專利名稱：重組融合蛋白,含該重組融合蛋白的(疫苗)組合物及其制備方法
技術領域：
本發(fā)明涉及一種重組融合蛋白，含該重組融合蛋白的(疫苗)組合物及該重細融合蛋白的制備方法。
豬的水腫病是由形成志賀菌毒素的大腸桿菌(STEC)引起的。這種病原體對這種臨床疾病唯一負責的主要毒性因素是2e志賀菌毒素(Stx2e)(Mac Leod等人，1991)。由于這種疾病在大多數(shù)情況下發(fā)病甚急，開始治療時又大多太遲，或者未取得預期的效果，因而研究一種有效的預防方法是很有意義的。但是，Stx2e的制備和徹底純化都存在問題Stx2e的B亞單位由于各種原因被考慮用作疫苗候選物。它是從康復豬仔的血清中鑒定的，即它具有抗原決定族。其次，該毒素的B-亞單位在胃腸外施用之后誘導中和毒素的抗體形成(Acheson等人1996；Boyd等人1991)。籍助基因工程方法成功地制備了一種重組融合蛋白，該融合蛋白由Stx2eB亞單位和Shistosoma Japonicum的谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶的片段組成(Franke等人1995)。對患水腫病的斷奶仔豬的病原體排泄以及對STEC感染的免疫反應進行了長時間的研究。為證明Stx2e抗體存在所用的由Stx2eB亞單位和谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶片段組成的重組融合蛋白很好地適宜于間接證明STEC感染，迄今被視為預防水腫病的潛在疫苗(Wieler L.H.，F(xiàn)ranke Sylvia，Rose M.和Karch H.用一種志賀菌類毒素IIe的重組B-亞單位表征豬水腫病的免疫響應，在BadNau-heim 21.DVG會議上的報告(1995.3))。
因此，本發(fā)明的目的在于，提供適用于接種目的的重組融合蛋白，編碼它的質(zhì)粒，用于與水腫，特別是豬水腫相關的各種不同用途的含該融合蛋白的(疫苗)組合物以及該重組融合蛋白的制備方法。
該目的是通過具有權利要求1特征的重組融合蛋白，具有權利要求5特征的(疫苗)組合物，符合權利要求18的含質(zhì)粒的大腸桿菌菌株和具有權利要求20特征的方法來實現(xiàn)的。本發(fā)明的其它方面描述在從屬權利要求中。
本發(fā)明提供一種重組融合蛋白和一種含有這種重組融合蛋白的(疫苗)組合物，它們可以用于有關水腫病，尤其是豬水腫病的各種用途。尤其考慮下列用途-證明抗Stx2e的抗體，-診斷水腫病，-產(chǎn)生抗水腫病病原體毒素的單克隆抗體，尤其是作為檢查制備重組融合蛋白的收率的基礎或通過免疫親和層析純化制備全毒素的基礎，-針對水腫病，尤其是豬水腫病的免疫。
重組融合蛋白是2e志賀菌毒素的亞基因Stx2e片段和一種末端標記物的融合物，該末端標記物大小大約相當于該片段的大小或該片段一部分的大小。末端標記物是該蛋白質(zhì)氨基酸序列的標記的末端基團。該亞基因Stx2e片段優(yōu)選是2e志賀菌毒素的B亞單位(Stx2eB)。末端標記物的大小最大優(yōu)選為5kDa，其最大更優(yōu)選為1kDa。該末端標記物還優(yōu)選是氨基末端His-標記物。該His-標記物包含6個細氨酸。其大小約為0.66kDa。
重組融合蛋白具有天然蛋白質(zhì)的實質(zhì)性抗原域。這是其適宜于水腫病相關各種用途的原因。的確，這還是理論性的，在迄今所知的由Stx2eB亞單位和谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶的片段細成的重組融合蛋白已證明這點。但是，這里存在的問題是，按申請人的估計，必須考慮干擾性的免疫反應，它們防礙屬間的融合蛋白(generic fusion protein)對，例如，治療目的的應用。相反，本發(fā)明的融合蛋白的顯著優(yōu)點在于，這里由于專門選擇的標記物，可不考慮干擾性的免疫反應，從而第一次提供了能在疫苗中應用的融合蛋白。如屬間的融合蛋白一樣，本發(fā)明所采用的標記物亦對制備重組融合蛋白有利，尤其對其純化，例如通過親和層析方法的純化有利。
交聯(lián)His-Stx2eB單體的低聚物能特別有效地形成融合蛋白。
按照一個有利的方面，(疫苗)組合物除了重組融合蛋白之外還包含至少一種外加抗原。疫苗組合物是免疫原性量的重組融合蛋白和免疫原性量的至少一種外加抗原的配方。用這種組合疫苗可同時實現(xiàn)對豬水腫病和至少一種其它疾病的免疫接種。
(變苗)組合物除了重組的融合蛋白之外可以包含至少一種外加抗原，該外加抗原選自含有與細胞結合的類毒素的多殺巴斯德氏菌(Pasteurellamultocida)菌苗，支氣管炎博德特氏菌(Bordetella bronchiseptica)菌苗，豬缸斑丹毒絲菌(Erysipelothrix rhusiopathiae)抗原，多殺巴斯德氏菌D型和/或大腸桿菌和/或產(chǎn)氣莢膜梭菌(Clostridium perfringens)的一種或多種可溶性非細胞類毒素(non-cell toxiods)，多殺巴斯德氏菌A或D型的滅活全細胞，大葉性肺炎放線桿菌(Actinobacillus pleuropneumoniae)、副豬嗜血菌(Haemophilus parasuis)、大腸桿菌、產(chǎn)氣莢膜梭菌、豬鏈球菌(Streptococcus suis)、豬肺炎支原體(Mycoplasma hyopneumoniae)、以及豬生殖和呼吸綜合征病毒(Porcine Reproduction and Respiratory SyndromVirus)、流感病毒、假狂犬病病毒和豬環(huán)狀病毒I和II的培養(yǎng)物。
已知前面所提及的抗原是下列疾病的原因-多殺巴斯德氏菌和支氣管炎博德特氏菌引起豬進行性萎縮性鼻炎，亦稱“吸鼻涕病”；在致病方面，主要是多殺巴斯德氏菌毒素起重要作用(商用疫苗中該類毒素成分是重要的)。
-多殺巴斯德氏菌A和D型引起豬的呼吸道疾病(肺炎)，多殺巴斯德氏菌D亦引起鼻呼吸阻塞病。
-豬紅斑丹毒絲菌引起豬丹毒病-大腸桿菌引起腹瀉病(豬水腫病是其中一種特殊形式)(毒素起決定作用)-產(chǎn)氣莢膜梭菌引起乳豬壞死性腸炎(毒素起決定作用)-大葉性肺炎放線桿菌引起出血壞死性胸膜肺炎-副豬嗜血菌格拉瑟病(纖維蛋白性漿膜炎和關節(jié)炎)-豬鏈球菌鏈球菌敗血癥-豬肺炎支原體引起地方性獸肺炎，亦稱“仔豬流感”-豬生殖和呼吸綜合征病毒仔豬呼吸道病(肺炎)，母豬不育癥-流感病毒呼吸道病-假狂犬病病毒引起豬的奧耶斯基病(假狂犬病)-豬環(huán)狀病毒I和II斷奶后多系統(tǒng)消瘦(Post-weaningmultisystemicwasting)綜合征。
該至少一種外加抗原優(yōu)選這樣選擇，即它與一種疾病有關，該疾病典型地與水腫病在大致相同的年齡侵害豬。上面所引的抗原基本上是這種情況。因而此疫苗組合物使得可以特別有效地聯(lián)合接種。
該疫苗組合物中優(yōu)選含有重組融合蛋白和/或該至少一種外加抗原，每一種的量為免疫原性量，用于抗豬水腫病及其它病毒和/或細菌感染的豬接種。
此外，本發(fā)明涉及疫苗組合物，其成份和/或數(shù)量這樣選擇，即相關動物對至少一種疾病的免疫可通過先后和/或同時接種疫苗細合物實現(xiàn)。
對疫苗細合物，特別重要的是佐劑的選擇。例如可采用W/O/W乳劑(例如ISA206)，W/O乳劑(例如iFA不完全弗氏佐劑)，水性懸浮劑(例如氫氧化鋁)或0/W乳劑。
按照本發(fā)明的方法，為了重組制備與末端標記物融合的2e志賀菌毒素(Stx2e)的亞基因片段，在一合適的載體系統(tǒng)中從Stx2e操縱子克隆亞單位，產(chǎn)生的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至大腸桿菌菌株中，誘導所產(chǎn)生的表達系統(tǒng)，該融合蛋白被表達并被純化。
將2e志賀菌毒素B-亞單位(Stx2eB)的基因克隆在不同的表達載體中。用這樣產(chǎn)生的重細質(zhì)粒轉(zhuǎn)化各種大腸桿菌K12實驗室菌株。將全部轉(zhuǎn)化體在表達研究中在變化的條件下(溫度，誘導水平，誘導時間)進行重組B-亞單位形成測試。確定這種轉(zhuǎn)化體或克隆，其重組蛋白相對細胞總蛋白含量的產(chǎn)率最高。對由這種菌株形成的融合蛋白，即含有成熟的B-亞單位和N端His-標記物(His-Stx2eB)的融合蛋白，開發(fā)了一種純化方法，并以實驗室規(guī)模進行了試驗。為了將這種純化方法在大規(guī)模上實施，擬采用應用適宜緩沖體系的FPLC。
實施例Stx2e重組B亞單位的制備為了制備重組B亞單位，采用了菌種大腸桿菌Cux-Stx2eB，DSM編號12721(德意志微生物保藏中心(Deutsche Sammlung von Mikroorganismen undZellkulturen GmbH)，Mascheroder Weg I b，D-38124 Brauschweig)。這種大腸桿菌實驗室菌株含有質(zhì)粒pHIT-24，這種質(zhì)?？寺×薙tx2e的B-亞單位。
從此菌種建立種子分批體系并在-78℃冷藏于2ml低溫小瓶中。
為了產(chǎn)生重組B亞單位，將1安瓿工作種子(2ml)融化以便培養(yǎng)預培養(yǎng)物1。
預培養(yǎng)物1的制備條件如下培養(yǎng)基150ml無菌的標準I營養(yǎng)內(nèi)湯+0.01％氨芐青霉素放入300ml的三角瓶中。培養(yǎng)37℃，15小時，直立靜置培養(yǎng)。
采用帶有5升培養(yǎng)容器的發(fā)酵罐“BIOSTAT B”制備主要物質(zhì)。此培養(yǎng)容器裝有4L標準I營養(yǎng)肉湯+0.01％氨芐青霉素，并作為一單元在121℃下高壓滅菌25分鐘。
將預培養(yǎng)物1放入此培養(yǎng)基中，并在下列條件下培養(yǎng)6小時溫度37℃pH＝7.0-7.1攪拌速度100-150rpm空氣導入量2升/分鐘pH的控制通過自動加入無菌的10％NaOH溶液來保證。
誘導在培養(yǎng)6小時之后通過添加0.25mM IPIG溶液(異丙基-β-D-硫代吡喃型半乳糖苷)進行，pH從7.1躍至7.5.誘導時間約為3.5小時。
然后將培養(yǎng)物泵入10升收集容器中并在一離心機中以2500xg離心。除去上清液體，粒狀沉淀放入200ml 8M尿素緩沖液中并在冷室(4-8℃)放置約15小時.然后對所得重懸沉淀進行超聲處理(4×15分鐘，190赫茲，0.3秒脈沖)，接著以10000xg離心。上清液體小心取出并進一步處理，丟棄此步驟得到的沉淀。
接著將此溶液籍助超濾(“Pellicon XL”)從200ml濃縮至80ml。
這樣得到的80ml蛋白質(zhì)溶液然后籍助親和層析(FPLC“ktaexplorer”)進一步處理。
對所得含重組目的蛋白質(zhì)的材料分份，每份3ml，并送入一裝有金屬螯合物基質(zhì)(NI-NTA，Qiagen)的柱(容積8ml)中。
這種基質(zhì)專門結合重組蛋白質(zhì)的His-標記物。
目的蛋白質(zhì)被金屬滯留并在變性的條件下(8M尿素，0.1M Na2HPO4，10mMTris/HCl，pH8)洗滌。
去除污染蛋白質(zhì)之后，重組蛋白質(zhì)通過pH跳躍(8M尿素，0.1M NaH2PO4，10mMTris/HCL，pH3)從親合基質(zhì)上脫附并在柱出口被收集。
純化后的蛋白質(zhì)籍助交叉流過濾(Cross-Flow-Filtration)(孔尺寸5kDa)濃縮。經(jīng)過純化和收率檢驗之后(通過SDS凝膠電泳，Western印跡，Elisa，蛋白質(zhì)測定)將尿素緩沖液與一種生理緩沖溶液(PBS，PH7.2)進行交換，交換籍助交叉流過濾(孔尺寸5kDa)實現(xiàn)。
重組蛋白質(zhì)的濃度為300μg/ml。
重組融合蛋白的描述目的蛋白質(zhì)由基因片段Stx2eB編碼。Stx2eB亞單位亞基因片段的大小為228bp。
對重組蛋白質(zhì)的下列性質(zhì)進行檢驗1.分子量大小從SDS凝膠電泳得出目的蛋白質(zhì)的分子量約為7.5kDa.
2.在免疫印跡中用患病仔豬血清檢查重組蛋白對純化后的抗原用患有水腫病的仔豬血清在免疫印跡進行研究。動物用的是養(yǎng)豬場的仔豬，其中出現(xiàn)明白無誤的Stx2e-大腸桿菌菌株的臨床癥狀。這種血清的90％以上與重組蛋白質(zhì)呈陽性反應。為了排除錯誤的陽性結果，曾用偶聯(lián)在Schistosoma japonicum谷胱甘肽S轉(zhuǎn)移酶上的B-亞單位確證了該研究。
3.用抗Stx2eB單克隆抗體檢查重組蛋白質(zhì)。
為了確定重組B-亞單位的結構是否與野生型蛋白質(zhì)相近，曾用斑點印跡方法對重組Stx2eB進行了研究。為此采用了單克隆抗體BC5BB12，該抗體特異識別Stx2的B-亞單位并與Stx2eB亞單位發(fā)生交叉反應。作為陽性檢驗，引入Stx2e全毒素。作為陰性檢驗采用一種Stx1的粗毒素制劑。
單克隆抗體BC5BB12既與Stx2e全毒素反應又與重組Stx2eB蛋白質(zhì)反應，但不與Stx1反應。
4.在Vero細胞試驗中檢驗重組蛋白質(zhì)的細胞毒性重組蛋白的細胞毒性在對Vero細胞，Hela細胞以及MDBK細胞的毒性試驗中進行了研究。為此目的，應用了濃度為0.3μg/ml-100μg/ml的重組Stx2eB。即使在最低的稀釋階段也未能在被研究的細胞系中發(fā)現(xiàn)與陰性實驗(無重組蛋白質(zhì)的緩沖液)有顯著的差別。結果征實，重組的Stx2eB本身不帶細胞毒性。
5.家兔試驗證明重組Stx2eB的免疫性。
使兩只品種為“Weiβe Neuseel鋘der”，兔齡約為12個月的雄家兔接受重組Stx2eB免疫。第一次接種時，皮下注射添加有不完全弗氏佐劑(iFA)的100μg抗原。六星期之后皮下注射50μg重組Stx2eB加強免疫，同樣添加iFA。對接種前后得到的血清在免疫印跡上進行試驗。
在兩只兔子中皆證明有特異的血清轉(zhuǎn)換。
疫苗制劑制備的描述(實施例)1.W/O/W疫苗制劑的制備在無菌條件下將抗原作為水相(溫度22℃)在攪拌下(速度＜2000rpm)連續(xù)加入佐劑(例如Montanide ISA206)，然后乳液在約2000rpm下勻化10分鐘。
在8℃下放置24小時之后將疫苗制劑重新勻化。用顯微鏡和染色試驗檢驗相位(Phasenlage)。
2.W/O疫苗制劑的制備。
在無菌條件下將抗原作為水相(溫度22℃)在攪拌下(速度＜2000rpm)連續(xù)加入佐劑(例如不完全弗氏佐劑)并進行乳化。
用顯微鏡和染色試驗檢驗相位。
3.水相懸浮物的制備。
在無菌條件下將水性抗原在攪拌下(例如磁力攪拌器)連續(xù)加入水性佐劑(例如氫氧化鋁)并進行攪拌。
疫苗根據(jù)參數(shù)pH和滲漲度(tonizitt)檢驗。
4.O/W-懸浮物的制備。
在無菌條件下將水相抗原連續(xù)加入佐劑并進行乳化。
用顯微鏡和染色試驗檢驗相位。
疫苗制劑制成之后直至進一步應用之前皆在+4℃-+8℃的溫度下置于冰箱中存放。
應用不同疫苗制劑證明重組Stx2eB對目標動物豬的免疫原性作用的例子試驗目的研究的問題基因工程方法制備的重組Stx2eB蛋白質(zhì)(應用不同佐劑的條件下)能否在兩次肌肉注射之后在仔豬體內(nèi)誘導免疫反應？為進行此試驗用了8只年齡為6周的仔豬。
用疫苗制劑處理6只動物，2只動物給予一種安慰劑。
接種，間隔3周施用疫苗2次。
從每只動物采集下列血樣1.第1次免疫之前2.第1次免疫之后14天3.直接在第2次免疫之前(第1次免疫之后21天)4.第2次免疫之后14天5.第2次免疫之后21天血清用Elisa檢查重組Stx2eB的特異性抗體的存在。此外還評價了疫苗的相容性和安全性值。一般的試驗數(shù)據(jù)動物動物種類豬動物類別Absetzer年齡6周(第1次免疫時)性別混雜試驗開始時動物的免疫狀況Stx2eB抗體陰性飼養(yǎng)方式分組飼養(yǎng)喂養(yǎng)方案隨意水供應由自來水管隨意供應飼料添加劑的應用無疫苗接種參數(shù)施用方法注射施用途徑肌內(nèi)兩次免疫注射的間隔3周所用疫苗的預處理無試驗動物的預處理無被免疫動物數(shù)目8對照動物2研究方案隨機化，盲試接種劑量，動物特征，疫苗使用具體試驗計劃列于表l。關鍵佐劑佐劑A-ISA206佐劑B-iFA佐劑C-Montanide試驗進程副反應的出現(xiàn)在第1次免疫后-一般狀況和進食有輕微影響，動物7和8體溫稍增+輕微腹瀉。
在第2次免疫后-除動物8體溫增高外無其它副反應。
在試驗過程中被淘汰的動物數(shù)仔豬2，原因大腸桿菌引起的胃和腸炎與接種無關的疾病的出現(xiàn)除仔豬2的疾病外，無用其它藥劑治療無結果疫苗制劑的相容性和安全性總體評估，疫苗制劑是相容的和安全的，雖然在第1次免疫之后動物7和8的一般狀況稍有干繞，進食受到短時間不利影響，體溫增高及輕微腹瀉。第2次免疫未出現(xiàn)臨床癥狀。只有動物8對再次注射疫苗出現(xiàn)體溫升高的反應。
局部組織反應—觸診發(fā)現(xiàn)輕微水腫-僅動物5和6在第1次免疫后在注射處出現(xiàn)。
在仔豬宰殺之后，除動物1和3之外皆在注射通道(Strichkanal)周圍發(fā)現(xiàn)宏觀可識別的炎癥，全部動物的炎癥處皆被壞死材料塞滿。對仔豬1和3的組織學研究能發(fā)現(xiàn)，只有結締組織輕微增生(成血管細胞滲有淋巴細胞和組織細胞)，而所有其它仔豬被壞死材料填滿的注射通道皆被一種結締組織的被膜包圍。在結締組織的被膜上可觀察到帶淋巴細胞和組織細胞滲入的炎癥。
疫苗制劑的有效性這組試驗表明，重組Stx2eB在年齡6周的仔豬肌內(nèi)注射后，可被動物免疫系統(tǒng)識別并誘發(fā)免疫反應，產(chǎn)生特異性的免疫球蛋白。
可籍助Elisa和免疫印跡證明這種抗體的存在。
免疫反應的強度似乎取決于所采用的疫苗制劑選取。
在所選的試驗條件下，W/O乳劑(例如在采用iFA的條件下)可達到最佳效果。表2列出了詳細結果。
表1被測樣本、動物體重和注射的疫苗量
表2免疫試驗得出的豬血清試樣的抗-Stx-B2e的血清檢驗結果
+陽性檢驗+++(808)；陰性檢驗-(187，3)
保藏的微生物大腸桿菌菌株Cux-Stx2eB以原始名稱Cux-SLT-IIe-B，保藏在德意志微生物保藏中心(DSMZ-Deutsche Sammlung von Mikroorganismenund Zellkulturen GmbH，Mascheroder Weg 1b，D-38124 Brauschweig)。
該保藏單位指定的該微生物保藏號為DSM 12721。
關于保藏的微生物的說明(PCT實施細則第13條之二)
PCT/RO/134表
權利要求
1.重組融合蛋白，其包括與末端標記物融合的2e志賀菌毒素(Stx2e)亞基因Stx2e片段，此末端標記物的大小約相當于該片段或該片段一部分的大小。
2.根據(jù)權利要求1的重組融合蛋白，其中該亞基因Stx2e片段是2e志賀菌毒素的B亞單位(Stx2eB)。
3.根據(jù)權利要求1或2的重組融合蛋白，其中末端標記物的大小最大為1kDa。
4.根據(jù)權利要求1-3之任一項的重組融合蛋白，其帶有氨基末端His標記物。
5.根據(jù)權利要求1-4之任一項的重組融合蛋白，其具有許多交聯(lián)的融合蛋白質(zhì)。
6.用于與動物，尤其是哺乳動物，具體地是豬的水腫病有關的各種應用的(疫苗)組合物，該組合物具有與末端標記物融合的2e志賀菌毒素(Stx2e)亞基因片段，此末端標記物的大小約相當于該片段或該片段一部分的大小。
7.根據(jù)權利要求6的(疫苗)組合物，其中該亞基因Stx2e片段是2e志賀菌毒素的B亞單位(Stx2eB)。
8.根據(jù)權利要求6或7的(疫苗)細合物，其中末端標記物的大小為1kDa。
9.根據(jù)權利要求6-8之任一項的(疫苗)組合物，其帶有氨基末端His標記物。
10.根據(jù)權利要求6-9之任一項的(疫苗)細合物，其具有許多交聯(lián)的融合蛋白。
11.根據(jù)權利要求6-10之任一項的(疫苗)組合物，其還包含一種外加抗原或多種外加抗原。
12根據(jù)權利要求11的(疫苗)組合物，其中所述一種外加抗原或多種外加抗原選自含有與細胞結合的類毒素的多殺巴斯德氏菌菌苗，支氣管炎博德特氏菌菌苗，豬紅斑丹毒絲菌抗原，D型多殺巴斯德氏菌和/或大腸桿菌和/或產(chǎn)氣莢膜梭菌的一種或多種可溶性非細胞類毒素，A型或D型多殺巴斯德氏菌的滅活全細胞，大葉性肺炎放線桿菌、副豬嗜血菌、大腸桿菌、產(chǎn)氣莢膜梭菌、豬鏈球菌、豬肺炎支原體、以及豬生殖和呼吸綜合征病毒、流感病毒、假狂犬病病毒和豬環(huán)狀病毒I和II的培養(yǎng)物。
13.根據(jù)權利要求6-12之任一項的(疫苗)組合物，其包含與末端標記物融合的2e志賀菌毒素(Stx2e)亞基因Stx-IIe片段和/或包含至少一種外加抗原，每一種的量為免疫原性量，用于接種豬以防治豬的水腫病或防治豬的水腫病及其它病毒和/或細菌感染。
14.根據(jù)權利要求6-13之任一項的(疫苗)組合物，其組成和數(shù)量能使它們在先后和/或同時接種豬后對豬的水腫病或豬的水腫病及其它病毒和/或細菌感染產(chǎn)生免疫。
15.具有與末端標記物融合的2e志賀菌毒素(Stx2e)亞基因Stx2e片段的，尤其是根據(jù)權利要求6-12之任一項的(疫苗)細合物，該組合物是一種W/O/W乳劑，一種O/W乳劑，一種W/O乳劑或一種水性懸浮液。
16.根據(jù)權利要求15的(疫苗)組合物，其含有不完全弗氏佐劑(iFA)。
17.質(zhì)粒，其含有編碼權利要求1-6之任一項的融合蛋白質(zhì)的DNA。
18.用權利要求17的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化的大腸桿菌菌株。
19.權利要求18的大腸桿菌菌株，其保藏在DSMZ-德意志微生物保藏中心，保藏編號為DSM 12721。
20.與末端標記物融合的2e志賀菌毒素(Stx2e)亞基因片段的重組制備方法，其中將Stx2e操縱子的亞單位克隆到適宜的載體系統(tǒng)中，將產(chǎn)生的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至一種大腸桿菌菌株中，誘導所產(chǎn)生的表達系統(tǒng)，表達和純化該融合蛋白。
21.根據(jù)權利要求20的方法，其中該亞基因片段是2e志賀菌毒素的B亞單位。
22.根據(jù)權利要求20或21的方法，其中末端標記物的大小最大為1kDa。
23.根據(jù)權利要求20-22之任一項的方法，其中該末端標記物是氨基末端His標記物。
24.根據(jù)權利要求20-23之任一項的方法，其中將該表達培養(yǎng)物進行裂解緩沖液處理。
25.根據(jù)權利要求20-24之任一項的方法，其中將該表達培養(yǎng)物在弗氏壓碎器中處理或籍助超聲處理。
26.根據(jù)權利要求20-25之任一項的方法，其中該表達培養(yǎng)物在用弗氏壓碎器或超聲和/或用裂解緩沖液處理之后進行親和層析純化。
27.根據(jù)權利要求26的方法，其中純化籍助FPLC進行。
28.根據(jù)權利要求20-27之任一項的方法，其中對該被純化的融合蛋白進行交聯(lián)。
29.根據(jù)權利要求20-28之任一項的方法，其中將用重組融合蛋白免疫的小鼠的脾細胞和骨髓瘤細胞融合以產(chǎn)生用于制備抗Stx2eB免疫球蛋白的雜交瘤克隆。
30.根據(jù)權利要求29的方法，其中通過雜交瘤克隆產(chǎn)生的抗體用于在生產(chǎn)過程中控制重組融合蛋白的生產(chǎn)。
31.根據(jù)權利要求29或30的方法，其中由雜交瘤克隆產(chǎn)生的抗體用于Stx2e全毒素的免疫親和層析純化方法。
全文摘要
本發(fā)明涉及重組融合蛋白,該蛋白質(zhì)含有和末端標記物融合的2e志賀菌毒素(Stx2e)亞基因Stx2e片段,該末端標記物的大小約相當于該片段或該片段一部分的大小。
文檔編號A61K39/00GK1357047SQ00808467
公開日2002年7月3日 申請日期2000年6月5日 優(yōu)先權日1999年6月4日
發(fā)明者G·巴爾杰, S·弗蘭克 申請人:羅曼動物健康兩合公司