xì)胞增多的嚴(yán)重性隨兩次OVA進(jìn)攻的時(shí)間間隔延長而降低。更進(jìn)一步，DD-母牛分枝桿菌-酸致所用全部三組小鼠嗜酸性粒細(xì)胞百分?jǐn)?shù)的統(tǒng)計(jì)顯著抑制。這些數(shù)據(jù)證實(shí)誘導(dǎo)氣道嗜曙紅細(xì)胞增多后施用DD-母牛分枝桿菌-酸有治療利益。例16 以O(shè)VA進(jìn)攻前即刻施用DD-母牛分枝桿菌-酸對氣道嗜酸性粒細(xì)胞的影響此例說明以二次OVA進(jìn)攻來誘導(dǎo)氣喘樣過敏原特異性肺病小鼠模型嚴(yán)重氣道嗜曙紅細(xì)胞增多之前一天，施用DD-母牛分枝桿菌-酸的療效。
在0和7日，腹膜內(nèi)注射200μL含10μg OVA和1mg明礬佐劑的乳劑使兩組BALB/cByJ雌小鼠對OVA致敏化。在14日，麻醉小鼠，鼻內(nèi)施用DD-母牛分枝桿菌-酸(200μg)。在15日，麻醉小鼠，鼻內(nèi)進(jìn)攻100μg OVA于50μL PBS。I組小鼠在19日接受第二次鼻內(nèi)100μg OVA于50μL PBS進(jìn)攻。II組小鼠在18日接受第二次200μg DD-母牛分枝桿菌-酸，然后在19日接受第二次OVA進(jìn)攻(100μg OVA于50μL PBS)。在22日殺死兩組小鼠并用PBS作BAL。兩組對照小鼠以PBS而非DD-母牛分枝桿菌-酸免疫，其余處理同實(shí)驗(yàn)組。BAL細(xì)胞樣品以流式細(xì)胞計(jì)來測定嗜酸性粒細(xì)胞含量(％嗜酸性粒細(xì)胞)。總BAL嗜酸性粒細(xì)胞由嗜酸性粒細(xì)胞百分?jǐn)?shù)乘所得淋巴細(xì)胞總數(shù)而得，淋巴細(xì)胞總數(shù)由血細(xì)胞計(jì)數(shù)器測得。
如見于圖15，觀察到氣道嗜曙紅細(xì)胞增多(示以％嗜酸性粒細(xì)胞)的統(tǒng)計(jì)顯著抑制(P＝0.0000015)，說明DD-母牛分枝桿菌-酸的療效。當(dāng)僅在第一次入侵前以DD-母牛分枝桿菌-酸處理小鼠時(shí)，嗜酸性粒細(xì)胞百分?jǐn)?shù)減少20％。當(dāng)在兩次入侵前均以DD-母牛分枝桿菌-酸處理小鼠時(shí)，氣道嗜曙紅細(xì)胞增多的抑制被增強(qiáng)，指示為嗜酸性粒細(xì)胞百分?jǐn)?shù)減少40％。例17 以O(shè)VA進(jìn)攻后施用DD-母牛分枝桿菌-酸對氣道嗜曙紅細(xì)胞增多的抑制此例說明以O(shè)VA進(jìn)攻后三天，以DD-母牛分枝桿菌衍生物DD-母牛分枝桿菌-酸兩次免疫，對氣喘樣過敏原特異性肺病小鼠模型中肺過敏性免疫反應(yīng)發(fā)展的影響。
在0和7日，腹膜內(nèi)注射200μL含10μg OVA和1mg明礬佐劑的乳劑使三組BALB/cByJ雌小鼠對OVA致敏化。在14日，麻醉全部小鼠，鼻內(nèi)進(jìn)攻100μg OVA于50μL PBS。在18日，再麻醉全部小鼠，鼻內(nèi)施用200μg DD-母牛分枝桿菌-酸。I組小鼠在21日(第一次進(jìn)攻后七天)以O(shè)VA(100μg于50μL PBS)第二次鼻內(nèi)進(jìn)攻。在24日殺死這些小鼠，并用PBS作BAL。II組小鼠在25日(第一次進(jìn)攻后11天)接受第二次OVA進(jìn)攻，在28日殺死，并用PBS作BAL。III組小鼠在25日接受200μg DD-母牛分枝桿菌-酸。這些小鼠在28日(第一次進(jìn)攻后14日)接受第二次100μg OVA于50μL PBS入侵，在31日殺死，并用PBS作BAL。三組對照小鼠接受PBS而非DD-母牛分枝桿菌-酸，其余免疫處理同實(shí)驗(yàn)組。BAL細(xì)胞樣品以流式細(xì)胞計(jì)分析來測定嗜酸性粒細(xì)胞含量(％嗜酸性粒細(xì)胞)?？侭AL嗜酸性粒細(xì)胞數(shù)由嗜酸性粒細(xì)胞百分?jǐn)?shù)乘所得淋巴細(xì)胞總數(shù)而得到，淋巴細(xì)胞總數(shù)以血細(xì)胞計(jì)數(shù)器測定。
如圖16示，觀察到氣道嗜曙紅細(xì)胞增多(示以％嗜酸性粒細(xì)胞)的統(tǒng)計(jì)顯著抑制，說明DD-母牛分枝桿菌-酸的療效。在PBS和DD-母牛分枝桿菌-酸處理的小鼠，氣道嗜曙紅細(xì)胞增多的嚴(yán)重性隨兩次OVA進(jìn)攻時(shí)間間隔延長而降低。進(jìn)一步，DD-母牛分枝桿菌-酸在所有三種所用方法中均致嗜酸性粒細(xì)胞百分?jǐn)?shù)的統(tǒng)計(jì)顯著抑制。
第一次進(jìn)攻后四天，以DD-母牛分枝桿菌-酸處理小鼠三天后繼以第二次進(jìn)攻(進(jìn)攻遲滯＝7日)，氣道嗜曙紅細(xì)胞增多減緩約15％(I組；P＝0.034)。當(dāng)?shù)诙芜M(jìn)攻又遲滯四天時(shí)，觀察到稍高程度(約25％)的抑制(II組；P＝0.036)。當(dāng)?shù)诙芜M(jìn)攻前，以DD-母牛分枝桿菌-酸兩次處理小鼠時(shí)，氣道嗜曙紅細(xì)胞增多被抑制56％(III組；P＝0.0000027)。這些數(shù)據(jù)顯示，氣道嗜曙紅細(xì)胞增多誘發(fā)后，施用DD-母牛分枝桿菌-酸有療效。
盡管本發(fā)明已通過說明和實(shí)例詳述以便理解清晰，可以進(jìn)行不離開本發(fā)明范圍的改變和修飾，本發(fā)明僅限于所附權(quán)利要求的范圍。
權(quán)利要求
1.含至少以下一種成分的一種組合物(a)已經(jīng)堿水解處理的去脂去糖脂母牛分枝桿菌細(xì)胞；(b)已經(jīng)酸水解處理的去脂去糖脂母牛分枝桿菌細(xì)胞；(c)已經(jīng)高碘酸處理的去脂去糖脂母牛分枝桿菌細(xì)胞；(d)已經(jīng)堿水解和酸水解處理的去脂去糖脂母牛分枝桿菌細(xì)胞；(e)已經(jīng)堿水解和高碘酸處理的去脂去糖脂母牛分枝桿菌細(xì)胞；(f)已經(jīng)蛋白酶K處理的去脂去糖脂母牛分枝桿菌細(xì)胞；和(g)已經(jīng)氫氟酸處理的去脂去糖脂母牛分枝桿菌細(xì)胞。
2.權(quán)利要求1的組合物，其中成分含半乳糖量小于總碳水化合物的9.7％。
3.權(quán)利要求1的組合物，其中成分含葡糖胺量大于總碳水化合物的3.7％。
4.權(quán)利要求1的組合物，其中成分與未處理的去脂去糖脂母牛分枝桿菌細(xì)胞相比，貧化分枝菌酸。
5.權(quán)利要求1的組合物，其中成分與未處理的去脂去糖脂母牛分枝桿菌細(xì)胞相比，貧化阿拉伯半乳聚糖。
6.權(quán)利要求1的組合物，其中成分與未處理的去脂去糖脂母牛分枝桿菌細(xì)胞相比，貧化蛋白質(zhì)。
7.權(quán)利要求1的組合物，其中成分與未處理的去脂去糖脂母牛分枝桿菌細(xì)胞相比，貧化糖苷鍵。
8.權(quán)利要求1的組合物，另含佐劑。
9.治療患者失調(diào)的一種方法，包括向患者施用據(jù)權(quán)利要求1的組合物，失調(diào)選自以下呼吸系統(tǒng)失調(diào)和過敏性失調(diào)。
10.權(quán)利要求9的方法，其中失調(diào)選自以下分枝桿菌感染，氣喘，肉樣瘤病，過敏性鼻炎，特異反應(yīng)性皮炎和肺癌。
11.權(quán)利要求9的方法，其中呼吸系統(tǒng)失調(diào)為氣喘。
12.權(quán)利要求9的方法，其中呼吸系統(tǒng)失調(diào)表征為呼吸系統(tǒng)組織嗜曙紅細(xì)胞增多。
13.減緩患者嗜曙紅細(xì)胞增多的一種方法，包括向患者施用據(jù)權(quán)利要求1的組合物。
14.增強(qiáng)IL-10生產(chǎn)的一種方法，包括施用含至少一種以下成分的組合物(a)去脂去糖脂母牛分枝桿菌細(xì)胞；(b)已經(jīng)堿水解處理的去脂去糖脂母牛分枝桿菌細(xì)胞；(c)已經(jīng)酸水解處理的去脂去糖脂母牛分枝桿菌細(xì)胞；(d)已經(jīng)高碘酸處理的去脂去糖脂母牛分枝桿菌細(xì)胞；(e)已經(jīng)堿水解和酸水解處理的去脂去糖脂母牛分枝桿菌細(xì)胞；和(f)已經(jīng)堿水解和高碘酸處理的去脂去糖脂母牛分枝桿菌細(xì)胞。
15.權(quán)利要求14的方法，其中組合物還含佐劑。
16.治療患者失調(diào)的一種方法，包括向患者施用含至少一種以下成分的組合物(a)去脂去糖脂母牛分枝桿菌細(xì)胞；(b)已經(jīng)堿水解處理的去脂去糖脂母牛分枝桿菌細(xì)胞；(c)已經(jīng)酸水解處理的去脂去糖脂母牛分枝桿菌細(xì)胞；(d)已經(jīng)高碘酸處理的去脂去糖脂母牛分枝桿菌細(xì)胞；(e)已經(jīng)堿水解和酸水解處理的去脂去糖脂母牛分枝桿菌細(xì)胞；和(f)已經(jīng)堿水解和高碘酸處理的去脂去糖脂母牛分枝桿菌細(xì)胞；其中失調(diào)選自以下動(dòng)脈粥樣硬化；癌癥；高膽固醇血癥；細(xì)菌感染；和胰島素依賴性糖尿病。
17.權(quán)利要求16的方法，其中組合物另含佐劑。
18.權(quán)利要求16的方法，其中成分含半乳糖量小于總碳水化合物的9.7％。
19.權(quán)利要求16的方法，其中成分含葡糖胺量大于總碳水化合物的3.7％。
20.含至少一種以下成分的一種組合物(a)已經(jīng)堿水解處理的去脂去糖脂分枝桿菌細(xì)胞；(b)已經(jīng)酸水解處理的去脂去糖脂分枝桿菌細(xì)胞；(c)已經(jīng)高碘酸處理的去脂去糖脂分枝桿菌細(xì)胞；(d)已經(jīng)堿水解和酸水解處理的去脂去糖脂分枝桿菌細(xì)胞；(e)已經(jīng)堿水解和高碘酸處理的去脂去糖脂分枝桿菌細(xì)胞；(f)已經(jīng)蛋白酶K處理的去脂去糖脂分枝桿菌細(xì)胞；和(g)已經(jīng)氫氟酸水解處理的去脂去糖脂分枝桿菌細(xì)胞。
21.權(quán)利要求20的組合物，其中分枝桿菌細(xì)胞選自結(jié)核分枝桿菌和恥垢分枝桿菌。
22.治療患者呼吸系統(tǒng)失調(diào)的一種方法，包括向患者施用 20的組合物。
23.權(quán)利要求22的方法，其中組合物含至少以下成分之一(a)去脂去糖脂結(jié)核分枝桿菌；和(b)去脂去糖脂恥垢分枝桿菌。
24.權(quán)利要求22的方法，其中呼吸系統(tǒng)失調(diào)選自分枝桿菌感染，氣喘，肉樣瘤病，過敏性鼻炎和肺癌。
25.權(quán)利要求22的方法，其中呼吸系統(tǒng)失調(diào)為氣喘。
26.權(quán)利要求22的方法，其中呼吸系統(tǒng)失調(diào)表征為呼吸系統(tǒng)組織嗜曙紅細(xì)胞增多。
27.活化患者γδT細(xì)胞，γδT細(xì)胞或NK細(xì)胞的一種方法，包括施用含至少一種以下成分的組合物(a)熱滅活母牛分枝桿菌細(xì)胞；(b)去脂去糖脂母牛分枝桿菌細(xì)胞；(c)已經(jīng)堿水解處理的去脂去糖脂母牛分枝桿菌細(xì)胞；(d)已經(jīng)酸水解處理的去脂去糖脂母牛分枝桿菌細(xì)胞；(e)已經(jīng)高碘酸處理的去脂去糖脂母牛分枝桿菌細(xì)胞；(f)已經(jīng)堿水解和酸水解處理的去脂去糖脂母牛分枝桿菌細(xì)胞；和(g)已經(jīng)堿水解和高碘酸處理的去脂去糖脂母牛分枝桿菌細(xì)胞。
28.修復(fù)患者上皮的一種方法，包括施用含至少以下成分之一的組合物(a)熱滅活母牛分枝桿菌細(xì)胞；(b)去脂去糖脂母牛分枝桿菌細(xì)胞；(c)已經(jīng)堿水解處理的去脂去糖脂母牛分枝桿菌細(xì)胞；(d)已經(jīng)酸水解處理的去脂去糖脂母牛分枝桿菌細(xì)胞；(e)已經(jīng)高碘酸處理的去脂去糖脂母牛分枝桿菌細(xì)胞；(f)已經(jīng)堿水解和酸水解處理的去脂去糖脂母牛分枝桿菌細(xì)胞；和(g)已經(jīng)堿水解和高碘酸處理的去脂去糖脂母牛分枝桿菌細(xì)胞。
全文摘要
提供了一種用于治療呼吸系統(tǒng)的免疫介導(dǎo)失調(diào),如分枝桿菌如結(jié)核分枝桿菌、貪食分枝桿菌,肉樣瘤病、氣喘和肺癌,該方法包括適用至少一種脫脂或脫糖脂的母牛分枝桿菌細(xì)胞。
文檔編號A61K35/66GK1371285SQ00808400
公開日2002年9月25日 申請日期2000年6月1日 優(yōu)先權(quán)日1999年6月2日
發(fā)明者J·D·瓦特森, P·L·J·譚, R·L·普雷斯蒂格 申請人:吉尼西斯研究及發(fā)展有限公司